Apoptotični cd8 t-limfociti onemogućavaju imunitet posredovan makrofagom na infekciju tripanosomom cruzi | stanična smrt i bolest

Apoptotični cd8 t-limfociti onemogućavaju imunitet posredovan makrofagom na infekciju tripanosomom cruzi | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • CD8-pozitivne T stanice
  • Monociti i makrofagi
  • Parazitska infekcija

Sažetak

Chagasova bolest uzrokovana je infekcijom protozojskim Trypanosoma cruzi . CD8 T-limfociti pomažu u kontroli infekcije, ali apoptoza CD8 T stanica narušava imunitet, a eferocitoza može pojačati infekciju parazitima unutar makrofaga. Ovdje istražujemo kako apoptoza aktiviranih CD8 T stanica utječe na M1 i M2 fenotipove makrofaga. Prvo smo otkrili da CD8 T-limfociti i upalni monociti / makrofagi infiltriraju peritoneum tijekom akutne infekcije T. cruzi . Pokazano je da tretman anti-Fas ligandom (FasL) sprječava apoptozu limfocita, pojačava reakcije tipa 1 na parazitske antigene i smanjuje infekciju u makrofazima kokultiviranim s aktiviranim CD8 T stanicama. Anti-FasL potkoljenice miješale su M1 / ​​M2 makrofag profile u polarizirani M1 fenotip, in vitro i nakon ubrizgavanja u zaražene miševe. Nadalje, inhibicija T-stanične apoptoze izaziva široko reprogramiranje reakcija na citokine i poboljšava imunitet na T. cruzi posredovan makrofagom. Rezultati pokazuju da odlaganje apoptotskih CD8 T stanica povećava diferencijaciju M2-makrofaga i doprinosi postojanju parazita.

Glavni

Chagasova bolest, uzrokovana patogenim protozoanom Trypanosoma cruzi , endemska je pojava u Latinskoj Americi, unatoč naporima za kontrolu vektora i prenosa insekata. 1 T. cruzi paraziti inficiraju gotovo bilo koju stanicu, dostižući citoplazmu, gdje dolazi do replikacije, nakon čega dolazi do stanične smrti i širenja zaraznih parazita. Većina pacijenata ostaje asimptomatska, ali postojanost parazita često rezultira kroničnom bolešću, koja utječe na periferni živčani sustav ili srce pacijenata. 2, 3 Stanični i humoralni imuni odgovori prevladavaju akutnu infekciju, ali ne uspijevaju eliminirati T. cruzi i zaražene stanice. 4 Nema dostupnih cjepiva ili djelotvornih lijekova za liječenje utvrđene bolesti. 3

Protozoan T. cruzi opremljen je molekularnim aparatom koji aktivira više Toll-like receptora i inducira urođenu imunost. Konkretno, makrofagi imaju kritičnu ulogu kao stanice domaćina, stanice koje prezentiraju antigene i učinke za ubijanje parazita. 5, 6, 7, 8 Ovisno o podražajima, makrofagi mogu izraziti različite aktivacijske fenotipe i učinke na infekciju. M1 / klasično aktivirani / M (LPS + IFN- γ ) makrofagi obično proizvode IL-12 i NO za ubijanje unutarćelijskih patogena, dok alternativno aktivirani makrofagi, koji pripadaju M2 spektru, pomažu u obnavljanju tkiva i zapravo potiču rast infekcije i tumora. 9, 10, 11, 12

Za kontrolu infekcije potrebne su T stanice kao i antitijela. 13, 14, 15 CD8 T stanice eliminiraju stanice u kojima se nalaze paraziti u citoplazmi, dok i CD4 i CD8 T stanice stvaraju IFN- γ i aktiviraju makrofage da obuzdaju infekciju. 16, 17 T-limfociti s efektom također promiču imunopatologiju u srcu. 18, 19 Suprotno tome, regulatorni mehanizmi koje pružaju citokini i apoptoza efektorskih stanica smanjuju upalu i sprečavaju patologiju, ali mogu pridonijeti postojanju parazita. 20, 21

Limfociti se podvrgavaju apoptozi tijekom infekcije T. cruzi , što negativno utječe na širenje T-stanica, 22, 23 B-staničnog odgovora, 24 ubijanja parazita klasično aktiviranim makrofazima, 23, 25 i imunitetom posredovanim T-stanicama T8. 26, 27 Nadalje, unos apoptotskih stanica potiče infekciju unutar makrofaga, proizvodnjom prostaglandina E-2 (PGE-2), TGF- p i poliamina, 28 karakteristika povezanih s M2 / alternativno aktiviranim makrofazima. 9 Suprotno tome, blokada stvaranja PGE-2 ili inhibicija apoptoze limfocita inhibitorima kaspaze smanjuje rast parazita in vitro i parazitemiju. 28, 29 Stoga su apoptoza i eferocitoza potencijalni terapeutski ciljevi. 20, 30, 31 Međutim, još uvijek nije poznato utječe li eferocitoza na polarizaciju makrofaga M1 / ​​M2 u upalnom okruženju infekcije.

