Autofagija kao novi terapijski cilj mišićne distrofije duchenne | stanična smrt i bolest

Autofagija kao novi terapijski cilj mišićne distrofije duchenne | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • autophagy
  • Molekularno ciljana terapija
  • Neuromuskularna bolest
  • Ispravljanje ovog članka objavljeno je 07. ožujka 2013
  • Izraz zabrinutosti ovom članku objavljen je 07. kolovoza 2014

Ovaj je članak ažuriran

Sažetak

Još uvijek nedostaje odlučna terapija za Duchenovu mišićnu distrofiju, tešku degenerativnu bolest koštanog mišića. Kako se pokazalo da je autofagija ključna u uklanjanju disfunkcionalnih organela i u sprečavanju oštećenja tkiva, istražili smo njegovu patogenu ulogu i njegovu prikladnost kao cilj novih terapijskih intervencija u Duchenneovoj mišićnoj distrofiji (DMD). Ovdje pokazujemo da je autofagija ozbiljno oslabljena u mišićima pacijenata pogođenih DMD i mdx miševima, modelom bolesti, sa nakupljanjem oštećenih organela. Poraz autofagije bio je popraćen ustrajnom aktivacijom fosforilacijom Akt, metom rapamicina (mTOR) sisavaca i o njima ovisnim putevima inhibiranja autofagije, uključujući protein 1 koji veže translacijski faktor 4E i ribosomalni protein S6, i silazna regulacija gena koji uzrokuju autofagiju LC3 , Atg12 , Gabarapl1 i Bnip3 . Neispravna autofagija spašena je u mdx miševima dugotrajnim izlaganjem dijeti s malo proteina. Tretman je doveo do normalizacije Akt i mTOR signalizacije; Također je značajno smanjila upalu mišića, fibrozu i oštećenje miofibre, što dovodi do oporavka mišićne funkcije. Ova studija ističe nove patogene aspekte DMD-a i sugerira autofagiju kao novu učinkovitu terapijsku metu. Liječenje koje predlažemo može se sigurno primijeniti i odmah testirati na učinkovitost u ljudi.

Glavni

Mišićne distrofije skupina su genetskih, nasljednih mišićnih bolesti koje karakteriziraju nedostaci u mišićnim proteinima. Ovi nedostaci rezultiraju progresivnim oštećenjem skeletnih mišića popraćenim miofibre nekrozom i kroničnom lokalnom upalom, što dovodi do zamjene miofibre veznim i masnim tkivom. 1 U Duchenneovoj mišićnoj distrofiji (DMD), najtežem obliku ovih bolesti, kontinuirano i progresivno oštećenje skeletnog mišića dovodi do potpune paralize i smrti pacijenata, obično od respiratornog i / ili zatajenja srca. 2

Terapeutski protokoli koji se trenutno koriste i temelje se na primjeni kortikosteroida pružaju određeno odgađanje napredovanja bolesti, ali povezani su s ozbiljnim nuspojavama. 3, 4 Terapije koje zamjenjuju kortikosteroide ili barem mogu djelovati kao lijekovi koji štede kortikosteroide, tako se aktivno provodi i istražuju se biološki mehanizmi relevantni za homoeostazu skeletnih mišića kako bi se identificirali novi ciljevi.

Autofagija se pojavljuje kao važan proces koji ograničava oštećenje mišića. 5, 6 Inhibicija / promjena autofagije doprinosi degeneraciji miofibre što vodi ka nakupljanju nenormalnih organela. 7, 8 Mutacije koje inaktiviraju Jumpy, fosfatazu koja suzbija aktivaciju VPS34 za stvaranje autofagosoma i smanjuje autofagiju, povezane su s centronuklearnom miopatijom. 9 Ovo promatranje sugerira da je neuravnotežena autofagija patogena u mišićnoj degeneraciji. Isto tako, hiperaktivacija Akt kao posljedica mišićno-deletirane delecije sisavca meta rapamicina (mTOR) dovodi do inhibicije autofagije i do mišićnog fenotipa sličnog onom koji je uočen u mišićnoj distrofiji. 10

Valjanost modulacije autofagije kao terapijske strategije prikazana je u mišjem modelu Ulrichove miopatije koju karakteriziraju defektna autofagija i nakupljanje disfunkcionalnih organela. 11, 12 Prisilna reaktivacija autofagije kod ovih životinja dala je povoljan terapeutski odgovor. 11

