Anaplastični limfom velikih ćelija nastaje u timocitima i zahtijeva prolazni tcr izraz za timski izlazak | komunikacije prirode

Anaplastični limfom velikih ćelija nastaje u timocitima i zahtijeva prolazni tcr izraz za timski izlazak | komunikacije prirode

Anonim

teme

  • limfom
  • T-stanični receptor

Sažetak

Anaplastični velikocelijski limfom (ALCL) je periferni limfom T-stanica koji se pojavljuje uglavnom kod djece i mladih. Prirodno napredovanje ove bolesti u velikoj je mjeri nepoznato, kao i identitet njezine prave stanice podrijetla. Ovdje predstavljamo model periferne patogeneze ALCL-a gdje se malignost započinje u ranim timocitima, prije β-preuređenja T-staničnih receptora (TCR), što je zaobiđeno CD4 / NPM-ALK transgeničnim miševima nakon Notch1 ekspresije. Međutim, otkrivamo da je potreban TCR za ispadanje timije i razvoj perifernih tumora miševa, ali taj TCR mora biti reguliran za limfomagenezu T-stanica. U skladu s tim, klonski preraspoređivanje TCR-a u ljudskom ALCL-u je pretežno unutar okvira, ali često i apstraktno, s klonalnim TCRα, ali nema usporedivog klonalnog preuređenja TCRβ, dajući događaje koji obično ne bi bili dozvoljeni za opstanak tijekom razvoja timije. Djeca koja su pogođena ALCL-om mogu sadržavati stanice koje potiču limfom i sposobne su seliti recidivi nakon kemoterapije.

Uvod

Nukleofofmin-anaplastična limfomska kinaza (NPM – ALK) pozitivna anaplastična velikocelijska limfoma (ALCL) smatra se perifernim limfomom T-stanica i povezana je s translokacijom t (2; 5) (p23; q35), koja je identificirana kao fuzija. gena kinaze, ALK , do nukleolarnog gena proteina, NPM1 (ref. 1). ALCL je definiran ekspresijom CD30 markera aktiviranih B i T stanica i, u nekim slučajevima, T ćelijskih markera kao što su CD4 ili CD8, kao i proizvodnjom citotoksičnih molekula poput perforina, koji zajedno s prisutnošću klonalnog T- preuređivanje staničnih receptora (TCR) sugerira aktivirano T-stanično podrijetlo 2, 3, 4, 5, 6 . Druge studije su predložile Treg stanično podrijetlo (zahvaljujući stvaranju FoxP3 transkripata i proizvodnji IL10 i TGFβ po ALCL staničnim linijama) ili u novije vrijeme Th17 fenotip (zahvaljujući proizvodnji IL17 od strane tumorskih stanica) 5, 6, 7, 8, Da li su ovi stanični atributi ostaci stanice podrijetla ili su inducirani NPM-ALK ostaje da se u potpunosti razjasne. Unatoč pretpostavljenoj pripadnosti T-stanicama, ALK + ALCL rijetko izražava TCRβ ili CD3ɛ imunohistokemijom 9, a CD3 signalna kaskada se regulira na način ovisan o NPM-ALK transkripcijskim i epigenetskim modifikacijama 10 . Nedavno smo pokazali da subpopulacija matičnih stanica ALCL karcinoma (CSC) izražava gene obogaćene unutar genskog skupa ranih tihičnih progenera (ETP), koji ukazuju na primitivnu stanicu podrijetla 11 . Naši podaci sugeriraju da je sjeme ALCL-a zasijano u timusu, ili čak i ranije u razvoju hemopoetike, što možda ukazuje da događaji u timusu ili nakon što primed stanice izađu iz timusa mogu oblikovati konačni fenotip ćelije. Da bismo istražili ovu hipotezu, proveli smo detaljnu analizu TCR preuređenja u humanom ALCL kako bismo tražili dokaze o razvoju podređenih timskih T-stanica NPM-ALK. Tijekom normalnog razvoja T-stanica, preuređenju TCRα VJ prethodi preuređenje TCRβ VDJ i masivna stanična ekspanzija timocita tijekom pre-TCR β-selekcije. Proces β-selekcije pokreće pre-TCR sastavljen od pre-TCRα izraženog na staničnoj površini zajedno sa TCRβ lancem. TCR imunogenetski profili multipleksnim PCR mogu se stoga upotrijebiti za utvrđivanje pripadnosti loza i stadija sazrijevanja.

Naši podaci pokazuju da većina ALK + ALCL pokazuje imunogenetičke dokaze o unutarnjem TCR preuređivanju, 25% prikazuje atipične TCR profile koji nisu odabrani za vrijeme (ili dopuštajući) TCR-αβ timski razvoj. U normalnoj ontogeniji T-stanica, ti bi događaji rezultirali neuspjehom β-selekcije i smirom timskih stanica, što sugerira da su događaji u timici ovih bolesnika poništili β-selekciju. Stoga smo koristili CD4 / NPM-ALK (CD4NA) timski T ćelijski limfom model 12 kako bismo istražili potencijalni doprinos preuređenja TCR gena koji aktivira rekombinazu i signala TCR prirodnom napredovanju NP-ALK-T-ćelija. limfoma. U nedostatku Rag-posredovanog TCR preuređenja, NPM-ALK može inducirati "sazrijevanje T stanica" na stupnjeve razvoja CD4 + CD8 + dvopozitivne (DP) i CD4 jednopozitivne (SP), omogućujući formiranje limfoma timusa. Hipotetizirali smo da bi za stvaranje inhibicije timije mogao biti potreban ekspresija nekog oblika TCR, te je na taj način ukrenula transgeničnu liniju CD4NA u transgeničnu liniju OT1 specifičnu za klasu I, OT1, ograničenu klasu I, i na pozadini 13 Rag-kompetentnoj i na Rag-deficitarnoj 13, 14 . Prisutnost OTI TCR pomiče mjesto prezentacije limfoma prema periferiji, iako stanice tumora ne izražavaju TCR, a TCR stimulacija sprječava limfoidnu onkogenezu; kao takav ovaj model više sliči ljudskom ALCL-u koji također rijetko iskazuje TCR 9, 10 . Ovi podaci sugeriraju da periferni ALK + ALCL ovisi o prolaznoj ekspresiji funkcionalnog TCR kako bi se omogućila timska emigracija primiriranih T limfocita i njegovo kasnije smanjivanje nakon što su stanice na periferiji kako bi se omogućila transformacija.

Rezultati

Nenormalno preuređivanje TCR kod humanog ALCL tumora

Kako je ekspresija NPM sveprisutna, fuzija NPM-ALK može dovesti do ekspresije ALK-a u svim fazama razvoja timije 15 . Da bismo istražili jesu li ALCL stanice prošle kroz timus dok su eksprimirale NPM – ALK, analizirali smo stanje TCR preuređenja u ljudskim tumorima. TCRδ, TCRγ i TCRβ geni su amplificirani iz DNA ALCL tumora i klonskih populacija identificiranih genetskom analizom PCR proizvoda, s približnom osjetljivošću od 1-5% (Slika 1, Tablica 1, Dopunska tablica 1 i sažeta Dopunska Sl. 1). Za pročišćavanje TCR statusa, za odabrane slučajeve izvedena je 180K Agilentna CGH matrična analiza i PCR detekcija klonskih TCRα transkripata iz komplementarne DNA (cDNA) pomoću Vα i Cα prajmera (Tablica 1).

Image

( a ) Tijekom normalnog razvoja T-stanica, preuređenje TCR gena događa se na vremenski način, pri čemu preuređivanje δ prethodi γ, nakon čega slijedi β, a zatim α, od kojih se posljednji podudara s brisanjem lokusa δ. DP, dvostruko pozitivno; ISP, srednji pojedinačni pozitivni; SP, pojedinačno pozitivno. ( b ) prikazani su tipični PCR DNA (γ, β, δ) ili RNA (α) koji prikazuju prisutnost / odsutnost i vrstu klonskih preuređenja za svaku od četiri identificirane TCR kategorije, kao i Agilentni 180K CGH TCRα / δ profili. ( c ) Tri primjera koja predstavljaju raspon preinakiranja CGH TCRβ VJ uočenih među slučajevima TCRaβ: odsutni (12 od 17), oligoklonalni (2 od 17) ili klonski (3 od 17). ( d ) Postotak ljudskog ALCL-a kategoriziran da ima bilo TCR zarodnu liniju (GL), TCRaβ (TCR AB), TCRγδ (TCR GD) ili samo TCRγ (TCR G) preuređenja. ND, nije određeno.

