Akt i mtor posreduju programirana nekroza u neuronima | stanična smrt i bolest

Akt i mtor posreduju programirana nekroza u neuronima | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična signalizacija
  • Necroptosis
  • Neurološki poremećaji

Sažetak

Nekroptoza je novo opisani oblik regulirane nekroze koji pridonosi smrti neurona u eksperimentalnim modelima moždanog udara i moždane traume. Iako je učinjeno mnogo posla na rasvjetljavanju pokretačkih mehanizama, signalni događaji koji upravljaju nekroptozom ostaju uglavnom neistraženi. Akt je poznat da inhibira smrt apoptotske smrti neuronskih stanica. Mehanički cilj rapamicina (mTOR) je silazni efektor Akt koji kontrolira sintezu proteina. Ranije smo izvijestili da dvostruka inhibicija Akt i mTOR smanjuje akutnu staničnu smrt i poboljšava dugoročni kognitivni deficit nakon kontroliranog kortikalnog utjecaja na miševima. Ovi nalazi povećali su mogućnost da Akt / mTOR može regulirati nekroptozu. Da bismo testirali ovu hipotezu, inducirali smo nekroptozu na staničnoj liniji neuronskog hipokampnog neuronskog HT22 koristeći istodobni tretman faktorom nekroze tumora α (TNF α ) i inhibitorom pan-kaspaze N-benziloksikarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilketon. Tretmanom TNF a / zVAD izazvao je staničnu smrt unutar 4 h. Staničnoj smrti prethodila je montaža RIPK1-RIPK3-pAkt i fosforilacija Thr-308 i Thr473 AKT i njegovog izravnog supstrata glikogen sintaza kinaza-3 β , kao i mTOR i njegov izravni supstrat S6 ribosomalni protein (S6), što sugerira aktivaciju puta Akt / mTOR. Prethodna obrada inhibitorom Akt viii i rapamicinom inhibira događaje fosforilacije Akt i S6, proizvodnju mitohondrijskih reaktivnih kisika i nekroptozu preko 50% bez utjecaja na kompleks RIPK1-RIPK3. Ovi podaci potvrđeni su korištenjem malog inhibicijskog propadanja ribonukleinske kiseline posredovanog AKT1 / 2 i mTOR. Svi gore navedeni biokemijski događaji inhibirali su nekrostatin-1, uključujući Akt i mTOR fosforilaciju, stvaranje oksidativnog stresa i sklop RIPK1-RIPK3-pAkt kompleksa. Podaci sugeriraju novu, dosad neočekivanu ulogu Akt i mTOR nizvodno od aktivacije RIPK1 u smrti neuronskih stanica.

Glavni

Nekroptoza je oblik programirane nekroze reguliran kinaznom aktivnošću proteinske kinaze 1 koja djeluje na receptor (RIP1; poznata i pod nazivom RIPK1) i RIP3 (također poznata kao RIPK3). Nekroptotski stimulansi induciraju kompleksnu skupinu TNF receptora 1 koja uključuje protein protein domene vezan uz TNFR, protein povezan s Fas proteinima, kaspazu-8, RIPK1, RIPK3, i razne molekule regulatora, kao što je beta-konvertorni enzim interleukin-1 beta (FLICE) - FLICE) - poput proteina inhibitora i proteina cilindromatoze, između ostalih. Kompleks koji tvori RIPK1-RIPK3 definira nekrosom, koji je potreban za pokretanje smrti nekroptotskih stanica. 1 Nekroptoza doprinosi smrti neurona u eksperimentalnim modelima moždanog udara i traumatičnih ozljeda mozga. 2, 3 U posljednje vrijeme intenzivni istraživački napori usmjereni su na rasvjetljavanje mehanizama koji doprinose provođenju nekroptoze otkrivajući kritične uloge za kinaznu aktivnost RIP1 i RIP3, kao i prisutnost proteina sličnog mješovitom kinaznom domenu, 4, 5 protein-166 vezan uz dinamin-regulator regulatora fisije proteina mitohondrije i reaktivne vrste kisika (ROS). 2 Aktivnost RIPK1 i sklop nekrokomskih kompleksa reguliraju se reakcijama ubikvitulacije i deubikvitacije posredovanih proteinima cilindromatoze 7 i drugima. Iako su u mnogim izvješćima razjašnjeni mehanizmi pokretanja nekroptoze, malo se zna o mehanizmima signalizacije i izvršenja nizvodno od nekrosoma, a kako nekroptoza upravlja u neuronskim ćelijama ostaje neistražena. 8, 9, 10