Neizravni dokazi ukazuju na moguću ulogu deficitarne autofagije također u patogenezi DMD-a. Primjećene su veće razine aktivacije i fosforilacije Akt u mišićima i primarnim mioblastima mdx mišjeg modela distrofije. 13, 14 U skladu s ovim opažanjem, progresivni mišićni distrofični fenotip koji se opaža kod mdx miševa popraćen je progresivno pojačanom Akt aktivacijom, posebno u vršnoj nekrotičnoj i hipertrofičnoj fazi bolesti. 14. Takav fenotip je također opisan u bolesnika oboljelih od DMD-a. 14 Akt je najsnažniji inhibitor autofagije u skeletnim mišićima, blokirajući stvaranje autofagosoma i propadanje njihovog sadržaja o lizosomima, 15, 16, sugerirajući neispravan autofagični proces. Štoviše, histopatološka obilježja DMD-a, naime, agregacija proteina, prisutnost natečenih i oštećenih mitohondrija, kao i distenzija sarkoplazmatskog retikuluma, često se opažaju kada je autophagija oslabljena. 17, 18

Molekularni putevi i uloga autofagije u DMD-u još nisu istraženi. Sada smo istražili autofagičke strojeve u mdx modelu miša DMD-a i u mišićnim tkivima pacijenata oboljelih od DMD-a. Analizama in vivo i ex vivo utvrdili smo da je autofagija neispravna i u mišićnoj distrofiji čovjeka i miša i da takav kvar doprinosi patogenezi bolesti. Nadalje, pokazujemo da farmakološka reaktivacija autofagije vraća mišićnu strukturu i funkciju. Naši rezultati identificiraju autofagiju kao važan homoeostatički mehanizam uređen u distrofičnim mišićima i ukazuju na to da su novi terapijski pristupi usmjereni na reaktivaciju autofagije vrijedna strategija za smanjenje oštećenja mišića u DMD-u.

Rezultati

Autofagija se smanjuje kod mdx miševa

Da bismo istražili status autofagije u distrofičnom mišiću, uspoređivali smo ključne markere autofagije u mišićima mdx -a i miševa divljih vrsta (WT) koji su imali 4 mjeseca. Ispitivali smo mišiće tibialis anterior (TA) i dijafragme, jer su oni dobri primjeri mišića koji se oslanjaju na glikolitički i oksidativni metabolizam 11, te blisko oponašaju tipične karakteristike ljudske mišićne distrofije, uključujući miofibre s središnjim jezgrama i grupiranje upalnih stanica. 13

Kao što je prikazano na slici 1a, razine lipidiranog oblika lakog lanca 3 proteina-1 povezanog mikrotubulom (LC3 II), koji se stvara tijekom stvaranja autofagosoma i odražava aktivnu autofagiju, 19 su značajno niže u mišićima mdx nego u onima WT životinja. Razine p62, proteina za koji se zna da se ugrađuje u autofagosome i učinkovito razgrađuje, 20 umjesto toga su povećane.

Image

Autofagija je neispravna u mdx miševima. ( a ) Mišični homogenati mdx i WT miševa (60 μg po traci) imunoblotirani su s antitijelima protiv LC3 i p62. LC3 lipidizacija (LC3 II) u TA i dijafragmalnim mišićima mdx miševa smanjena je u usporedbi s WT miševima. Mdx miševi također pokazuju nakupljanje p62. Također je prikazana denzometrijska kvantifikacija omjera LC3 II / I i p62, normalizirana u odnosu na aktin. ( b ) U mišićnim homogenatima (60 µg po traci), razina fosforilacije Akt, S6 i 4E-BP1 je povećana u mdx miševima u usporedbi s onima WT-a. Koristili smo iste proteinske ekstrakte kao na ploči a . Densitometrijske analize pokazuju omjer između fosforiliranog i odgovarajućeg ukupnog proteina. U oba su panela zapadnjačka mrlja reprezentativna, a kvantifikacija odgovara 15 životinja u skupini. Zvezdice pokazuju statističku značajnost prema WT (* P <0, 05 i ** P <0, 01). Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

Pronašli smo poboljšane razine Akt i u TA i dijafragmatnim mišićima mdx miševa kao što je već opisano. 13, 14 Od važnosti smo također otkrili da se fosforilacija Akt na Ser473 značajno povećala jer je bila fosforilacija ključnih efektora mTOR-a nizvodno, to jest ribosomalnog proteina S6 i eukariotskog translacijskog faktora 4E-vezujućeg proteina 1 (4E- BP1) (slika 1b). Fosforilacija ovih proteina dovodi do njihove aktivacije, što u mišićima može dovesti do inhibicije autofagije. 21

Akt fosforilacija održava mTOR u svom aktivnom obliku i sprječava translokaciju FoxO3 iz citoplazme u jezgro, uslijed čega dolazi do inhibicije transkripcije gena bitnih za stvaranje autofagosoma. 12 U skladu s tim, pronašli smo manju ekspresiju mRNA gena povezanih s autofagijom, izravno reguliranim FoxO3, to jest LC3 , Atg12 , Gabarapl1 i Bnip3 u mdx mišićnim mišićima (slika 3e), što ukazuje da su FoxO3 nizvodne ciljeve oštećene u mdx miševima i davanje molekularnog korelata s uočenim nedostatkom autofagije.

