Automatizirani test za mikroskopsku fluorescenciju za otkrivanje mitotske katastrofe | stanična smrt i bolest

Automatizirani test za mikroskopsku fluorescenciju za otkrivanje mitotske katastrofe | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Mitoza
  • Proteini koji su supresori tumora
  • Fluorescentna mikroskopija širokog polja

Sažetak

Mitotska katastrofa može se definirati kao način ćelijske smrti koji se javlja tijekom ili nedugo nakon dugotrajne / aberantne mitoze i može pokazati apoptotičke ili nekrotične osobine. Međutim, konvencionalni postupci otkrivanja apoptoze ili nekroze, uključujući biokemijske masovne analize i citofluorometrijske tehnike, ne mogu razlikovati između pre-mitotičke, mitotičke i post-mitotičke smrti, pa su stoga neprikladni za nadgledanje mitotske katastrofe. Da bi se pozabavili ovim problemom, stvorili smo izogene stanice stanica humanog karcinoma debelog creva koje se razlikuju po ploidnom i p53 statusu, a istovremeno izražavaju slične količine fluorescentnih biosenzora koji omogućuju vizualizaciju kromatina (histon H2B uparen na zeleni fluorescentni protein (GFP)) i centrosome ( centrin spojen s crvenim fluorescentnim proteinom Discosoma striata (DsRed). Kombinacijom fluorescentne video-mikroskopije visoke rezolucije i automatizirane analize slike uspostavili smo protokole i postavke za istodobnu procjenu ploidnosti, mitoze, broja centrosoma i stanične smrti (što se u našem modelnom sustavu događa uglavnom apoptozom). Vremenska video mikroskopija pokazala je da se ovaj pristup može upotrijebiti za otkrivanje mitotske katastrofe visoke propusnosti izazvane od strane tri mehanički različita antititotička sredstva (dimetilenastron (DIMEN), nokodazol (NDZ) i paklitaxel (PTX)) i - u ovom kontekst - otkrila je važnu ulogu p53 u kontroli broja centrosoma.

Glavni

Deregulacija stanične smrti najvažnija je za patogenezu brojnih ljudskih bolesti. Stoga dubinska analiza stanične smrti i njenih mehanizama predstavlja glavni izazov za temeljna i primijenjena biomedicinska istraživanja, istovremeno kada uvjetuje i razvoj novih terapijskih intervencija. 1, 2, 3, 4 Programirana stanična smrt može biti posredovana različitim mehanizmima, uključujući apoptozu i nekrozu, a može biti povezana i s masivnom aktivacijom autofagije. 5, 6 Stotine metoda su dostupne za otkrivanje ovih pojava i njihovih biokemijskih korelata u staničnim ekstraktima, uzgojenim stanicama, izoliranim tkivima kao i u živim organizmima, od kojih su svaka obilježena specifičnim prednostima i zamkama. 7, 8, 9

Mitotska katastrofa izvorno je opisana kao "događaj nenormalne mitoze koja onemogućuje razmnožavanje stanica bez obzira na mehanizam ili vremenski raspored". Iako se takozvana 'odgođena radioinducirana smrt stanica', koja slično odražava post-mitotsku smrt, može nastupiti godinama nakon radioterapije u ljudskim tkivima, 11 moglo bi biti korisno identificirati mitotsku katastrofu na pragmatičniji način pozivajući se na specifična (i stoga istraživačka) kinetika. U skladu s tim, mitotička katastrofa definirana je kao događaj apoptotske ili nekrotične smrti stanica koji se događa tijekom ili nedugo nakon aberantne, često dugotrajne mitoze. 12, 13 Preciznije, mitotsku katastrofu treba promatrati kao proces koji može dovesti do niza različitih ishoda, ovisno o okidaču i staničnom kontekstu. 13, 14 U stvari, ne samo mitotička katastrofa sučeljava se sa staničnom smrću putem apoptoze, već i s nekrozom, staroskopom i održivom poliploidizacijom, bilo u razvojnim uvjetima, bilo kao odgovor na antikancerogene tretmane. 13, 15, 16, 17 Nadalje, nedavne publikacije ukazuju na sposobnost aneuploidnih stanica da prođu depoliploidizaciju multipolarnom podjelom, 18, 19 fenomen koji bi mogao dovesti do stvaranja matičnih stanica aneuploidnog karcinoma. 20

Mitotska katastrofa često uključuje apikalnu aktivaciju jedne određene kaspaze, kaspaze-2. 15 Međutim, kako se kaspaza-2 može aktivirati podražajima koji nisu povezani sa mitozom (npr. Oštećenje DNK, stres Golgijevog aparata i toplinski šok) 21, 22, 23, 24, a u nekim slučajevima mitotska katastrofa nastavlja se neovisno o kaspazi-2 mehanizmi, 13, 17, 25, samostalna procjena aktivnosti kaspaze-2 ne dopušta točnu identifikaciju ove potprograme smrti ćelije.