Nedavno smo izvijestili da je, iznenađujuće, kombinirano-farmakološka inhibicija Akt i mehanički cilj rapamicina (mTOR) smanjila nekrotičnu staničnu smrt u CA3 i CA1 regijama hipokampusa i poboljšala funkcionalni ishod nakon kontrolirano-kortikalnog utjecaja (CCI) na miševima. 11 Ova promatranja, zajedno s našim prethodnim podacima koji su sugerirali doprinos nekroptoze ovisne o RIP1 kinazi, CCI, 3 sugerirali su moguću ulogu Akt / mTOR signalizacije u programiranoj nekrozi neuronskih stanica. Ove in vivo studije u mišjem CCI modelu potaknule su nas da direktno istražimo da li Akt i mTOR posreduju programiranu nekrozu u stanicama neurona. U tu svrhu koristili smo hipokampalne HT22 stanice za testiranje hipoteze da je nekroptoza posredovana RIPKI-RIPK3 regulirana nizom od nekrosomske montaže od strane Akt i mTOR. Ovdje navodimo aktiviranje Akt / mTOR signalnih putova i smrt neuronskih stanica koje inhibiraju zajedno farmakološkom ili genetskom inhibicijom Akt i mTOR. Inhibicija Akt / mTOR nije utjecala na sklop nekrosomnog kompleksa, ali je inhibirala oksidativni stres i staničnu smrt. Podaci sugeriraju neočekivanu ulogu Akt / mTOR u regulaciji nekroze neurona. S obzirom na velik broj inhibitora Akt i mTOR koji su trenutno u fazi razvoja, ovaj mehanizam akutne smrti neuronskih stanica mogao bi biti vrlo pogodan za terapijsku intervenciju.

Rezultati

TNF α / zVAD inducira nekrozu u stanicama HT22

Da bismo procijenili signalne putove koji mogu posredovati nekroptozu nizvodno od RIPK1, započeli smo s uspostavljanjem uvjeta koji induciraju nekroptozu u HT22 stanicama primjenom tumora nekroze tumora- α (TNF α ) i zVAD primjenom. Studije o odgovoru na dozu TNF a i zVAD zasebno su odredile optimalne koncentracije svakog reagensa koje zajedno potiču nekroptozu (Slika 1). Ustanovili smo da 1 ng / ml TNF a i 50 µ M zVAD efikasno induciraju staničnu smrt i stoga su ovi uvjeti naknadno korišteni u svim eksperimentima (Slike 1a-c). Tretmanom TNF α / zVAD inducirana je propusnost membrane na propidijev jodid (PI) (slika 1c), kao i rana translokacija visoko pokretne kutije proteina grupe-1 (HMGB1) iz jezgre u citosol (slika 1d), što sugerira nekrozu. Elektronska mikroskopija potvrdila je ultrastrukturne značajke nekroze, uključujući natečene mitohondrije, citoplazmatsko čišćenje, oštećenje membrane i karakteristične nuklearne promjene (Slika 1e). Tako stanice HT22 umiru nekrozom kao odgovor na TNF α / zVAD.

Image

TNF α / zVAD inducira nekrozu u stanicama HT22. ( a, b ) TNF α i zVAD krivulje doza-odgovor. Stanična smrt procijenjena je propidium jodidom (PI) i Hoechstovom obojenjem. ( c ) Reprezentativne slike HT22 stanica tretirane DMSO ili TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μM) 4 h. ( d ) Translokacija HMGB1 otkrivena je u stanicama (plavo: Hoechst-boja; zeleno: HMGB1 antitijelo), a u kulturi medija Western blot-om. ( e ) Prijenosna elektronska mikroskopija stanica HT22 liječenih TNF a / zVAD tijekom 4 ili 24 sata pokazuje nekrotičnu morfologiju, uključujući natečene mitohondrije, citoplazmatsko čišćenje, oštećenje membrane i kromatinolizu. M, mitohondrion; N, jezgra. (Svi podaci prikazani su kao srednja ± SEM iz 3–5 neovisnih pokusa. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 u odnosu na DMSO grupu.) Ljestvice: c, 100 µm; d, 10 μm; e, 1 μm

