Poremećaj spektra autizma povezan je sa stresom endoplazmatskog retikuluma izazvanim mutacijama u adhezijskoj molekuli sinaptičke stanice, cadm1 | stanična smrt i bolest

Poremećaj spektra autizma povezan je sa stresom endoplazmatskog retikuluma izazvanim mutacijama u adhezijskoj molekuli sinaptičke stanice, cadm1 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Poremećaji autizma
  • Genetika bolesti
  • Mutacija

Sažetak

Poremećaj autizanskog spektra (ASD) je neurorazvojni poremećaj s nepoznatom molekularnom patogenezom. Nedavno molekularni fokus bio je mutirani neuroligin 3, neuroligin 3 (R451C), u istraživanjima porasta funkcije i zbog njegove uloge u induciranom oštećenju sinaptičke funkcije, ali stres endoplazmatskog retikuluma izazvan mutiranim molekulama također zaslužuje istraživanje. Prethodno smo pronašli dvije mutacije zablude, H246N i Y251S, u molekuli adhezije sinaptičke stanice-1 (CADM1) koja kodira gen, u bolesnika s ASD-om, uključujući cijepanje mutiranog CADM1 i njegovu unutarćelijsku akumulaciju. U ovom istraživanju otkrili smo da mutirani CADM1 pokazuje blago smanjene homofilne interakcije in vitro, ali da većina njegovih interakcija traje. Mutirani CADM1 također je pokazao morfološke abnormalnosti, uključujući kraće dendrite i oslabljenu sinaptogenezu u neuronima. Divlji CADM1 djelomično je lokaliziran u ER C2C5 stanica, dok se mutirani CADM1 uglavnom akumulirao u ER unatoč različitoj osjetljivosti prema 4-fenil maslačnoj kiselini s kemijskom kapepenskom aktivnošću i rapamicinu s promocijskom aktivnošću za razgradnju agregiranog proteina. Analiza modeliranja sugerirala je izravan odnos između mutacija i promjene konformacije. I mutirani CADM1 i neuroligin 3 (R451C) uzrokovali su reguliranje C / EBP-homolognog proteina (CHOP), ER markera stresa, sugerirajući da pored oštećenja trgovine ljudima, ova regulacija CHOP također može biti uključena u patogenezu ASD-a.

Glavni

Poremećaj autizanskog spektra (ASD) najčešći je nasljedni neurorazvojni poremećaj, karakteriziran oslabljenim socijalnim interakcijama, poremećajem komunikacije i ograničenim i ponavljajućim ponašanjima; trenutno se procjenjuje preko 15 lociranja osjetljivosti, 1 ali glavni način nasljeđivanja ostaje nepoznat. Genetskim testiranjem kod pojedinaca s ASD-om identificirane su mutacije u genima koji kodiraju nekoliko molekula adhezijske sinaptičke ćelije, uključujući neuroligin (NLGN) 3 i 4, molekulski stanični adhezivni molekul-1 (CADM1) i protein-sličan protein 2, 22 4 NLGN su proteini postinaptičke adhezije ćelija koji stupaju u interakciju s neureksinima na presinaptičkoj membrani, 5 i potrebni su za sazrijevanje sinapse. 6 Interakcije neureksin-NLGN potiču diferencijaciju γ- aminobuterne kiseline (GABA) i postinaptičke specijalizacije glutamata. 7 Mutant povezan sa ASD-om, NLGN3 (R451C), zadržava se unutarćelijski, što ograničava njegove prije-sinapske interakcije. 8 Neki od mutiranih NLGN4 također se ne transportiraju do stanične površine i umjesto toga se zadržavaju u endoplazmatskom retikulu (ER). 9