Istražili smo molekularne mehanizme koji stoje na osnovi apoptoze T-stanica u infekciji T. cruzi i pronašli smo funkcionalnu ekspresiju i Fas (CD95) i Fas liganda (FasL), aktivnosti 23, 26 kaspaze-8, i aktiviranja efektorske kaspaze-3 29 , 32 u T stanicama od T. cruzi- inficiranih miševa. Kako bismo spriječili apoptozu tijekom akutne infekcije, koristili smo farmakološke pristupe i modele miša s nedostatkom apoptoze. 23, 26, 29, 32 Međutim, intrinzični nedostaci imunoloških odgovora isključili su precizne interpretacije imunoloških ishoda kod FasL-mutantnih miševa 23 ili kod miševa koji izražavaju inhibitor kaspaze-8 virus-FLIP (virusni FLICE / protein inhibicije kaspaze-8) u T ćelije. 32 Do sada je opći inhibitor kaspaze zVAD i antagonist anti-FasL mAb učinkovito inhibirao apoptozu i pojačao imunitet na infekciju T. cruzi . 26, 29 CD8, ali ne i CD4, čini se da su T stanice preferencijalne mete za rane učinke inhibicije apoptoze u akutnoj infekciji, temeljene na ranijoj kinetičnosti aktivacije T8 stanica CD8 i većoj ekspresiji Fas. 26, 29 Oba tretmana poboljšala su preživljavanje CD8 T-stanica, aktivaciju makrofaga i kontrolu parazita kod zaraženih miševa. 26, 29 Interakcije između CD8 T stanica i makrofaga nisu u potpunosti istražene i mogle bi biti presudne za objašnjenje djelotvornog imuniteta izazvanog inhibicijom apoptoze. Nadalje, vrijedno je istražiti kako aktivirane i apoptotske CD8 T stanice utječu na različite fenotipe makrofaga tijekom infekcije. Korištenjem primarnih kultura CD8 T stanica i makrofaga zaraženih miševa rekapitulirali smo većinu karakteristika uočenih in vivo pri inhibiciji apoptoze. Kao što je procijenjeno pomoću in vitro i in vivo pristupa, inhibicija apoptoze T-stanica utječe na ishod CD8 presjeka T-stanica-makrofag da reprogramira imunološki odgovor na infekciju T. cruzi .

Rezultati

CD8 T stanice i monociti repopuliraju peritonealnu šupljinu kod infekcije T. cruzi

Kao validirani eksperimentalni model Chagasove bolesti koristili smo BALB / c miševe zaražene kemijski izvedenim metacikličkim probapomastigotima klona Dm28c T. cruzi . 33 Vrhunac parazitemije ~ 3 tjedna nakon infekcije, imunološkog odgovora i upale u srcu reproduciraju obilježja infekcije T. cruzi izazvane metacikličkim parazitima koji potiču od insekata. 33 Pored toga, CD8 T stanice prevladavaju u upali srca, 33 kao što je to opaženo kod ljudskih pacijenata. 34 Procijenili smo fenotip stanica peritonealnog eksudata (PEC) tijekom akutne infekcije i otkrili smo da je oko 20–40% PEC-a CD8 T-stanica (slika 1a), dok stanice CD4 + predstavljaju samo 5% PEC-a u normalnim i inficiranim miševima (nije prikazano). Apsolutni broj CD8 T stanica također se povećava tijekom infekcije (slika 1b). T8 stanice CD8 predstavljaju važan izvor IFN- γ , što je otkriveno u peritonealnim eksudatima zaraženih miševa (Slika 1c) i u PEC stimuliranim antigenom T. cruzi (Ag; Tzelepis i dr. 35 ) (dopunska slika S1). Iako 30–50% PEC-a iz normalnih miševa izražava F4 / 80 marker makrofaga na visokim razinama, samo 10–20% PEC-a iz zaraženih miševa izražava F4 / 80 na srednjim razinama (F4 / 80 int ) (Slika 1a). Suprotno tome, 30–40% PEC od zaraženih, ali nije normalno, miševi nose Ly6C marker upalnih monocita / makrofaga (Slika 1a). Apsolutni broj monocita (slika 1b), ali ne F4 / 80 + makrofagi (nije prikazan), također se povećava nakon infekcije. Čini se da F4 / 80 int makrofagi iz zaraženih miševa potječu iz Ly6C + monocita, umjesto rezidualnih rezidentnih makrofaga. Zbog toga, upalni monociti / makrofagi sadrže oko 40–60% PEC-a, koji se prianjaju za ploče s kulturom i stječu F4 / 80 int (slika 2d). Oko 90% adhezivnih stanica su F4 / 80 int i CD11b-dvostruko pozitivni makrofagi.

Image

CD8 T stanice i makrofazi koji potječu od monocita kod akutne infekcije T. cruzi . ( a ) Postotak CD8 + T stanica, Ly6C + monocita i F4 / 80 + makrofaga u PEC od miševa zaraženih T. cruzi u usporedbi s PEC od neinficiranih (d 0) miševa. ( b ) Apsolutni broj CD8 + T stanica i Ly6C + monocita i ( c ) IFN- y u peritonealnom eksudatu od normalnih i zaraženih (18 dpi) miševa. ( d ) Ekspresija markera MGL1 (M2) i IL-12p35 (M1) (kao i odgovarajući kontrolni mAbs, gornja ploča) u F4 / 80 + makrofagovima iz normalnih ili zaraženih (18 dpi) miševa uzgojenih tijekom 48 h. ( e ) Slika prikazuje PEC od zaraženih (18 dpi) miševa i predstavlja rezultate tri neovisna eksperimenta. T stanice obojene su s anti-CD8 (PE, crvena, strelica), makrofagi obojeni anti-MGL1 (Alexa Fluor 488, zelena), i jezgre označene DAPI (plava). ( f ) Parazitski teret kao tripometigoti koje makrofagi oslobađaju od normalnih ili zaraženih (18 dpi) miševa uzgajanih tijekom 3 tjedna nakon infekcije metacikličkim parazitima. U ( a, b, c i f ), svaki simbol predstavlja pojedinačnog normalnog (Δ) ili inficiranog (▾) miša. Ukazuje se na značajne razlike između normalnih ( N = 5–10) i zaraženih ( N = 3–7) miševa (*), što je analizirano analizom varijancije (ANOVA) Dunnettovim post-testom ( a ) i t- testom ( b), c i f ). Grafikoni prikazani u ( d ) reprezentativni su za najmanje tri neovisna pokusa s bazenima stanica inficiranih (18 dpi) miševa, uzgajanih u dvije do četiri tehničke replike. IL, interleukin

