Izmjena sastava lanca sfingolipidnog acil sprječava jetreni neuspjeh uzrokovan lps / gln miševima poremećajem internalizacije tnfr1 | stanična smrt i bolest

Izmjena sastava lanca sfingolipidnog acil sprječava jetreni neuspjeh uzrokovan lps / gln miševima poremećajem internalizacije tnfr1 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Bolesti jetre

Sažetak

Učešće ceramida u apoptozi posredovanoj receptorima smrti ispitivano je širokom većinom studija usredotočenih na ulogu ceramida nastalog hidrofizom sfingomijelinom. Sada analiziramo učinak duljine lanca ceramidnog acila proučavanjem apoptoze faktora tumorske nekroze α receptora-1 (TNFR1) u nultog miša ceramid sintaze 2 (CerS2), koji ne može sintetizirati ceramide vrlo dugog acil lanca. Nulta miševi CerS2 bili su rezistentni na lipopolisaharid / galaktoza posredovani lipopolisaharidom / galaktenom, iako nije utjecalo na lučenje TNFa iz makrofaga. Kultivirani hepatociti također nisu bili osjetljivi na apoptozu posredovanu TNF-om α . Pored toga, u jetri i u hepatocitima aktivnosti kaspaze nisu povišene, što je u skladu s inhibicijom pro-apoptotičke signalizacije TNFR1. Suprotno tome, aktivacija Fas receptora rezultirala je smrću CerS2 nula miševa. Aktivacija kaspaze blokirana je zbog nemogućnosti nula miševa CerS2 da internaliziraju TNFR1; dok je Fc-TNF a internaliziran u perinuklearno područje u hepatocitima divljih miševa, kod CerS2 nula miševa nije otkrivena internalizacija. Naši rezultati pokazuju da promjena sastava sfingolipida acilnog lanca inhibira internalizaciju TNFR1 i inhibira selektivnu pro-apoptotsku signalizaciju nizvodno za apoptozu.

Glavni

Uloga faktora α receptora faktora nekroze tumora-1 (TNFR1) u apoptozi široko je proučavana. 1, 2 Angažiranje TNFR1 rezultira regrutacijom proteina TNFR1 kompleksa I proteina faktora nekroze tumora α povezanog putem domene smrti (TRADD), proteina koji utječe na faktor nekroze tumora α proteina (RIP1), faktora 2 nekroze tumora α, faktora 2 povezanog s receptorima ( TRAF2), IAP i cFLIP, što rezultira K63-ubikvitinacijom RIP1 i aktiviranjem NF κ B puta preživljavanja. TNFR1 je internaliziran, što dovodi do K48-sveprisutnosti i degradacije RIP1 i TRAF2, prestanka signala za preživljavanje, 3 i aktiviranja pro-apoptotičke signalizacije TNFR1 regrutovanjem FADD-a i kaspaze 8 kako bi se formirao „signalni kompleks koji izaziva smrt“ ili kompleks II kod unutarćelijskih TNF-receptosoma. 4, 5, 6, 7 Internalizirani receptosomi koji sadrže TNFR1 spajaju se s trans-Golgijevim vezikulama, tvoreći višejezične organele, s naknadnom aktivacijom lizosomalnih enzima, uključujući kiselinsku sfingomijelinazu (aSMase) i pro-apoptotsku proteazu, katepsin D. 4, 7, 8

Ceramid, okosnica svih složenih sfingolipida (SL), moćan je apoptotski posrednik koji regulira i unutarnje i vanjske apoptotičke okidače i uključen je u put signalizacije faktora nekroze tumora α (TNF- α ). 9, 10, 11 Prikupljeni su značajni dokazi o ulozi aSMase i neutralne (nSMase) sfingomijelinaze u signalizaciji TNFR1. Dakle, inhibicija TNFR1-posredovane aktivacije aSMase umanjuje apoptotski odgovor, 12 miševa s manjkom aSMase (ASM - / - ) su visoko otporni na apoptozu posredovanu TNFR1, a 13 i aktiviranje TNFR1 uzrokuje nagomilavanje dugih (C16-C20) i vrlo dugi (C22-C24) acilni lanac (VLC) ceramidi u hepatocitima, 14 što pokazuje ključnu ulogu za SM-bogate membranske domene u TNFR1 kompleksnom signalu I. 3

Znatno je manje poznato o ulozi de novo sintetiziranih ceramida u apoptozi posredovanoj TNFR1. Nedavno smo stvorili miša koji ne sadrži VLC-ceramide i VLC-sfingolipide (SL) zbog ablacije ceramid sintaze 2 (CerS2), 15, 16, enzima odgovornog za dodavanje vrlo dugačkih acilnih lanaca u sfingoid dugi lanac baza. 17, 18 nula miševa CerS2 pokazuju povećane stope smrti i proliferacije hepatocita, što rezultira stvaranjem više jetrenih čvorova i hepatocelularnog karcinoma. 16 Uz to, nula miševa CerS2 pokazuju kronični oksidativni stres, 19 kao i jetrenu rezistenciju na inzulin. 20 Nadalje, miševi pokazuju velike promjene u membranskim biofizičkim svojstvima. 21

U trenutnoj studiji ispitujemo ulogu VLC-ceramida u apoptozi posredovanoj TNFR1 i pokazujemo da su nula miševi CerS2 potpuno otporni na fulminantnu jetrenu zatajenje (FHF) zbog inhibicije signalizacije TNFR1 kompleksa II. Naši rezultati sugeriraju kritičnu ulogu za VLC-SL-ove nizvodno do signalizacije s TNFR1 složenim I i uzvodno do signalizacije s TNFR1 složenim II.