Mitotska katastrofa može biti posljedica endogenih uzroka. Na primjer, poliploidne stanice često sudjeluju u nenormalnoj mitozi zbog prisutnosti superbrojnih centrosoma, zaostalih kromosoma i / ili akumuliranih nepovrijeđenih lezija DNA. 26, 27 Većina stanica koje uđu u aberantnu mitozu konačno umiru, vjerojatno zbog mehanizama kontrolnih točaka kojima je cilj minimizirati rizik od genomske nestabilnosti. U skladu s ovom hipotezom, ranije smo pokazali da inhibicija mitotske katastrofe povećava sklonost stanica da uđu u multipolarne, asimetrične podjele što na kraju dovodi do aneuploidije. 12 Pored toga, mitotsku katastrofu mogu izazvati egzogeni uzročnici, uključujući ionizirajuće zračenje, 28 mikrotubula, otrovi 29 inhibitora mitotičkog kinezina Eg5 30, kao i farmakološkim / genetskim strategijama koje posebno ciljaju kinazu kontrolne točke Chk1. 31 Međutim, postotak stanica koje podležu mitotičkoj katastrofi nasuprot klasičnoj interfaznoj apoptozi kao odgovor na otrove mikrotubulama ovisi o staničnom kontekstu. 32 Natjecanje između molekularnih strojeva za aktivaciju kaspaze i regulatora obilja ciklina B1 (koji djeluje kao inhibitor mitotičkog proklizavanja) određuje hoće li stanice umrijeti tijekom interfaze ili će podleći mitotičkoj katastrofi. 32

Konvencionalne metode za otkrivanje stanične smrti ne mogu pratiti "povijest" stanične smrti s obzirom na mitozu. Apoptotički i nekrotični markeri, uključujući kondenzaciju kromatina, izloženost fosfatidilserinu, otpuštanje citokroma c iz mitohondrija i permeabilizaciju plazma membrane, mogu se pojaviti prije, za vrijeme ili nakon mitoze. 33, 34, 35 Pored toga, proizvodi krajnje faze apoptoze ili nekroze u stanicama koje su poslije mitotike i proliferacije ne razlikuju se. 7 Stoga nijedna metoda koja se rutinski koristi za otkrivanje stanične smrti nije primjenjiva za točno određivanje mitotske katastrofe. Trenutno se jedini pristup za procjenu mitotske katastrofe oslanja na kontinuirano promatranje stanica konvencionalnom mikroskopijom, što je mučno, dugotrajno i ovisi od operatora. Kako bi se zaobišao unutarnji problemi konvencionalnih mikroskopskih ispitivanja, potrebno je razviti automatizirane metode sa visokim sadržajem slike. 36, 37 Vođeni tim razmatranjima, odlučili smo implementirati automatizirani video-mikroskopski test za realno vrijeme, istodobno otkrivanje mitoze, ploidnih, nadzemnih centrosoma i stanične smrti koji se mogu koristiti za otkrivanje mitotske katastrofe sa velikim protokom.

Rezultati i rasprava

Automatsko otkrivanje mitotičkog zastoja

Divlje tipove (WT) i p53 deficitarne ( p53 - / - ) 38 stanica ljudskog karcinoma debelog crijeva HCT 116 stanica prethodno su napravljene za stabilnu ekspresiju histone H2B-zelene fluorescentne bjelančevine (H2B-GFP) himere, omogućavajući vizualizaciju kromatina i stoga za kontinuirano praćenje kretanja kromosoma. 16, 39 Da bismo istovremeno nadgledali ciklus centrosoma, dodatno smo transficirali ove stanice plazmidom koji kodira centrin, esencijalni sastojak centrosoma, stopljenih na C-kraj varijante crvene fluorescentne proteine ​​(DsRed-Centrin himera) Discosoma striata (Dopunska slika 2). Izabrani su stabilni klonovi koji izražavaju umjerene količine crvenog fluorescentnog proteina u strukturama sličnim točkama (uglavnom jedna jednostruka točka po stanici, što odgovara centrosomu ), a video-mikroskopija je upotrijebljena za potvrđivanje normalne replikacije DNK i ciklusa centrosoma (slika 1a). Prisutnost DsRed-Centrina nije utjecala na brzinu rasta WT i p53 - / - HCT 116 stanica (Slika 1b) niti na njihovu distribuciju staničnog ciklusa (Slika 1c). Nakon tetraploidizacije posredovane nocodazolom (NDZ) (dopunska slika 1) i odabira stabilnih WT i p53 - / - tetraploidnih klonova, 31, 39, ekspresija DsRed-Centrina ostala je konstantna i omogućila otkrivanje superbrojnih centrosoma (Slika 1d) za koje se zna da nastaju u p53 - / - tetraploidnim stanicama. 40