Slika pune veličine

Image

Pomak M2-fenotipa u peritonealnim stanicama liječenim anti-FasL. ( a - f ) PEC-i normalnih miševa zaraženih T. kruzi (18-20 dpi) uzgajani su sa ili bez anti-CD8 ili anti-CD3 vezanim na ploču u prisutnosti ili odsutnosti anti-FasL ili kontrolnog imunoglobulina G ( IgG). ( b i c ) Neke su kulture stimulirane s T. cruzi Ag, kako je naznačeno. ( b ) NE proizvodnja u supernatantima i vitalnost adhezivnih stanica (pomoću MTT testa) su procijenjeni nakon 24 h ( b, gornja ploča) ili 48 h. ( c ) izlučeni citokini izmjereni su u 48 h supernatantima ispitivanjem imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA). ( d i e ) Stanice se odvajaju za procjenu ekspresije MGL1 u stanicama koje su zatvorene F4 / 80 + . Rezultati su izraženi kao sredstva i SEM i predstavljaju tri neovisna eksperimenta s tri tehničke replike združenih stanica zaraženih miševa. Ukazuje se na značajne razlike između tretmana (*), kako ih je analizirao t -test ( e ) ili analizu varijance (ANOVA) s Tukeyevim post-testom ( b, gornja ploča) ili dvosmjernom ANOVA s Tukey-jevom ( b, srednja ploča) ili Bonferroni ( b, donja ploča i c ) post-test

Slika pune veličine

Makrofagi iz zaraženih miševa izražavaju M1 i M2 fenotipove

Da bismo se pozabavili funkcionalnim fenotipom makrofaga, izmjerili smo ekspresiju IL-12p35 i lektina tipa 1 makrofaga lektina-1 (MGL1, CD301a) 36 kao surogat markera M1 i M2. Iako većina makrofaga iz normalnih miševa izražava MGL1, IL-12p35 i MGL1 definirali su dvije podskupine u makrofagovima od zaraženih miševa (Slika 1d). Pored toga, makrofagi iz normalnih miševa dopusuju infekciju parazitima nego makrofazi zaraženih miševa (Slika 1f). Zanimljivo je da smo otkrili MGL1 + makrofage povezane sa staničnim krhotinama apoptotskih CD8 T stanica u PEC od zaraženih miševa (slika 1e i dodatna slika S2). Prema tome, 20–30% peritonealnih CD8 T stanica podvrgava se apoptozi tijekom akutne infekcije (nije prikazano), a do 40% F4 / 80 makrofaga podnosi unutarćelijske CD8 + događaje (dopunska slika S2). Ovi rezultati sugeriraju da je razvoj funkcionalnih fenotipa kod makrofaga pod utjecajem aktivacije citokina tipa 1 nasuprot supresije apoptotskim stanicama.

Blokada FasL utječe na preslušavanje između T stanica i makrofaga

Iskoristili smo prisutnost i CD8 T stanica i monocita / makrofaga u peritoneumu zaraženih miševa da bismo istražili interakcije između CD8 T stanica i makrofaga. Pretpostavili smo da prisutnost apoptotskih stanica može uravnotežiti aktivaciju makrofaga i utjecati na imunitet na infekciju T. cruzi . Ranije smo izvijestili da eferocitoza pojačava rast parazita unutar makrofaga iz miševa zaraženih T. cruzi . 28 Da bismo procijenili kako apoptoza aktiviranih T stanica utječe na fenotip makrofaga, tretirali smo kulture s neutralizirajućim anti-FasL ili kontrolirali IgG mAb (Slika 2a). Anti-FasL je povećao NO odgovore, ali nije poboljšao održivost makrofaga (Slika 2b i Dodatna slika S3). Također smo koristili anti-CD8 vezan na ploču da bismo dobili inficirane mišje stanice obogaćene CD8 od inficiranih miševa (70–80% iz supernanata kulture). Zapanjujuće, tretman NO-induciranim NO-om u kulturama obogaćenim CD8 T-stanicama, kako u prisutnosti tako i u odsutnosti Ag stimulacije (Slika 2b, donje ploče). Anti-FasL potencirani IL-12 i TNF- α , ali ne i IFN- y odgovor u kulturama obogaćenim CD8 T-stanicama (Slika 2c). Tretman anti-FasL takođe je povećao proizvodnju NO (slika 2b) i citokina tipa 1 (slika 2c) u kulturama aktiviranim anti-CD3. Konačno, anti-FasL je smanjio ekspresiju MGL1 u F4 / 80 + makrofazima (Slike 2d i e). Stoga je tretiranje primarnih kultura peritonealnih limfocita i makrofaga anti-FasL promoviralo f1tip M1-makrofaga, ali suzdržalo M2-makrofage.