CADM1 (poznat i kao RA175 / SynCAM1) je membranski glikoprotein koji pripada superfamiliji imunoglobulina (Ig) i lokaliziran je na obje strane sinaptičke pukotine. Njegova izvanćelijska domena pokazuje aktivnost adhezije homofilne trans -ćelije neovisnu o kalciju, 10, 11, a njegova unutarćelijska domena povezuje se s sermod / treonin-kinazom povezanom s kalmodulinom preko pojedinačnih domena koja vežu PDZ (PDZ: post-sinaptički protein gustoće / Drosophila disk veliki supresor tumora / zonula okludens-1 protein). 10 Nedavno smo identificirali dvije mutancije mutacije, C739A (aminokiselina: H246N) i A755C (Y251S), u genima CADM1 muških kavkaških bolesnika s ASD-om i članovima njihovih obitelji. 3 Obje mutacije smještene su u trećoj Ig (Ig3) domeni CADM1, što je bitno za transaktivne interakcije. Ove mutacije povezane s ASD-om potiču cijepanje CADM1 i izazivaju neispravni promet na staničnoj površini. 3 Ovi rezultati sugeriraju povezanost između oslabljene sinaptogeneze i patogeneze ASD.

Međutim, miševi s oštećenjem nlgn3 ne pokazuju srčane simptome koji su primijećeni u bolesnika s ASD-om. 6 Suprotno tome, knock-in miševi koji izražavaju NLGN3 (R451C), mutaciju uključenu u ASD, 12 pokazuju ponašanja analogna osnovnim simptomima ASD-a, uključujući oslabljeno socijalno ponašanje. 12, 13 Ovaj nalaz sugerira da su i mutacija gubitka funkcije i dobitak funkcije uključene u patogenezu ASD. ER stres je dobitak funkcija povezan s mutiranim proteinom.

Sustav kontrole kvalitete ER prepoznaje rastvorene ili pogrešno savijene proteine ​​i aktivira ER-senzore naprezanja putem signalnih senzora stresa nazvanih neotkriveni odgovor proteina (UPR). 14, 15, 16 PKR-slična ER-kinaza, jedan od senzora stresa u ER-u, posebno regulira prijevod CAAT / proteina koji veže pojačivač (C / EBP) -homologni protein (CHOP / Gadd153) 17 putem fosforilacije eukariotski faktor inicijacije-2 α (eIF2 α ). Zanimljivo je da CHOP regulira sinaptičku funkciju reguliranjem prometa membrane18 i da eIF2 α kinaza, GCN2, kontrolira sinaptičku plastičnost, učenje i pamćenje. 19, 20 Međutim, malo je poznato što se tiče povezanosti mutiranih molekula povezanih sa ASD-om i ER stresa.

U ovom istraživanju pokazujemo da mutacije CADM1 povezane sa ASD, H246N i Y251S i mutacije NLGN3, R451C, uzrokuju UPR odgovor uz povećanje regulacije CHOP kao dobitak funkcije.

Rezultati

Isprva smo ispitivali trans- interakciju između divljeg tipa i mutiranih CADM1 molekula in vitro pomoću padajuće i Western blot analize (Slika 1a). Usporedili smo trans- interakcije između rekombinantnih proteina CADM1-His-tag-konjugiranih zrncima kojima nije nedostajala transmembranska domena i bilo divljeg tipa CADM1 ili mutiranih CADM1 proteina (Slika 1a). U usporedbi s interakcijom divljeg i divljeg tipa, interakcije između proteina mutanta i divljeg tipa blago su smanjene, a većina njihove interakcije, 83, 5% CADM1 (H246N) i 74, 6% CADM1 (Y251S), ostali su. Da bismo kvantitativno procijenili ovu homofilnu interakciju, pripremili smo rekombinantne izvanstanične domene divljeg tipa i mutirane CADM1 proteine ​​i ispitali njihovu interakciju fluorescentnom korelacijskom spektroskopijom (Slika 1b). Mutirana aktivnost CADM1 homofilne interakcije bila je oko 20 ± 5% slabija od aktivnosti CADM1 divljeg tipa.