Slika pune veličine

Tablica pune veličine

Analizirano je ukupno 57 ALK + ALCL s najmanje 40% sadržaja tumorskih stanica. T limfoidna imunohistologija i citotoksični status sažeti su u tablici 1 i detaljno su prikazani u dopunskoj tablici 1. Sveukupno, klonalni preraspoređivanje TCRγ VJ PCR je identificiran u 49 (75%), TCRβ VDJ u 33 (58%) i TCRδ VDJ u 11 (19 %) slučajeva (tablica 1). Na temelju tih podataka, klasificirali smo ALCL u četiri različite kategorije na temelju promatranog profila preuređenja TCR: samo TCR germline (GL), TCRαβ, TCRγδ i TCRγ.

Osam (14%) tumora nije pokazalo značajne dokaze o klonalnom preuređivanju TCR pomoću PCR ili TCRa / 8 CGH, unatoč najmanje 50% sadržaja tumorskih stanica (Sl. 1b, d, tablica 1 i dodatna tablica 1) i kategorizirani su kao TCR GL, Kao takvi, oni predstavljaju molekularni ekvivalent nulte ALCL (iako je šest od osam slučajeva izrazilo stanične površinske markere povezane s fenotipom T-stanica (Dodatna tablica 1)).

Tumori su klasificirani kao TCRαβ ako je PCR detektirao klonalno preuređenje TCRβ VDJ na barem jednom alelu, u nedostatku TCRδ VDJ preuređenja, što je u skladu s bilateralnim TCRδ brisanjem tijekom TCRα preuređenja. Ovo je bila preovlađujuća kategorija (32 od 57; 56%; Sl. 1d). Velika većina (16 od 17 testiranih) TCR-αβ ALK + ALCL pokazala je jasan dokaz TCRα VJ na barem jednom alelu pomoću CGH i klonski TCRα transkripti identificirani PCR reverznom transkriptazom (RT-PCR) u 10 od 10 15 CGH-pozitivnih slučajeva (Sl. 1b). Neočekivano, TCRβ preuređenja, iako ih je jasno otkrio PCR, CGH je otkrio samo u malom broju slučajeva (3 od 17, 18%), pri čemu su dva dodatna slučaja (ALCL19 i 07) demonstrirala heterogene delecije (Sl. 1c). To nije zbog nedovoljne razlučivosti Agilent 180K nizova, jer čak ni TCRβ preuređenja koja uključuju 5 ′ Vβ nisu primijećena i ponavljaju CGH koristeći Affymetrics niz citoscanskih gustina visoke gustoće (2, 7 M sonde) u tri TCRβ PCR VDJ + / CGH-TCRαβ slučaja potvrđena dokaz preusmjeravanja TCRα VJ, ali ne i TCRβ VDJ koji se može otkriti, pri čemu samo jedan slučaj pokazuje očekivani klonski nepotpuni TCRβ DJ (ALCL24) (dopunska Sl. 2).

Analiza redoslijeda klonskih PCR proizvoda pokazala je barem jedno unutarnje TCRα preuređenje u osam od devet slučajeva TCRαβ, a tri slučaja su pokazala dva preuređenja u okviru. Sekvenciranjem preusmjeravanja TCRβ VDJ iz 16 TCR-αβ ALCL (dopunska tablica 1) identificirano je mono-alelno unutar unutarnje preuređenje u svim slučajevima osim ALCL 26, od kojih je jedan od rijetkih slučajeva pozitivan na TCRβ CGH. Unatoč ovim dokazima funkcionalnog TCRab, nijedan od 16 ALCL-a analiziranih imunohistokemijom nije dokazao ekspresiju TCRβ ekspresije na tumorskim stanicama (dopunska slika 3A). Trinaest TCRγ alela sekvencionirano je iz osam slučajeva TCRαβ, ali kao što se očekivalo, samo su dva (15%) alela bila unutar okvira (dopunska tablica 1).

Uzeti zajedno, TCRαβ tumori pokazuju jasne dokaze unutar okvirnog klonskog preuređenja TCRα, ali samo manje, unutar okvira TCRβ preuređenja koje detektira PCR, ali rijetko CGH niz, u skladu s heterogenim, tekućim preuređivanjem TCRβ unutar TCRα klona, ili s reaktivnim limfocitima koji infiltriraju tumor. Da bismo utvrdili da li ta tekuća preusmjeravanja nose bilo kakvo klonsko rodoslovno razdoblje, klonirali smo i sekvencionirali TCRβ preuređenja iz ALCL19, ali nijedno od manjih preinačenja nije podijelilo bilo koji očigledni pradavni TCRβ CDR3 DJ slijed.

Šest slučajeva pokazalo je klonalno preuređivanje TCRγ, ali nije bilo TCRδ preuređivanje i, u najmanju ruku, nepotpuno TCRβ preuređivanje (tri monoallelična DJ-a), a označeni su samo TCRγ (sl. 1b, d). Iznenađujuće, nađeno je da je TCRα locus u dva od četiri slučaja preuređen pomoću CGH, a klonski TCRα VJC transkripti detektirani su u pet od šest pomoću RT-PCR (slika 1b, dopunska slika 2, ALCL30 i tablica 1). Zapanjujuće, svih šest TCRα preuređenja sekvencioniranih iz ovih pet ALCL bilo je unutar okvira, unatoč očiglednoj odsutnosti klonskog TCRβ VDJ preuređenja. To nije bilo zbog lažno negativnih rezultata TCRβ PCR-a, jer 180K CGH analiza nije identificirala TCRβ preuređenje u četiri ispitana slučaja (dopunska tablica 1), a citosanska analiza visoke razlučivosti 2, 7M ALCL30 identificirala je samo očekivani TCRβ DJ (dopunska slika 2B), Samo jedan (ALCL23) nije imao dokaze o preuređivanju TCRα pomoću RT-PCR i CGH. Kao takav, podsjećao je na TCR GL ALCL s izoliranim 'nezrelim' van-okvira VγfI-JP1 / 2 TCRγ preuređenja. U nedostatku TCRβ, TCRα bi se mogao, barem hipotetski, pariti s TCRγ, jer su svi slučajevi prošli barem mono-alelno preuređenje, ali samo je jedan od šest TCRγ alela sekvenciranih unutar okvira. Kao takav, pet od šest slučajeva samo za TCRγ pokazuju potencijalno funkcionalno preusmjeravanje TCRα u nedostatku TCRβ preuređenja i samo se razlikuju od slučajeva TCRαβ po nedostatku TCRβ klonalnog VDJ vrha PCR-om.

Jedanaest slučajeva (19%) klasificirano je kao TCR-γδ otkad su otkriveni klonski preuredi TCRγ VJ i TCRδ VDJ (Sl. 1b, d). Ova kategorija je pokazala jednolični genotip, s 10 od 11 koji su pokazali Vδ1-Jδ1 / Dδ2-Jδ1 genotip i unutar okvira TCRγ i TCRδ preuređivanje na najmanje jednom alelu (Dodatna tablica 1). 180K CGH profili potvrdili su samo TCRδ, ali nije bilo TCRα ili TCRβ preuređenja u šest ispitanih slučajeva (Dodatna tablica 1 i Tablica 1). Svi su pokazali nepotpuni TCRβ DJ na barem jednom alelu (ispod razlučivosti detekcije CGH). ALCL36 je također pokazao potpuno unutarnje TCRβ VDJ preuređenje, ali je klasificiran kao TCR-y obzirom da su TCRδ preuređenja bila dvostrana, klonski TCRγ je bio unutar okvira i RT-PCR nisu detektirani TCRα transkripti. Prema tome, što se tiče TCR-αβ ALCL, TCR-y ALCL imaju imunogenetske dokaze o potencijalno funkcionalnom TCR.

