Aktivirani trombociti spašavaju apoptotičke stanice parakrinskom aktivacijom egfr i dna ovisne proteinske kinaze | stanična smrt i bolest

Aktivirani trombociti spašavaju apoptotičke stanice parakrinskom aktivacijom egfr i dna ovisne proteinske kinaze | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Ozljede mozga
  • Stanična signalizacija
  • trombociti

Sažetak

Aktivacija trombocita je prva reakcija na ozljede, ne samo bitne za stvaranje ugruška, već je važna i za obnavljanje tkiva. Zapravo, reparativni utjecaj trombocita dugo je iskorištavan terapeutski, gdje primjena koncentrata trombocita ubrzava oporavak rana. Unatoč tome, mehanizmi citoprotekcije koju pokreće trombociti slabo su razumjeli. Ovdje pokazujemo da se aktivirani trombociti akumuliraju u mozgu do izuzetno visoke razine nakon ozljede i oslobađaju faktore koji moćno štite neurone od apoptoze. Ispitivanja kinomske mikroraze i naknadnih inhibitora inhibitora kinaze pokazali su da se neuroprotekcija na bazi trombocita oslanja na parakrinsku aktivaciju receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) i proteinske kinaze ovisne o DNK nizvodno (DNA-PK). Ta ista anti-apoptotička kaskada stimulirana aktiviranim trombocitima također je osigurala hemo-rezistenciju na nekoliko tipova stanica raka. Iznenađujuće, duboko proteomsko profilisanje releasata trombocita nije uspjelo identificirati niti jedan poznati EGFR ligand, što ukazuje da aktivirani trombociti oslobađaju atipični aktivator EGFR-a. Ova studija prva je koja formalno povezuje aktivaciju trombocita s EGFR / DNA-PK - endogenom citoprotektivnom kaskadom.

Glavni

Trombociti su mali diskoidni fragmenti anuklearnih stanica koji su ključni igrači hemostaze - fiziološkog odgovora na prednjoj liniji akutne ozljede tkiva. U bazalnim uvjetima, trombociti cirkuliraju sa 150–400 × 10 9 po litri i odvajaju niz različitih bioaktivnih molekula unutar svojih unutarćelijskih granula. 1 Nakon povrede tkiva, vaskularni poremećaj pokreće lokalizirano taloženje trombocita, aktivaciju i oslobađanje granuliranog sadržaja. Te molekule koje oslobađaju trombocite (PRM) dalje regrutiraju i aktiviraju trombocite, rezultirajući višećelijskim agregatom koji ograničava gubitak krvi. Zajedno, kaskada koagulacije postaje aktivirana, što dovodi do stvaranja trombina koji konsolidira rastući tromb promovirajući daljnju aktivaciju trombocita i katalizirajući stvaranje fibrina.

Pored ove kritične uloge u hemostazi, trombociti sudjeluju i u brojnim nehemostatskim procesima, uključujući upale, 2 popravka tkiva, 3 angiogeneze i razvoj limfe. 4 Trombociti također promiču proliferaciju i metastazu tumorskih stanica putem peri-stanične adhezije i signalizacije. 5, 6, 7 Takva pleiotropija pripisuje se nizu molekula koje se oslobađaju iz aktiviranih trombocita.

Reparativni utjecaj trombocita također ima važnu kliničku korisnost. Desetljećima se "koncentrati trombocita" primjenjuju na mjesta ozljede kako bi se ubrzao oporavak organa poput kostiju, 8 kože 9 i tetiva. 10 Smatra se da blagotvorno djelovanje koncentrata trombocita dolazi zbog mnogih faktora rasta koji se oslobađaju iz aktiviranih trombocita. 3 Međutim, ovo se obrazloženje može smatrati spekulativnim obzirom na nedostatak izravnih eksperimentalnih dokaza. Nadalje, nema malo podataka o peri-staničnim signalima koji su trombocitni i koji olakšavaju obnavljanje tkiva.

Trombociti su normalno ograničeni na intravaskularni odjeljak. Međutim, ekstravaskularno nakupljanje trombocita može se dogoditi i pod određenim patološkim uvjetima. Jedan zapažen primjer toga je neurotrauma. Ovdje nalazimo da se u mozgu nakon neurotraume događaju izuzetno visoke razine aktivacije trombocita, pružajući načelnu potporu da proizvodi trombocita mogu utjecati na opstanak neurona. Stoga smo ispitali utjecaj PRM-a na oštećene primarne kortikalne neurone. Kako su neuroni post-mitotični, takav pristup omogućio je rasvjetljavanje učinaka koji nisu bili povezani sa proliferacijom. Otkrivamo da PRM selektivno i moćno smanjuju apoptozu neurona parakranskom aktivacijom receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) i aktiviranjem DNA proteinske kinaze ovisne o DNA (DNA-PK) - sveprisutnim enzimom za popravak DNA. Zapanjujuće, isti mehanizam ovisan o trombocitu štiti i nekoliko tipova stanica koje nisu neuronske ljudske stanice od apoptoze izazvane kemoterapijom. Tako aktivirani trombociti pokreću moćan i široko djelujući parakrinski signal koji smanjuje apoptozu.