Rezultati

Nulta miševi CerS2 otporni su na FHF

Koristili smo model FHF koji uključuje injekciju lipopolisaharida (LPS) / D - (+) - galaktozamin hidroklorida (GLN). 22 Nakon ubrizgavanja jedne doze LPS / GLN, 90% divljih vrsta (WT) miševa umrlo je unutar otprilike 6–8 h nakon injekcije, ali CerS2 nula miševi bili su u potpunosti otporni (Slika 1a). Masivno parenhimsko oštećenje povezano s nekrozom tkiva i krvarenjem primijećeno je kod WT miševa, ali je potpuno odsutno kod nula miševa CerS2 (slika 1b), u skladu s nedostatkom jetrenih jetrenih enzima AST i ALT u serumu nula miševa CerS2 (Slika 1c). Otpornost na FHF nije nastala zbog smanjene sekrecije TNF α iz makrofaga, jer je TNF α dostigao slične razine i u WT i CerS2 nula miševima 90 min nakon ubrizgavanja LPS / GLN i ostao viši kod CerS2 nula miševa 4 sata nakon (Slika 1d).

Image

Nulta miševi CerS2 otporni su na fulminantno zatajenje jetre. ( a ) Krivulja preživljavanja nultih miševa WT i CerS2 nakon injekcije s 15 μg / kg LPS i 800 mg / kg GLN. n = 14 za WT, n = 7 za nula miševa CerS2. ( b ) bojenje H&E 6 h nakon ubrizgavanja LPS / GLN. Linija mjerila = 100 μ m. ( c ) Razine ALT i AST u serumu 6 h nakon ubrizgavanja LPS / GLN. n = 3, * P <0, 005; ** P <0, 0005. ( d ) razine TNF- a u serumu nakon injekcije LPS / GLN. n = 3, * P <0, 05

Slika pune veličine

Inhibicija TNFRl-posredovane aktivacije kaspaze u CerS2 nula miševima

Za ispitivanje učinka TNFa u hepatocitima nulta miševa WT i CerS2, uzgajani hepatociti inkubirani su s TNF a i aktinomicinom D (ActD). 23 WT hepatociti su umrli 10-12 sati nakon liječenja, ali hepatociti izolirani iz CerS2 nula miševa bili su rezistentni (Slika 2a). Nakon vezanja za TNF α , TNFR1 trimerizira i aktivira TNFR1 kompleks I, koji potom aktivira NF κ B put preživljavanja. 3, 5 Nakon toga, TNFR1 internalizacija rezultira regrutacijom FADD-a i kaspaze-8 uzrokujući aktiviranje apoptotičkog signala preko kompleksa II vezanog na TNFR1.

Image

Aktivacija TNFR1 složene signalizacije ali ne i složene II signalizacije u uzgojenim hepatocitima iz CerS2 nula miševa. Kultivirani hepatociti iz nultih miševa WT i CerS2 tretirani su TNF a (100 ng / ml) i ActD (500 ng / ml) naznačena vremena. ( a ) Ploče s lijeve strane pokazuju reprezentativne kontrastne faze hepatocita faze 12 sati nakon tretmana (ljestvica ljestvice = 100 µm), a desna ploča pokazuje stupanj smrti stanice (mjereno otpuštanjem LDH). n = 3, * P <0, 0005. ( b ) Na ploči s lijeve strane prikazana je fosforilacija IKK α / β i fosforilacija i razgradnja I κ B α . Sredstva ± SEM prikazana su na desnoj ploči, n = 3. GAPDH i p- aktin prikazani su kao kontrole opterećenja. ( c ) Rascjepljivanje pro-kaspaze 8 do njegovog aktivnog oblika 18 i I κ B α razgradnja. Rezultati su tipičnog eksperimenta ponovljenog tri puta. S lijeve su markere, a s desne strane su označeni proizvodi cijepanja. β -Aktin je prikazan kao kontrola opterećenja