Slika pune veličine

TNF α / zVAD-inducirana stanična smrt u HT22 stanicama je nekroptoza

Da bi se utvrdilo da li TNF α inducira nekroptozu, na primjer, programirana nekroza ovisna o RIPK1 / RIPK3, HT22 stanice su tretirane TNF a / zVAD u prisutnosti ili odsutnosti snažnog i specifičnog inhibitora 7-Cl-O-nekrostatin-1 inhibitora RIPK1 ( koji se u daljnjem tekstu nazivaju Nec-1), optimizirani analog nekrostatina-1 koji nije pokazao izvan ciljanu inhibicijsku aktivnost u pregledu od preko 400 ljudskih kinaza. 12, 13, 14 Nec-1 doza ovisno inhibira staničnu smrt kao odgovor na TNF α / zVAD (Slike 2a i b). Da bismo dodatno potvrdili ulogu Nec-1, koristili smo N- metil neaktivni analog 7-Cl-O-nekrostatina-1 kojem nedostaje inhibicijska aktivnost 12 i pokazali da stanična smrt više nije inhibirana, snažno sugerirajući da je smrt stanica HT22 bila necroptosis. Da bismo nastavili nekroptozu kao specifični način smrti, upotrijebili smo genetski propad RIPK3 koristeći specifičnu malu inhibicijsku ribonukleinsku kiselinu (siRNA). Slika 2 prikazuje snažnu redukciju proteina RIPK3 nakon 72 sata liječenja siRNA-specifičnom za RIPK3 i snažnu inhibiciju stanične smrti uzrokovane TNF a / zVAD, snažno sugerirajući uključenost i RIPK1 i RIPK3 zajedno u HT22 nekrozu (Slike 2c i d). Nekroptoza u stanicama koja nisu neuronska zahtijeva stvaranje nekropoznog kompleksa RIPK1-RIPK3 koji je ovisan o kinaznoj aktivnosti RIPK1 i RIPK3. 15, 16, 17 Da bismo procijenili skupljanje nekrosoma, izveli smo eksperimente imunoprecipitacije (IP) koji su potvrdili interakciju između RIPK1 i RIPK3. Formiranje kompleksa RIPKl / RIPK3 inhibirano je Nec-1, kao što je ranije izvješteno u stanicama koje nisu neuronske. 15 Inhibicija interakcije RIPK1 / RIPK3 pomoću Nec-1 nije objašnjena smanjenjem razine proteina kao što je prikazano Western blot-om homogenata ulaza (Slika 2e). Iz ovih eksperimenata zaključujemo da je smrt stanica HT22 kao odgovor na TNF α / zVAD nekroptoza, u ovom slučaju ovisna i o RIPK1 i RIPK3, te da barem dio zaštitnih učinaka nekrostatina-1 uključuje inhibiciju RIPK1 / RIPK3 kompleksa skupština.

Image

Stanična smrt izazvana TNF a / zVAD u HT22 stanicama je nekroptoza. ( a ) Inhibicija doze ovisne o TNF a / zVAD uzrokovana nekrostatinom-1. Podaci su prosječni ± SEM iz tri neovisna pokusa. * P <0, 01; ** P <0, 001 nasuprot TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 uM) (TZ). ( b ) Specifični inhibitor RIPK1 kinaze, 7-Cl-O-nekrostatin-1 (Nec-1), ali neaktivni analog (7-Cl-O-Nec-1; Nec-1i) spriječio je staničnu smrt induciranu TNF a i zVAD. p = ns TZ nasuprot TZ Nec-1i. ( c ) Srušenje RIPK3 specifičnom siRNA-supresiranom TNF a / zVAD-induciranom staničnom smrću. * P <0, 001 nasuprot negativnom siRNA tretiranom TNF a / zVAD. ( d ) Western blot analiza RIPK3 obustave. ( e ) Reprezentativni eksperiment imunoprecipitacije ( n = 3) koji pokazuje kompleks RIPK1-RIPK3 kompleksa u HT22 stanicama tretiranim TNF a / zVAD. Složeni sklop je inhibirao Nec-1. T, TNFa (1 ng / ml); TZN, TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μM) / Nec-1 (30 μM ). Podaci su prosječni i SEM od tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Nekroptoza u stanicama HT22 ovisi o ROS

Pokazalo se da nekroptoza u nekim, ali ne u svim staničnim linijama ovisi o stvaranju ROS-a. 2, 16, 18 Da bismo utvrdili ima li generacija ROS ulogu u nekrozi uzrokovanoj TNF a / zVAD u stanicama HT22, koristili smo Mitosox crveni, koji otkriva mitohondrijski ROS kao i niz drugih potencijalnih ROS vrsta. 19 Mitosox-pozitivne stanice povećane su TNF a / zVAD tretmanom i ovo povećanje snažno je inhibiralo Nec-1, što ukazuje da ROS nastaje nizvodno od RIPK1 (Slike 3a i b). Generacija ROS-a također je inhibirana Akt viii / rapamicinom, što sugerira da su Akt i mTOR signalizacija uzvodno od proizvodnje ROS-a (Slike 3a i b). Generacija ROS (nije prikazana) i smrt HT22 stanica (slika 3c) doza je inhibirana antioksidansom betahidroksianizolom, a staničnu smrt blokirao je niz drugih antioksidanata, uključujući rotenon (inhibitor mitohondrijalnog kompleksa I) i baicalein inhibitora lipoksigenaze (Bai ; Slika 3c). Još jedan inhibitor lipoksigenaze, koji sam po sebi nema antioksidacijsku aktivnost, ali se zna da smanjuje oksidativnu stresnu staničnu smrt u HT22 stanicama, LOXBlock-1 (LOX-1), 20, 21, također zaštićen od TNFa / ZVAD u istoj mjeri kao bai i rotenon. Dakle, generacija ROS-a je potrebna za nekroptozu u stanicama HT22.