Smanjena autofagija kod mdx miševa nastaje zbog neispravne proavtofagičke signalizacije

Smanjena razina LC3 II može ovisiti o izravnoj inhibiciji autofagičnog fluksa; Alternativno, oni mogu biti posljedica progresivne iscrpljenosti vezikula koji sadrže LC3 II nakon hiperaktivacije autofagije. Da bismo razlikovali ove dvije mogućnosti, koristili smo klorokvin, lizosomalni inhibitor koji blokira razgradnju autofagosoma i njihov sadržaj, uključujući LC3 i p62. 22 Miševi su liječeni klorokvinom, davani u dozi od 50 mg / kg tjelesne težine dnevno, tokom 7 dana. Ovaj tretman doveo je do značajnog povećanja razine LC3 opsega i p62 i u TA i u dijafragmi mišića WT životinja; takvi porasti nisu primijećeni u odgovarajućim uzorcima mdx miševa (slike 2a i b). Ovi podaci pokazuju da smanjena razina LC3 II koja se opaža u mdx mišićima mišića nije posljedica iscrpljivanja vezikula sekundarnog hiperaktivnom autofagičnom procesu.

Image

Liječenje klorokinom WT i mdx miševa. ( a i b ) Western mrlje pokazuju nivo LC3 i p62 u TA ( a ) i dijafragmi ( b ) mišića mdx i WT miševa tretiranih (+) ili ne (-) s klorokvin difosfatom u tjelesnoj težini od 50 mg / kg dnevno tijekom 7 dana. Odsutnost učinaka holorokina u mdx (ali ne i WT) miševa ukazuje na to da je defekt u ekspresiji LC3 II posljedica stvarnog manjka autofagije, a ne posljedica autofagičnog iscrpljivanja mjehurića sekundarne hiperaktivaciji autofagije. Western blotting su reprezentativni, a kvantifikacija odgovara 15 životinja u skupini. Zvezdice pokazuju statističku značajnost prema netretiranom WT-u (** P <0, 01 i *** P <0, 001). Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

Zatim smo miševe podvrgli kratkotrajnom gladovanju (6 i 15 sati posta), tretmanu koji aktivira autofagičnu signalizaciju u različitim organima, uključujući mišiće. 23 nivoi LC3 II poboljšani izgladnjivanjem s povećanim omjerom LC3 II / I u TA i dijafragmalnim mišićima WT miševa; umjesto toga, razine p62 su smanjene, u skladu s njegovom pojačanom razgradnjom (slike 3a i b i dodatna slika S1a). Umjesto toga, nisu opaženi učinci gladovanja na nivoima LC3 II i p62 u mdx mišićima mišića (slike 3a i b i dodatna slika S1a). Klorokin je još više poboljšao omjer LC3 II / I i izazvao nakupljanje p62 u mišićima WT životinja, dok je bio potpuno neučinkovit za mdx mišiće mišića (slike 3a i b).

Image

Indukcija autofagije oslabljena je kod mdx miševa. ( a i b ) Western mrlje koje pokazuju nivo LC3 i p62 u TA ( a ) i dijafragmi ( b ) mišića (60 μ g po traci) hranjenih i 15-satno izgladnjelih (15 h) WT i mdx miševa, liječenih (+) ili ne (-) s klorokvinom 50 mg / kg tjelesne težine dnevno tijekom 7 dana. Densitometrijska kvantifikacija omjera LC3 II / I i razine p62, normalizirana u odnosu na aktin, pokazuje indukciju autofagije samo kod WT miševa nakon 15 sati gladovanja. ( c i d ) Western mrlje, koristeći iste proteinske ekstrakte ploča a i b, otkrivaju smanjenje fosforilacije Akt i 4E-BP1 u dijafragmi i TA mišiće WT miševa sa 15 h izgladnjelih zvijezda. Mdx mišići ne pokazuju promjene u razini fosforilacije oba proteina. ( e ) Kvantitativna RT-PCR analiza LC3β , Atg12 , Gaparapll i Bnip3 mRNA u mišićima dijafragme i TA hranjenih i 15-satnih WT i mdx miševa izgladnjelih. Geni niz FoxO3 nizvodno su regulirani u WT miševima nakon gladovanja, ali ne i u mdx miševima. Zapadne mrlje su reprezentativne, a kvantifikacija odgovara 15 životinja u skupini. Zvezdice pokazuju statističku značajnost u odnosu na miševe hranjene WT-om (* P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001); križanja pokazuju statističku značajnost u odnosu na miševe koji gladuju WT ( +++ P <0, 001). Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