Naši nalazi naglašavaju blagotvorno djelovanje trombocita koji vjerojatno djeluje unutar oštećenog mozga gdje je postojeće znanje o trombocitima ograničeno na njegovu hemostatsku ulogu. Zanimljivo je također da otkrivamo da ovo podcijenjeno citoprotektivno djelovanje trombocita može imati posljedice na karcinom gdje je povezanost između većeg broja trombocita i lošije prognoze bolesnika dobro uspostavljena. 11, 12, 13, 14 Pored toga, ovaj novootkriveni anti-apoptotički mehanizam trebao bi poticati racionalno dizajnirana poboljšanja u kliničkoj upotrebi koncentrata trombocita.

Rezultati

Razumijevanje trombocita tijekom stečenih ozljeda mozga u velikoj mjeri odnosi se na njihovu ulogu u hemostazi. S obzirom na svoj reparativni utjecaj na ostala tkiva, trombociti također vjerojatno imaju nehemostatski blagotvoran učinak na oštećeni mozak. Prvo smo pokušali utvrditi u kojoj su mjeri PRM prisutni u mozgu nakon neurotraume, stečene moždane ozljede u kojoj je vjerojatno da dolazi do ekstremne aktivacije trombocita. U tu svrhu mjerili smo topljivi GPVI (sGPVI; marker specifičan za trombocite koji se ispušta iz aktiviranih trombocita 15 ), u cerebrospinalnoj tekućini (CSF) pacijenata s neurotraumom (Slika 1a). Dok su kontrolni bolesnici imali sGPVI sa malo vrijednosti (prosjek = 0, 45 ng / ml), razina sGPVI u CSF-u bolesnika s neurotraumom bila je značajno povišena (prosjek = 35, 42 ng / ml). Koliko znamo, ovo je prva kvantifikacija bilo kojeg PRM-a u mozgu nakon neurotraume. Značajno je da je razina sGPVI u CSF-u bolesnika s neurotraumom bila usporediva s razinom u plazmi tijekom diseminirane intravaskularne koagulacije, koja iznosi između 39, 9 i 72, 8 ng / ml. 15 Dakle, duboko intrakranijalno oslobađanje molekula dobivenih trombocitima dolazi nakon neurotraume.

Image

Trombociti se nakupljaju i aktiviraju u mozgu nakon neurotraume. ( a ) ELISA mjerenje topljivog GPVI u CSF-u bolesnika koji nisu neurotrauma ( n = 9, crni otvoreni krugovi) i neurotrauma ( n = 31, plavi zatvoreni krugovi). Označeni su srednji ± 95% intervali pouzdanosti. *** P <0, 001 dvonožnim Mann-Whitney testom. ( b ) (i) Reprezentativna imunofluorescencija za marker trombocita integrin α IIb β 3 pokazuje obilježeno taloženje trombocita u ozlijeđenom ipsilateralnom korteksu 30 min nakon neurotraume u usporedbi s odgovarajućim kontralateralnim korteksom. Promjer udarne glave označen je crvenom prekidnom linijom. Dubina udara označena je kontinuiranom crvenom linijom. (ii) Povećana slika područja ipsilateralnog korteksa (naznačeno žutim okvirom u i). Imunoznak integrina α IIb β 3 prikazan je bijelom bojom, a signal Hoechst 33342 plavom bojom. Zatvorene strelice pokazuju intravaskularne naslage trombocita. Otvorene strelice pokazuju velike naslage trombocita. ( c ) Reprezentativni imunoblot lizata mozga miša uzet iz ozlijeđene ipsilateralne (ipsi) i neoštećene kontralateralne (kontra) hemisfere. Integrin α IIb β 3 korišten je kao marker trombocita. Cijepljeni fragment GPIb (GPIb α -tail) korišten je kao marker aktivacije trombocita. Albumin je korišten kao pokazatelj rušenja krvno-moždane barijere. GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja. Linija skale: ( b ) (i) 500 μ m. (ii) 50 μm

Slika pune veličine

Da bismo utvrdili prostornotemporalne karakteristike aktivacije / taloženja trombocita nakon neurotraume, koristili smo mišji model neurotraume; gdje je jednostrano jednostrani udar duljine 2 mm nanesen na moždanu koru. Nakon ozljede, miševi su transkardijalno perfuzirani kako bi uklonili krv bez protoka, a njihovi mozgovi podvrgnuti imunofluorescenciji za marker specifičan za trombocite, integrin α IIb β 3 . Kao što je prikazano na slici 1b, došlo je do značajnog nakupljanja trombocita unutar ozlijeđene ipsilateralne hemisfere, ali ne unutar neoštećene kontralateralne hemisfere 30 min nakon neurotraume. Značajno je da su se trombociti taložili ne samo unutar početnog mjesta udara (sjekire crvene boje; Slika 1bi), već i na udaljenim sekundarnim mjestima lezije unutar ipsilateralne hemisfere gdje prevladava apoptotska smrt stanica. Taloženje trombocita unutar traumatske lezije nije bilo ograničeno na krvne žile, a brojni ekstravaskularni agregati bogati trombocitima javljaju se unutar ozlijeđenog parenhima mozga (Slika 1bii). Slični rezultati opaženi su kada je provedena imunofluorescencija za marker specifičan za trombocite, GPIb α (podaci nisu prikazani). Ova istraživanja potvrđuju da se široka aktivacija trombocita događa u ipsilateralnoj hemisferi nakon žarišne neurotraume.