Image

Stanična smrt izazvana TNF a / zVAD povezana je s oksidativnim stresom. ( a ) Reprezentativni × 200 fotomikrografija koje prikazuju MitoSox crvenu i Hoechst fluorescenciju u stanicama HT22 4 sata nakon tretmana dimetilsulfoksidnim nosačem (DMSO), TNF a / zVAD (TZ) ili TNF a / zVAD tretman u prisutnosti ili odsutnosti Akt / mTOR inhibitore (TZAR, TZ + Akt inhibitor VIII (10 uM) + rapamicin (100 nM)) ili nekrostatin-1 (30 uM; TZN). ( b ) MitoSox-pozitivne stanice kvantitativno su fluorescentnom mikroskopijom. ANOVA P <0, 0001. * P <0, 05 prema TZ za sve skupine. Podaci su iz četiri neovisna pokusa. ( c ) Zaštitni učinci betahidroksianizola (BHA), LOXBlock-1 (LOX-1) inhibitora, baicaleina i rotenona na staničnu smrt uzrokovanu TNF a / zVAD. Podaci su iz tri neovisna pokusa. * P <0, 05; ** P <0, 01 nasuprot TNF α / zVAD (TZ) grupi. TZN, TNF α / zVAD / Nec-1 (30 μM)

Slika pune veličine

TNF α / zVAD aktivira signale Akt i mTOR u stanicama HT22

Zanimljivo je da su prethodne studije na stanicama karcinoma sugerirale da Akt aktivnost može promovirati, a ne inhibirati ROS-induciranu staničnu smrt uslijed transkripcijske redukcije antioksidativnih odbrana. Naše nedavno istraživanje pokazalo je da u specifičnom slučaju stanične linije Akt i mTOR fibrosarkoma L929 aktivacija mTOR-a doprinosi nekroptozi. 22, 23, 24 Međutim, to nije primijećeno u brojnim drugim staničnim linijama, gdje je Akt povezan sa sintezom TNF α, ali ne i staničnom smrću, što sugerira da pronecroptotska signalizacija može biti ograničena na L929 stanice. Međutim, s obzirom na naše prethodne podatke o ulozi Akt i mTOR u CCI, procijenili smo aktiviranje Akt i mTOR staza u HT22 stanicama tretiranim s TNF α / zVAD u 2 sata. Odabrali smo ovu ranu vremensku točku jer je to prije početka detektirajuće stanične smrti u našem modelu sustava. Kao odgovor na TNF α / zVAD, Akt je fosforiliran na lokacijama 473 i 308, zajedno s glikogen sintaza kinazom (GSK) -3 β (Ser9), izravnim supstratom Akt, i mTOR i njegovim izravnim supstratom S-6 (Slike 4a i c). Za razliku od L929 stanica koje je inducirala nekroptoza samo TNF α u kojima je Akt fosforilacija bila rana prolazna, ali održana nekoliko sati kasnije, 23 Akt i mTOR fosforilacija u HT22 stanicama otkrivena je već 30 minuta nakon dodavanja TNF a / zVAD i bila je održano tijekom cijelog eksperimentalnog razdoblja (slike 4a i c i podaci nisu prikazani). Fosforilacija Akt i mTOR i njihovih srodnih supstrata nije inducirana samo sa TNF a ili zVAD, već je bila potrebna specifična nekroptotska signalizacija zajedno sa TNF a / zVAD (Slike 4b i d). Predtretman nekrostatinom-1 inhibirao je porast Akt-308 i -473, kao i mTOR i Akt i mTOR supstrata nizvodno, što potvrđuje da fosforilacija i aktivacija Akt / mTOR kao odgovor na TNF α / zVAD ovisi o RIPK1 i predstavljaju posljedice nekroptoze koja signalizira nizvodno od RIPK1 (slike 5b i c). Značajno je da je liječenje HT22 stanica TNF / cikloheksamidom (CHX) izazvalo široku smrt do 18 h, ali nije induciralo Akt fosforilaciju u 2 h (slika 4e) ili 18 h (podaci nisu prikazani), što sugerira da je aktivacija Akt u stanicama HT22 tretirana s TNF / zVAD je specifičan za nekroptozu.

Image

Aktivacija Akt / mTOR nakon tretmana TNF α / zVAD. Rezultati reprezentativnih imunoblotova ( a, b ) i denzitometrije ( c, d ) aktivacije Akt / mTOR u HT22 stanicama nakon tretiranja dimetilsulfoksidom TNF- a / zVAD ili nosačem. ( a ) Vremenski tijek događaja fosforilacije nizvodno od Akt / mTOR ( n = 3 neovisna eksperimenta). ( c ) Podaci o denzitometriji od a . ( b ) Za aktiviranje Akt / mTOR signalizacije u HT22 stanicama potreban je sinergistički učinak TNF α i ZVAD. ( d ) Podaci o denzitometriji od b . ( e ) Reprezentativna analiza blokade zapadne mrlje Akt fosforilacijom 2 sata nakon tretmana TNF / cikloheksamidom da se inducira apoptotska smrt stanica. Nije primijećena promjena u pAkt-473 ili ukupnom Akt primjenom apoptotskih podražaja. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 nasuprot grupi DMSO. Podaci su iz n = 3 neovisna pokusa. Kratice: fosfo-Ser-473-Akt (p-Akt-473), fosfo-Ser308-Akt (p-Akt-308), fosfo-Ser9-GSK-3 β (p-GSK-3 β ), fosfo-Ser2448 -mTOR (p-mTOR) i fosfo-Ser235 / 236 S6 (p-S6)