Image

Karakterizacija humanih stanica HCT 116 stanica raka debelog crijeva stabilno koeksprimira H2B-GFP i DsRed-Centrin. ( a ) Nadzirana je normalna progresija staničnog ciklusa divljih tipa (WT) diploidnih HCT 116 stanica dizajnirana za stabilnu koekspresiju H2B-GFP i DsRed-Centrina (koji omogućuju otkrivanje statusa kromatina i broja centrosoma). vremenskom lapsiranom videomikroskopijom. Prikazani su snimci snimljeni u naznačeno vrijeme (ljestvica ljestvice = 10 μ m). Film u cjelini dostupan je kao Dopunski video 1. ( b ) Brojanje hemocitometrijskih stanica pokazalo je da se stope rasta i WT i p53 - / - HCT 116 ćelija kofeficiranih s H2B-GFP i DsRed-Centrin ne razlikuju od onih njihovih netraficiranih kolega. ( c ) Citofluorometrijska analiza nakon Hoechst 33342 bojenja roditeljskog i stabilno transficiranog WT i p53 - / - HCT 116 stanica potvrdila je da ko-ekspresija H2B-GFP / DsRed-Centrin ne utječe na distribuciju staničnog ciklusa. ( d ) Vrijeme mikroskopske video-mikroskopije p53 - / - tetraploidnih HCT 116 stanica koje zajedno ekspresioniraju H2B-GFP i DsRed-Centrin korištene su za nadgledanje superbrojnih centrosoma, multipolarnih metafaza i asimetričnih citokineza, za koje se navodno da karakteriziraju njihove netransfektirane palete (ljestvica skale = 10 µ m). Film u cjelosti dostupan je kao Dopunski video 2. DsRed, Discosoma striata crveni fluorescentni protein; GFP, zeleni fluorescentni protein; H2B, histon H2B

Slika pune veličine

Sustavno smo izložili WT diploid, p53 - / - diploidne, WT tetraploidne i p53 - / - tetraploidne HCT stanice tri različita induktora mitotičke katastrofe, naime paklitaksel (PTX, taksan koji nepovratno inhibira mikrotubularnu depolimerizaciju), 41 dimetilenastron (DIMEN, koji cilja mitotički kinezin Eg5) 30 i NDZ (reverzibilni inhibitor mikrotubularne polimerizacije), 42 kao i na 7-hidroksistaurosporin (UCN-01), derivat staurosporina (STS) koji inducira apoptozu djelujući kao efekt prilično nespecifičnog tirozina inhibitor kinaze. 43 Sve ove kemikalije su imale snažne citotoksične / antiproliferativne učinke, uzrokujući značajno smanjenje učestalosti preživjelih stanica bez obzira na ploidni i p53 status, što je određeno 72 sata nakon davanja automatiziranim brojenjem stanica u obrađenim mikrografima (slike 2a i b) i potvrđeno procjenom rezidualne proliferacije kolorimetrijskim testom tetrazolijeve soli (WST-1) konverzije (Slika 2c). Važno je napomenuti da su diploidne stanice koje su preživjele primjenu induktora mitotičke katastrofe (tj. PTX, DIMEN i NDZ) pokazale neto povećanje nuklearne veličine, vjerojatno zbog poliploidizacije (o kojoj je dalje riječ u daljnjem tekstu), što je manje očito u postotku stanice koje su odolijevale UCN-01 (Slika 2a).

Image

Automatizirana analiza slike za otkrivanje ćelijske smrti. ( a ) Fluorescentne mikrofotografije divljeg tipa (WT) diploidnih HCT 116 stanica koje zajedno ekspresioniraju biosenzore za detekciju statusa kromatina i broja centrosoma (H2B-GFP i DsRed-Centrin, respektivno) - ili se ne liječe (kontrola) ili se inkubiraju za 72 h sa paklitakselom (PTX), dimetilenastronom (DIMEN), nokodazolom (NDZ) ili 7-hidroksistaurosporinom (UCN-01) - obrađeni su za stvaranje sljedećih segmentacijskih maski: jezgre (ružičaste), stanice = jezgre +10 piksela ( ružičasta + plava); centrosomi (bijeli ili zeleni, ovisno o tome nalaze li se superponirani ili ne u drugim područjima od interesa (ROI)) (ljestvica ljestvice = 10 µm). ( b ) Automatizirano brojanje stanica unutar mikrofotografije omogućilo je neizravnu procjenu preživljavanja stanica (neobrađene kulture korištene su kao kontrola relativne procjene broja stanica). ( c ) Neizravno kvantificiranje preživljavanja stanica koloimetrijskim ispitivanjima na temelju konverzije tetrazolijeve soli WST-1 daje slične rezultate. Prikazana je frakcija preživjelih stanica (pretvorba WST-1 normalizirana na srednju vrijednost kontrole) (srednja vrijednost ± SEM, n = 3 neovisna eksperimenta). AU, proizvoljna jedinica; DsRed, Discosoma striata crveni fluorescentni protein; GFP, zeleni fluorescentni protein; H2B, histon H2B