Apoptoza u kokultiviranim CD8 T stanicama onemogućuje imunitet posredovan makrofagom

Istražili smo utječe li ili ne apoptoza T-stanica na aktivaciju makrofaga kokultivirajući makrofage pročišćenim / slezenskim CD8 T stanicama zaraženih miševa (Slika 3a). Za inficirane kokultacije, PEC od zaraženih miševa pažljivo su isprani da bi se uklonile adhezivne stanice, a zatim zarazile metacikličkim tripomastigotima. Koristili smo topljivi anti-CD3 da induciramo aktivaciju i apoptozu CD8 T stanica. Anti-FasL, ali ne i kontrolni IgG, smanjio je apoptozu CD8 T-stanica (zasnovano na obojenju aneksinom V i 7-AAD), povećavajući za dva puta oporavak održivih CD8 T stanica iz kokultura, ali ne i IFN- γ proizvodnju CD8 T ćelije (slika 3b). Zanimljivo je da su se paraziti razmnožavali u prisutnosti aktiviranih CD8 T stanica, za razliku od kultura samo s makrofazima (slika 3c), usprkos proizvodnji NO u aktiviranim kulturama (slika 3c). Suprotno tome, liječenje anti-FasL pomoglo je makrofazima u kontroli infekcije i daljnjoj povećanju aktivacije makrofaga, što je procijenjeno proizvodnjom IL-6 i NO (Slika 3c). Anti-FasL nije povećao IFN- γ u kokulturama, a neutralizacija IFN- γ nije uklonila učinke anti-FasL na proizvodnju NO (nije prikazano). Osim toga, nismo pronašli nikakav izravni učinak anti-FasL samo na makrofage (nije prikazano). Da bi se riješila bilo koje uloge anti-FasL neovisnog o sprječavanju aktivacije izazvane apoptozom, nestimulirane kokulture također su tretirane anti-FasL ili kontrolnim IgG (slika 3d). Apoptoza u CD8 T stanicama i rast parazita u makrofazima zabilježeni su u kulturama aktiviranim anti-CD3, dok je istodobno liječenje anti-FasL smanjenom apoptozom i infekcijom T. cruzi (slika 3d, lijeva ploča). Tretman anti-FasL također je poboljšao proizvodnju NO u stimuliranim kulturama (Slika 3d). U usporedbi s kontrolnim IgG, nismo pronašli značajan učinak anti-FasL u nestimuliranim kulturama (slika 3d). Ovi su rezultati kompatibilni s ranije uočenim štetnim učincima eferocitoze na proizvodnju NO i ubijanjem parazita izazvanim izravnom aktivacijom s IFN- y i LPS. 28

Image

FasL posredovana apoptoza CD8 T stanica potiče infekciju T. cruzi u kokultiviranim makrofazima. ( a-d ) Peritonealni makrofagi zaraženih (18 dpi) miševa zaraženi su T. cruzi i kokultivirani s pročišćenim slezenastim CD8 T stanicama zaraženih (18-20 dpi) miševa u prisutnosti interleukin-2 (IL-2). Kokulture su stimulirane ili ne topljivim anti-CD3 i tretirane ili ne anti-FasL ili kontrolnim imunoglobulinom G (IgG). ( b-d ) Nakon 48 h, supernatanti kulture sakupljeni su za NO ili citokinske odgovore. ( b i d ) CD8 T stanice prikupljene su za detekciju apoptoze obojenjem aneksinom V i 7-aminoaktinomicinom D (7-AAD). ( c i d ) adhezivne stanice uzgajane su tijekom 2-3 tjedna za određivanje opterećenja parazitima kao oslobođeni tripometigoti. Podaci su izraženi kao sredstva i SEM od tri tehničke replike. Svaka skupina podataka ( b-d ) predstavlja najmanje tri neovisna pokusa. Ukazuje se na značajne razlike između tretmana u kulturama aktiviranim anti-CD3 (*), što je analizirano analizom varijance (ANOVA) ( b i c ) ili dvosmjernom ANOVA ( d ) s Tukeyjevim post-testom

Slika pune veličine

FasL-inducirana T-stanična apoptoza reprogramira reakcije makrofaga

Funkcionalni fenotip zaraženih makrofaga kokultiviran s CD8 T stanicama također je ocijenjen pomoću citokinove matrice i ELISA testom. Stimulacija CD8 T stanica anti-CD3 pokrenuta apoptoza, poticaj rasta parazita, smanjena proizvodnja NO (Slika 4a) i inducirano reprogramiranje fenotipa makrofaga (Slika 4b). U nedostatku anti-CD3, kokultureni (inficirani) makrofagi izrazili su prevladavajući M1 fenotip, proizvodeći NO (slika 4a) kao i citokine tipa 1 (slika 4b, gornja i donja ploča). Uspjeli smo identificirati barem dva različita obrasca reakcija na aktivaciju s anti-CD3 i liječenje anti-FasL. Prvo, anti-CD3 downmodulirani citokini NO i M1 (slike 4a i b, donje ploče). Drugo, novi skup citokina (IL-1 β , IL-3, IL-10, IL-13 i GM-CSF) je reguliran (Slika 4b). Izuzetno je da je liječenje anti-FasL spriječilo aktivaciju izazvanu apoptozu, smanjio rast parazita i djelomično obnovio proizvodnju NO kao i M1 fenotip (slike 4a i b, donje ploče). Suprotno tome, IL-3, IL-13 i GM-CSF su podmodulirani nakon anti-FasL tretmana (Slika 4b). Otkrivene su samo niske razine reakcija drugog tipa 1 (IL-12p70, IL-23) ili tipa 2 (CCL11, CCL17, IL-4, IL-5) (nisu prikazane). Kako bismo isključili učinke parazita na reakcije na citokine, dodatno smo procijenili liječenje anti-FasL kako bi se spriječila apoptoza u kulturama koje nisu bile izložene in vitro T. cruzi (slika 5a). Za razliku od zaraženih kultura, citokini tipa 1 bili su u bazalnoj razini u nestimuliranim kulturama (Slika 5b). Ipak, izlučivanje CXCL9, TNF- a i G-CSF povećalo se nakon stimulacije CD-3 (Slika 5b). Slično tome, IL-lp, IL-3, IL-10, IL-13 i GM-CSF su regulirani u aktiviranim kulturama. Tretman anti-FasL smanjio je razinu IL-1 β , IL-3, IL-13 i GM-CSF, ali povećao lučenje CXCL9 (Slika 5b). Stoga, aktivacija T-stanična apoptoza inducira makrofage na ekspresiju M2 fenotipa koji nije u stanju kontrolirati infekciju T. cruzi .