Slika pune veličine

Hepatociti izolirani iz nultih miševa WT i CerS2 tretirani su TNF a / ActD što rezultira inhibitorom fosforilacije κ B (IKK α / β ) 5 min nakon tretmana, što je praćeno fosforilacijom i razgradnjom inhibitora κ B α ( I κ B α ) u sličnoj mjeri i u WT i CerS2 hepatocitima sa nultim miševima (Slika 2b). Iako su, hepatociti nula miševa CerS2 pokazali produženu IKK α / β fosforilaciju i sporiju razgradnju I κ B α , ovi rezultati pokazuju da se signalizacija TNFR1 kompleksa I aktivira kod CerS2 nula miševa u sličnoj mjeri kao u WT hepatocitima. Suprotno tome, aktivna cijepljena kaspaza 8 otkrivena je u WT, ali ne i u CerS2 nulti mišjim hepatocitima 8–10 sati nakon tretmana TNF α / ActD (slika 2c), pokazujući da su CerS2 nulti hepatociti vrlo otporni na TNF a / ActD posredovanu apoptozu, jer nedostatka aktivacije TNFR1 kompleksa II. Štoviše, razgradnja I κ B α pokazuje da ne postoji disfunkcija proteasoma (slika 2c).

TNFRl signalizacija je zatim ispitana na miševima tretiranim LPS / GLN analizom IKK α / β fosforilacije u jetrenim homogenatima. IKK α / β fosforiliran je u roku 30–60 min i u WT i CerS2 nula miševima i bio je praćen sličnim opsegom I κ B α fosforilacije i razgradnje u WT i CerS2 nula miševima (Slika 3a). Kao što se očekivalo, razina I κ B α smanjila se nakon ubrizgavanja LPS / GLN, ali iznenađujuće, povećala se 6 h nakon ubrizgavanja u CerS2 nula miševa (Slika 3a). Da bismo procijenili učinkovitost inhibicije transkripcije, procijenili smo razinu I κ B α mRNA prije i nakon LPS / GLN tretmana, u usporedbi s LPS tretmanom. Nije ustanovljeno povišenje razine I κ B α mRNA nakon ubrizgavanja LPS / GLN u usporedbi s WT i CerS2 nula miševima ubrizganim samo LPS (0, 8 ± 0, 045 za LPS / GLN nasuprot 4, 7 ± 0, 17 za LPS sam (WT) i 1, 3 ± 0, 1 nasuprot 3, 7 ± 0, 5 (CerS2 nula), n = 4) što sugerira da bi porast razine I κ B α u CerS2 nula miševa mogao biti posljedica njegovog porasta u ne-parenhimskim stanicama. Tome u prilog promatraju kultivirani hepatociti u kojima se razina I κ B α nije oporavila ni nakon dugog vremena inkubacije (10 h) s TNF α / ActD (slika 2c).

Image

TNFR1 kompleks I signalizacija kod nula miševa tretiranih LPS / GLN. WT ili CerS2 nulti miševi ubrizgavani su s 15 µg / kg LPS i 800 mg / kg GLN i različitim parametrima mjerenim u naznačenim vremenima. ( a ) Na ploči s lijeve strane prikazana je IKK α / β fosforilacija i I κ B α fosforilacija i razgradnja. Sredstva ± SEM prikazana su na desnoj ploči, n = 3, * P <0, 05. GAPDH je prikazan kao kontrola opterećenja. ( b ) Analiza zapadne mrlje kaspaza 8, 9 i 3 i njihovih produkata odvajanja 6 h nakon ubrizgavanja LPS / GLN. S lijeve su markere, a s desne strane su označeni proizvodi cijepanja. Rezultati su tipičnog pokusa ponovljenog pet puta, koji je dao slične rezultate. ( c ) Aktivnosti kasapa 8, 3/7 i 9. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD, n = 5, * P <0, 005; ** P <0, 0005

Slika pune veličine

Aktivna p18-kaspaza 8 otkrivena je 6 h nakon ubrizgavanja LPS / GLN u WT miševe zajedno s cijepanjem kaspaze 9 i kaspaze 3, ali je jedva uočena u CerS2 nulte mišje jetre (Slika 3b). Isto tako, aktivnosti kaspaze nisu povišene u CerS2 nulte mišje jetre (Slika 3c). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je pro-apoptotična signalizacija TNFR1 kompleksa II inhibirana u nula miševa CerS2 što rezultira ukidanjem apoptoze u ovom modelu FHF.

Za razliku od nesposobnosti LPS / GLN da inducira FHF, ubrizgavanje miševa s Fas agonističkim antitijelom Jo-2 rezultiralo je sličnim razinama smrti i u WT i CerS2 nula miševa (Slika 4a), što je bilo povezano s masivnim parenhimom oštećenja praćena krvarenjima i nekrozom tkiva (slika 4b) i cijepanjem kaspaze 8 (slika 4c). Ovi rezultati pokazuju specifičnu ulogu za VLC-SL u TNFR1, ali ne i za signalizaciju Fas receptora.