Da bi se utvrdio vremenski tijek aktivacije trombocita nakon ozljede, miševi su transkardijalno perfuzirani 5–60 min nakon neurotraume i pripremljeni su lizati ipsilateralne i kontralateralne kore. Ti su lizati potom podvrgnuti imunoblotskoj analizi. Kao što je prikazano na slici 1c, opažen je veći stupanj taloženja trombocita (prisutnost specifičnog trombocita, integrin, α IIb β 3 ) i aktiviranje trombocita (prisutnost markera specifičnog za aktivaciju trombocita, ∼ 17-kDa GPIb α fragment) u ozlijeđenom ipsilateralnom korteksu u odnosu na neoštećen kontralateralni korteks. Važno je da su primijećene i veće razine serumskog albumina u ipsilateralnom korteksu kroz sve vremenske točke u odnosu na odgovarajući kontralateralni korteks (slika 1c), što ukazuje da je došlo do rušenja barijere u krvi i mozga. Stoga, nedugo nakon neurotraume (30–60 min), izraženi taloženje / aktivacija trombocita i poremećaj krvno-moždane barijere podudaraju se unutar ipsilateralne kore.

Sve u svemu, ovi eksperimenti pokazuju da preklapanje krvnih i moždanih barijera i taloženje / aktiviranje trombocita omogućuju PRM-ovima da uđu u ozlijeđeni parenhim mozga. Prostorno taloženje trombocita je ogromno i proteže se daleko od početnog mjesta kontuzije. Uz to, veličina taloženja / aktivacije trombocita je takva da se koncentracija tGTVI trombocita u CSF-u nakon neurotraume približava onoj koja se nalazi u plazmi tijekom diseminirane intravaskularne koagulacije. Važno je da nam je ova usporedba dala patofiziološki relevantnu koncentraciju za korištenje PRM in vitro (PRM su korišteni in vitro u manjoj od polovine koncentracije od one utvrđene u CSF-u pacijenata s neurotraumom).

PRM-ovi smanjuju apoptozu neurona

Dalje smo istražili utjecaj PRM-a na ozljede neurona in vitro . Primarni mišji kortikalni neuroni bili su izloženi raznim stresorima (uključujući etopozid, L-glutamat, linsidomin i nedostatak glukoze u kisiku) u prisutnosti ili odsutnosti PRM-a i oštećenja stanica procijenjenih 24 sata kasnije. Najupečatljivije opažanje iz ovih studija bilo je da PRM iz aktiviranih trombocita, ali ne i od trombocita koji se odmaraju, značajno smanjuje jačinu ozljeda uzrokovanog etopozidom, što ukazuje na očuvanje integriteta membrane posredovanog PRM-om (slike 2a i b) i stanični metabolizam ( Slika 2c). Kako je etopozid inhibitor topoizomeraze II koji inducira oštećenje DNK i naknadnu apoptozu, 16 pratili smo učinak PRM-a na aktivaciju kaspaze. PRM-ovi oslabili aktiviranje etopozida izazvano kaskadom -8 i -9 inicijatora, smanjili aktivaciju efektorske kaspaze-3/7 (slika 2d) i spriječili cijepanje PARP-a ovisno o kaspazi (Slika 2e). Dakle, PRM blokiraju ranu fazu apoptoze prije aktiviranja glavnih intrinzičnih / vanjskih kaspaza.

Image

PRM-ovi smanjuju toksičnost uzrokovanu etoposidima u neuronima. Primarne mišje kortikalne neuronske kulture tretirane su nosačem, 2 mg / l etopozidom, etopozidom + supernatantom od neaktivacijskih trombocita (niska koncentracija PRM-a) ili etopozidom + supernatantom iz trombocita aktiviranih trombocita (PRM). Stupanj ozljede procijenjen je 24 sata kasnije mjerenjem poremećaja membrane plazme (oslobađanjem laktatne dehidrogenaze (LDH); a ; n = 4), mjerenjem staničnog metabolizma (pretvorbom MTS; c ; n = 5) i mjerenjem kaspaze-8, -9, -3/7 aktivacija ( d ; n = 4). Označena je srednja vrijednost sa SEM. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 i 'ns' nisu značajni jednosmjernom ANOVA s Newman-Keulsovom korekcijom. ( b ) Reprezentativne slike neuronskih kultura koje su 24 sata tretirane s etopozidom-PRM, zatim inkubirane s Hoechst 33342 (obojena u plavu) i 7AAD (obojena u ružičastoj). Slika kultura diferencijalnog interferencijskog kontrasta (DIC) prikazana je u gornjem redu mikrografije. Slika kultura epifluorescencije prikazana je u donjem redu mikrografija, a zdrave stanice u plavoj, a mrtve stanice u ružičastoj boji. ( e ) Reprezentativni imunoblot lizata iz neuronskih kultura koji su 24 sata tretirani vehiklom, PRM i etopozid ± PRM. Imunobloti pokazuju da PRM smanjuje cijepanje PARP uzrokovano etopozidom. Tubulin je korišten kao kontrola opterećenja. Linija mjerila: ( b ) 100 µm

Slika pune veličine

PRM-i su također zaštitili neurone od linsidomina (dopunska slika S2a) - snažnog nitrozativnog stresa. Na taj način PRM štite neurone od mehanički različitih povreda. Suprotno tome, PRM nisu uspjeli spasiti neurone od stanične smrti uzrokovane L-glutamatom (dopunska slika S2b) ili nedostatkom glukoze s kisikom (dopunska slika S2c). Zanimljivo je da dok je liječenje neurona s etopozidom ili linsidominom potaknulo aktivaciju kaspaze-3, izloženost L-glutamatu i lišavanje glukoze u kisiku nisu uspjeli izazvati nikakvu vidljivu aktivaciju kaspaze-3 (dopunske slike S2d i e). Ovi nalazi sugeriraju da PRM-i ne štite od oblika stanica stanične smrti neovisnih o kaspazi, već da PRM-ovi posebno ublažavaju neuronske ozljede prigušivanjem događaja iznad aktivacije pro-apoptotične kaspaze.