Image

Učinci mutacija na interakcijsku aktivnost. ( a ) Interakcija između His-označenog divljeg tipa (WT) CADM1 i myc-označenog WT-a ili mutiranog CADM1. (lijeva ploča) Analiza imunoblota. Myc-WT i mutirani (H246N- ili Y251S-) CADM1 koji su djelovali u interakciji s His-WT CADM1 otkriveni su Western blot analizom upotrebom antitikla protutijela. U usporedbi s WT-om, mutirani CADM1 nije bio povezan sa Njegovom označenom CADM1. (desna ploča) Densitometrijska analiza. Podaci iz tri eksperimenta skenirani su. Intenziteti pojasa za vezani CADM1 (H246N) i (Y251S) normalizirani su na vezani divlji tip CADM1 i predstavljeni kao srednja vrijednost sd Svi eksperimenti su izvedeni tri puta, a prikazani su tipični podaci. P <0, 05 u usporedbi s divljim tipom. ( b ) FCS analiza interakcije protein-protein između rekombinantnih proteina WT CADM1 ili onih mutiranih CADM1. Interakciju je otkrio FCS koristeći molekule označene TAMRA kao sonde. Ispitali smo interakciju između TAMRA-etiziranog i ne-obilježenog WT-CADM1, TAMRA-obilježenog i ne-obilježenog CADM1 (H246N), i TAMRA-etiziranog i ne-obilježenog CADM1 (Y251S). Svi su pokusi izvedeni tri puta. Rezultati su srednja ± sd tri različita određivanja. P <0, 05 u usporedbi s divljim tipom

Slika pune veličine

Također smo modelirali kemijsku strukturu CADM1 (slika 2a) s modelom u kojem su ostaci H246 i Y251 smješteni u području koje odgovara NH2-terminalnom lancu domene Ig3 (aminokiselinski slijed 160–324). Model je pokazao da mutacije H246N i Y251S predstavljaju smanjenje veličine bočnih lanaca NH2-terminalnog lanca. Mutacije su također inducirale promjenu konformacije (Slika 2b), a u usporedbi s H246N, mutacija Y251S izazvala je veću konformacijsku promjenu u regiji.

Image

Modelirana struktura mutiranog CADM1. ( a ) Ig3 domena CADM1, koja je izgrađena korištenjem Ig3 domene NCAM-a kao predloška i registrirana u MODBASE. 39 Pramenovi NH2 - i COOH na modelu su crveni i žuti. Ostaci prikazani kao štapići mogu biti uključeni u trans- interakciju. Mutni ostaci, H246 i Y251, u cijan su. ( b ) Nadređeni modeli divljeg tipa (crni), mutant H246N (zeleni) i mutantni C25MS Y251S (plavi) pomoću MOLMOL-a. 40 Slijed aminokiselina, PQVHIQMTYP, pokazuje izmijenjeno područje u mutantu Y251S u usporedbi s divljim tipom

Slika pune veličine

Da bismo ispitali odnos između mutiranog CADM1 i patogeneze ASD-a, transficirali smo myc-označenim sekvencama CADM1 divljeg tipa i H246N- ili Y251S-mutiranim CADM1 u neurone i ispitali njihovu kolokalizaciju s sinaptofizinom, markerom sinapse. Isključili smo utjecaje endogenog Cadm1 primjenom neurona izoliranih iz mišjih zametaka deficitarnih Cadm1 na embrionalni dan (E) 16. Dendriti transfektiranih neurona uglavnom su pokazali tri vrste morfologije (slika 3, tablica 1): većina neurona koji su eksprimirali divlji tip CADM1 imali su duge dendrite (> 100 µm) sa sinaptofizin-pozitivnim bodljima; neuroni koji su eksprimirali mutirani CADM1 ili su imali kratke dendrite (<100 µm) bez sinaptofizina ili uopće nisu imali dendrite. Stoga su neuroni koji eksprimiraju mutirani CADM1 pokazali nenormalne dendrite i oslabljenu sinaptogenezu.