Ukratko, PCR i CGH analiza TCR preuređenja u ALK + ALCL pokazala je da dvije trećine (TCR-αβ i samo TCRγ) pokazuju veliko unutarnje TCRα klonsko preuređenje, koje nije popraćeno usporedivom velikom populacijom TCRβ klonalne populacije, ali manja TCRβ klonska populacija koja je pretežno unutar okvira i može poticati unutar ili neovisno od TCRa klonske populacije i nije povezana sa detektibilnim proteinom TCRβ imunohistokemijom. Preostala trećina dijeli se između imunogenetskog 'Null-ALCL' (TCR germline, 14%) i imunogenetskog TCR-γδ ALCL (19%).

Stoga smo hipotetizirali da, u skladu s našim prethodnim prijedlogom da NPM – ALK može zamijeniti signalnu kaskadu TCRβ 16, NPM – ALK može omogućiti nezreloj hematopoetskoj ćeliji da zaobiđe timski β-odabir do faze kada TCRα VJ preuređenje postane moguće, omogućujući tako nenormalna diferencijacija limfe T i podrazumijeva, timski podrijetlo, barem dio ALCL-a. Da bismo procijenili može li se dogoditi aktivnost rekombinaze u utvrđenim ALK + ALCL tumorima, tražili smo transkripte RAG1 u 52 slučaja, ali svi su bili negativni, kao i sve tri ALCL stanične linije koje su testirane za razliku od nezrelih T-ALL staničnih linija zarobljenih u stupanj razvoja timije (Dopunska slika Sl. 3B).

NPM – ALK može potaknuti sazrijevanje „t T stanica“

Da bismo razjasnili može li se razvijati timociti koji se eksprimiraju od NPM-ALK i na kraju proći transformaciju u nedostatku funkcionalnog preusmjeravanja TCR, generirali smo transgene miševe koji su eksprimirali NPM-ALK u svim fazama razvoja timova kojima je nedostajao gen rag2 (Sl. 2a). RAG2 je potreban za preusmjeravanje TCR, stoga miševi 2 - / - miševa imaju male timijane lišene zrelih T-stanica, ali sadrže normalan broj T-staničnih porijekla blokiranih u razvoju u fazi DN3. Analizirali smo timijan i miševa CD4NA / RAG + / + i CD4NA / RAG2 - / - prije prezentacije otvorenih tumora. U miševima CD4NA / RAG + / + u dobi od 5 tjedana dolazi do nakupljanja fenotipskih DN3 stanica. (Sl. 2b, c, apsolutni broj stanica prikazan je u Dodatnoj tablici 2). Bilo je i povećanja postotka ukupne timske populacije koja izražava stanični površinski marker CD117, protein čija se ekspresija isključila u fazi DN3 / 4 razvoja timice (Slika 2b, c). Ovi podaci sugeriraju kašnjenje u razvoju T-stanica u ovoj fazi uzrokovano NPM-ALK aktivnošću i u skladu s vremenom u kojem dolazi do β-selekcije.

Image

( a ) CD4NA transgeni miševi s timijama sortirani su u naznačene podskupove T-stanica, a ekstrahirana RNA ocijenjena je na prisutnost NPM-ALK transkripata. SP, pojedinačno pozitivno; DP, dvostruko pozitivno; DN, dvostruko negativan; RT, obrnuta transkripcija. ( b ) Timijan (ukupni broj timskih stanica uspoređujući divlji tip s transgeničnim miševima jednak je ovoj dobi) 5-tjednih CD4NA transgenih miševa analiziran je na postotak stanica u svakoj fazi dvostruko negativnih stadija (gated na CD3 / 4/8 - stanice) razvoja timskih T-stanica. Prikazan je reprezentativan primjer pet analiziranih miševa. Brojevi u grafovima predstavljaju postotak ukupnog DN baze. ( c ) Pregled postotka stanica u svakoj fazi razvoja timskih T-stanica u skupinama od po pet miševa svakog od navedenih genotipova u dobi od 5 tjedana. Podaci predstavljaju pojedinačno brojanje miša i srednju vrijednost, P = 0.0368, P = 0.015 i P = 0.0007 za subpopulacije DN3, DN4 i CD117 (Studentov t -test uz pretpostavku jednake varijance). ( d ) Timski razvoj u dvostruko negativnim stadijima ocijenjen je u naznačenim mišjim genotipima protočnom citometrijom. Prikazan je reprezentativni primjer tri analizirana miševa, a brojevi u grafovima predstavljaju postotak DN baze. ( e ) Pregled postotka stanica u svakoj fazi razvoja timusa u naznačenih genotipova u dobi od 9 tjedana. Podaci predstavljaju pojedinačno brojanje miša i srednja vrijednost, šipke pogreške pokazuju standardno odstupanje, P = 0.0267, P = 0.0005 i P = 0.0001 za potpopulacije CD4SP, DP i DN, n = 10 svakog genotipa, Studentov t- test. ( f ) NPM – ALK obnavlja timski razvoj kod RAG2 - / - miševa. Prikazan je reprezentativni primjer tri analizirana miševa, a brojevi predstavljaju postotak ukupnog broja živih timocita. ( g ) Ekspresija NPM-ALK u timusu obnavlja notch1 ekspresiju na površini DN3 timocita u RAG2 - / - miševima. Reprezentativni primjer triju miševa analiziranih za svaki od navedenih genotipova prikazan je pozitivnim vratima nacrtanim na temelju izotipske kontrole.

Slika pune veličine

U CD4NA / RAG2 - / - miševima, stanična funkcija timusa je značajno povećana u odnosu na broj koji se vidi kod RAG2 - / - miševa, ali ne i na razine opažene u miševa divljeg tipa (Sl. 2e, apsolutni broj stanica prikazan u Dodatnoj tablici 3). Broj stanica opažen u RAG2 - / - liniji je u skladu s prethodnim izvještajima 13 . U CD4NA / RAG2 - / - miševima, broj DN3 stanica bio je previše zastupljen u usporedbi s miševima divljeg tipa. Značajno da je većina timocita u CD4NA / RAG2 - / - bila DP (Sl. 2e, f). Ovi podaci govore da NPM – ALK može promovirati zaobilaznicu kontrolne točke β-odabira. Daljnjom potporom ovih podataka, 32% manje DN4 stanica izoliranih iz CD4NA miševa eksprimira TCRβ na staničnoj površini u usporedbi s divljim tipom kontrolnih miševa legla (Dopunska slika Sl. 4A).

Nadalje, DN3 stanice izolirane iz CD4NA / RAG2 - / - transgenih miševa izraženih staničnih površina Notch1, u skladu s očiglednim sazrijevanjem timocita izvan stupnja DN3 (Sl. 2 g), kao i uregulacijom transportera hranjivih tvari CD98 i CD71 potrebnim za zadovoljavanje metabolički zahtjevi timocita u razvoju (dopunski Sl. 4B). Zaista, regulacija CD98 i CD71 obično se vidi samo u prisutnosti signalizacije od strane Notch1 i pre-TCR, što sugerira da NPM – ALK ne samo da inducira Notch1 ekspresiju, već i nadoknađuje odsutnost pre-TCR 17 .

Populacija CD44 hi je prethodnik rasta tumora

Nenormalna populacija timocita može se otkriti u CD4NA transgeničnim miševima u kasnijoj dobi, kada je timska ćelija još uvijek u granicama normale. CD4 / CD8 zrele T stanice izražavaju nezreli marker površinske stanice CD117 kao i CD44, pri čemu je posljednji normalno ograničen na DN1 / 2 timocite (dopunska slika 5A). Je li povećanje CD44 hi ćelija ostatak ekspresije na DN1 / 2 stanicama ili NPM – ALK inducirana regulacija CD44 nije jasno, iako je posljednje objašnjenje potkrijepljeno eksperimentima u kojima je NPM – ALK sposoban pokretati ekspresiju luciferaze iz CD44 promotor (dopunska Sl. 5B).