Image

Apoptoza CD8 T stanica korelira sa širokim reprogramiranjem reakcija makrofaga na citokine. ( a i b ) Zaraženi makrofagi i slezenske CD8 T stanice zaraženih miševa stimulirani su ili nisu topljivi anti-CD3 u prisutnosti interleukina-2 (IL-2). Kokultacije aktivirane anti-CD3 tretirane su ili nisu anti-FasL ili kontrolnim imunoglobulinom G (IgG). Nakon 48 h, supernatanti kulture sakupljeni su za procjenu odgovora NO ( a ) ili citokina ( b ), što je procijenjeno citokinskim nizom. CD8 T stanice analizirane su na obojenje ( a ) s annexin V / 7-AAD (7-aminoaktinomicin D). Adherentne stanice su kultivirane tijekom 4 tjedna za određivanje oslobođenih trypomastigotes ( a ). Podaci predstavljaju srednju i SEM vrijednost dvije ( b ), ili tri do četiri ( a ) tehničke replike. Podaci prikazani u ( a ) predstavljaju najmanje tri neovisna pokusa. Ukazuje se na značajne razlike između tretmana (*), što je analizirano analizom varijance (ANOVA) s Bonferroni post-testom ( a )

Slika pune veličine

Image

Apoptoza CD8 T stanica korelira s M2-citokinskim odgovorima. ( a i b ) Peritonealni makrofagi i slezenske CD8 T stanice zaraženih miševa stimulirani su ili nisu topljivi anti-CD3 u prisutnosti interleukina-2 (IL-2). Kokultacije aktivirane anti-CD3 tretirane su ili nisu anti-FasL ili kontrolnim imunoglobulinom G (IgG). Nakon 48 h, supernatanti kulture sakupljeni su za procjenu reakcija na citokine, što je procijenjeno imunološkim testom vezanim za enzim (ELISA) ( b ). CD8 T stanice analizirane su na obojenje ( a ) s annexin V / 7-AAD (7-aminoaktinomicin D). ( b ) Potpune linije stoje za citokine proizvedene stimuliranim CD8 T stanicama, a isprekidane linije predstavljaju citokinske odgovore makrofaga. Podaci predstavljaju prosjek i SEM od tri do četiri tehničke replike u najmanje tri neovisna eksperimenta. Ukazuje se na značajne razlike između tretmana (*), što je analizirano analizom varijance (ANOVA) s Bonferroni post-testom

Slika pune veličine

Anti-FasL smanjuje M2 makrofage kod infekcije T. cruzi

Istražili smo hoće li liječenje in vivo anti-FasL biti dovoljno učinkovito da modulira fenotip makrofaga u aktiviranom okruženju infekcije. Procijenili smo fenotip makrofaga 3 dana nakon jedne intraperitonealne injekcije anti-FasL kod zaraženih miševa (Slika 6a). U usporedbi s miševima koji su primili kontrolni IgG, miševi tretirani anti-FasL pokazali su povećanu proizvodnju G-CSF-a, ali smanjenu sekreciju IL-1 β , IL-3, IL-10 (Slika 6b) i ekspresiju M2 markera MGL1 u F4 / 80 + makrofagi (slika 6d). Nadalje, spontana proizvodnja NO povećala se u 24 h uzgojenih makrofaga, dok je porast parazita smanjen u makrofagama kod miševa koji su tretirani anti-FasL (Slika 6c). Stoga je liječenje anti-FasL zamijenilo miješane M1 / ​​M2 stanice s efektorima M1 makrofazima u zaraženih miševa. Ovi rezultati pokazuju da blokada apoptoze limfocita anti-FasL poboljšava imunitet posredovanih makrofazima, ali ne isključuje inhibiciju apoptoze u drugim stanicama ili druge moguće učinke blokiranja FasL tijekom infekcije.

Image

Liječenje anti-FasL promiče imunitet posredovan makrofagom na infekciju T. cruzi . (a-d) Zaraženi miševi BALB / c (18 dpi) tretirani su intraperitonealno anti-FasL (100 µg) ili kontrolnim imunoglobulinom G (IgG). Kao kontrola korišćeni su neinficirani miševi. ( b ) Nakon 3 dana, peritonealni eksudati su analizirani na citokine i hemokine. ( c ) Peritonealni makrofagi uzgajani su tijekom 24 sata prije ocjenjivanja spontane proizvodnje NO-a ili su zaraženi T. cruzi i uzgojeni tijekom 2 tjedna prije određivanja opterećenja parazitima. ( d ) PEC-ovi su procijenjeni na ekspresiju MGL1 u stanicama F4 / 80 + . Simboli predstavljaju peritonealne stanice ili eksudate pojedinačnih normalnih (Δ) ili zaraženih (▾) miševa liječenih anti-FasL ili imunoglobulinom G (IgG) ( N = 6 miševa po skupini). U ( c ), svaki simbol predstavlja sredstva od dvije do tri tehničke kopije uzgojenih stanica svakog pojedinog miša. Značajne razlike između tretmana prikazane su kao (*) za P <0, 05 u t- testu