Slika pune veličine

Image

Dvostruka inhibicija Akt i mTOR inhibira nekroptozu induciranu TNF a / zVAD. ( a ) Akt i mTOR inhibitori smanjili su staničnu smrt izazvanu TNF a / zVAD, što je otkriveno propidijevim jodidom (PI) i Boje Hoechst. ( b, c ) Reprezentativni imunobloti i denzitometrija za fosforilirani Akt, GSK-3 β , FoxO1, mTOR i S6 u HT22 stanicama nakon TNF a / zVAD u prisutnosti ili odsutnosti Akt inhibitora VIII (10 uM) i rapamicina (100 nM ) (podaci su tri neovisna pokusa, * P <0, 01; ** P <0, 001 u usporedbi s TZ skupinom). Kratice: TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μM) / Akt inhibitor VIII (10 μM ) (TZA), TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μM) / rapamicin (100 nM ) (TZR), TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μM) / Akt inhibitor VIII (10 μM ) / rapamicin (100 nM) (TZAR)

Slika pune veličine

Za testiranje funkcionalnosti Akt i mTOR aktivacije koristili smo dva različita pristupa. Prvo smo tretirali stanice HT22 s inhibitorom Akt viii, rapamicinom ili oboje i procijenili staničnu smrt pomoću PI bojenja i inhibicije putanja Western blotom. Primjena Akt i mTOR inhibitora zajedno je smanjila smrt HT22 stanica u većoj mjeri nego sami Akt ili mTOR inhibitori, sugerirajući da oba puta sudjeluju u signalizaciji nekroptoze (Slika 5a). Stanična smrt je također smanjena liječenjem inhibitorom Akt viii i torinom II, specifičnijim inhibitorom mTOR od rapamicina (podaci nisu prikazani). Western blot i denzitometrijske analize potvrdile su inhibiciju fosforilacije Akt i mTOR i njihovih supstrata Akt inhibitorom viii odnosno rapamicinom (Slike 5b i c).

U drugom pristupu za ublažavanje potencijalnog problema izvan ciljnih učinaka koji bi mogli ometati interpretaciju farmakoloških eksperimenata, koristili smo specifičnu siRNA za rušenje Akt 1 i 2 (Akt 3 nije detektiran u HT22 stanicama; Slika 6a) i mTOR (Slike 6b i c) i procijenili učinak genetske inhibicije svakog u staničnoj smrti uzrokovanoj TNF a / zVAD. U svakom slučaju dobiveno je snažno obrušavanje proteina, a stanice HT22 koje su siRNA davale protiv Aktl / 2 i mTOR zajedno imale su smanjenje smrti uzrokovane TNF a / zVAD slične veličine kao i liječenje kemijskim inhibitorima Akt i mTOR (slika 6d). Dakle, kemijski i genetski pristupi sugerirali su ulogu za aktivaciju Akt i mTOR u programiranoj nekrozi HT22 stanica.

Image

Srušenje Akt i mTOR inhibira nekroptozu induciranu TNF α / zVAD. ( a ) HT22 stanice eksprimiraju Aktl i Akt2, ali ne Akt3 određene imunoblotom. Mišji fibroblasti pluća korišteni su kao Akt3 pozitivna kontrola. ( b, c ) srušenje mRI, Akt1 i Akt2 posredovano siRNA u HT22 stanicama je potvrđeno imunoblotom pomoću reagensa koji identificiraju ukupni Akt i mTOR. ( d ) Stanična smrt je određena u kontrolnim stanicama i u stanicama s oborenjem Aktl / 2, mTOR ili trostrukim padom mTOR i Aktl / Akt2 zajedno. Podaci predstavljaju tri neovisna eksperimenta, * P <0, 05 nasuprot kontrolnoj (CTL) siRNA

Slika pune veličine

Inhibicija Akt / mTOR ne utječe na kompleks RIPK1-RIPK3 u HT22 stanicama tretiranim TNF α / zVAD

Prethodne studije su pokazale bitnu ulogu za kinaznu aktivnost RIPK1 / RIPK3 u sastavljanju nekrokomskog kompleksa. 4, 15, 16, 17 Da bi se utvrdilo može li aktivacija Akt / mTOR imati i ulogu u RIPK1 / RIPK3 složenom kompleksu, HT22 stanice su tretirane TNF a / zVAD u prisutnosti ili odsutnosti Akt inhibitora viii i rapamicina, i RIPK1– Interakcija RIPK3 ocijenjena je IP-om. Inhibicija Akt / mTOR nije utjecala na interakciju RIPK1-RIPK3 (Slika 7a), sugerirajući da se aktivacija Akt / mTOR događa nizvodno od sklopa RIPK1-RIPK3 i prije koraka nekroptoze koji proizvode oksidativni stres. Ti su podaci također povećali mogućnost izravne interakcije Akt s nekrosomom i reguliranja njegove fosforilacije i aktivacije pomoću RIPK1. Zaista, ukupni Akt kao i fosfo-Akt-473 otkriveni su u imunoprecipitantima RIPK1 u HT22 / ZVAD-stimuliranim HT22 stanicama, a fosfo-Akt-473 interakcija s RIPK1 bila je neprimjetna uz prethodnu obradu stanica s nekrostatinom-1 (Slike 7b i c ). Inhibicija pAkt-RIPK1 interakcije s Nec-1 nije bila posljedica nedostatka proteina RIPK1, što je potvrđeno u IP (slika 7c). Ovi podaci sugeriraju da Akt kompleksi s RIPK1 i RIPK3, te da se njegova aktivnost tijekom nekroptoze može regulirati nekrosomskom aktivnošću.