Ovi podaci sugeriraju da NPM – ALK pokreće asinhronu TCRβ neovisnu proliferaciju DN3 sličnih stanica i sazrijevanje u DP stanicama, bez gubitka DN1 / 2 karakteristika kao što su ekspresija CD44 i CD117. Ovo može pružiti onkogenu prednost ovoj populaciji koja nije podvrgnuta odabiru timiranom TCR-om. Zapravo, ova populacija CD44 + stvorila je tumore timice pri transplantaciji intravenski miševima recipijentima, opet u skladu s podrijetlom iz ETP-a u ovom modelu sustava (dopunska slika 5C).

NPM – ALK pokreće TCR-neovisnu timijsku formaciju tumora

Unatoč nepostojanju TCR preuređenja, CD4NA / RAG2 - / - miševi stvaraju tumore timije koji se sastoje od stanica koje podsjećaju na dvostruko pozitivni stadij razvoja T-stanica (slika 3a, tablica 2). Međutim, tumori koji nastaju u linijama CD4NA ili CD4NA / RAG2 - / - pokazuju istu histopatologiju, koja se sastoji od difuznih, homogenih listova srednje veličine veličine NPM-ALK, s potpunim učinkom normalne timske arhitekture (sl. 3b). Kao što se očekivalo, CD4NA / RAG2 - / - tumori, iako izražavaju CD4 ± CD8, ne prikazuju TCR preuređenja (Sl. 3c). Ovi podaci pokazuju da preusmjeravanje TCR nije potrebno za staničnu transformaciju u timusu, iako je razvoj tumora u CDNA / RAG2 - / - miševima u usporedbi s CD4NA odgođen, što sugerira da ovaj proces može poboljšati tumorigenezu (Sl. 3d). NA u odsustvu TCR preuređenja, dakle, omogućava asinhroni razvoj timije stadijumu CD4 / 8 DP i razvoj kortikalnog timskog limfoma.

Image

( a ) Fenotip tumora timice koji se pojavljuju u miševima CD4NA i CD4NA / RAG - / - podsjeća na kortikalne timocite. Brojevi u grafovima predstavljaju postotak ukupnog broja živih stanica tumora. Ovi su podaci reprezentativni za najmanje 10 analiziranih tumora. ( b ) Tipičan histopatološki prikaz tumora koji su pozitivni na ALK ekspresiju, uvećanje × 400. Linija skale, 50 µm. ( c ) TCRβ preuređenja u naznačenim genotipovima tumora miševa u usporedbi s normalnom timusnom i ne-limfoidnom DNK; prikazana su četiri reprezentativna primjera svakog od njih. ( d ) Kaplanova-Meierova krivulja preživljavanja za miševe CD4NA i CD4NA / RAG2 - / -, P <0, 005, test rang-dnevnika. NPM – ALK / RAG2 - / -, n = 20; NPM – ALK, n = 15.

Slika pune veličine

Tablica pune veličine

Miševi tumora uvijek su ograničeni na timus, dok je ALCL kod ljudi prisutnih većim dijelom na periferiji i često je ekstranadalni (premda je zahvaćenost medijastina primijećena u čak 50% slučajeva čovjeka 18 ). Stoga je jasno da ako se tumori pokreću u timusu mora nešto pridonijeti timskom ispadanju. Tijekom normalnog sazrijevanja timije to se obično postiže površinskom ekspresijom TCR / CD3 kompleksa. ALCL je, nasuprot tome, karakteriziran i za ljude 9 i za naš mišji CD4NA / RAG2 - / - model potpunom odsutnosti TCR / CD3 kompleksa, što potencijalno objašnjava neuspjeh izlaska timusa, barem kod miševa. To nije uvijek slučaj, jer miševi CD4NA u rijetkim slučajevima mogu biti prisutni s perifernim tumorima (u našim rukama jedan od 50 CD4NA miševa razvija tumore u perifernim limfnim čvorovima). Pored toga, naši podaci pokazuju da većina humanih ALCL pokazuje imunogenetske dokaze unutar okvira TCRaβ ili TCRγδ, što sugerira prethodnu ekspresiju funkcionalnog TCR. Stoga smo obnovili TCR izraz u mišjem modelu uvođenjem TCR transgena.

Prisutnost OT1 TCR rezultira perifernim limfomom T-stanica

OT1 TCR (Vα2) prepoznaje ostatke ovalbumina (ova) u 257-2264 (SIINFEKL) u kontekstu H2κ b (ref. 14). U nedostatku jajnika, mišja linija CD4NA / RAG2 - / - / OTI ne razvija limfoidne tumore, već je prisutna nakon dužeg trajanja s (OT1 TCR negativnim) gastrointestinalnim stromalnim tumorima, hepatocelularnim karcinomima i sarkomima, iako je OTI TCR- pozitivne T stanice postoje na periferiji (Dopunska slika 6, Dodatna tablica 4). Suprotno tome, RAG kompetentna linija CD4NA / OT1 proizvodi ALK + limfome, s perifernim a ne timskim prikazom, i srednjim preživljavanjem od 181 dana (nasuprot 88 dana za CD4NA miševe ( P = 0.0001, Studentov t- test); Sl. 4a). Je li ta kašnjenje u razvoju tumora stvarna razlika ili je posljedica zakasnele detekcije tumora (timski CD4NA tumori potiču otežano disanje, dok periferni tumori u CD4NA / OTI miševima mogu biti teže detektirati zbog asimptomatskog rasta) nije jasno. Međutim, analiza populacije DN3 u miševima CD4NA / OTI u usporedbi s miševima CD4NA pokazala je povećanu staničnu proliferaciju u prvom, što bi potencijalno moglo smanjiti vrijeme za stjecanje sekundarnih genetskih događaja koji potiču tumor (moguće RAG-posredovan), omogućujući timski bijeg i transformacija na periferiji (dopunska Sl. 7). Međutim, CD4NA / OTI miševi imaju očigledno normalne profile razvoja T-stanica iako je ukupna timska ćelijska povećana (dopunska slika 8A-C). Značajnije je da periferni tumori u liniji CD4NA / OTI pobliže repliciraju histopatološki prikaz ljudske bolesti (tablica 2, slika 4b). Svi tumori su pozitivni na obojenje ALK imunohistokemijom i histološkom analizom pokazali su stanice s eozinofilnom citoplazmom i reniformnim jezgrama, nalik klasičnim 'oznakama' stanica ljudskog ALCL (Sl. 4b) 19 . Unatoč prisutnosti RAG-a u ovim miševima, tumori nisu pokazali endogene preuređivanje TCRβ, što sugerira da potiču od tipične populacije koja eksprimira OTI transgeni TCR, za koji se zna da suzbija endogene preuređenje posredovane RAG-om (sl. 4c). Izražavanje OTI TCR (još uvijek u nedostatku jajnika) signaliziralo bi emitiranje timije u nedostatku drugih preinačenja TCR. Međutim, tumori rijetko izražavaju transgeni Vα2 TCR na staničnoj površini (samo jedan od 10 analiziranih miševa; slika 4d, tablica 2), iako V2 koji eksprimiraju T stanice postoje zajedno u organima koji nisu pogođeni tumor-miševima (Sl. 4e) i prisutni su na periferiji pre-tumorigenskih miševa (dopunska slika 6B), što sugerira da je njegova ekspresija izgubljena. Intracelularni CD3 mogao se otkriti, ali površinski CD3 nije bio ekspresioniran na tumorima i postojala je odsutnost unutarćelijskog Vα2 TCR iako bi se mogli otkriti OTI transkripti (dopunska slika 8D, E). Ovaj "null" površinski fenotip ćelija (slika 4d) upečatljivo podsjeća na ljudski ALK + ALCL. Objavljeno je da IL2R i molekule nizvodno od signalizacije izazvane TCR-ligacijom utišavaju se epigenetskim mehanizmima u ALCL 10, 20, što sugerira da TCR-inducirana signalizacija djeluje kao tumor-supresijski mehanizam.