Image

Lokalizacija divljeg tipa i mutirani CADM1 u neuronima. Izolirani neuroni iz embriona miševa oštećenih za cadm1 (E16) transficirani su divljim tipom i mutirani CADM1 (H246N ili Y251S). Njihova lokalizacija u sinapsi ispitana je imunološkanjem sa anti-SynCAM (Cadm1; crvena), anti-sinaptofizinom (zelena) i Hoechstom (plava). Zatvorene strelice: CADM1 bez sinaptofizina; strelice, neuroni s kratkim ili bez dendrita. Ljestvice: 25 μ m

Slika pune veličine

Tablica pune veličine

U usporedbi s molekulima divljeg tipa, mutirani CADM1 češće je pokazao unutarćelijsku akumulaciju. Ispitali smo unutarćelijsku lokalizaciju divljih vrsta CADM1 i CADM1 (Y251S) u transficiranim stanicama i neuronima C2C5 (slika 4a). Divlji CADM1 djelomično je kolokaliziran anti-KDEL, markerom ER, dok se CADM1 (Y251S) pretežno akumulirao u ER. Divlji CADM1 također je djelomično kolokaliziran beclinom, koji je lokaliziran na različitim organelama, uključujući trans- Golgi, mitohondrije i ER, 21 dok je akumulirani CADM1 (Y251S) kolokaliziran ER-lokaliziranim beklinom (slika 4b). Beklin je bio uglavnom lokaliziran na ER pod stresom ER (slika 4c), što sugerira da je nakupljanje CADM1 (Y251S) u ER uzrokovalo stres ER.

Image

Lokalizacija divljeg tipa i mutirani CADM1. ( a ) C2C5 stanice i neuroni su 26 sati transficirani divljim tipom i mutiranim CADM1 (Y251S). Nakon fiksacije, stanice su imuno obojene sa anti-SynCAM (Cadm1, zelena), anti-KDEL (crvena). ( b ) Transficirane C2C5 stanice imuno obojene su anti-SynCAM (zelena), anti-beklin (crvena) i Hoechst (plava). ( c ) C2C5 stanice su također tretirane sa ili bez tapsigargina (Thap, 1 μM) tijekom 24 sata i otkrivene su anti-KDEL (zelena), anti-beklina (crvena) i Hoechst (plava). Ljestvice: 20 μ m

Slika pune veličine

Stanice koje eksprimiraju CADM1 (Y251S) često su pokazale nenormalnu morfologiju okruglih stanica (Slike 4 i 5a). 4-fenil maslačna kiselina (4-PBA), potencijalni kemijski kapepen u ER 22, smanjio je unutarćelijsku akumulaciju i abnormalnu morfologiju stanica koje eksprimiraju mutirani CADM1 (Y251S) (slika 5a i b). ER-lokalizirani beclin ima ulogu u regulaciji autofagije. 21 Rapamicin, koji stimulira razgradnju nakupljenog proteina aktivacijom autofagosoma, 23 inhibira unutarćelijsku akumulaciju CADM1 (Y251S) (Slika 5a i b).

Image

Učinci 4-fenil maslačne kiseline (4-PBA) ili rapamicina na unutarćelijsku akumulaciju mutiranog CADM1 u stanicama C2C5. ( a ) Akumulacija mutiranog CADM1 (Y251S) u prisutnosti ili odsutnosti 4-PBA (7, 5 mM) ili rapamicina (10 µg / ml). C2C5 stanice su transficirane 28 sati divljim tipom i CADM1 (Y251S), zatim fiksirane paraformaldehidom i imunostanirane anti-SynCAM (Cadm1). Ljestvice: 50 μ m. ( b ) Stanična populacija koja pokazuje nakupljanje divljeg tipa i mutirane CADM1 (Y251S) u prisutnosti ili odsutnosti 4-PBA ili rapamicina. Obavljena su tri pokusa. Trake označavaju sd

Slika pune veličine

Također smo istražili mutiranu COPM1-induciranu regulaciju CHOP-a nizvodno od ER-stresa. 24, 25 I CADM1 (H246N) i CADM1 (Y251S) potaknuli su reguliranje CHOP (slika 6a), a CHOP-pozitivne stanice češće su otkrivene u stanicama koje su eksprimirale CADM1 (H246) i (Y251S) (Slika 6b). U stanicama koje eksprimiraju NLGN3 (R451C), CHOP-pozitivne stanice se također češće otkrivaju u usporedbi sa stanicama koje eksprimiraju divlji tip NLGN3 (slika 6c). Tako su mutirani proteini CADM1 (H246) i (Y251S) kao i protein NLGN3 (R451C) najvjerojatnije potaknuli ER stres, uzrokujući povećanje regulacije CHOP.