Image

Nulta miševi CerS2 nisu zaštićeni od hepatitisa posredovanog Fas-om. WT i CerS2 nultim miševima ubrizgavano je s 35 µg / kg Jo2 antitijela naznačeno vrijeme. ( a ) Krivulja preživljavanja nultih miševa WT i CerS2. n = 10 za WT i n = 12 za nulte miševe Cers2. ( b ) bojanje H&E 6–8 h nakon injekcije s Jo2 antitijelom. Linija mjerila = 100 μ m. ( c ) Rascjepljivanje pro-kaspaze 8 njegovom aktivnom p18 obliku 6 sati nakon injekcije. Rezultati su tipičnog eksperimenta ponovljenog četiri puta. S lijeve su markere, a s desne strane su označeni proizvodi cijepanja. GAPDH je prikazan kao kontrola opterećenja

Slika pune veličine

Manjak VLC-SL blokira internalizaciju TNFR1 u hepatocitima

Hepatociti su zatim inkubirani s humanim IgG1 Fc konjugiranim TNF a . Hepatociti se inkubiraju na 4 ° C s Fc-TNFa kako bi se omogućilo vezanje Fc-TNFa na TNFR1. Naknadno zagrijavanje na 37 ° C omogućilo je sinkroniziranu TNFR1 internalizaciju. Dok su značajne razine Fc-TNF α internalizirane u WT hepatocitima, u suštini nijedan Fc-TNF α nije internaliziran u hepatocite od nula miševa CerS2 (slika 5a), u kojima bi se obilježeno površinsko obilježavanje stanica moglo otkriti još 30 minuta nakon zagrijavanja do 37 ° C. Nedostatak internalizacije Fc-TNF α potvrđen je ispitivanjem razine RIP1 i TRAF2, a oba su značajno smanjena WT hepatocita u različitim periodima nakon inkubacije s TNF α , vjerojatno zbog degradacije, ali nisu promijenjena u hepatocitima od nula miševa CerS2 (Slike 5b i c). To je u skladu sa studijama koje pokazuju da inhibicija internalizacije TNFR1 blokira RIP1 i TRAF2 razgradnju. 24 Slični rezultati dobiveni su kod LPS / GLN tretiranih miševa kod kojih bi se unutarćelijsko TNFR1 označavanje moglo jasno otkriti u WT, ali ne i u CerS2 nulte mišje jetre gdje je opaženo označavanje na staničnoj površini (Slika 6a). Slični rezultati dobiveni su nakon što su miševima ubrizgani konkanavilin A, koji izravno aktivira T stanice koje se infiltriraju u jetru, a kao rezultat toga izaziva lučenje citokina uključujući TNF α i aktiviranje TNFR1 na hepatocitima. TNFR1 je internaliziran u WT, ali ne i u CerS2 nulte mišje jetre (Slika 6b). Nisu primijećene promjene u TNFR1 mRNA (WT miš, 0.78 ± 0.53 proizvoljne jedinice; CerS2 nula, 1.2 ± 0.4, n = 5) ili razina proteina u membranama iz WT i CerS2 nulte mišje jetre (Slika 6c). Slično rezultatima u izoliranim hepatocitima, razine RIP1 i TRAF2 značajno su smanjene zbog aktivacije TNFR1 u WT, ali ne i u CerS2 nulte mišje jetre (Slika 6d). Razine RIP1 i TRAF2 značajno su povišene kod nula miševa CerS2 (dvostruko za RIP1 i četverostruko za TRAF2, slika 6d). To bi moglo dovesti do trajne aktivacije NF k B u netretiranim morskim miševima CerS2. Stoga smo analizirali razine mRNA kod mnogih gena nizvodno do NF κ B, a nijedan od njih nije povišen (razina mRNA u proizvoljnim jedinicama: Bcl XL : 1, 0 ± 0, 53 (WT), 0, 2 ± 0, 02 (CerS2 nula); XIAP: 1, 0 ± 0, 2 (WT), 0, 6 ± 0, 1 (CerS2 nula); cIAP2: 1 ± 0, 02 (WT), 0, 8 ± 0, 15 (CerS2 nula); A20: 1, 0 ± 0, 6 (WT), 1, 2 ± 0, 3 (CerS2 nula)). Razine cFLIP L smanjile su se nakon LPS / GLN tretmana u WT, ali ne i u CerS2 nula miševima (Slika 6e).

Image

Internalizacija TNFa je atenuirana u kultiviranim hepatocitima iz nula miševa CerS2. ( a ) Hepatociti izolirani iz WT i CerS2 nula miševa inkubirani su s Fc-TNF a 10 min na ledu i nakon toga se inkubirali na 37 ° C 15 i 30 min prije ispitivanja konfokalnom mikroskopijom. Plava označava DAPI, a crvena Fc-TNF α . Rezultati su tipičnog pokusa ponovljenog pet puta, koji je dao slične rezultate. Linija mjerila = 20 μ m. ( b ) analiza Western blot-a koja pokazuje razine RIP1 i TRAF2 u kultiviranim hepatocitima u različito vrijeme nakon tretmana TNF-om α (100 ng / ml) i aktinomicinom D (500 ng / ml). GAPDH je prikazan kao kontrola opterećenja. Rezultati su tipičnog eksperimenta ponovljenog tri puta, koji je dao slične rezultate. ( c, d ) Kvantifikacija razine RIP1 ( c ) i TRAF2 ( d ) prije ( crni stupci ) i 40 min nakon ( otvoreni stupci ) TNF a / aktinomicin D tretman; podaci su prikazani kao promjena puta RIP1 i TRAF razina normaliziranih na GAPDH. n = 3, * P <0, 005