Slika pune veličine

Zatim smo uspostavili postupak za automatiziranu, fluorescentnu mikroskopiju, identifikaciju stanica uhićenih u mitozi uz kratkotrajno (8 h) izlaganje različitim mitotičkim inhibitorima i induktorima apoptoze (slika 3a). Zabraniti većinu događaja uznapredovale apoptoze (što dovodi do izrazitog nuklearnog skupljanja i stvaranja apoptotskih tijela, dopunska slika 3) 5 iz analize, područja interesa (ROI) koja su karakterizirana signalom H2B-GFP (koristi se za definiranje nuklearnog područja) <100 piksela nije zanemareno. Dva su različita parametra korištena za identificiranje i kvantifikaciju mitotskih stanica unutar mikrografija. Prvi je bio granularnost, parametar teksture koji predstavlja heterogenost fluorescentnog signala u ROI. To je izračunato kao omjer prosječne razlike u fluorescenciji susjednih piksela unutar jedne ROI i njegove ukupne prosječne fluorescencije. Kako se u ovom eksperimentalnom okruženju intenzitet fluorescencije povećava nakon agregacije H2B-GFP, zrnatost daje informacije o stanju kondenzacije DNK i povećava se u mitotičkim ili apoptotskim stanicama (dopunska slika 3). Drugi korišteni parametar bila je nuklearna srednja denzitometrija (koja odražava omjer srednjeg intenziteta fluorescencije nuklearnog ROI-a i njegovog područja). Iscrtavanjem nuklearne preciznosti na osnovi denzitometrije nuklearne sredine mogu se stvoriti točkaste plohe koje opisuju više jezgara koje pripadaju populaciji stanica. To nam je omogućilo definirati razine praga (a time i vrata) za preciznu identifikaciju mitotičkog zastoja, u kojem povećana granularnost uslijed kondenzacije kromatina prati povećana srednja denzitometrija. Tako su mitotičke stanice definirane granularnošću od> 550 proizvoljnih jedinica (AU) i srednjom denzitometrijom> 250 AU (slika 3b).

Image

Automatizirano otkrivanje mitotičkog zastoja. ( a ) Diploidne HCT 116 stanice divljeg tipa (WT) konstruirane su za koekspresiju H2B-GFP i DsRed-Centrin (omogućujući vizualizaciju kromatina i centrosoma, respektivno). Fluorescentne mikrofotografije ovih stanica u netretiranim uvjetima (Kontrola) ili nakon 8 h duge inkubacije s paklitakselom (PTX), dimetilenasronom (DIMEN), nokodazolom (NDZ), 7-hidroksistaurosporinom (UCN-01) ili staurosporinom (STS) pokazuju da mitotički blokatori (ali ne pro-apoptotičke molekule) inducirali su porast mitotskih brojki (ljestvica ljestvice = 10 µm). ( b ) PTX, DIMEN i NDZ (ali ne pro-apoptotički okidači) generirali su karakteristične stanične populacije (koje odgovaraju mitotičkim događajima) koje su se lokalizirale u kvadrantu definiranim vrijednostima višim od 550 i 250 proizvoljnih jedinica (AU) na nuklearnoj granularnosti prema nuklearnoj srednja granica denzitometrije, respektivno. ( c ) Svaki mitotički blokator doveo je do specifične nuklearne morfologije (naime, "polukružne", "kružne" i "čvrste" jezgre inducirane PTX, DIMEN i NDZ, respektivno), što je u korelaciji s raspodjelom vrijednosti nuklearne granularnosti (skala bar = 10 μ m). ( d ) Fluorescentne mikrofotografije uzete su iz WT diploidne, p53 - / - diploidne, WT tetraploidne, p53 - / - tetraploidne HCT 116 stanice zadržane u netretiranim uvjetima (Kontrola) ili obrađene kao u ( a ). Naknadno automatizirano brojanje događaja s nuklearnom granularnošću i nuklearnom srednjom denzitometrijom većom od 550, odnosno 250 AU, omogućilo je kvantifikaciju stanica metafaze. ( e ) Podaci fluorescentne mikroskopije potvrđeni su paralelnom procjenom raspodjele staničnog ciklusa bojenjem Hoechst 33342 i citofluorometrijskom kvantifikacijom stanica sa sadržajem G2 / M DNK. Stupci prikazuju srednje vrijednosti ± SEM, zabilježene u tri neovisna pokusa. DsRed, Discosoma striata crveni fluorescentni protein; GFP, zeleni fluorescentni protein; H2B, histon H2B