Image

( a ) Kaplanova-Meierova krivulja preživljavanja, CD4NA n = 20, CD4NA / OT1 n = 16, CD4NA / OT1 / RAG2 - / - n = 10, P = 0, 0052 (CD4NA / OTI nasuprot CD4NA / OTI / RAG2 - / - ), test za rangiranje zapisa. ( b ) Tipičan histopatološki prikaz tumora prisutnih u mišjoj liniji CD4NA / OTI. Stanica koja ima morfološke sličnosti s "oznakom" ćelije označena je strelicom, uvećanjem × 400; ljestvica, 50 µm. ( c ) Endogena preuređenja TCRβ u tumorima koji su prisutni u mišjoj liniji CD4NA / OTI, prikazana su tri reprezentativna primjera. ( d ) Većina tumora koji se razvijaju kod miševa ima "nulti" stanični fenotip koji nema izraz svih T-staničnih određivača stanične površine uključujući transgeni OT1 TCR (Vα2). Brojevi unutar grafova predstavljaju postotak ukupnog broja živih stanica tumora. ( e ) Reprezentativni primjer tumora sa nultom stanicom koji nastaje u slezini koji ne izražava Vα2 TCR (desni panel), dok zdravi limfni čvorovi uzeti od istog miša izražavaju Vα2 TCR (lijeva ploča). ( f ) CD4NA / OTI miševi kojima se daje MHV-ova razvijaju hepatocelularni karcinom, uvećanje × 400; ljestvica, 50 µm. ( g ) HCC tumori ne izražavaju OTI TCR (Vα2) na njihovoj staničnoj površini, dok neinficirano tkivo slezine kod istog miša. Plava boja predstavlja izotipsku kontrolu, a crvena OTI Vα2 TCR. Reprezentativni primjer triju miševa prikazan je na f i g .

Slika pune veličine

Kako CD4NA / RAG2 - / - / OTI transgenični miševi ne razvijaju limfoidne tumore, moguće je da je RAG djelovao kao esencijalni promotor tumora u mišju NPM-ALK / OTI. RAG1 transkripti ne proizvode humani ALCL tumori (suplementarna slika 3B) (iako se RAG2 transkripti mogu otkriti u našim mišjim NA / OTI tumorima, Dopunska slika Sl. 8E). RAG se normalno gubi ekspresijom i kognitivnom signalizacijom funkcionalnog TCR, tako da je njegova odsutnost u ljudskom ALCL kompatibilna sa zrelim stanicama postimije, ali ne isključuje RAG ekspresiju u ranijoj fazi razvoja ALCL. Alternativno, B-stanice (koje nisu proizvedene na pozadini RAG - / - miša) mogle bi biti ključni doprinos razvoju tumora iako nije bilo značajne infiltracije B-stanica u tumore nastale u CD4NA / OTI miševima (dopunska slika 8F ).

Da bismo procijenili ulogu TCR-Ag interakcije u razvoju perifernog ALCL-a, izložili smo NA / OT1 RAG kompetentne miševe MHV-OVA (MHV68; ref. 21). Iznenađujuće, ovaj prekinuti razvoj ALCL-a pogoduje hepatocelularnim karcinomima i sarkomima, kao što je prikazano na miševima NA / RAG2 - / - / OT1 (Slika 4f, Dodatna tablica 4). To pokazuje da kognitivna periferna TCR signalizacija u stanicama koje eksprimiraju NPM-ALK nije kompatibilna s razvojem i / ili preživljavanjem ALCL-a. Kao što se očekivalo, OTI Vα2 TCR nije bio ekspresioniran na površini tumora koji se razvijaju kod ovih miševa, dok je bio prisutan u neizravnom hematološkom tkivu (Sl. 4 g).

Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da NPM – ALK dopušta zaobići timski β-odabir, ali da je TCR signalizacija potrebna za timski izlazak i razvoj perifernog ALCL-a, čiji posljednji ovisi o naknadnom ukidanju TCR-a (dopunska slika 9). ). Zapravo, analiza 16 humanih ALK + ALCL dvostrukim obojenjem za CD30 i TCRβ lanac pokazala je odsutnost tumorskih stanica koje koeksprimiraju oba proteina, opet sugerirajući da prisutnost TCR nije kompatibilna s preživljavanjem tumorskih stanica u prisutnosti NPM – ALK (dopunska Sl. 3A).

Rasprava

Bilo je notorno teško stvoriti kliničke i imunofenotipske karakteristike ljudskog ALCL-a u transgeničnim mišjim modelima 12, 22, 23, 24, 25 . Sada pokazujemo da NPM-ALK vođen CD4 može dovesti do obilaženja RAG2 - / - -posredovanog mišjeg bloka sazrijevanja DN3 i do razvoja kortikalnog timskog limfoma. Međutim, TCR ekspresija je potrebna za timski izlazak i razvoj perifernih tumora koji po prvi put histološki nalikuju ljudskom ALK + ALCL. Činjenica da se ovi periferni tumori miševa ne mogu razviti u prisutnosti stimulacije transgenih TCR izazvanih jajcima i izgubili su endogenu TCR ekspresiju nevjerojatno slična široko prepoznatoj odsutnosti TCR ekspresije i signalizacije 9, 10, unatoč prethodnom kloniranom preustroju TCR, u ljudskom ALCL-u, i sugeriraju da trajni suživot TCR i NPM-ALK-signaliziranih signala na periferiji nije kompatibilan s razvojem i / ili preživljavanjem ALCL-a. Imunogenetska analiza ljudskog ALCL pokazala je da većina ima značajne unutar okvira, potencijalno odabrane, TCRα reorganizacije receptora u nedostatku uporedivih TCRβ preuređenja, u skladu s nedostatkom detektiranog TCRβ proteina, kompatibilnog s nadomještanjem TCRβ NPM-ALK u razvoj klasičnog ALCL-a.

NPM – ALK je dozvolio stanicama da prođu asinhronu diferencijaciju kroz timski β selekciju u nedostatku TCRβ preuređenja u RAG2 - / - modelu, s izrazom Notch1 (za razliku od miševa rag2 - / - ) i njegovim nizvodnim transporterima hranjivih tvari CD98 i CD71 26, ali održavanjem CD44 i CD117 izraza, u skladu s prethodnom identifikacijom ETP transkripcijskog potpisa u ALCL 11 . To ukazuje da se početni stadiji razvoja ALCL-a javljaju u timusu i kompatibilni su s identifikacijom medijastinalne mase u 50% dječjeg ALCL-a i ekspresijom Notch1 na visokoj razini u ALCL 18, 27 . Kao takav, NPM-ALK signalizacija mora biti u mogućnosti barem djelomično oponašati pre-TCR signalizaciju i omogućiti sazrijevanje do preuređenja TCRα, uključujući u očiglednoj odsutnosti velikog klonskog preuređenja TCRβ, kako je identificirano u 67% (samo za TCRαβ i TCRγ) ljudski ALCL. Čini se da NPM – ALK ne sprječava kontinuirano preuređivanje TCRβ u ljudskom ALCL-u, jer mnogi slučajevi pokazuju klonalnu populaciju PCR-om (ali ne i CGH visoke rezolucije) i kao takvi su vjerojatno prisutni u 1–20% DNK. Nije moguće utvrditi potiču li ta manja preuređenja u ALCL populaciji ili predstavljaju reaktivne T-limfocite koji infiltriraju tumor, ali mi favoriziramo prve, jer bi reaktivni T limfociti koji infiltriraju tumor trebali otkriti pomoću TCRαβ-specifičnih antitijela imunohistohemijom, što nije bio slučaj,

Odgođeni početak razvoja limfoma u modelu NA / RAG2 - / - i njegova odsutnost u NA / RAG2 - / - / OT1 modelu sugerira da TCR signalizacija (ili druga rekombinacija izazvana RAG-om) doprinosi limfomagenezi, iako je to posljedica Ostale, ciljane RAG učinke ostaje istražiti. RAG aktivnost u limfoidnim prekursorima T i B nosi rizik od stvaranja abnormalnosti posredovanih rekombinazom koja bi mogla pridonijeti limfomagenezi, što je prepoznato u akutnoj limfoblastičnoj leukemiji 28 . Alternativno objašnjenje može se nalaziti u sposobnosti RAG proteina da induciraju prekid lanca DNA pri (kriptičnim) rekombinacijskim signalnim sekvencama, što može dovesti do stvaranja onkogenih kromosomskih translokacija. Malo je vjerojatno da je odsustvo B limfocita objašnjenje za neuspjeh razvoja limfoma u odsustvu RAG-a, jer nije bilo značajne infiltracije B-stanica u tumore koji nastaju u CD4NA / OTI miševima.