Slika pune veličine

Inhibicija kaspaze povećava omjer M1 / ​​M2 makrofaga

Koristili smo opći inhibitor kaspaze zVAD.fmk za ciljanje unutarćelijskih kaspaza. 29 Liječenje zVAD-om smanjuje aktivaciju kaspaze-3 i apoptozu u CD8 T stanicama zaraženih miševa (Silva i sur. 29, a podaci nisu prikazani). Nadalje, predobrada zVAD-om spriječila je eferocitozu CD8 T stanica kokultiviranim makrofazima (dopunska slika S2). Da bismo procijenili kako blokada apoptoze T-stanica utječe na fenotip makrofaga, koristili smo in vitro i in vivo pristup (slike 7a i b). Prvo, ploča-vezana anti-CD3 zarobila (i aktivirala) peritonealne T stanice zajedno s adhezivnim PEC. Zatim smo ovim primarnim kulturama T stanica i makrofaga ili kulturama makrofaga dodali zVAD ili DMSO (Slika 7a). U usporedbi s kontrolnim razrjeđivačem (DMSO), liječenje zVAD-om smanjilo je ekspresiju MGL1 i udvostručilo omjer IL-12 / MGL1 u F4 / 80 + makrofazima iz aktiviranih kultura (Slika 7a). Stoga je liječenje aktiviranih kultura peritonealnih limfocita i makrofaga fenotipom izmijenjenog zVAD makrofagom. Nismo pronašli značajne učinke zVAD-a samo na makrofage. Za in vivo eksperimente, slezinske T stanice (i CD4 i CD8 T stanice u omjeru 1: 1) zaraženih miševa prvo su stimulirane anti-CD3 u prisustvu zVAD ili DMSO 4 ili 24 sata (za analize apoptoze, slika 7c). Nakon 4 sata, aktivirane T stanice su isprane i ubrizgane u zaražene miševe (Slike 7d i e). Kontrole su bile zaraženi miševi kojima je ubrizgan PBS. Nakon 2 dana, PECs su sakupljeni i aktivirani, prije bojenja za ekspresiju MGL1 i IL-12p35 u F4 / 80 + stanicama. Nakon ubrizgavanja aktiviranih T stanica tretiranih zVAD-om, F4 / 80 + makrofagi iz zaraženih miševa izrazili su dva puta više IL-12p35 i povećali omjer IL-12p35 / MGL1 (slike 7d i e), kao i IL-12p70 (slika 8a), u usporedbi s miševima ubrizganim DM stanicama tretiranim DMSO. Peritonealni eksudati primatelja T-stanica tretiranih zVAD-om također su iskazali povećanu razinu CXCL9 (slika 8a) i smanjenu sekreciju M2 citokina (slika 8b) u usporedbi s zaraženim miševima ubrizganim s PBS-om. Nadalje, kultivirani makrofagi iz miševa koji su primili zVAD tretirane T stanice proizveli su više NO i pokazali bolju kontrolu in vitro infekcije od makrofaga od miševa kojima je ubrizgan PBS (Slika 8c). Stoga apoptoza T-stanica ima širok učinak na funkcionalni fenotip makrofaga, a mi smo uspjeli vratiti imunitet posredovan makrofagom primjenom strategija koje sprečavaju apoptozu T-stanica i in vitro i in vivo .

Image

Inhibicija uzrokovane aktivacijom smrti T-stanica pomiče M2 u M1 makrofage. ( a ) PEC od miševa zaraženih T. cruzi uzgajani su sa ili bez pločica vezanih anti-CD3 u prisutnosti inhibitora kaspaze zVAD ili dimetil sulfoksida (DMSO). Stanice se odvajaju nakon 48 sati za procjenu ekspresije MGL1 i IL-12p35 u stanicama sa zatvorenim F4 / 80 + . Proizvodnja NO nije izmjerena u 48 h kultura supernanata. Rezultati su izraženi kao sredstva i SEM od tri do četiri tehničke kopije združenih PEC iz zaraženih miševa. ( b ) T stanice normalnih ili inficiranih miševa (20 dpi) tretirane su anti-CD3 u odsustvu ili prisutnosti zVAD ili DMSO tijekom 4 sata za in vivo injekciju i 24 sata ( c ) za protočnu citometriju. ( c ) T stanice su analizirane na bojanju aneksina V u CD8 i CD4 T stanicama. Rezultati su izraženi kao sredstva i SEM od četiri do pet tehničkih replika. ( d i e ) Inficirani miševi (20 dpi) ubrizgani su intraperitonealno fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) (-) ili s 2 × 106 aktivnih T stanica (tretiranih zVAD ili DMSO). Nakon 2 dana, prikupljeni su i aktivirani PEC s PMA i ionomicinom, prije bojenja za ekspresiju MGL1 i IL-12p35 u stanicama F4 / 80 + . ( e ) Simboli predstavljaju PEC od pojedinačnih zaraženih miševa liječenih PBS (A) ili s T stanicama (▾) aktiviranim u prisutnosti zVAD ili DMSO ( N = 4 miševa po skupini). Ukazuje se na značajne razlike između tretmana (*), koje su analizirane t- testom ( a i c ) ili analizom varijancije (ANOVA) s Tukeyjevim post-testom ( e )