Slika pune veličine

Unatoč prekidu nuklearnog područja, jednostavna usporedba između nuklearne granularnosti i nuklearne srednje denzitometrije ne dopušta isključenje svih stanica koje pokazuju apoptotsku morfologiju (kao što je inducirano STS-om). Međutim, kako ove stanice karakteriziraju povećana nuklearna granularnost, kao i varijabilna denzitometrija (zbog prisutnosti apoptotskih tijela), pokazuju veću heterogenost od stanica uhićenih u mitozi i na taj način se raspodjeljuju na sva četiri kvadranta dijagrama (koji ograničiti njihov utjecaj na ukupne zapise; Slika 3b). Ovaj pristup omogućuje ne samo identifikaciju stanica blokiranih u metafazi, bez obzira na njihovu preciznu morfologiju, već također može pružiti neke informacije koje odražavaju pojavu mitotičkog zastoja. Dakle, tipično „polukružne“, „kružne“ i „čvrste“ metafazne ploče koje su izazvane PTX, DIMEN i NDZ, povezane su s smanjenjem vrijednosti nuklearne granularnosti (Slike 3b i c). U isto vrijeme (8 h) kada STS rezultira akumulacijom apoptotskih stanica, nakon davanja UCN-01 može se identificirati određeni broj morfološki normalnih metafaza (slika 3c). To je u skladu sa idejom da STS inducira apoptozu brže od UCN-01, možda zato što inhibira tirozin kinaze još manje specifično nego UCN-01. 43 Iako su svi klonovi korišteni u ovoj studiji (bez obzira na ploidni status i p53 status) reagirali (i stoga su metafazi blokirani) PTX, DIMEN i NDZ, opseg takvog mitotičkog hapšenja bio je niži u tetraploidnim stanicama nego u njihovim diploidnim kolegama, Ovi rezultati dobiveni su automatiziranom analizom fluorescentnih mikrofotografija (Slika 3d) i potvrđeni citofluorometrijskom procjenom sadržaja DNA nakon Hoechstovog obojenja 33342 (slika 3e). Sve u svemu, ovi podaci pokazuju da se fluorescentna mikroskopija može uspješno povezati s automatiziranom analizom slike za otkrivanje mitotičkog zastoja visoke propusnosti.

Automatsko otkrivanje superbrojnih centrosoma i poliploidije

Aberacije centrosomskog ciklusa često izazivaju multipolarne metafaze, koje se mogu pojaviti na prijelazan način (nakon čega slijedi kongres nadnabrojnih centrosoma, formiranje samo dva funkcionalna centra za organiziranje mikrotubula i bipolarna podjela) ili trajati, što dovodi do multipolarne citokineze. 44 Stoga smo odlučili uspostaviti jedan protokol za automatsko otkrivanje broja centrosoma po ćeliji. U ovom slučaju, ROI ćelije definiran je nuklearnim signalom H2B-GFP plus perinuklearnom produženom zonom od 10 piksela, a broj centrosoma unutar ovog ROI određen je korištenjem DsRed-Centrin signala. Neobrađene WT diploidne HCT 116 stanice obično su sadržavale jednu ili dvije (i rijetko tri) crvene fluorescentne točkice (koje odgovaraju centrosomima ) (Slika 4a). Frakcija preživjelih stanica koja je imala više od dva centrosoma kontinuirano se povećavala nakon liječenja PTX-om, DIMEN-om i NDZ-om (ali ne i UCN-01) (slike 4b-e). Kvantifikacija nuklearnog područja fluorescentnom mikroskopom zajedno s automatiziranom analizom slika sugerira da su PTX, DIMEN i NDZ (ali ne UCN-01) povećali srednju nuklearnu veličinu diploidnih i tetraploidnih stanica, bez obzira na njihov status p53 (Slike 4a-e i 5a ). Povećanje nuklearnog područja izazvano mitotičkim blokatorima bilo je neznatno (ali značajno) manje u tetraploidnim stanicama nego u njihovim diploidnim kolegama (Slika 5a). Poliploidizacija je potkrijepljena citofluorometrijskom analizom, koja pokazuje da subpopulacije stanica s povećanim sadržajem DNK (> G2 / M) nastaju iz diploidnih i tetraploidnih stanica kao odgovor na mitotičke blokatore (Slika 5b). Ovo je otkriće u skladu s izvješćima o ograničenjima veličine nuklearne vode koja sprečavaju izravnu povezanost između sadržaja DNK i količine nuklearne energije. 45 Važno je da su p53 - / - diploidne stanice nakon primjene PTX ili DIMEN bile sklonije nakupljanju superbrojnih centrosoma nego njihovi WT kolege (slika 5c), što je u skladu s prethodnim izvještajima i potvrđuje ulogu p53 u kontroli centrosomski brojevi. 46 Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da se fluorescentna mikroskopija adhezivnih stanica koja eksprimira specifične biosenzore može koristiti za automatsko otkrivanje natprosečnih centrosoma i poliploidije.