Image

Sastav RIPK1-RIPK3 odvija se ispred aktivacije Akt / mTOR i stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) nakon TNF α / zVAD tretmana. Interakcija između RIPK1-RIPK3 ( a ) i RIPK1-Akt ( b ) otkrivena je imunoprecipitacijom (IP) i western blot analizom. ( c ) RIPK1-p-Akt-473 interakcija (strelica) je također otkrivena u 2 sata nakon TNF / ZVAD (TZ) tretmana. Detekcija p-Akt-473 ukinuta je prethodnom obradom s nekrostatinom-1 (TZN, 30 uM). Kontrolni eksperimenti pokazali su prisustvo RIPK1 u imunoprecipitantima iz svih skupina, osim onih imunoprecipitiranih s nebitnim IgG. DMSO, kontrola dimetilsulfoksida. Podaci su reprezentativni za tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Rasprava

Mehanizmi rasvjetljavanja neuronske nekroptoze važno su područje istraživanja s obzirom na sve veći broj izvještaja koji sugeriraju njegovu uključenost u akutnu ozljedu središnjeg živčanog sustava, uključujući ishemiju / reperfuziju, traumu i intracerebralno krvarenje. 2, 3, 25, 26 Unatoč značajnom istraživačkom naporu za karakterizaciju molekularne mehanizacije nekroptoze, malo se zna o komponentama nekroptoze koja signalizira nizvodno od sklopa nekrozoma, a gotovo ništa se ne zna o regulaciji nekroptoze u neuronskim stanicama. 8, 9, 10 Nekroptoza u stanicama HT22 pokazala je sva stanična i biokemijska obilježja nekroze zabilježene u ne-neuronskim ćelijama, uključujući sastavljanje nekropoznog kompleksa RIPK1-RIPK3, stvaranje ROS, osjetljivost na Jun-N-kinazu (JNK) i ROS inhibitori, 2, 23, 27, 28 gubitak potencijala mitohondrijske membrane i iscrpljivanje adenosin trifosfata, te karakteristična ultrastrukturna obilježja. 2, 15, 16, 17 Zaštita specifičnim inhibitorom RIPK1 7-Cl-O-nekrostatin-1 i padom RIPK3 potvrdili su smrt nekroptotskih stanica u ovom modelu sustava.

Ranije smo izvijestili da farmakološka inhibicija Akt i mTOR smanjuje ranu staničnu smrt CA1 i CA3 nakon CCI kod miševa, sugerirajući novu ulogu Akt i mTOR u patogenezi traumatične smrti moždanih stanica. 11 Ova su me opažanja potaknula da istražimo ulogu Akt i mTOR u signalizaciji nekroptoze u stanicama neurona. Otkrili smo da primjena TNF a / zVAD (ali ne samo TNF α ili zVAD) inducira brzu i trajnu fosforilaciju Akt na Thr-308 i Ser-473 i mTOR, kao i fosforilaciju izravnih supstrata Akt (GSK-3 β , klasa O vilheadhead klasa O (FOXO) -1) i mTOR (ribosomalni protein S6 (S6)). Sve ove događaje fosforilacije inhibirao je nekrostatin-1, snažni i visoko specifični RIPK1 inhibitor. 12 IP pokusa pokazalo je da TNF / ZVAD uzrokuje interakciju RIPK1-Akt i RIPK1-pAkt-473. Tretman nekrostatinom-1 učinio je RIPK1-pAkt-473 interakciju neodredivom, što je u skladu s inhibicijom fosforilacije Akt od strane nekrosoma. Alternativno, nekrostatin-1 može spriječiti vezanje Akt na RIPKl. Prema našem saznanju, podaci su prvi koji pokazuju izravnu interakciju Akt-a s RIPK1 i omogućuju molekularnu vezu između skupa nekrosoma i Akt-aktivacije tijekom nekronoze neurona.

Inhibicija Akt / mTOR nije utjecala na interakciju RIPK1-RIPK3, ali je inhibirala proizvodnju ROS-a i staničnu smrt. Važno je da je genetska inhibicija Akt i mTOR zajedno smanjila staničnu smrt za veličinu sličnu onoj farmakoloških inhibitora, potvrđujući specifičnu ulogu za Akt i mTOR. Uzeti zajedno, podaci govore da Akt / mTOR posreduje nekroptoza signalizirajući nizvodno od sklopa nekrosoma i prije proizvodnje ROS-a i početka oštećenja plazmalemme. Promatranje da je za maksimalnu zaštitu potrebna istodobna inhibicija Akt i mTOR zajedno podsjeća na naša otkrića u CCI modelu i sugerira različite uloge Akt i mTOR u nekroptotskoj signalizaciji u neuronskim stanicama. Suprotno tome, aktivacija Akt nije uključena u apoptozu HT22 stanica liječenih TNF-om i CHX-om (Slika 4e).