Slika pune veličine

Image

Internalizacija TNFR1 inhibira se u CerS2 nula mišje jetre. ( a ) WT i CerS2 nula miševima ubrizgavano je 15 μg / kg LPS i 800 mg / kg GLN-a za navedena vremena. Nakon izolacije jetre utvrđena je lokalizacija TNFR1 konfokalnom mikroskopijom. Plava boja označava DAPI, a crvena označava TNFR1, koji je u nekim slučajevima označen strelicama. Rezultati su tipičnog eksperimenta ponovljenog tri puta. Linija mjerila = 10 μ m. ( b ) WT i CerS2 nultim miševima ubrizgano je 25 mg / kg ConA u trajanju od 8 h i TNFRl lokalizacija određena konfokalnom mikroskopijom. Strelice označavaju internalizirani TNFR1. Rezultati su tipičnog eksperimenta ponovljenog tri puta. Linija mjerila = 20 μ m. ( c ) Western blot analiza TNFR1 u membrani ( mem ) i citosolnim frakcijama (cit) iz CerS2 null i WT jetre. Rezultati su tipičnog eksperimenta ponovljenog pet puta. Na + / K + ATP-aza korištena je kao kontrola opterećenja za frakcije membrane, * nespecifični pojas. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja za frakcije citoplazme. ( d ) Razine RIP1 ( lijeva ) i TRAF2 ( desna ) 6 h nakon ubrizgavanja LPS / GLN. Gornji paneli pokazuju tipične zapadne mrlje, a donji kvantifikacija ploča za RIP1 ( n = 8) i za TRAF2 ( n = 6) normalizirana na GAPDH. * P <0, 05. ( e ) razine cFLIP L 6 h nakon ubrizgavanja LPS / GLN. Gornji paneli pokazuju tipične zapadne mrlje, a kvantifikacija donjih ploča normalizirano na GAPDH. n = 6, * P <0, 05. Za ploče d i e, crne trake označavaju neobrađene i otvorene miševe tretirane

Slika pune veličine

Konačno, analizirali smo razinu aktivnosti aSMase nakon ubrizgavanja LPS / GLN, budući da internalizirani TNFR1 formira receptosome koji se spajaju s trans-Golgijevim vezikulama, što rezultira aktiviranjem aSMase. 7, 25 aSMase aktivnost se prolazno aktivirala u WT, ali ne i u CerS2 nula miševima (Slika 7), u skladu s nedostatkom TNFR1 internalizacije.

Image

Nedostatak aktiviranja ASMase u jetri mišjeg nula kod CerS2. WT i CerS2 nulta miša injicirani su s 15 μg / kg LPS i 800 mg / kg GLN i izmjerenom aSMase aktivnošću. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD n = 3, * P <0, 05

Slika pune veličine

Rasprava

Glavni nalaz trenutne studije je da sastav SL-a acilnog lanca ima presudnu ulogu u regulaciji internalizacije TNFR1 i naknadne signalizacije za apoptozu u hepatocitima. CerS2 nula mišje jetre ne sadrži VLC-SL, već sadrži povišenu razinu SL dugog lanca (C16). 15 Kao rezultat tih promjena uočene su značajne promjene u biofizičkim svojstvima membrane jetre, 21 kao što su promijenjena fluidnost membrane i morfološke promjene. Važno je i to da se promijeni lokalizacija receptora plazma membrane na membranama otpornim na deterdžente. Na primjer, translokacija inzulinskog receptora u membrane rezistentnih na deterdžente i njegova naknadna fosforilacija ukidaju se u CerS2 nulte mišje jetre, što rezultira jetrenom rezistencijom na inzulin. 20 Sadašnja studija o inhibiciji pro-apoptotičke signalizacije TNFR1 daljnji je primjer kako promjena sastava lanca SL-acila utječe na funkciju membranskih receptora, no čini se da je u ovom slučaju inhibicija internalizacije receptora posljedica modulacije klatrina posredovane put 6, 25, 26, a ne put lipiran lipidnim splavom. 20 Suprotno tome, signalizacija s TNFR1 složenim I ovisi o splavu 3, ali nije promijenjena u nula miša CerS2, što sugerira da promjena odnosa između VLC- i LC-ceramida posebno utječe na internalizaciju TNFR1, ali ne i na njegovu trimerizaciju. Međutim, aktiviranje TNFR1 povezano je s produljenom IKK α / β fosforilacijom i laganom zakašnjenjem razgradnje I κ B α , što bi moglo biti posljedica prigušenja internalizacije trimeriziranih receptora, što bi moglo biti od vitalnog značaja za prestanak puta preživljavanja NF κ B. 6