Image

Mitotički blokatori dovode do povećanja nuklearne površine i do stvaranja superbrojnih centrosoma. Divlji tip (WT) diploidnih HCT 116 stanica koje zajedno ekspresioniraju H2B-GFP i DsRed-Centrin (koji omogućuju nadzor statusa kromatina i broja centrosoma) ostavljene su neobrađene (Kontrola, a ) ili inkubirane s paklitakselom (PTX, b ) dimetilenastron (DIMEN, c ), nokodazol (NDZ, d ), 7-hidroksistaurosporin (UCN-01, e ) u trajanju od 72 h. Fluorescentne mikrofotografije snimljene u ovom trenutku automatski su analizirane radi utvrđivanja nuklearnog područja i broja centrosoma po ćeliji (unutar preživjele stanične populacije). Prikazane su mikrofotografije i kvantitativni podaci reprezentativni za jedan od tri neovisna pokusa (ljestvica ljestvice = 10 µm). DsRed, Discosoma striata crveni fluorescentni protein; GFP, zeleni fluorescentni protein; H2B, histon H2B

Slika pune veličine

Image

Automatska analiza fluorescentnih mikrofotografija omogućuje procjenu poliploidizacije. Stanice karcinoma HCT 116 humanog karcinoma debelog crijeva s naznačenim ploidnim i p53 statusom koji stabilno eksprimiraju fuzijske proteine ​​za detekciju statusa kromatina (H2B-GFP) i broja centrosoma (DsRed-Centrin) ostavljene su neobrađene (kontrolirane) ili su inkubirane s paklitakselom (PTX), dimetilenastron (DIMEN), nokodazol (NDZ) ili 7-hidroksistaurosporin (UCN-01) u trajanju od 72 h. ( a ) Automatizirana analiza fluorescentnih mikrofotografija dopuštena je za kvantificiranje nuklearnog područja. Stupci prikazuju srednju srednju vrijednost ± SEM, zabilježenu u tri neovisna pokusa. Mitotski blokatori (ali ne UCN-01) izazvali su značajno povećanje nuklearnog područja i diploidnih i tetraploidnih stanica, bez obzira na njihov status p53 . ( b ) Citofluorometrijska analiza bojenjem Hoechst-om 33342 potvrdila je da su, u jasnoj suprotnosti s UCN-01, mitotički inhibitori (naročito PTX i NDZ) doveli do nakupljanja stanica sa sadržajem DNK 2G 2 / M, i u diploidnom i u tetraploidnom stanju Stanice. Kako u ovom trenutku mitotičke stanice nije moguće detektirati slikanjem (podaci nisu prikazani), ti su događaji predstavljali nepoštene aneuploidne stanice. ( c ) Automatizirano kvantificiranje broja centrosoma po stanici (br. Centr.) sugerira da p53 - / - HCT 116 stanice imaju tendenciju da akumuliraju nadbrojne centrosome spremnije nego njihovi divljači (WT). U ( b ) i ( c ), podaci su srednje vrijednosti ± SEM ( n = 3 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

Videomikroskopsko otkrivanje mitotske katastrofe

Gore prikazane kvantitativne procjene provedene su kao ispitivanje krajnje točke na fiksnim stanicama, ali su savršeno pogodne za ponovljena mjerenja i kinetička određivanja živih stanica. Stoga smo odlučili pratiti pojedinačne stanice fluorescentnom videoomikroskopijom kako bismo odredili vrijeme koje će proteći između metafaze i fenotipa krajnje točke. Nekoliko istraživača saželo je različite ishode nenormalne mitoze, 13, 14, 16, 20, definirajući tako smrt tijekom mitoze (mitotička katastrofa, slika 6a), preokret u interfazu (mitotičko proklizavanje, slika 6b) ili završetak kariokeineze (podjela, slika 1a), što može pratiti normalno napredovanje staničnog ciklusa, starenje ili smrt bilo s apoptotičkim ili nekrotičnim značajkama.