Slika pune veličine

Image

Inhibicija T-stanične apoptoze pojačava imunitet posredovan makrofagom na infekciju T. cruzi . ( a - c ) Sleplenske T stanice iz zaraženih miševa (18 dpi) tretirane su anti-CD3 u prisutnosti inhibitora kaspaze zVAD ili dimetil sulfoksida (DMSO) 4 sata. T stanice su isprane i usvojene premještene intraperitonealno na zaražene miševe (20 dpi). Zaraženi miševi ubrizgani fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) korišteni su samo kao kontrola. Nakon 2 dana, peritonealni eksudati su analizirani na ( a ) M1 i ( b ) M2 citokine. ( c ) Peritonealni makrofagi uzgajani su tijekom 24 sata prije ocjenjivanja spontane proizvodnje NO-a ili zaraženi T. cruzi i uzgojeni tijekom 4 tjedna prije određivanja opterećenja parazitima. ( a i b ) Simboli predstavljaju peritonealni eksudat pojedinačnih miševa kojima je ubrizgan PBS (Δ) ili s aktiviranim T stanicama (▾) prethodno tretiranim zVAD ili DMSO ( N = 5 miševa po skupini). U ( c ), svaki simbol predstavlja sredinu dvije do tri tehničke kopije uzgojenih stanica svakog pojedinog miša. Ukazuje se na značajne razlike između tretmana (*), koje su analizirane t- testom ( c ) ili analizom varijance (ANOVA) s Tukeyjevim post-testom ( a i b)

Slika pune veličine

Rasprava

Ovdje smo se pozabavili kako interakcije između makrofaga i CD8 T stanica utječu na fenotip makrofaga i sposobnost borbe protiv infekcije parazitima. Otkrili smo da FasL posredovana apoptoza CD8 T-stanica inducira široko reprogramiranje reakcija makrofaga i obećavajući je cilj za povećanje regulacije imunoloških odgovora na infekciju. Pokazano je da intervencije s agensima koji blokiraju apoptozu T-stanica i eferocitozu (tj., Anti-FasL ili zVAD) vraćaju imunitet posredovan makrofagom.

Prije smo koristili ranije i opetovane injekcije anti-FasL ili zVAD, što je poboljšalo imunološki odgovor limfocita i makrofaga, te smanjilo parazitemiju. 26, 29 Ovdje smo testirali odloženo i kraće liječenje tijekom akutne infekcije, vremenom kada CD8, ali ne i CD4, T stanice dođu do upalnih makrofaga u peritonealnoj šupljini. Upalni makrofagi iz zaraženih miševa izražavaju Ly6C, monocitni marker koji se nalazi i u nezrelim mijeloidnim stanicama iz srca miševa zaraženih T. cruzi . 37 Stoga, tijekom akutne infekcije, peritonealni makrofagi imaju obilježja nezrelih mijeloidnih stanica, a samo mali dio PEC-a izražava F4 / 80. Nakon adhezije, PEC iz zaraženih miševa gube Ly6C i stječu F4 / 80 int ekspresiju, zajedno s M1 (IL-12) i M2 (MGL1) markerima. Unatoč tome, primarne kulture makrofaga i peritonealne CD8 T stanice tretirane anti-FasL ili zVAD smanjile su M2 i povećale M1 fenotip. Nadalje, ko-tretman anti-FasL pogoršanih odgovora tipa 1 i na anti-CD3 i na parazit Ag.

U kulturama makrofaga i slezene CD8 T stanice zaraženih miševa makrofagi eksprimiraju F1 fenotip i stvaraju NO i ubijaju parazite. Suprotno tome, aktiviranje apoptozom CD8 T ćelija izazvanom anti-CD3, smanjilo je stvaranje NO i značajno povećalo broj parazita, usprkos višim razinama IFN- γ u kokulturama. Ono što je također važno, zajednički tretman anti-FasL poboljšao je oporavak održivih CD8 T stanica i proizvodnju NO i pomogao makrofazima u kontroli zaraze parazitima. Stoga je povećana replikacija parazita u korelaciji s početkom apoptoze u CD8 T stanicama.

Zatim smo se usredotočili na citokine koji su modulirani i anti-CD3 i anti-FasL. Otkrili smo da aktiviranje i liječenje anti-FasL dovode do širokog reprogramiranja reakcije makrofaga. Anti-FasL je regulirao protuupalne citokine IL-6 i CXCL9, ali je smanjio IL-1 β , IL-3, IL-13 i GM-CSF. Iako proizvodnja IL-1 β može pomoći imunitet na T. cruzi , izlučivanje IL-1 β nije povezano s proizvodnjom NO ili ubijanjem parazita u kokulturama. Suprotno tome, rast parazita povezan je s proizvodnjom IL-3, IL-13 (zajedno s IL-10) i GM-CSF, koji su potencijalni promotori parazita, bilo induciranjem PGE-2 39 i arginaze 40 ili direktnim utjecajem parazita rast, 25 značajki povezanih s M2 makrofazima. Slično tome, M2 makrofagi inducirani u nedostatku IL-12 potiču infekciju T. cruzi . 10 Stoga je blokiranjem apoptoze CD8 T stanica u kokulturama liječenje anti-FasL ograničilo rast fenotipa i parazita nalik M2 te povećalo NO i druge značajke M1. Slično tome, kratkotrajno liječenje anti-FasL in vivo smanjilo je M2 odgovore, ali poboljšalo ubijanje parazita makrofazima. Stoga, blokada apoptoze limfocita anti-FasL ili zVAD korelira s neuređenim omjerom M1 / ​​M2 i promiče imunitet posredovan makrofagom. Nadalje, na temelju bezbroj uključenih citokina i hemokina 11, mogao bi imati široki utjecaj na imunološke odgovore.