Mehanizam utjecaja internalizacije 5, 27 na klatrinu mijenjanjem omjera duljina lanca acilnog lanca nije poznat, mada se sugerira da stabilnost jama prekrivenih klatrinom ovisi o platformama ceramida. 9, 28, 29 Dakle, uključivanje LC-ceramida u džinovske unilamelarne vezikule rezultira spontanom zakrivljenošću membrane i stvaranjem tubula, 30 sfingomijelinaza izaziva spontano oticanje vektorske membrane 31, a ceramid aktivira egzozomsko punjenje i olakšava izlučivanje egzooma. 32 Nadalje, receptor B-stanične membrane, HM1.24, djeluje s α -adaptinom u lipidnim splavovima za internalizaciju putem klatrina. 33, 34 Zajedno, inhibicija internalizacije TNFR1 u nula miša CerS2 u skladu je s idejom da staze posredovane klatrinom, osim putevima posredovanim splavom, mogu regulirati i SL-ove, možda promjenom regrutovanja adapterskih proteina potrebnih za klatrin -obrazna formacija jama. 33 Suprotno tome, internalizacija Fas receptora nije potrebna u hepatocitima (stanice tipa II) kako bi se inducirala Fas-posredovana stanična smrt, pokazujući različite učinke promjene dužine acila lanca SL na različitim putovima posredovanim receptorima. 5

Pokazano je da stvaranje ceramida putem aSMase ili nSMase aktivacijom 35, 36, 37 posreduje apoptozu uzrokovanu stresom, uključujući i puteve ovisne o kaspazi i-ovisne. 38, 39, 40, 41 Nakon trimerizacije TNFR1 regrutuje nSMase na staničnoj membrani što rezultira hidrolizom SM i obogaćivanjem ceramida; 4, 5, 42, nakon toga, internalizirani TNFRl aktivira sintezu aSMase i de novo ceramida, uz istodobnu akumulaciju C16-ceramida. 13, 43 Iako CerS2 nulti miševi akumuliraju visoku razinu C16-ceramida, nakon liječenja LPS / GLN nije uočeno oštećenje jetre. To pokazuje da su apoptotički učinci C16-ceramida 14 niži od stvaranja VLC-ceramida, što je u skladu s tvrdnjom da je nedostatak toksičnosti posredovanu TNF-om u nula miševa CerS2 zbog promijenjenih svojstava membrane, što utječe na endocitozu TNFR1.

Važno je da je inhibicija TNFR1 internalizacije u nula miševa CerS2 spriječila aktiviranje kaspaza 8, 9 i 3, aSMase, stanične smrti hepatocita i hepatitisa. Ovi rezultati odražavaju prethodna zapažanja o kritičnoj ulozi TNFR1 internalizacije za regrutovanje signalno-kompleksnog proteina ili kompleksa II proteina, TRADD, FADD i kaspaze 8, kao i aSMase, te širenje apoptoze u različitim staničnim sustavima. 5, 25 Inhibicija internalizacije TNFR1 adenovirusnim E3-proteinom 14, 7K služi za mehanizam imunološkog bijega od adenovirusnih infekcija. 25

Internalizacija TNFR1 rezultirala je ukidanjem RIP1 i TRAF2 degradacijom u CerS2 nula miševima. Nedostatak degradacije RIP1 i TRAF2 nije bio posljedica promijenjene aktivnosti proteasoma. Neočekivano su u nula miševa CerS2 pronađene više bazne razine TRAF2 i RIP1, što može biti povezano sa smanjenom bazalnom razinom internalizacije TNFR1. Pokazalo se da je ubikvitin protein ligaza, CARP-2, koja je ubikvitin ligaza RIP1 nakon internalizacije TNFR1, djeluje kao konstitutivni negativni regulator aktiviranja NF κ B induciranog s TNF. 24 CARP-2 je lokaliziran u endocitnim vezikulama, gdje djeluje s internaliziranim receptorima TNF-a i, zajedno s A20, ubikvitin ligazom koja ubikvitinira i TRAF2 i RIP1, 44, 45, posreduje RIP1 ubikvitaciju i razgradnju. Iako su bazne razine RIP1 i TRAF2 više u nula mišje jetre CerS2, geni nizvodno do NF κ B, kao što su A20, cIAP2, xIAP, BCL XL i I κ B α, nisu povišeni kod nula miševa CerS2, što ukazuje da povišena razina RIP1 i TRAF2 ne doprinosi nedostatku osjetljivosti na FHF.