Kako bismo stekli daljnji uvid u citoprotektivne akcije osoba s oštećenjima, procijenili smo njegov utjecaj na proteasomski stres. Unatoč činjenici da inhibicija proteasoma može aktivirati apoptotsku kaskadu i u neuronima i u ne-neuronskim stanicama, 17, 18 PRM-a nisu ublažile ozljede uzrokovane tretmanom MG132 (dopunska slika S2f) ili liječenjem bortezomibom (dopunska slika S2g). Stanično oštećenje uzrokovano inhibicijom proteasoma razlikuje se od ozljede etopozida i linsidomina po tome što uglavnom ne uključuje oštećenje DNK. Stoga ovi rezultati sugeriraju da PRM preferirano ublažava ozljede posredovane kaspazom, već i PRM-ove učinkovito štite od apoptoze uzrokovane oštećenjem DNA.

Karakterizacija PRM-posredovane citoprotekcije

Kako neuroprotekcija prethodno nije bila izravno povezana s aktiviranjem trombocita, dodatno smo karakterizirali sposobnost trombocita da priguši apoptozu. Prvo smo procijenili da li neuroprotekciju još uvijek može izazvati in situ aktivirani trombociti (a ne pročišćenim PRM-om), jer naš protokol za pripremu PRM-a uklanja molekule <3 kDa i omogućava razgradnju labilnih trombocitnih agenasa (npr. Tromboksana A2), Te izostavljene molekule, međutim, uglavnom ne mijenjaju citoprotektivni učinak PRM-a, jer in situ aktivacija ispranih trombocita i dalje smanjuje ozljede izazvane etopozidom u kulturama neurona (* P <0, 05; n = 3; podaci nisu prikazani). Ovo otkriće pokazuje da je neto učinak aktiviranja trombocita doista neuroprotekcija. Također smo ispitali potenciju neuroprotekcije posredovane PRM-om. Kao što je prikazano na slikama 3a i b, PRM još uvijek smanjuje oštećenje neurona uzrokovano 5 puta većom koncentracijom etoposida. Pored toga, citoprotektivni utjecaj PRM-a uočen je čak i nakon 48 h izlaganja etopozidima (Slike 3c i d). Otuda, PRM prenose snažan i dugotrajan anti-apoptotički signal na neurone. Značajno je da je blagotvoran utjecaj PRM-a bio povezan sa staničnom proliferacijom jer nije primijećeno ugradnju bromodeoksiuridina u neuronske kulture nakon 24 sata liječenja PRM-om (podaci nisu prikazani). Zatim, za procjenu terapijskog potencijala PRM-a, dodali smo PRM neuronskim kulturama 1 sat nakon početka etoposidne ozljede. Unatoč činjenici da je apoptoza već započeta, primjena PRM-a nakon ozljede značajno je oslabila ozljedu neurona izazvanu etopozidom (Slike 3e i f). Dakle, sposobnost PRM-a da spašavaju neurone nakon početka apoptoze sugerira da aktivno sredstvo unutar PRM-a ima terapeutski potencijal.

Image

PRM štite od etopozida visoke doze i prethodno započete ozljede etopozida. ( a i b ) Primarne kulture neurona stimulirane su nosačem, 10 mg / l etopozida ± PRM-a. ( c i d ) Primarne kulture neurona stimulirane su nosačem, 2 mg / l etopozida ± PRM-a. ( e i f ) Primarne kulture neurona stimulirane su nosačem ili 2 mg / l etopozida 1 sat prije dodavanja PRM-a. Stupanj ozljede procijenjen je 24 h ( a, b, e i f ) ili 48 h ( c i d ) kasnije mjerenjem poremećaja membrane plazme ( putem otpuštanja laktat dehidrogenaze (LDH); a, n = 4; c, n = 4; e, n = 3) i mjerenje staničnog metabolizma (MTS pretvorbom; b, n = 5; d, n = 4; f, n = 7). Označeno je srednja vrijednost sa SEM. * P <0, 05; ** P <0, 01; **** P <0, 0001 i 'ns' neznačajno jednosmjernom ANOVA s Newman-Keulsovom korekcijom

Slika pune veličine

Konačno, istražili smo mogu li PRM-ovi ublažiti apoptozu u drugim staničnim tipovima. S obzirom na dobro prepoznati doprinos trombocita u progresiji raka 6, procijenili smo sposobnost PRM-a da inhibiraju etopozid-induciranu apoptozu u nizu staničnih linija ljudskog karcinoma. PRM smanjili su opseg ćelije uzrokovane etopozidom u stanicama monocitnih limfoma (U937, slika 4a), mijelocitnim plazma stanicama (JIM-1, slika 4b) i mijelocitnim limfocitima (KMS26, slika 4c). Ovi nalazi proširuju važnost citoprotekcije posredovane trombocitima i značajni su jer je etopozid kemoterapeut koji se koristi za liječenje malignih oboljenja, uključujući karcinom pluća malih stanica, karcinom germin-line, sarkom, limfom i leukemiju. 19