U trenutnoj studiji, antagonizam Akt i mTOR zajedno bio je potreban da bi se maksimalno inhibirala nekroptoza u HT22 stanicama. Ti su nalazi u skladu s našom prethodnom in vivo studijom u kojoj su Akt i mTOR inhibitori zajedno trebali smanjiti nekrotičnu staničnu smrt i poboljšati postinjurijsku kognitivnu funkciju nakon cerebralne kontuzije kod miševa. 11 Dakle, regulacija nekroptoze od strane Akt i mTOR zajedno može biti jedinstveno svojstvo neuronskih stanica ili može ovisiti o točnom podražaju koji se koristi za pokretanje nekroptoze. Akt se aktivira i bitan je za nekroptozu u mišjim L929 fibroblastima stimuliranim TNF-om α ili zVAD-om, ali ne i za nekroptozu proteina povezanog s Fas-om, sa limfatima Jurkat T-a s nedostatkom domene smrti tretiranim TNF-om α . 23 U mišjim fibroblastima i makrofagovima pluća Akt je pokazao kontrolu nad proizvodnjom TNF α povezane s nekroptozom, ali nije imao ulogu u staničnoj smrti. 23 Dakle, Akt aktivacija posreduje nekroptozu kod nekih, ali ne svih tipova nevronskih stanica, i kao takva nije jednoznačno definirajuća značajka nekroptoze. Ovu ideju podržavaju podaci koji pokazuju djelomičnu ili potpunu inhibiciju stanične smrti različitim antioksidansima i inhibitorima enzima oksidativnog stresa (Slika 3c). Akt se aktivira tijekom nekroptoze u Jurkat stanicama, ali ne dolazi do proizvodnje ROS-a, a inhibitori Akt blokiraju proizvodnju TNF-a, ali ne i staničnu smrt u ovoj liniji. 2, 23 Dakle, ne postoji jednostavan odnos između aktivacije Akt / mTOR, produkcije ROS-a i nekroptoze u svim tipovima stanica.

IP studije provedene u ovom dokumentu sugeriraju da će fosforilacija Akt biti potrebna za njegovo uključivanje u nekrokomski kompleks, jer je liječenje nekrostatinom-1 ukinulo otkrivanje interakcije fosfo-Akt-473-RIPK1. Ovi nalazi sugeriraju da bi Akt fosforilacija mogla regulirati nekroptozu na razini nekrosoma. U slučaju L929 stanica, Akt Ser-473 nije bio povećan niti je bio uključen u staničnu smrt; međutim, potrebna je lokalizacija plazmelemme i selektivna fosforilacija Akt Thr-308 za povezivanje RIPK1 s signalizacijom JNK nizvodno, autokrino TNF α proizvodnjom i smrću. 23 Iako točan mehanizam fosforilacije Thr-308 ostaje nepoznat, inhibicija fosfataze 2A (fosfataze koja defosforilira Thr-308; 45 MnA) nije imala učinka. 23 In vitro , rekombinantni RIPKl može fosforitirati Akt na Thr146, 195/197, 435 i Ser381, ali je li Akt endogeni supstrat RIPK1 nije jasno. 23 Potrebne su daljnje studije kako bi se bolje razumjelo kako se Akt regulira fosforilacijom tijekom nekroptoze.

Prevladavajuća mudrost daje prospervivalnu ulogu Akt-u u paradigmi ozljede CNS-a, uključujući moždani udar i traumatične ozljede mozga. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 Antiapoptotsko djelovanje Akt-a dobro je dokumentirano, kroz brojne mehanizme, uključujući inhibiciju kaspaze 9, Bad i GSK-3 β i indukcija mitohondrijske hekokinaze i ekspresija antiapoptotskog gena ovisnog o nuklearnom faktoru kappa B. 41, 42, 43 Unatoč tome, nekoliko nedavnih izvještaja ilustriraju nastajanje uloge za Akt kao "kinazu smrti" i ključni regulator programirane nekroze, uključujući vrste neuronskih stanica, 44, ovisno o kontekstu ozljede. Aktivacija fosfatidilinozitol 3 kinaze / Akt povezana je sa smrti citotoksične ćelije 45, 46, 47, 48, a nuklearna translokacija Akt izvješćuje da će kemoterapijska sredstva senzibilizirati stanice karcinoma do smrti. 49, 50 Akt inhibitori također štite uzgojene neurone od fotodinamičke nekroze. 44 Podaci iz trenutne studije postavljaju pitanje koji bi Akt / mTOR supstrati mogli biti kritični regulatori nekroptoze u neuronskim stanicama. Naši podaci sugeriraju moguću ulogu regulacije ovisne o mTOR kompleks1, kako su ranije izvijestili McNamara i sur. , 23 kao i Akt podloge FOXO1, GSK-3 β i drugi. Iako su potrebne daljnje studije za utvrđivanje specifičnih medijatora nizvodno od Akt i mTOR, uzevši zajedno sadašnje podatke i naše prethodno izvješće 11 sugeriraju da Akt može promicati nekrozu tipova neuronskih stanica nakon akutne ozljede CNS-a.