Koliko znamo, prvi smo pokazali da apoptoza aktiviranih CD8 T stanica izravno utječe na fenotip makrofaga i potencijalni je cilj poboljšanja imuniteta. Iako su i zVAD i anti-FasL djelotvorni za jačanje imuniteta, za razliku od inhibicije kaspaze, put Fas-smrti stoji kao selektivniji cilj. Ovo je važno za sprječavanje potencijalnih nuspojava blokiranja apoptoze ili eferocitoze, poput narušavanja samo tolerancije i regulacije imunoloških odgovora, ometanja popravljanja tkiva ili utjecaja na imunitet na tumore. 41, 42, 43 Suprotno tome, liječenje anti-FasL može utjecati na apoptozu tijekom tekućih imunoloških odgovora koji dovode do povišenja FasL-a. Unatoč tome, drugi izravni ili neizravni učinci anti-FasL na aktivaciju makrofaga 44 ili smrt 45 ne mogu se isključiti, a potencijalno povećanje slijedećih Th1 i Th2 odgovora 23, 26 treba uzeti u obzir.

Nedavno su Vasconcelos i sur. 27 je pokazalo da proapoptotski fenotip Ag-specifičnih CD8 T-stanica koje eksprimiraju višu razinu Fas korelira s oštećenim imunološkim odgovorima na infekciju T. cruzi . Nadalje, virusno cjepivo koje eksprimira Ag parazita sprečava razvoj proapoptotskih CD8 T stanica i promovira imunitet, uključujući citotoksične i CD8 T stanice koje eksprimiraju citokine. 27 Na temelju ovih i prethodnih nalaza, smatramo dvije glavne, ali ne isključive hipoteze za objašnjenje modulacije infekcije parazitima liječenjem anti-FasL. Prvo, sprječavanjem smrti CD8 T-stanica, anti-FasL može obuzdati negativne učinke eferocitoze na aktivaciju makrofaga. Drugo, anti-FasL bi pomogao imunitet spašavanjem efektivnih CD8 T stanica, koje aktiviraju ili ubijaju makrofage iz miševa zaraženih T. cruzi . Iako imamo dokaze o citotoksičnoj aktivnosti i proizvodnji IFN- γ od strane CD8 T stanica, učinci anti-FasL na fenotip makrofaga ne koreliraju s višim razinama IFN- γ ili s povećanom vitalnošću makrofaga ili sa smanjenom citotoksičnošću. Vrijedno je istražiti da li blokada apoptoze potiče pojačane efektorske aktivnosti antigen specifičnim CD8 T stanicama in vivo i kako liječenje anti-FasL ili zVAD utječe na različite podskupove efektorskih stanica. Važno je da podgrupe CD8 T stanica koje eksprimiraju perforin i IFN- y mogu imati suprotstavljene (patogene u odnosu na zaštitne) uloge u Chagasovoj bolesti. 18

Naši rezultati kompatibilni su s hipotezom da inhibicija CD8 T-stanične apoptoze potencira imunitet posredovan makrofagom ograničavanjem inhibicijskih učinaka eferocitoze na makrofage. Prvo, apoptotske stanice imaju izravne učinke na makrofage i na zaražene miševe kako bi promovirali parazite, 25, 28, 46 bakterijske, 47, 48, 49, 50 i virusne 51 infekcije. Drugo, eferocitoza mijenja funkciju makrofaga inducirajući različite metaboličke programe 28, 50 i proizvodnju topljivih faktora. 28, 48, 49, 50 Efferocytosis inducira izlučivanje TGF-P, 28 što suzbija ekspresiju sintaze dušičnog oksida (dodatna slika S4) i stvaranje NO 28 nakon LPS i / ili IFN- y stimulacije. Treće, učinci apoptotskih stanica mogu se zaustaviti ometanjem unosa apoptotskih stanica, metaboličkom aktivnošću ili proizvodnjom topljivih medijatora. 28, 48, 49 Ipak, važno je da aktiviranje ili supresija imunoloških odgovora uslijedi kada eferocitoza posreduje dendritičkim stanicama 52, 53 ili makrofazima koji fagocitoziraju apoptotske stanice, ovisno o genetskoj pozadini / imunološkim osobinama stanica 46 ili infekcijama, 50, 53, 54 Nedavna otkrića sugeriraju da makrofagi koriste različite skupine receptora za eferocitozu u homeostatskim ili upalnim uvjetima. 55 Eksperimentalni model Chagasove bolesti pruža priliku da se ispita kako su različiti receptori uključeni u eferocitozu i modulaciju fenotipa makrofaga u upalnom okruženju infekcije T. cruzi, kao i kako će to utjecati na razvoj bolesti. Dok M1 makrofagi mogu poticati upalu, M2 makrofagi mogu izazvati fibrozu u srcu 56 u kontekstu infekcije parazitima.

Ovdje pokazujemo da iako efektorske CD8 T stanice mogu pridonijeti upalnom okruženju u tkivima, apoptoza CD8 T-limfocita uravnotežuje aktivaciju makrofaga, negativno utječući na imunitet na infekciju T. cruzi , promovirajući diferencijaciju makrofaga prema fenotipu sličnom M2. Nadalje, farmakološki alati usmjereni na apoptozu mogu obnoviti reakcije M1-makrofaga, otvarajući nove putove za promicanje imuniteta na zarazne bolesti.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

Glosar

dpi

dana nakon infekcije

FasL

Brzi ligand

MGL1

lektin tipa makrofaga galaktoze-1

PIP

stanica peritonealnog eksudata

PMA

forbol miristat acetat

PGE-2

prostaglandin E-2

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)