Image

PRM-ovi smanjuju apoptozu u stanicama koje nisu neuronske. Stanične stanice (označene na lijevoj strani) tretirane su vehikulmom, etopozidom-PRM-ovima. Stupanj ozljede procijenjen je 24 sata bojenjem na nuklearnoj boji 7AAD (FL-3) i CaspACE FITC-VAD-FMK (FL-1). Tri lijeva stupca prikazuju neobrađene podatke (kao raspršujuće crteže FL-1 nasuprot FL-3) jednog reprezentativnog eksperimenta, s prekrivenim vratima živih stanica. Desni stupac prikazuje dio živih stanica sakupljenih u više eksperimenata koji pokazuju da je toksičnost etopozida smanjena za PRM u ( a ) monocitnim stanicama U937 ( n = 8), ( b ) plazma ćelijama JIM-1 ( n = 3) i ( c ) limfocitne stanice KMS26 ( n = 3). Označeno je srednja vrijednost sa SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01 i 'ns' nisu značajni jednosmjernom ANOVA s Newman-Keulsovom korekcijom

Slika pune veličine

Prepoznavanje signalnih putova koji su u osnovi citoprotekcije posredovane PRM-om

Sljedeći smo željeli identificirati parakrinski signalni put odgovoran za PRM posredovanu citoprotekciju. Prvo smo testirali na ovisnost o kinazi primjenom staurosporina (inhibitora pan-kinaze koji pokreće oštećenje DNA i apoptoze neurona) i otkrili smo da PRM nisu promijenili stupanj oštećenja neurona izazvanih staurosporinom (Dodatna slika S3). Ovaj nalaz sugerira da se neuroprotektivno djelovanje PRM-a oslanja na aktivnost kinaze. Da bismo identificirali koje kinaze aktiviraju PRM, napravili smo kinomski ekran pri kojem su neuronske kulture ozlijeđene etopozidom u prisutnosti / odsutnosti PRM-a. Lizati su sakupljeni nakon 30 i 180 minuta tretmana, a zatim podvrgnuti mikroseriji protutijela za Kinexus (koja koristi ∼ 500 pan-i ∼ 340 fosfo-specifičnih antitijela). Kompletni skupovi podataka mikrorasta prikazani su u Dodatnoj tablici 1. Parovna usporedba i usporedba podataka mikroračunanja kroz obje vremenske točke stvorila je popis visokih pouzdanosti signalnih proteina koji su različito regulirani PRM-ovima (slika 5a). Ono što je također važno, kinomski zaslon pokazao je da PRM uzrokuju 44% smanjenje funkcije kaspaze-3, provjeravajući integritet početnog eksperimenta sa staničnom kulturom (Dodatna tablica 1).

Image

Kinomski probir i predviđanje signalnih događaja koji su u osnovi citoprotekcije posredovane PRM-om. ( a ) Neuronske kulture 30 min i 3 sata nakon stimulacije etopozid-PRM su lizirane i podvrgnute kinomskoj mikroarkološkoj analizi što je donijelo kratki popis signalnih proteina značajno izmijenjenih (crvena označava pojavu reguliranja od 1, 2 × 1, 2, a zelena označava događaj reguliran> 0, 55 × ) PRM nakon ozljede etoposida. ( b ) Signalni proteini koji su ušli u uži izbor (Dodatna tablica 1) podvrgnuti su Analizi intenziteta puta (IPA) da bi se dobilo šest kanonskih signalnih puta (podaci nisu prikazani) za citoprotekciju posredovanu PRM-om. Signalni proteini koji su pokazali međusobnu interakciju s kaspazom ili drugim apoptotskim procesima ručno su spojeni (preko predviđenih kanonskih signalnih putova) da bi se stvorio jedan predviđeni put signalizacije koji je u osnovi citoprotekcije posredovane PRM-om. Crveni simboli predstavljaju neregulirane događaje. Zeleni simboli predstavljaju oštećene događaje. Naknadne studije inhibitora kinaze temeljene na ovom pretpostavljenom signalnom putu istaknule su DNK-PK kao ključni kinazni efekt citoprotekcije posredovane s PRM-om.

Slika pune veličine

Da bi se ponudio uvid u cijeli sustav, kinomski skupovi podataka podvrgnuti su Analizi prirodnog puta (Redwood City, CA, USA) gdje je analitičar (iz australske organizacije Proteome Analysis) bio zaslijepljen i eksperimentalnim dizajnom i ukupnom hipotezom projekta. Pet od prvih šest kanonskih puteva identificiranih analizom putanja Ingenuity pokazalo je kritični utjecaj PRM-a na apoptozu i predviđalo je smanjenje funkcije kaspaze (podaci nisu prikazani). Ovih pet putnih putova zatim su ručno sjedinjeni u jedan signalni put koji navodno leži u citoprotekciji posredovanoj PRM-om (Slika 5b).

PRM inhibiraju apoptozu očuvanjem aktivnosti DNA-PK

Na temelju pretpostavljenog signalnog puta prikazanog na slici 5b, selektivni farmakološki inhibitori p38 α , JNK1, JAK1, DAPK1 (podaci nisu prikazani) i DNA-PK su testirani na njihovu sposobnost uklanjanja citoprotekcije posredovane PRM-om. Od testiranih inhibitora, samo DNA-PK-selektivni spoj, NU7441, oslabio je PRM-posredovanu citoprotekciju i u mišjim kortikalnim neuronima, i u ljudskim U937 monocitima (slike 6a i b, respektivno). Dakle, parakrinska aktivacija DNA-PK posreduje citoprotektivni utjecaj PRM-ova.