Kako Akt može promicati nekrotičnu smrt? Iako je ograničena aktivacija Akt antiapoptotična, kontinuirana aktivnost Akt može pospješiti staničnu smrt pomoću nekoliko različitih mehanizama. Snažna aktivacija Akt povećava potrošnju kisika povećanjem glikolize i oksidativne fosforilacije, što rezultira stvaranjem ROS-a i oksidacijskim stresom. 24, 42 Održana Akt aktivacija također inducira fosforilaciju faktora transkripcije podklase O (FOXO) prednjeg dijela, potrebnog za povećanje regulacije antioksidacijskih obrana kao što je mangan superoksid dismutaza, katalaza i sestrin-3. 51, 52 Fosforilirani faktori transkripcije FOXO vežu se na 14-3-3 proteina i isključuju se iz jezgre, čineći na taj način transkripcijsko neaktivnim, 53 a trajna fosforilacija potiče njihovu proteosomalnu razgradnju. 54, 55 Naše otkriće da inhibicija Akt / mTOR snažno inhibira fosforilaciju FOXO1, smanjuje stvaranje ROS-a i inhibira smrt u HT22 stanicama stimuliranim na nekroptozu sugerira da Akt / mTOR aktivacija može povećati smrtonosni oksidativni stres nakon akutne ozljede neuronskih stanica. Konačno, trajna Akt aktivacija može konstitutivno aktivirati ciklin-ovisnu kinazu 2 što vodi njenoj citoplazmatskoj sekvestraciji, zaustavljanju staničnog ciklusa na G2-M i indukciji stanične smrti. 56, 57 Buduće studije usmjerene na utvrđivanje točnih mehanizama nekroptoze uzrokovane Akt / mTOR jamče se jer Akt i mTOR ne mogu biti optimalni terapijski ciljevi za neuroprotekciju zbog proteanskih funkcija u stanicama.

Ovdje pokazujemo da Akt i mTOR zajedno čine ∼ 50% stanične smrti u uvjetima korištenim u testovima nekroptoze. Ostali mehanizmi koji obuhvaćaju ostatak nekroptotske ćelijske smrti ostaje da se otkriju. JNK inhibitor smanjio je nekroptozu u HT22 stanicama za ∼ 50%; međutim, nismo primijetili aditivni učinak inhibitora Akt / mTOR / JNK i nije bilo utjecaja inhibicije izvanstanično regulirane kinaze ili P38 mitogen-aktivirane proteinske kinaze (MAPK), što je u skladu sa sličnom nedostatkom uloge ovih MAPK u nekroptozi ne-neuronske vrste stanica. 23, 28 Zanimljivo je da smo ranije izvijestili da intracerebroventrikularna primjena nekrostatina-1 smanjuje smrt nekrotičnih stanica u dentati gyrus i korteksu nakon CCI kod miševa. 3 Međutim, ove regije mozga nisu bile zaštićene inhibitorima Akt / mTOR u našoj sljedećoj studiji, 11 u skladu s nalazima trenutne studije da je nekrostatin-1 u potpunosti, a inhibitori Akt / mTOR samo djelomično zaštitni od nekrotične stanične smrti u stanicama HT22.

Zaključno, prvi put pokazujemo ulogu Akt / mTOR signalizacije koja upravlja nekroptozom u stanici neuronske stanice. Podaci su u skladu s potrebom za dvostrukom inhibicijom Akt i mTOR radi smanjivanja traumatične smrti moždanih stanica in vivo . 11 Razjašnjenje dodatnih mehanizama signalizacije nekroptoze nizvodno od sklopa nekrosoma bit će važno da se u potpunosti shvati kako je nekroptoza regulirana u stanicama neurona. Takve informacije vjerojatno će donijeti nove terapijske ciljeve za smanjenje smrtnosti stanica i poboljšanje funkcionalnog ishoda nakon moždanog udara, traumatične ozljede mozga i drugih oblika akutne ozljede CNS-a.

Glosar

mTOR

mehanička meta rapamicina

TNF

faktor nekroze tumora

GSK

kinaza glikogen sintaza

S6

S6 ribosomalni protein

ROS

reaktivne vrste kisika

FLIP

Inhibitorni protein nalik interleukin-1-beta pretvorbenom (FLICE) nalik FADD

CCI

kontrolirani kortikalni udar

BHA

butilirani hidroksianizol

Dn-1

7-Cl-O-metil-1-necrostatin

LOX-1

LOXBlock-1

Bai

baicalein

HMGB1

visoko-pokretna kutija protein-1 protein

CHX

cyclohexamide

JU

propidijev jodid

siRNK

mala inhibicijska ribonukleinska kiselina

EDTA

etilendiamintetraoctena kiselina

IP

imunoprecipitaciju

JNK

Jun-N-kinaze

FOXO

Razdjelna kutija klasa O

MAPK

mitogen-aktivirana protein kinaza