U ovom modelu, RAG je neophodan za tumore timije koji su uhapšeni prije pozitivne i negativne selekcije u DP-kortikalnim timocitima, ali je potreban za periferne tumore, što dokazuje odsutnost limfoma u miševa NA / RAG - / - / OT1, u skladu s uloga za događaje posredovane rekombinazom u razvoju ALCL-a. Činjenica da je razvoj perifernog ALCL kod rekombinatnih kompetentnih NA / OT1 miševa bio povezan s gubitkom ekspresije transgena TCR, a ta indukcija konstitutivnog TCR signalizacije izlaganjem NA / OT1 miševa jajološkom perifernom razvoju ALCL, sugerira da je TCR-induciran signalizacija djeluje kao tumor-supresivni mehanizam u prisutnosti NPM-ALK u perifernim T stanicama. "Imunološki nadzor" ili funkcija supresije tumora u ALCL dodijeljena je signalizaciji IL2Rγ, a NPM-ALK smanjuje signalne molekule povezane sa TCR, ovisnim o kinazi, STAT3 posredovanim, transkripcijom gena i / ili epigenetskim prigušivanjem 10, 20 .

Jedno moguće objašnjenje je da TCR + ALK + stanice mogu napustiti timus i preživjeti na periferiji, ali da TCR signalizacija potaknuta stimulacijom antigenom dovodi do klonalne delecije u prisutnosti onkogenog ALK-a. Razmnožavanje TCR signalizacije, kao što je vidljivo u ljudskom ALCL, i ponovno stvoreno u RAG-kompetentnom NA / OT1 'tihom' transgenu u nedostatku jajašaca, ostavilo bi ALK signalizaciju neprimijećeno, što pogoduje limfoproliferaciji. Moguće je da Ag (ili druga) T-limfoidna stimulacija unutar određenog konteksta, osim što inducira ekspresiju markerskih aktivacijskih markera ALCL kao što su CD30, perforin i Granzim B (ref. 3), i početno TCR signaliziranje, mogu na neki način naknadno pokreće TCR prigušivanje i neprimjerenu ALK signalizaciju. U skladu s tim, opisan je antigeni podražaj koji izaziva jak imunološki odgovor prije početka ALCL-a, poput sistemskih ALK-pozitivnih ALCL-ovih lezija kože koje nastaju nakon uboda insekta 29 .

NPM – ALK također može dovesti do razvoja ALCL u T-limfoidnim podskupovima, osim prekursora TCRaβ, jer je 19% slučajeva ljudi iskazalo jednolični imunogenetski profil TCRγδ, s timiziranim tipovima Vδ1-Jδ1 30 . Naivne TCRγδ stanice proizvode IL-17, a TH17 profil identificiran je transkripcijskim profiliranjem u ALCL 31 . Osam ALCL (14%) izraženih kombinacija CD2, CD4, CD5 ili CD7, ali nije moguće detektirati TCR preuređenja i kao takvi odgovaraju imunogenetskom ekvivalentu nulte ALCL, što može biti rezultat transformacije NK ili drugih urođenih imunoloških podskupova. Te stanice reagiraju na upalno okruženje citokina, a ne klasično ograničeno na TCR / MHC. Međutim, većina (80%) humanog ALCL-a pokazuje imunogenetske dokaze barem prolazne TCR ekspresije i selekcije tijekom razvoja ALCL-a.

U normalnim TCRαβ linijama timocita, odsutna ili prekomjerna TCR signalizacija dovodi do smrti stanice, kao dio pozitivnog i negativnog odabira TCRαβ repertoara. Naši podaci sugeriraju da signalizacija vođena ALK-om u nedostatku RAG-a može zamijeniti odsutni timski pre-TCR proliferativni signal, s nekontroliranom ekspanzijom kortikalne timocite (kao što je vidljivo u NA / RAG - / - modelu) jer ne postoji mehanizam za TCR- posredovana negativna selekcija. Suživot s funkcionalnim TCR omogućava izlazak timije, ali naknadnu smrt stanica u prisutnosti istodobne signalizacije TCR i NPM-ALK, procesom analognim odabiju timske negativne selekcije. Kao takav, TCR djeluje kao supresor tumora, koji mora biti reguliran za razvoj klasičnog, perifernog ALCL-a. Ta su opažanja očito potrebna daljnja eksperimentalna istraga preciznih mehanizama na kojima se nalazi periferni protu-izbor, ali trenutni podaci opisuju model miševa, koji po prvi put jako nalikuje ljudskom ALCL-u i koji će biti korisni za procjenu novih terapijskih sredstava.

Nadalje, ovo djelo povećava mogućnost da djeca oboljela od ALCL luke 'stanice koje iniciraju limfom' u populaciji timocita koja bi mogla pridonijeti ponovnoj pojavi nakon kemoterapije očito su očistila bolest. Prije smo pokazali da stanice koje razmnožavaju ALCL izražavaju genski potpis povezan s ETP-om u skladu s pretpostavljenim timskim podrijetlom kao što je opisano u trenutnom modelu 32 . Zapravo, transkripti NPM-ALK otkriveni su u 2% novorođenčadi u krvi 33, a ekspresiju NPM-ALK regulira endogeni promotor NPM1 , koji pokreće sveprisutnu ekspresiju NPM1, uključujući u timskim progenitorima (dopunska Sl. 10). Stoga nije nerazumno nagađati da se i NPM-ALK izražava u ovoj staničnoj populaciji.

metode

Ljudska ALCL biopsija

Biopsije tumora dobivene su uz informirani pristanak kod dijagnoze od 57 ALK-pozitivnih ALCL-a centraliziranih na Odjelu za patologiju Universitaire du Cancer u Toulouseu u skladu s protokolima koji su odobreni od institucionalnog pregleda (DC 2009-989) i u skladu s Helsinškom deklaracijom iz 1975., kao što je revidirano 2000. Svi osim dvije (jedna masa mekog tkiva, jedan tumor debelog crijeva) bile su biopsije limfnih čvorova. Među 57 pacijenata, 35 je bilo muškaraca i 22 žene. Ispitna skupina uključila je 48 dječjih ALCL (mlađih od 18 godina) i 14 odraslih ALCL-a. Dijagnoza ALCL postavljena je na tkivima uklopljenim parafinom i utemeljena na morfološkim i imunofenotipskim kriterijima, kako je opisano u posljednjoj klasifikaciji WHO 34, koristeći veliku ploču monoklonskih antitijela protiv CD30 / BerH2, ALK, EMA, nekoliko T ćelija (CD2, CD3ɛ, CD4, CD5, CD7, CD8, CD43) i B-stanični markeri (CD20, CD79a) i citotoksične molekule (Perforin, Granzyme B, TiA1). Slučajevi su klasificirani kao T / NK loza ako su reagirali s jednim ili više antitijela na T- ili NK-stanične antigene CD2, CD3ɛ, CD4, CD5, CD7, CD8, CD43 ili citotoksične molekule i nedostajala im reaktivnost za CD20 i CD79a B -celi povezani antigeni. Nulti fenotip dodijeljen je slučajevima koji ne izražavaju oznake povezane sa T / NK- ili B-stanicama. Sve slučajeve pregledala je međunarodna skupina za patologiju. Pedeset slučajeva izraženih NPM – ALK proteina, četiri TPM3 – ALK i dva ATIC – ALK; u jednom slučaju ALK partner nije identificiran.