Image

Citoprotekcija posredovana PRM-om vrši se putem EGFR-a i nizvodne DNA-PK aktivacije. Neuronske kulture ( a ; n = 5) ili U937 stanice ( b ; n = 4) stimulirane su nosačem ili 1–2 mg / l etopozida ± PRM ± 10 nM NU7441 (DNA-PK-specifični inhibitor). Stupanj ozljede procijenjen je 24 sata kasnije mjerenjem aktivacije kaspaze-3/7 ( a ) ili vitalnosti stanica ( b ;% negativnog bojanja za 7AAD i CaspACE FITC-VAD-FMK). ( c ) Reprezentativne slike neuronskih kultura stimuliranih nosačem, 2 mg / l etopozida ili 2 mg / l etoposida + PRM. Kulture su fiksirane nakon 1 sata i podvrgnute imunofluorescenciji za katalitičku podjedinicu DNA-PK (DNA-PKcs). Gornja mikrografija prikazuje Hoechst 33342 nuklearni kontrastak, a donja mikrograme prikazuju odgovarajući imunosignal DNK-PKcs. ( d ) Reprezentativni imunoblot neuronskih kultura stimuliranih s 2 mg / l etopozida ± PRM-a. Kulture su lizirane 30 minuta nakon stimulacije i podvrgnute imunoblotskoj analizi za ukupni i fosforilirani EGFR (pEGFR). Podtekst je denzitometrijska analiza koja uspoređuje prosječni omjer pEGFR / EGFR (srednja vrijednost ± SD; n = 4; # P <0, 05 između skupina s / bez PRM-a koristeći neparni t- test s velškom korekcijom). Kulture tretirane u prisutnosti PRM-a imaju značajno povišene razine pEGFR / EGFR-a u usporedbi s kulturama tretiranim u nedostatku PRM-a. Neuronske kulture ( e ) ili U937 stanice ( f ) stimulirane su nosačem ili 1–2 mg / ml etopozida ± PRM ± Gefitinib (inhibitor specifičan za EGFR; 0, 4 μ M za neuronske kulture; 10 μM za U937s). Stupanj ozljede procijenjen je 24 sata kasnije mjerenjem staničnog metabolizma ( putem MTS pretvorbe; e ; n = 4) ili vitalnosti stanica ( f ; n = 4;% negativno obojenih za 7AAD i CaspACE FITC-VAD-FMK). * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 i 'ns' neznačajni su jednosmjernom ANOVA s Newman-Keulsovom korekcijom. # P <0, 05 neparnim t- testom s velškom korekcijom. Linija skale: ( c ) 10 µm

Slika pune veličine

DNA-PK je sveprisutni enzim odgovoran za popravak dvolančanih lomova DNA. 20 Zanimljivo je da je naš kinomski ekran pokazao da su razine DNK-PK bile u 317% više u neuronskim kulturama nakon tretiranja etopozidom + PRM, u odnosu na kulture tretirane samo etopozidom (Slika 5a; Dodatna tablica 1). U prilog tim nalazima, imunofluorescentna ispitivanja pokazala su da je 1 sat liječenja etopozidom dramatično smanjio nivo DNA-PK, dok je istodobno liječenje PRM-om potpuno vratilo DNK-PK na bazalnu razinu (Slika 6c). Dakle, naši podaci sugeriraju da neposredna, rana degradacija strojeva za popravak DNA doprinosi toksičnosti etopozida i da PRM štite očuvanjem popravka DNK-posredovanog DNA-PK-om.

Trombociti inhibiraju apoptozu atipičnom aktivacijom EGFR-a

Iako je DNA-PK prepoznati citoprotektant, receptori 21, 22 koji pokreću njegovu aktivaciju slabo su razumljivi. Jedini dobro uspostavljen receptor koji potiče DNA-PK aktivaciju je EGFR. 23, 24 Značajno, naš kinomski ekran pokazao je da PRM, pored povećanja razine DNK-PK, pokreću i istodobno povećanje nivoa fosfo-EGFR-a od 192% (Slika 5a; Dodatna tablica 1). Stoga smo hipotetizirali da se PRM štite aktiviranjem kaskade 'EGFRDNA-PK'. Da bismo testirali ovu hipotezu, prvo smo potvrdili da su PRM-ovi doista povećali aktivaciju EGFR-a (slika 6d). Zatim smo blokirali EGFR koristeći antikancerogeni spoj, Gefitinib - inhibitor malih molekula EGFR-a. 25, 26 Kao što je prikazano na slikama 6e i f, Gefitinib je značajno umanjio citoprotekciju posredovanu PRM-om protiv izloženosti etopozidima i u mišjim neuronima i u ljudskim monocitima U937. Ovi nalazi sugeriraju da citoprotektivni signal koji se prenosi PRM-om posreduje EGFR aktivacijom.