Image

Vremensko protekljiva videomikroskopija smrti mitotičkih stanica u HCT 116 stanicama stabilno koeksprimirajući DsRed-Centrin i H2B-GFP. Stanice divljeg tipa (WT) i p53 - / - diploidni humani karcinom debelog creva HCT 116 stabilno koeksprimiraju H2B-GFP i DsRed-Centrin (koji omogućavaju vizualizaciju kromatina i centrosoma, respektivno) su neobrađene (kontrolirane) ili zadržane u trajanju od 8 sati u prisutnosti paklitaksela (PTX), dimetilenastrona (DIMEN), nokodazola (NDZ) ili 7-hidroksistaurosporina (UCN-01), a zatim je nadziran videomikroskopijom (nakon dodavanja vitalnog bojila TO-PRO-3) za slijedećih 36 h (još uvijek u prisutnosti navedenog lijeka). Imajte na umu da se vrijeme 0 podudara s početkom video-mikroskopske procjene (8 sati nakon primjene lijeka). ( a ) WT diploidne stanice tretirane PTX pokazuju tipična svojstva mitotske katastrofe: jezgre u metafazi izravno se podvrgavaju skupljanju prije ugradnje TO-PRO-3 (što odražava permeabilizaciju plazma membrane). ( b ) Nakon primjene NDZ, p53 - / - diploidne stanice imaju tendenciju da pokazuju mitotičko klizanje do interfaze prije stanične smrti. U ovoj reprezentativnoj seriji fotografija karioreksa se dogodila otprilike 10 sati nakon oporavka interfaze i prethodila je unosu TO-PRO-3. Šipke skale = 10 μ m. Filmovi u cjelini za ( a ) i ( b ) dostupni su kao dodatni videozapisi 3 i 4. ( c ) Sudbinu više od 50 pojedinih stanica iz najmanje tri različita filma praćeno je fluorescentnom videomikroskopijom do 36 h, katalogizirano i kvantificirano prema naznačenim događajima, što je omogućilo stvaranje specifičnih profila sudbine ćelije. Dodatne ilustracije koje prikazuju katalogizirane događaje i objašnjavaju dijagrame sudbine stanica prikazuju se na Dodatnoj slici 4. Dakle, u usporedbi sa njihovim WT kolegama ( d ), p53 - / - diploidne stanice ( e ) pokazale su povećanu otpornost na mitotsku katastrofu (kao inducirana PTX-om, DIMEN-om i NDZ-om) u vezi s većom sklonošću mitotičkom klizanju. DsRed, Discosoma striata crveni fluorescentni protein; GFP, zeleni fluorescentni protein; H2B, histon H2B

Slika pune veličine

Započeli smo 36-satnu video-mikroskopsku akviziciju u 8 h nakon dodavanja mitotičkih blokatora (slika 6) i promatrali stanične sudbine u devet različitih kategorija: (1) mitotička katastrofa, (2) mitotička proklizavanja, praćena interfazom, (3 ) mitotičko klizanje nakon čega slijedi smrt u interfazi, (4) podjela daje životne kćeričke stanice, (5) dvostruka podjela (kćeri stanice su također podijeljene tijekom eksperimenta), (6) podjela praćena smrću u interfazi, (7) dvostruka podjela praćena smrt u interfazi, (8) stanična smrt u interfazi (u nedostatku bilo kojeg mitotičkog događaja) i (9) produljena interfaza (u nedostatku bilo kojeg mitotičkog ili staničnog smrti) (dopunska slika 4 i slika 6c). Naš sustav ne dopušta otkrivanje starenja, jer bi za to bilo potrebno mnogo duže (teoretski beskonačno) vrijeme snimanja videa, niti za diskriminaciju između kariokineze i citokineze.

Unatoč tim ograničenjima, ovaj video-mikroskopski raspored omogućio nam je stvaranje profila sudbine ćelija za WT i p53 - / - diploidne stanice (Slike 6d i e). Stoga su WT diploidne stanice liječene PTX, DIMEN i NDZ masovno pretrpjele mitotsku katastrofu (slika 6d, crvene trake), a također su pokazale i određeni stupanj stanične smrti tijekom interfaze (slika 6d, narančaste trake). Isto se nije dogodilo nakon davanja UCN-01, što je bilo povezano s vrlo malo slučajeva smrti mitotičke stanice (slika 6d). Nakon primjene mitotičkih blokatora, udio p53 - / - diploidnih stanica koje su pretrpjele mitotsku katastrofu bio je manji od onog opaženog među njihovim WT kolegama, što se može procijeniti usporedbom količine crvenih traka na slikama 6d i e. U tim uvjetima, p53 - / - stanice su se prilično vratile u interfazu i na kraju preživjele (slike 6d i e, ljubičaste šipke), u skladu s shvaćanjem da odsutnost p53 olakšava mitotičko proklizavanje. 16, 47 I u diploidnim i p53 manjkavim diploidnim stanicama postojala je linearna korelacija između učestalosti stanica koje nose natprosečne centrosome i frekvencije mitotičkih katastrofa (Slika 7). Međutim, nagib linearne regresije između ova dva skupa podataka bio je veći u p53 - / - ćelijama nego u njihovim WT kolegama, u skladu s zaključkom da prve generiraju i toleriraju veći broj dodatnih centrosoma nego drugi. Ovi eksperimenti u cjelini podržavaju mogućnost kvantificiranja mitotičke katastrofe video-mikroskopijom zajedno s automatiziranim slikanjem.