Ukratko, ovo istraživanje ukazuje na važnost VLC-SL u signalizaciji TNFR1 u hepatocitima. Ablacija VLC-SL rezultirala je potpunom inhibicijom signalizacije TNFR1 kompleksa II zbog neispravne internalizacije TNFR1. Kako različita tkiva sadrže različite razine SL-ova s ​​različitom dužinom lanca, 46 naši podaci sugeriraju novo sredstvo za reguliranje internalizacije TNFR1, što može biti od značaja za razumijevanje zašto neki karcinomi pokazuju visoku otpornost na apoptozu posredovanu TNF- a . 47, 48, 49

Materijali i metode

Antitijela i reagensi

Antitijela su kupljena iz sljedećih izvora: anti-fosfo-IKK α / β , antifosfo I κ B α , anti-total I κ B α , anti-cijepljena kaspaza 3, anti-kaspaza 9, anti-RIP, anti- TRAF2 i anti-FLIP (Cell Signaling, Boston, MA, SAD); anti-kaspaza 8 (Alexis, Shoham, Izrael); anti-TNFR1 (Abcam, Cambridge, Velika Britanija); agonistično anti-Fas antitijelo protiv Jo-2 (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD); antitijelo protiv Na + / K + ATPaze (Hybridoma 6H) poklon je profesora Haima Gartyja (Institut Weizmann, Rehovot, Izrael). 50 LPS, konkanavalin A i D - (+) - galaktozamin hidroklorid bili su iz tvrtke Sigma-Aldrich (St Louis, MO, SAD).

životinje

Generirani su CerS2 nulti miševi i održavani su kako je opisano. 15 Miševi su tretirani u skladu sa smjernicama za brigu o životinjama pri Weizmannovom odboru za brigu o životinjama i Nacionalnim institutima za zdravstvo životinja.

Indukcija FHF

Miševima (u dobi od 10 do 12 tjedana) se ubrizgavalo intraperitonealno sa 15 µg / kg LPS i 800 mg / kg GLN, ili intravenski, s 25 mg / kg konkanavalina A, ili s 35 µg / kg anti-Jo-2 agonista antitijelo Fas. Odjeljci jetrenog tkiva prikupljeni su za histološki pregled ili su flash zamrznuti. Krv je prikupljena putem orbitalnog sinusa i seruma ALT i AST razine analizirani su korištenjem sustava Spotchem Strips (Arkary, Edina, MN, SAD). Razine citokina u serumu mjerene su korištenjem anti-mišjeg ELISA kompleta (BioLegend, San Diego, CA, SAD). Aktivnost kaspaze mjerena je korištenjem kompleta aktivnosti kaspaza-Glo 3/7, kaspaza-Glo 8 i kaspaza-Glo 9 (Promega, Madison, WI, SAD), a aktivnost aSMase izmjerena je kako je opisano, 15, 51 uz neke modifikacije. Ukratko, homogenati jetre koji sadrže 40 μg proteina inkubirani su u konačnom volumenu od 500 µl natrijevog acetatnog pufera (50 mM natrijevog acetata pH 4, 5). Reakcije su započete dodatkom 4 µMC6 -NBD-sfingomijelina i inkubirane u mraku na 37 ° C 15 min. Reakcije su završene dodavanjem tri volumena kloroform / metanol (1: 2; v / v). Lipidi su ekstrahirani i razdvojeni tankoslojnom kromatografijom koristeći kloroform / metanol / 9, 8 mM vodeni CaCl2 (60: 35: 8; v / v / v) kao otapalo u razvoju. NBD-označeni SL-ovi identificirani su korištenjem autentičnih standarda pomoću Fluor-S Max uređaja (BioRad, Hercules, CA, SAD) i kvantificirani korištenjem programa Image Quant (BioRad).

Western blotting

Stanični ili tkivni lizati pripremljeni su u puferu za ispitivanje radioimunoprecipitacije (50 mM Tris HCl pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1% nonideta P-40, 0, 5% natrijevog deoksiholata, 0, 1% SDS) koji sadrži 50 mM NaF, 2 mM Na3 VO 4, inhibitore proteaze i fosfataze (Sigma). Koncentracija proteina izmjerena je korištenjem BCA Kit za ispitivanje proteina (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, SAD). Pedeset μg proteina naneseno je i razdvojeno na 8–15% SDS-PAGE i preneseno u nitroceluloznu ili PVDF membranu. Membrana je blokirana pomoću 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) u fiziološkoj otopini puferiranoj s fosfatima koja je sadržavala 0, 1% Tween-20 (PBST) 1 sat na sobnoj temperaturi. Primarno antitijelo je razrijeđeno u PBST koji sadrži 1% BSA i inkubirano s membranom na 4 ° C preko noći. Nakon tri ispiranja s PBST-om, membrane se inkubiraju sa sekundarnim antitijelom u PBST koji sadrži 1% BSA na sobnoj temperaturi 1 sat.

Izolacija hepatocita

Hepatociti su izolirani od miševa nakon perfuzije jetrene portalne vene toplom Ca ++ - i Mg ++ - Hank-ovom uravnoteženom otopinom soli (Sigma-Aldrich) koja je sadržavala 5, 5 mM KCl, 5, 5 mM glukoze, 25 mM NaHCO 3, 0, 7 mM EDTA za 3 min, i jetre za probavu u mediju (GIBCO / BRL Life Technologies, Grand Island, NY, SAD) 8 minuta. Nakon perfuzije, jetra se brzo izvadi i žučni mjehur ukloni. Hepatociti su odvojeni od vezivnog tkiva sterilnim pincetama, a zatim propušteni kroz staničnu cjedilo (BD Falcon Labware) i centrifugirani na 50 × g av (4 ° C, 5 min). Hepatociti su suspendirani u DMEM koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM natrijevog piruvata, 2% penicilina / streptomicina i 1 μM deksametazona.