EGFR ima dobro definiran repertoar izvanstaničnih ligandi, i to: EGF, transformirajući faktor rasta- α , heparin-EGF, amfigulin, betacellulin, Epigen, epiregulin i neuregulini 1–6. 25 Izvršili smo duboko proteomsko profiliranje kako bismo utvrdili da li je bilo koji EGFR ligand prisutan u našim preparatima PRM-a. Ukupno 394 proteina su identificirana u PRM-u, od kojih je 266 sa dva ili više peptida pouzdano identificirano (dopunska tablica 2). Međutim, niti jedan EGFR ligand nije pouzdano identificiran u našim pripremama osoba s invaliditetom. Slično tome, nijedna druga prethodna karakterizacija releasoma trombocita nije otkrila prisutnost prepoznatog EGFR liganda (Wijten i sur. 1 i reference u njemu). Iako u PRM-ovima nije otkriven prepoznati EGFR ligand, proteini koji sadrže 'EGF-sličnu domenu' predstavljali su najbrojniju klasu proteina u PRM-ovima (dopunska tablica 2). Dakle, aktivirani trombociti oslobađaju novi ligand EGFR-a koji zauzvrat potiče preživljavanje stanica tijekom genotoksične inzulta održavanjem popravka DNK ovisnog o PK.

Rasprava

Aktivacija trombocita primarni je odgovor na ozljede tkiva. Iako je stvaranje tromba najbolje karakterizirana posljedica aktiviranja trombocita, pravilna inicijacija upale, angiogeneza, proliferacija i obnavljanje tkiva također ovisi o aktivaciji trombocita. Nedavna istraživanja sugeriraju da peri-stanična zaštita može biti još jedna posljedica aktivacije trombocita. 7, 27, 28 Naše istraživanje jedinstveno pokazuje da aktivirani trombociti oslobađaju atipični agonist EGFR-a, što zauzvrat transkribira parakrinski signal koji snažno smanjuje apoptozu očuvanjem popravljanja DNK ovisnog o PK. Na slici 7 prikazan je naš radni model citoprotekcije koja se temelji na trombocitima, pri čemu aktivirani trombociti oslobađaju protein sličan EGF-u koji aktivira peri-staničnu aktivaciju i nuklearnu translokaciju EGFR-a, što dovodi do EGFR-a: formiranje DNA-PK kompleksa, očuvanje DNA-PK razine i promocija popravljanja DNK. U prilog ovom mehanizmu, prethodna ispitivanja pokazala su da EGFR: DNA-PK kompleks održava popravljanje DNA 23 vjerojatno blokadom razgradnje posredovane kaspazom DNA-PK tijekom genotoksičnog stresa. 29 Dakle, vjerojatno postoji „terapijski prozor“ za popravak DNK posredovanog PK-om tijekom genotoksičnog stresa. Teoretiziramo da se aktiviranje trombocita uzrokovano ozljedom poklapa s ovim 'terapijskim prozorom' i pomaže u sprječavanju nepovratne aktivacije unutarnje i vanjske apoptoze (Slika 7).

Image

Radni model PRM-posredovane citoprotekcije protiv ozljede etopozida. ( a ) Ozljede etopozida u nedostatku aktivacije trombocita omogućuju etopozidu da ozlijedi stanice inhibiranjem DNA-topoizomeraze II i inducirajući dvolančane oštećenja DNA. Inicijalna aktivacija kaspaze nakon oštećenja DNA dovodi do razgradnje DNA-PK, čime se sprječava popravak DNK i potiče ireverzibilno pokretanje kraka apoptoze kaspaza-8 (vanjski) i kaspaza-9 (unutarnja). ( b ) Ozljede etopozida u prisutnosti aktivacije trombocita ne mogu se dogoditi u apoptozi. To je zato što aktivirani trombociti oslobađaju EGF-sličan protein (plavi) koji se veže i promiče fosfoaktivaciju EGFR-a. Fosfo aktivirani EGFR translocira u jezgru i tvori kompleks s DNA-PK. Kako je EGFR: DNA-PK kompleks otporan na razgradnju posredovanu kaspazom, bilo koje oštećenje DNK izazvano etopozidom može se popraviti i tako dovodi do opstanka stanica

Slika pune veličine

Iako naši podaci govore da je EGFR-DNA-PK signalizacija glavni posrednik citoprotekcije koju pokreće trombociti, oni ne isključuju doprinos ostalih proaktivnih signalnih kaskada. Doista, predviđeni kanonski put prikazan na slici 5b propisuje da ostale kinaze, uključujući p38 α , JNK1, JAK1, 4E-BP1 i DAPK1 aktiviraju PRM. Studije bi se sada trebale pozabaviti je li aktivacija ovih dodatnih kinaza posredovana PRM-om i druge nehemostatske utjecaje trombocita.

Anti-apoptotički čimbenici koji se oslobađaju iz aktiviranih trombocita imaju nekoliko povoljnih karakteristika. Prvo, osobe s oštećenjima pružaju zaštitu različitim tipovima stanica (slika 4) i, što je najvažnije, mogu se koristiti za spašavanje ozlijeđenih stanica nakon pokretanja apoptoze (slike 3e i f). Primjetna je i potencijala anti-apoptoze koja se temelji na trombocitima, a PRM često u potpunosti štite neurone od ozljeda (slike 2a i 6e; dopunska slika S2a). Ova moć može biti posljedica činjenice da PRM ometaju vrlo rani korak apoptotske indukcije; s PRM-om smanjujući aktivaciju inicijalnih kaspaza (slika 2d), sprječavajući neposredan rani pad razine DNA-PK nakon tretmana etopozidom (slika 6c) i prigušivanje izloženosti fosfatidilserinom izazvanom etopozidom u stanicama U937 (podaci nisu prikazani). It is also notable that PRMs maintained their protective action after heating (>50 o C; data not shown) and that the protective agent lacked pro-thrombotic activity when purified from other PRM constituents (data not shown). Thus, the anti-apoptotic factor in PRMs harbours desirable traits that encourage its future identification and development as a potential therapeutic.