Zamrznuti uzorci tumora uz informirani pristanak preuzet su iz banke za tumorsko tkivo CHU de Toulouse, u skladu s protokolima koji su odobreni od institucionalne revizije (DC 2009-989) i u skladu s Helsinškom deklaracijom iz 1975., revidiranom 2000. 2000. Postotak zloćudnih Stanice su na smrznutim dijelovima ocijenjene bojenjem ALKl ili CD30 i bio je veći od 40% za sve odabrane slučajeve. Ukupna ekstrakcija DNA provedena je iz 10 smrznutih dijelova tumorskih biopsija (debljine 10 μm svaka), koristeći QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, Francuska), sukladno protokolu proizvođača. Izvedena je ukupna RNA ekstrakcija iz 40 smrznutih dijelova tumorskih biopsija (debljina 5 μm svaka), koristeći Trizolov ukupni RNA izolacijski reagens (Invitrogen, San Diego, SAD), prema protokolu proizvođača. Koncentraciju je kvantificirao NanoDrop spektrofotometar (NanoDrop Technologies, Wilmington, SAD). Integritet RNA ocijenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Massy, ​​Francuska). Integritet DNK procijenjen je 6% elektroakrozom poliakrilamidnog gela. Kvantifikacija RAG1 transkripta provedena je kao što je prethodno opisano 35 .

Ljudski timijan je dobiven od djece odbačen kao kirurško tkivo, uz informirani pristanak roditelja i etičkog pregleda bolnice Necker Enfants Malades u pariškoj Descartesu.

Genescan analiza ljudskog TCR preuređenja

TCRγ multipleksni PCR izveden je kao što je opisano 36 . Ukratko, 500 ng DNA je amplificirano u 35 ciklusa s 0, 25 µM svakog prajmera, 2, 5 mM MgCl2 i 1 U Taq Gold (Life Technology).

TCRβ i TCRδ multipleksni PCR razvijeni su u okviru koncentrirane akcije Biomed-2 BMH4-CT98–3936 @JJM 37 . Ukratko, 100 ng DNA je amplificirano tokom 35 ciklusa u prisutnosti 0, 2 μM svakog prajmera, 2 mM MgCl2 i 1 U Taq Gold (Perkin Elmer). Konfiguracija gena TCRβ procijenjena je multiplex PCR-om s tri cijevi, od kojih su dva sadržavala 27 VP specifičnih obiteljskih početnih slojeva s devet (PCR A) ili četiri (PCR B) nizvodno Jβ primera (Dodatna tablica 5). Treći (PCR C) je sadržavao svih 13 JP primera i Dβ1 i Dβ2 uzvodne primere (Dodatna tablica 5). TCRβ i TCRδ PCR proizvodi analizirani su heterodupleks analizom i Genscan analizom multipleks fluorescentne PCR odvajanjem jednostrukih niti (denaturiranih) PCR proizvoda označenih fluorohromom u kapilarnom sekvencijalnom polimeru i detekcijom automatskim laserskim skeniranjem. To rezultira Gaussovom raspodjelom više pikova koji predstavljaju mnogo različitih PCR proizvoda u prisutnosti poliklonalnih preuređenja, ali diskretni, uski vrh ako klonska populacija predstavlja najmanje 1-5% DNK.

Veliki broj Vα i Jα segmenata onemogućuje PCR detekciju klonskih preuređenja iz DNK, iako se TCRα VJC transkripti mogu detektirati iz cDNA. TCRα preuređenja su pojačana iz cDNA pomoću Cα i Vα primera u pet multipleksnih RT-PCR reakcija 38 . RNA je izolirana pomoću RNeasy kompleta prema uputama proizvođača (Qiagen, Courtaboeuf, Francuska) i 1 μg ukupne RNA je pretvoreno u cDNA pomoću SuperScript III RT (Invitrogen, San Diego, SAD). Kvaliteta i količina RNA procijenjeni su u odnosu na ABL domaćinstvo gena, prema protokolima razvijenim u mreži Europe protiv raka 39 na AB 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD). RNA (20 ng) je umnožena u svakoj PCR s 1 U Hotstart Taq (Qiagen, Courtaboeuf, Francuska), 10 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 20% Q otopine i 10 pmol svakog prajmera. Taq polimeraza se aktivirala 15 minuta na 95 ° C, nakon čega slijedi 37 ciklusa od 94 ° C tokom 30 s, 63 ° C tokom 45 s i 72 ° C tokom 1, 5 minute. Konačni korak produženja bio je 72 ° C 10 min. Negativna kontrola sastojala se od RNA izolirane iz mononuklearnih stanica periferne krvi od donatora, a pozitivna kontrola RNA izolirana iz Jurkat-ove stanične linije. Nizovi prajmera koji se koriste za pojačavanje TCRA transkripta navedeni su u Tablici 3.

Tablica pune veličine

CGH analiza TCR preuređenja

DNA kod dijagnoze analizirana je komparativnom genomskom hibridizacijom (array-CGH, ​​Agilent humani CGH MicroArray, 180K) i Afymetrics High Density Cytoscan (2, 7 milijuna sondi) prema preporukama proizvođača. Brisanje TCR lokusa, kao odraz V (D) J rekombinacije, definirano je koeficijentom broja kopija CGH log 2, s brisanjem / preuređenjem na jednom alelu definiranom kao 0, 5 do 1, 5, dok su definirani omjeri broja 2 kopije log <1, 5 kao biallelička brisanja / preuređenja. Podaci su dostupni u NCBI GEO bazi podataka pod GSE67131.

Transgeni miševi

Miševi CD4 / NPM-ALK (CD4NA) generirani su kako je prethodno opisano (ljubazno osigurao profesor G. Inghirami, Sveučilište u Torinu, Italija) 12 . Miševi NPM – ALK / OTI (CD4NA / OTI) nastali su križanjem linije CD4NA na OT1 transgeničnu T staničnu liniju (ljubazno osigurao profesor G. Griffiths, Sveučilište u Cambridgeu, Velika Britanija) 14 . Miševi NPM – ALK / RAG2 - / - (NARAG2 - / - ) nastali su križanjem linije CD4NA na liniju RAG2 - / - (ljubazno im je pružio profesor C. Rudd, University of Cambridge, Velika Britanija). NPM – ALK / RAG2 - / - / OT1 (NA / OTI / RAG2 - / - ) miševi nastali su križanjem NARAG2 - / - linije s OT1 transgeničnom T staničnom linijom koja je vraćena u RAG2 - / - liniju. Miševi OTINA bili su izloženi 2x104 pfu MHV-ova (MHV68), intranazalno, tri puta, u mjesečnim intervalima počevši od 6 tjedana starosti. Virus je pripremljen kao što je opisano u ref. 21, a pružio ih je dr. PG Stevenson sa Sveučilišta u Cambridgeu. Svi su miševi bili smješteni pod određenim uvjetima bez patogena u kavezima sa ventilatorom unutar prepreke na Sveučilištu u Cambridgeu i održavani su na genetskoj podlozi C57 / Bl6 i analizirani su u dobi od 4-12 tjedana, osim ako nije naznačeno. Svi postupci provedeni su pod licencom 80/2630 UK Office na Sveučilištu u Cambridgeu u skladu s UKCCR smjernicama.

Genotipizacija miševa izvedena je PCR-om na DNK-u izdvojenom iz biopsije uha, a PCR proizvodi su razdvojeni agaroznom gel elektroforezom kao što je prethodno opisano 12, 40, 41 pomoću sljedećih primera: OT1 FWD 5'- ACGTGTATTCCCATCTCTGG -3 ', OTI R 5′- CTGTTCATAATTGGCCCGA -3 ′; NPM – ALK FWD 5′- TCCCTTGGGGGCTTTGAAATA -3 ′, NPM – ALK RVS 5′- CGAGGTGCGGAGCTTGCTCAG -3 ′; RAG A 5′- GGGAGGACACTCACTTGCCAGTA -3 ′, RAG B 5′- AGTCAGGAGTCTCCATCTCACTGA -3 ′ i NeoA 5′- CGGCCGGAGAACCTGCGTGCAA -3 ′.

Histologija

Miševi koji pokazuju kliničke znakove su eutanazirani i post mortem su obavljeni ispitivanjem svih tkiva na stvaranje tumora. Tumori i / ili pridružena tkiva su fiksirani u 10% formalinu, nakon čega je parafin ugrađen, presječen i obojen hematoksilinom i eozinom za histološki pregled. Sva je obrada tkiva obavljena ili na Odjelu za patologiju Sveučilišta u Cambridgeu, ili na Medicinskom sveučilištu u Beču, Austrija, a odsjeci su neovisno pregledali najmanje dva histopatologa.

imunohistokemija

Imunohistokemija je provedena sa slijedećim antitijelima: CD30 (monoklonski mišji anti-čovjek; klon Ber-H2, 1:50, Dako, Danska); TCR β-F1 (monoklonski mišji anti-čovjek, klon 8A3, 1: 100, Thermo Scientific, IL 61105 USA); ALK1 mAb (1: 100 ljubazno pružio dr. Karen Pulford, Sveučilište u Oxfordu) kako je opisano u ref. 42.