Internalizacija Fc-TNF α

Fc-TNF kodirajući plazmid osigurao je H Wajant (Sveučilište Julius-Maximilians, Würzburg, Njemačka). Protein se prolazno eksprimira u stanicama HEK-a i pročisti iz supernatanta pomoću HiTrap Protein G stupaca (GE Healthcare, Little Chalfont, Velika Britanija). Hepatociti su uzgajani na 13 mm mm staklenim pokrivačima obloženim kolagenom i uzgajani preko noći. Stanice su tretirane s 5 μg / ml Fc-TNF a na ledu 15 minuta, a zatim dvaput isprane DMEM-om koji je sadržavao 1% BSA, 2 mM natrijevog piruvata, 2% penicilina / streptomicina i 0, 01 μM deksametazona za uklanjanje nevezanog Fc-TNF a i zatim je prebačen na 37 ° C. Da bi se zaustavio unos Fc-TNF a , stanice su isprane tri puta hladnim PBS-om i odmah fiksirane s 2% formaldehida. Fc-TNF α detektiran je korištenjem Cy3-konjugiranog anti-humanog IgG antitijela prije promatranja konfokalnom mikroskopijom.

Histološka analiza

Jetreni segmenti su fiksirani u 4% formaldehidu i ugrađeni u parafin za histološku analizu. Sekcije (5 μm) obojene su hematoksilinom / eozinom. Za imunohistokemiju TNFR1, presjeci su se inkubirali na 4 ° C preko noći s primarnim antitijelom, a nakon preuzimanja antigena inkubirali su s sekundarnim antitijelom 1 sat na sobnoj temperaturi prije suprotnog bojenja plavim emitivnim Hoechst 33342 bojom.

qPCR

Ukupna RNA izolirana je korištenjem mini kompleta Rneasy (Qiagen, Venlo, Nizozemska) u skladu s uputama proizvođača, koji su uključivali korak DNK i dodavanje p- merkaptoetanola. Sinteza cDNA izvedena je korištenjem Reverse-iT prvog lanca za sintezu (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) koristeći slučajne heksamere. cDNA proizvodi su pohranjeni na -20 ° C. qPCR izveden je korištenjem SYBR Green PCR master miksa (Finnzyme, Vantaa, Finska) i ABI Prism 7000 Sequence Deteence Sequence System (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) s cDNA (ekvivalentno 5 ng ukupne RNA). Korišteni su slijedeći temeljni premazi:

I κ B α : Naprijed: 5′-TTGGTCAGGTGAAGGGAGAGAC-3 ′; naličje: 5′-ACAGCCAAGTGGAGTGGAGT-3 ′.

TNFR1: Naprijed: 5 '-GCCCCACCTCCGGCTTCAAC-3'; naličje: 5 '-GTCAGGACGTTGCGGGTGGG-3'

A20: Naprijed: 5′-GGTGATGGAAACTGCCTCAT-3 ′; naličje: 5′-CTTCCTCAGGACCAGGTCAG

BCL XL : Naprijed: GCTGGGACACTTTTGTGGAT-3 '; naličje: 5 '-AACCACACCAGCCACAGTC-3'

cIAP2: Naprijed: 5′-CGAGGAGGAGGAGTCAGATG-3 ′; naličje: 5′-GGAGGCAATACAGCATTGGT-3 ′.

XIAP: Naprijed: 5′-TTGGAACATGGACATCCTCA-3 ′; naličje: 5′-TACCACTTCGCATGCTGTTC-3 ′.

Konfokalna mikroskopija

Konfokalna mikroskopija izvedena je korištenjem mikroskopa Olympus IX 81 Fluo-View 1000 i UPLSAPO × 60 cilja, a slike su obrađene i analizirane pomoću softvera FV-1000 (Olympus, Tokyo, Japan).

Statistička analiza

Vrijednosti su izražene kao srednje vrijednosti ± SEM Statistički značaj izračunat je Studentovim testom.

Glosar

SL

sfingolipid

SM

sfmgomijelma

VLC

vrlo dugačak acilni lanac

GLN

D - (+) - galaktozamin hidroklorid

aSMase

kiselina sfingomijelinaza

nSMase

neutralna sfingomijelinaza

TNFR1

faktor nekroze tumora α receptor 1

RIP1

Protein koji djeluje na receptor α faze nekroze

TRAF2

faktor 2 povezan s receptorima nekroze tumora

TRADD

putem domene smrti povezan s faktorom tumorske nekroze α -receptora

I κ B α

inhibitor κ B α

IKK α / β

inhibitor κ B kinaze

FHF

fulminantni zatajenje jetre

CerS2

ceramid sintaza 2

LPS

lipopolisaharid

WT

divlji tip

ActD

aktinomicin D

BSA

albumin od goveđeg seruma

PBST

fiziološka otopina puferirana fosfatima koja sadrži 0, 1% Tween-20