Several points pertaining to the preparation and use of PRMs warrant mention. First, PRMs were prepared by pooling the supernatants from washed activated human platelets across ≥4 independent donors. Our preparations of PRMs were also of high purity, significantly overlapping with the other published in-depth characterisation of the platelet releasome (Wijten et al. 1 and references therein). In addition, numerous independent batches of PRMs were used throughout this study, with each batch offering potent cytoprotection. Hence, our study denotes that a potent anti-apoptotic agent is constitutively expressed and reproducibly released from activated human platelets.

Platelets, EGFR and DNA-PK in the context of brain injury

Only recently have studies begun to define the non-haemostatic roles of platelets in the brain. For example, recent studies show that platelets drive neuroinflammation during experimental stroke and multiple sclerosis. 30, 31 However, discrepant findings exist with respect to the capacity of platelets to influence neurotoxicity. One research group has shown that activated platelets are toxic to the central nervous system, 32, 33 whereas another study shows that intracranial administration of platelet lysates (rather than PRMs) reduces post-stroke lesion volume and neurological deficit in spontaneously hypertensive rats. 34 Hayon et al. 34 attributed the beneficial effect of platelet lysates to an increase in angiogenesis and proliferation and also concluded that a platelet-based promotion of cell survival likely contributed to the dramatic improvement in post-stroke injury. Our observations that platelets offer potent neuroprotection complement and provide an underlying molecular mechanism for the findings of Hayon et al. 34 Following stroke and neurotrauma, for example, such a platelet-based mechanism might delay apoptosis, affording time for the restoration of tissue homeostasis. Indeed, a platelet-based neuroprotective mechanism capitalises on the fact that platelets are frontline responders to injury capable of releasing anti-apoptotic effectors in a spatially and temporally appropriate manner.

In comparison with the emerging neural roles of platelets, it is well established that EGFR signalling can protect the brain from injury. 35, 36, 37, 38, 39 Similarly, DNA-PK is a recognised neuroprotectant, with studies showing that DNA-PK −/− neurons are hypersensitive to injury. 22, 40 Surprisingly, no prior study has established whether EGFR-mediated activation of DNA-PK is a protective pathway that operates during brain injury. Thus, a PRM that activates the EGFR-DNA-PK cascade (our present study) warrants further investigation.

Platelets, EGFR and DNA-PK in the context of cancer

It is well accepted that activated platelets deleteriously contributes to cancer aetiology. 6, 41 It is thought that activated platelets ensheath circulating cancer cells, allowing them to evade immune detection, protecting them from vascular shear forces and helping vessel wall attachment and metastasis. 41, 42, 43 In addition, activated platelets release paracrine factors that promote cancer cell proliferation, 44 chemo-resistance 7 and angiogenesis. 45, 46 Hence, platelet count is commonly used as a prognostic factor whereby patients with high platelet counts have reduced survival rates in a range of tumour types including cervical 47 and lung cancer. 48 Our data extend these observations and show that activated platelets increase the survival of cancer cells exposed to etoposide – a widely used chemotherapeutic. Therefore, we predict that blockade of platelet-based cytoprotection, in conjunction with radio/chemotherapy may enhance the efficacy of cancer treatments.

Interestingly, ectopic activation of the EGFR-DNA-PK cascade has also been closely linked to tumourigenesis and radio/chemo-resistance. 49, 50, 51, 52, 53 Indeed, as a high proportion of malignancies feature hyperactivation/mutation of EGFR, the EGFR is a mainstay of anti-cancer research. 25, 54, 55, 56 Similarly, DNA-PK-selective antagonists, including NU7441, are promising new anti-cancer drugs. 51, 57 In this context, discovery of platelets as a potent, atypical and injury-specific activator of EGFR-DNA-PK signalling is of explicit relevance to the field of cancer. Clinical trial records should now be stratified to determine whether the efficacy of EGFR-inhibitory regimes correlates with platelet counts in cancer patients.

Zaključne napomene

The widespread medical use of platelet concentrates to facilitate tissue repair led us to investigate whether pro-survival factors are released by activated platelets. We find that molecules released from platelets that are yet to be identified, potently protect a variety of cell types from apoptosis by transactivation of the EGFR and stimulation of downstream DNA-PK-mediated DNA repair. Our study is the first to connect platelets, frontline responders to tissue injury, to the highly studied EGFR-DNA-PK cascade. While this connection uncovers new avenues for neuroprotection, it also provides a plausible mechanistic basis for the correlative actions of platelets, EGFR and DNA-PK during cancer. Future research should now address platelet-based cytoprotection during neurotrauma, cancer, the clinical use of platelet concentrates, and indeed, any situation where large-scale platelet activation and apoptosis coincide.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica 1

  2. 2.

    Dopunska tablica 2

Glosar

CSF

cerebrospinal fluid

DIC

differential interference contrast

DNA-PK

DNA ovisna o protein kinazi

EGFR

receptor faktora rasta

pEGFR

phosphorylated activate EGFR

GP

glycoprotein

PARP

poly ADP ribose polymerase

PRMs

platelet-released molecules

STS

staurosporine

veh

vozilo

SIN-1

linsidomine

OGD

oxygen-glucose deprivation

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)