Image

Linearna povezanost između postotka stanica s natprosječnim centrosomima i učestalosti mitotičke katastrofe. Stanice divljeg tipa (WT) i p53 - / - diploidni humani karcinom debelog creva HCT 116 koje konstitutivno koeksprimiraju biosenzore za detekciju kromatinskog statusa i centrosoma uzgajaju se 8 sati u odsutnosti (Kontrola) ili u prisutnosti paklitaksela ( PTX), dimetilenastron (DIMEN), nokodazol (NDZ) ili 7-hidroksistaurosporin (UCN-01), a zatim se prati video-mikroskopijom radi automatiziranog kvantifikacije broja centrosoma po stanici i mitotske katastrofe. I u WT ( a ) i p53 - / - ( b ) diploidnim stanicama postotak stanica karakteriziran superbrojnim centrosomima linearno je u korelaciji s učestalošću mitotičke katastrofe. Podaci su srednje vrijednosti iz tri neovisna pokusa. m = nagib; R2 = koeficijent određivanja

Slika pune veličine

Zaključne napomene

Mitotska katastrofa je modalitet ćelijske smrti koji je povezan s morfološkim i, što je još važnije, „povijesnim“ osobinama stanice, zahtijevajući tako specijaliziranu metodu otkrivanja. Doista, uobičajeni biokemijski skupni testovi (poput testova aktivacije kaspaze) ne mogu razlikovati interfazu i post-mitotsku apoptozu. Slično tome, citofluorometrijske metode ne mogu utvrditi jesu li apoptotičke osobine (poput izloženosti fosfatidilserinu ili propadanju potencijala mitohondrijske transmembrane) stečene prije, tijekom ili nakon mitoze. Dakle, radi preciznog prepoznavanja mitotičke katastrofe potrebno je pratiti dodatne morfološke promjene, idealno na način koji omogućava procjenu sudbine pojedinih stanica u kontekstu mitotičkih aberacija.

U ovom su istraživanju poboljšali skup eksperimentalnih postupaka i softverskih postavki koje omogućavaju kvantifikaciju mitoze, ploidnosti, nadzemnih centrosoma i apoptotske smrti stanica fluorescentnom (video) mikroskopom zajedno s automatiziranom analizom slike. Većina rezultata predstavljenih u ovom članku nastala je u HCT 116 stanicama, modelu karcinoma ljudskog debelog crijeva koji nam je omogućio da proučimo utjecaj p53 na ishode mitotske katastrofe. Unatoč tome, naši eksperimentalni postupci u potpunosti su prikladni za druge stanične linije (poput U2OS stanica ljudskog osteosarkoma, dopunska slika 5) koje toleriraju ekspresiju himernih proteina koje smo koristili. Segmentacija slike, kao i analize teksture i broja objekata mogu se postići videomikroskopima i softverom (npr. ImageJ, slobodno dostupan na //rsb.info.nih.gov/ij/; Metamorph, iz Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornija, USA ) koje se razlikuju od onih korištenih u ovom radu. Stoga se naši eksperimentalni i analitički postupci mogu prilagoditi platformama različitih komercijalnih pružatelja usluga.

Ukratko, u kombinaciji s kinetičkim procjenama, ove metode obećavaju olakšavanje automatskog otkrivanja smrtnosti ćelije povezane s mitozom i stoga predstavljaju objektivnu metodu za kvantifikaciju mitotičke katastrofe.

Sukob interesa

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

primki

GenBank / EMBL / DDBJ

  • BC029515.1

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

Video

  1. 1.

    Dopunski video 1

  2. 2.

    Dopunski videozapis 2

  3. 3.

    Dodatni videozapis 3

  4. 4.

    Dopunski video 4

Word dokumenti

  1. 1.

    Legende do dopunskih figura i video zapisa

Glosar

AU

proizvoljna jedinica

~ itim

dimethylenastron

DsRed

Discosoma striata red fluorescent protein

FACS

fluorescence-activated cell sorter

FSC

forward scatter

GFP

zeleni fluorescentni protein

H2B

histone H2B

NDZ

nocodazole

PTX

paclitaxel

PI

propidium iodide

ROI

regija interesa

SEM

standardna pogreška srednje vrijednosti

SSC

side scatter

STS

staurosporina

UCN-01

7-hydroxystaurosporine

WT

divlji tip

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)