Image

Ekspresija CHOP u stanicama koja eksprimira mutirani CADM1 i mutirani neuroligin 3. ( a ) Mutirana CADM1-inducirana regulacija CHOP. Stanice C2C5 transficirane su divljim tipom, CADM1 (H246N) ili (Y251S) cDNA i inkubirane 24 sata. Porast regulacije CHOP analiziran je imunoblotskom analizom primjenom anti-CHOP. ( b ) Postotak CHOP-pozitivnih stanica u stanicama koje eksprimiraju divlji tip ili mutirane CADMl. ( c ) Postotak CHOP-pozitivnih stanica u stanicama koje eksprimiraju divlji tip ili R451C-mutirani neuroligin (NLGN) 3. Ljestvice: 5 μm. Trake označavaju sd

Slika pune veličine

Rasprava

ER stres i mutirani CADM1

Mutirani CADM1 pokazao je najviše trans- interakcijske aktivnosti in vitro, ali se akumulirao u ER i pokazao oštećenu trgovinu, sugerirajući da oslabljena sinaptička funkcija uzrokovana neispravnim prometom mutiranog CADM1 može biti povezana s patogenezom ASD. Međutim, miševi s manjkom cadm1 26 kao i miševi 6 koji nedostaju nlgn3 nisu pokazali sve srčane simptome ASD (Takayanagi i dr. , Podneseni drugdje); pored neplodnosti, 26 miševa s nedostatkom cadm1 ispoljavalo je abnormalne tjeskobe i oslabljenu ultrazvučnu vokalizaciju, ali nije pokazalo narušenu socijalnu interakciju i ograničeno stereotipno ponašanje. Za razliku od cadm1 u testisu, gubitak sinaptičke funkcije cadm1 kod miševa s nedostatkom cadm1 mogli bi djelomično nadoknaditi ostali članovi obitelji Cadm. Ova mogućnost sugerira da je gubitak funkcije CADM1 ili NLGN3 jedan od faktora, ali nije dovoljan samo faktor da izazove ASD. Dobitak funkcije njihovih mutiranih molekula mogao bi biti još jedna značajka koja se odnosi na patogenezu ASD. 27

ER stres je dobitak funkcije povezane s mutiranim proteinima. 25 Pogrešno savijeni i neobloženi proteini provjeravaju se pod nadzorom ER sustava kontrole kvalitete u ER-u, nakon čega slijedi obrada ER-sistemom razgradnje (ERAD), ali ako razgradnja nije dovoljna, oni se akumuliraju i uzrokuju ER stres s UPR. 25 ER stres je signal koji odzvanja sustav kontrole kvalitete u početnim fazama UPR-a. Rapamicin inhibira ER stres potičući aktivaciju stvaranja autofagosoma, 25, 28 što također doprinosi razgradnji nagomilanih mutiranih proteina na ER membrani u suradnji s ERAD-om posredovanim s ubikvitinom / proteasomima. 23, 29 Osjetljivost CADM1 (Y251S) na rapamicin ukazuje da ubikvitin / proteasom posredovani ERAD nije dovoljan za njegovu razgradnju. Ovaj zaključak je također potpomognut izmijenjenom konformacijom i osjetljivošću na 4-PBA. Nadalje, mutirani CADM1 kao i NLGN3 (R451C) uzrokovali su reguliranje CHOP, sugerirajući da su mutirani CADM1 kao i NLGN3 (R451C) zadržani u ER-u, što je uzrokovalo ER stres s CHOP uregulacijom kao UPR. Ovo će biti jedno od važnih pitanja u budućnosti.