Stanične linije

Ljudske stanične linije SUDHL-1, Karpas-299, HPB-ALL, DND41 i Jurkat kupljene su od DSMZ i kultivirane u RPMI1640 uz dodatak 10% FCS. COST i PIO ALCL stanične linije razvijene su u laboratoriju Lamant i uzgajane su u ISCOVE medijumu (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francuska) uz 10% FCS. Sve stanične linije bile su podvrgnute tromjesečnom testiranju na mikoplazme i ne nalaze se na pogrešnom identificiranom popisu stanica ICLAC i NCBI Biosample.

Protok citometrija

Jednoćelijske suspenzije dobivene su iz izoliranih uzoraka tkiva. Stanice su isprane, prebrojene i obojene sledećim mišjim fikoetrininom, fluoresceinskim izotiocijanatom, alofikocijaninom ili cijaninom 7 (Cy7) - konjugiranim antitijelima: CD4, CD8, CD44, CD25, CD30, CD117, CD3, Vα2 TCR, Notch1 (BD Biosciences Velika Britanija). Nakon bojenja (30 min na 4 ° C, 1: 1.000), stanice su isprane i analizirane korištenjem fluorescentno razvrstanih stanica (FACS) Canto ili Fortessa protočnih citometra (BD Biosciences). Za unutarćelijsku mrlju, stanice su fiksirane u 0, 01% formaldehida u trajanju od 10 minuta, permealizirane u 0, 5% Tween 20 v / v u PBS-u (15 min u mraku na sobnoj temperaturi), stanice su isprane s PBS-om 0, 1% Triton-a i ponovo suspendirane u 100 μl 0, 1% Triton-a u PBS, stanice su obojene i analizirane kao što je prethodno opisano. Alternativno, stanična populacija je sortirana korištenjem FACS Aria stroja kako je detaljno opisano u literaturi. 11.

RT – PCR analiza

RNA je ekstrahirana iz stanica pomoću RNeasy Micro Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača i pretvorena u cDNA pomoću Superscript II reverzne transkriptaze (RT) (Invitrogen), s dNTPs i slučajnim heksamerima. PCR je proveden upotrebom primera specifičnih za NPM – ALK 24, RAG2 ili Vα2 (OTI transgen) (OT1 FWD 5′- ACGTGTATTCCCATCTCTGG -3 ′, OTI R 5′- CTGTTCATAATTGGCCCGA -3 ′; NPM – ALK FWD 5′- TCCCTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG 3 ′, NPM – ALK RVS 5′- CGAGGTGCGGAGCTTGCTCAG -3 ′; RAG A 5′- GGGAGGACACTCACTTGCCAGTA -3 ′, RAG B 5´- AGTCAGGAGTCTCCATCTCACTGA -3 ′ i NeoA 5′- CGGCAGGCAGGGGGGGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG)

Analiza preuređenja na mišjim TCR

DNA je ekstrahirana iz 5 × 106 6 mišjih tumorskih stanica ili timocita pomoću DNeasy Kit za krv i tkivo (Qiagen). PCR je izveden kao što je prethodno opisano 13, 43 . Ukratko, Vβ2 (5'- GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT -3 ′) ili Dβ2 prema naprijed (5 ′ - GGGTCACTGATACGGAGCTG -3 ′) i Jβ2 reverzivni (5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT -3 ′) primer, korišteni (za reakcije VJ i za DJ) pojačavaju preuređene regije TCRβ, koje su potom razdvojene elektroforezom. Potpune neobrezane slike prikazane su na dodatnim slikama 11-14 za sve predstavljene PCR podatke.

RQ-PCR RAG statusa

Cg vrijednosti ekspresije RAG ekspresije normalizirane su za kvalitetu i kvantitetu RNA u odnosu na Abl kao što je prethodno opisano 35 . Recikliran je jedan mikrogram ukupne RNA kao što je opisano 39, a kvaliteta i količina RNA ocijenjeni su u odnosu na ABL domaćinstvo gena, na ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD). Primeri korišteni za analizu Ragl bili su: RAG1 smisao, 5 '-AGCCTGCTGAGCAAGGTACC -3'; antisens, 5′- GAACTGAGTCCCAAGGTGGG -3 ′; sonda, Fam-5′- AGCCAGCATGGCAGCCTCTTTCC -3′-Tamra

imunohistokemija

Imunohistokemija dvostrukog bojenja izvedena je korištenjem automatizirane platforme Ventana Benchmark (Ventana Medical Systems Tuscon, AZ, SAD) sekvencijalnim bojenjem za oba antitijela (prvo TCR β-F1, a zatim CD30). Prethodna obrada izvedena je enzimom I (Leica AR9551) za TCR β-F1 i epitope pronalaženje 1 (Leica AR9961) za CD30. Bojenje je razvijeno korištenjem Bond Polymer Refine detekcijskog kompleta (DAB for TCR β-F1) i Bond Polymer Refine Red kit (AP Fast Red za CD30) prema preporukama proizvođača. ALK1 bojenje je izvedeno korištenjem standardnog protokola. Postupak HIER proveden je za dobivanje antigena primjenom ciljanog rješenja za pretraživanje (DAKO S2369). Razvoj je proveden pomoću IDEtect Super Stain System HRP (ID Laboratories, IDSTM007). Signal je vizualiziran s 3-amino-9-etilkarbazolom (ID Laboratories, BP1108).

Zračenje i intravenska injekcija timocita

Prije ubrizgavanja, divlji miševi primatelji bili su izloženi dva kruga zračenja na ukupno 11 siva radi čišćenja koštane srži domaćina. Timociti su dobiveni iz timusa miša CD4NA koji je pokazao znakove displazije procijenjene ekspresijom proteina stanične površine. Populacije CD44 hi i CD44 lo razvrstane su u PBS pomoću FACS Aria (BD). Poredani timociti iz CD45.2 mišera BL / 6 miševa (3 × 10 5 ) tada su pomiješani sa stanicama koštane srži donora CD45.1 (6, 6 × 10 4 ) i intravenski ubrizgani u ozračene primatelje CD45.2.

Analiza luciferaze

U svakoj reakciji transfekcije 1 × 10 7 Jurkat-ove stanice pomiješane su s plazmidnom DNK u 0, 4 cm elektrodnom razmaku Gene Pulser-kiveta (40 μg pGL2-CD44-luciferaze ptičice, 2 μg pRL-TK vektora i različite količine NPM- ALK vektor kao što je naznačeno) i elektroporacija izvedena na Gene Pulser II (Bio-Rad), pri 0, 25 kV i 950 µF u trajanju od 25 ms. Nakon 48 sati u kulturi, krijesnica i luciferaza renila izloženi su njihovim odgovarajućim supstratima koristeći Stop i Glo kit (Promega), a izlaz izmjeren na Victor 3 multi-label brojaču (Perkin Elmer, Waltham, MA) kao što je prethodno opisano 16,

In vivo EdU analiza stanične proliferacije

Miševima je ubrizgan intraperitonealno s 300 μl 10 mM EdU otopine u PBS-u. After 3 h, mice were killed and the thymus of each mouse was isolated before FACS staining for T cell markers as described in the main text. After staining (30 min at 4 °C), cells were washed and then fixed, permeabilized and EdU incorporation detected using a Click-iT EdU Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen). The amount of EdU incorporated was then measured by Flow Cytometry.

statistika

Data were analysed using a two-tailed Student's t -test (assuming equal variance) or log-rank test, as indicated using GraphPad Prism 6 software (La Jolla, CA).

primki

Omnibus ekspresije gena

  • GSE67131

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Supplementary Figures 1-14 and Supplementary Tables 1-5

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.