Odnos između ER stresa i patogeneze ASD

Kronični i višak ER stresa dovodi do smrti neuronskih stanica i može biti povezan s patogenezom neurodegenerativnih bolesti. 30 Međutim, malo je poznato o vezi između ER stresa i patogeneze ASD. Druga su istraživanja pokazala da kompleks gomoljaste skleroze (TSC), neurogenetski poremećaj uzrokovan mutacijom gubitka funkcije bilo u genima TSC-1 ili TSC-2 , također može biti povezan s ER stresom. TSC često rezultira izrazitim manifestacijama središnjeg živčanog sustava, uključujući epilepsiju, mentalnu retardaciju i ASD. 31, 32 Stanice s nedostatkom TSC-a pokazale su konstitutivnu aktivaciju sisavskog cilja rapamicina i pokazale su se vrlo osjetljivom na ER stres. 33 Dakle, širok izbor mutacija koje uzrokuju ER stres može biti povezan s patogenezom ASD.

ASD može biti rezultat abnormalnog prometa membrane sinaptičkih funkcionalnih molekula izazvanog ER stresom. CHOP djeluje u interakciji s heterodimernim receptorima GABA B1a R / GABA B2 R i inhibira stvaranje heterodimernih kompleksa; to rezultira unutarćelijskom akumulacijom i smanjenom ekspresijom receptora na površini stanice. 18 U bolesnika s ASD-om, razina GABA B1 R značajno je smanjena u području Brodmanna 9 i području Brodmanna 40 na mozak i mozak, dok je razina GABA B2 R značajno smanjena u moždanu. 34 Stoga je moguće da relativno niska razina ER stresa može mijenjati unutarstanični transport GABA B R do stanične površine uguranjem CHOP bez utjecaja na staničnu smrt neurona u mozgu.

Nenormalna morfologija neurona koji izražavaju mutirane molekule može biti posljedica ER stresa i ER stresa povezanih s nenormalnom trgovinom membrana. Trenutno, međutim, nije jasno je li mutirani molekulski posredovani molekulski stres povezan sa ER stresom posredovanom autofagosomskom aktivacijom u patogenezi ASD. Reguliranje mutiranog ER-a posredovanog molekularnim stresom bit će još jedno važno pitanje u budućnosti. Ulazni miševi koji izražavaju mutirani cadm1 koji se odnosi na ljudski CADM1 (H246N) ili (Y251S) pružit će više uvida u odnos između ER stresa i patogeneze ASD.

Materijali i metode

Test interakcije protein-protein

Njegov označeni rekombinantni protein divljeg tipa-CADM1 (48–334 aa, uključujući tri domene Ig) kojima nedostaje transmembranska domena pripremljen je korištenjem stanica svilenih glista (Katakura Industries Co., Tokyo, Japan). 35 Njegov označeni CADM1 (48–334 aa) pročišćen je Ni-stupom prema protokolu proizvođača (Qiagen Science, Germantown, MD, SAD).

Divlji tip ili mutirani CADM1 u pcDNA vektoru je transfektiran u COS stanice pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Nakon inkubacije tijekom 28 sati, stanice su lizirane s PBS-om koji sadrži 1% Triton X-100, te centrifugirane 20 000 rpm tijekom 20 minuta, COS-stanični ekstrakti. Njegov označeni rekombinantni protein Cadm1 (48–334) (2 μg proteina) inkubiran je s ekstraktima (500 μg proteina) iz COS stanica koje eksprimiraju divlji tip, H246N- ili Y251S-mutirani Cadm1 (48–334) - preko noći na 4 ° C. Kompleksi su izolirani iz inkubacijske smjese vezanjem s Ni-kolonom i otkriveni imunoblotskom analizom korištenjem anti-myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) i ocijenjeni denzitometrijskom analizom. Podaci iz tri eksperimenta skenirani su i analizirani radi kvantifikacije pomoću softvera Image J (National Institutes of Health).

Fluorescentna korelacijska spektroskopija (FCS)

Rekombinantni protein obilježen TAMRA (mutirani ili divlji tip Cadm1 (48–334 aa, uključujući tri domene Ig)) bez nedostatka transmembranske domene pripremljen je korištenjem in vitro Kit-a za fluorescenciju označavanja 543). 36 TAMRA obilježeni i neobilježeni rekombinantni protein pročišćen je korištenjem RTS 100, E. coli HY Kit (Roche, Basel, Švicarska). FCS mjerenja provedena su korištenjem sustava detekcije fluorescencije s jednom molekulom MF20 (Olympus, Tokyo, Japan). Za otkrivanje rekombinantnog proteina koji je obilježen TAMRA, upotrijebljen je helij-neonski laser (543 nm). Rekombinantni mutirani ili divlji tip Cadm1 (4 nM) s TAMRA-om pomiješan je s neobilježenim rekombinantnim mutiranim ili divljim Cadm1 (0–40 nM) i dodan u smjesu u PBS-u s 0, 05% Tween 20. Nakon što su smjese bile inkubira se 1 sat na 37 ° C, alikvot (50 μl) svakog uzorka prenese se u mikroploču (24 x 16 jažica, Olympus). Za dobivanje optičkih parametara potrebnih za pravilno mjerenje korišteno je standardno rješenje (MF-D543PX, Olympus). Sva mjerenja provedena su u višestruko duplikatima i s 10 skeniranja, a svako je trajalo 10 s na sobnoj temperaturi. Dobiveni podaci namješteni su prema funkciji autokorelacije utjelovljenoj u priloženom softveru.

Modeliranje strukture mutiranog CADM1

Strukturu Ig2 i Ig3 domena divljeg tipa i mutirani CADM1 izgrađen je SWISS-MODEL 37 koristeći kristalnu strukturu MuSK (unos PDB: 2IEP) kao predložak i aminokiselinski slijed od 163–327 od CADM1. Za modeliranje H246N i Y251S mutanta CADM1, ulazni nizovi su modificirani odgovarajući njihovim mutacijama.

Transfekcija divljeg tipa i mutirani CADM1-myc u neurone

Neuroni su izolirani iz mozga miševa s nedostatkom cadml u embrionalnom danu 16, kako je opisano. 38 Neuroni su uzgojeni uz primjenu Neurobasal medija s dodatkom 2% B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) i L-glutaminom (0, 5 mM). Kulture se inkubiraju na 37 ° C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% C02. Nakon 6 dana in vitro (DIV), neuroni su transfektirani divljeg tipa ili mutirani (H246N) ili (Y251S) myc-označeni CADM1 primjenom metode kalcijevog fosfata i inkubirani za 2 DIV.

imunološko

Za imuno-obojenu analizu za intracelularnu lokalizaciju CADM1 i sinaptofizina u neuronima i C2C5 stanicama, stanice su transficirane divljim tipom i mutiranom H246N- ili Y251S-pcDNA-CADM1 u prisutnosti ili odsutnosti 4-PBA (7, 5 mM) ili rapamicina (10 µg / ml) i fiksirano u 4% paraformaldehidu, isprano s PBS-om, a zatim se inkubira s mišjim anti-sinaptofizinom (Sigma, St Louis, MO, SAD), mišjim anti-KDEL (Stressgen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Kanada), zečji anti-beklin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, SAD), mišji anti-CHOP (Santa Cruz) ili pileći anti-SynCAM1 (Cadm1) (MBL, Nagoya, Japan) preko noći na 4 ° C, Sekundarna protutijela konjugirana na Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 568 protiv pilećeg i mišjeg ili zečjeg IgG kupljena su od Molekularnih sondi (Eugene, OR, SAD). Jednice su otkrivene Hoechst 33342 obojenjem (Molekularne sonde). Reaktivnost je korištena konfokalnim mikroskopom za lasersko skeniranje (CSU-10, Yokogawa, Yokokawa Electric Co., Tokio, Japan).

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunska slika S1

Glosar

ASD

poremećaj spektra autizma

CADM1

molekula stanične adhezije-1

Ig

imunoglobulin

NLGN

Neuroligin

CHOP

regulacija C / EBP-homolognog proteina

PDZ

post sinaptički protein gustoće / Drosophila disk veliki tumor supresor / zonula okludens-1 protein

eIF2 α

eukariotski faktor inicijacije-2 α

ER

endoplazmatski retikulum

ERAD

ER degradacija

UPR

nerazvijeni odgovor proteina

TSC

gomoljasti skleroza kompleks

GABA

aminobuterna kiselina

4-PBA

fenil maslačna kiselina

Thap

thapsigargin

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)