U skladu s ovim rezultatima, gladovanje se značajno smanjilo na razini fosfo-Akt i fosfo-4E-BP1 u WT životinjama (slike 3c i d i dopunska slika S1b), gdje je također regulirao nivo mRNA LC3B, Atg12, Bnip3 i Gabarapl1 (Slika 3e), u skladu s inhibicijom signala Akt i mTOR i s indukcijom autofagije.

Nisu primijećene promjene u fosforilaciji proteina ili ekspresiji mRNA u mišjim mišićima mdx nakon izgladnjivanja, što ukazuje na manjak proautomatske signalizacije (Slike 3c i e).

Zatim smo analizirali ultrastrukturu TA od WT i mdx miševa u bazalnim uvjetima (slike 4a i c). Otkrili smo nedostatke ni u arhitekturi kontraktilnog aparata niti u mitohondrijalnom bazenu WT mišića (slika 4a i ulomak); kod mdx miševa, iako je kontraktilni aparat izgledao uglavnom bez utjecaja (slika 4c), opazili smo širenje cisterni endoplazmatskog retikuluma u subarkolemmalnim regijama, gdje povremeno formiraju natečene hrpe (dopunske slike S2a i b); ovo je obilježje bilo još izraženije kod izgladnjelih mdx miševa (slika 4d). Štoviše, u tkivima mdx miševa, infiltracijske stanice i kolagena vlakna viđeni su među miofibrima (dopunske slike S2c i d). U mišićima dobivenim od životinja koje su izgladnjivale WT (slika 4b), uočili smo prisutnost autofagosoma povezanih s unutarćelijskim organelama (uglavnom mitohondriji, slika 4b, umetanje); nasuprot tome, u mišićima dobivenim od izgladnjelih mdx miševa, iako su uočene oštećene organele (uglavnom mitohondrije subarkolemmalnog bazena), one nikada nisu bile povezane s autofagosomima (slika 4d).

Image

Indukcija autofagije u WT i mdx miševima. ( a ) elektronski mikrografiji TA mišića s WT miševa. Nisu uočene pogreške u arhitekturi kontraktilnog aparata ili u mitohondrijskom bazenu kod miševa koji su hranjeni WT-om (ljestvice skale 1 µm, 200 nm u mjestu). ( b ) 15-satni TA mišići WT miševa ( b i insekata) pokazuju izmjenu mitohondrijskog bazena i povećanje autofhagosoma, identificiranih kao strukture s dvostrukom membranom povezane s degenerirajućim organelama (inset) (ljestvice skale 1 µm, 200 nm u insektima). (c) Elektronski mikrografi TA mišića hranjenih mdx miševa. Autofhagosomi se ne mogu otkriti, a defekt u autofagiji prati ekspanzija širenja cisterne endoplazmatskog retikuluma (ljestvica ljestvice 1 µm). ( d ) TA mišići zbrinuti s mdx- om predstavljaju povećanu razinu izmijenjenih organela, posebno mitohondrija u subarkolemmalnom bazenu, koji nisu povezani s litskim organelama ( d i inset) (ljestvice ljestvice 1 μ m, 200 nm u urezu ). Slike predstavljaju reproducibilne rezultate na 10 životinja u skupini

Slika pune veličine

Autofhagijska reaktivacija poboljšava distrofični fenotip mdx miševa

Specifičan režim prehrane, karakteriziran malim unosom aminokiselina, ali s istom kalorijskom vrijednošću standardne hrane, pokazao je da poboljšava distrofičnu karakteristiku miševa Col6 - / - poboljšavajući na kronični i fiziološki način autofaktičke mehanizme skeletnih mišića. 11, 12 Istražili smo je li tromjesečno liječenje s takvom nisko proteinskom dijetom (LPD) reaktiviralo autofagiju kod mdx miševa i utjecaj tog učinka na distrofični fenotip. LPD tretman pojačao je ekspresiju LC3 II i smanjio ekspresiju p62 u TA i dijafragmi, ne samo u WT, već i u mdx miševima, s defosforilacijom, a time i inaktivacijom, Akt i 4E-BP1 (slike 5a i b). Dosljedno tome, primijetili smo povećane razine RNA autopagičnih gena nizvodno do FoxO3 (slika 5c i podaci nisu prikazani). Takav učinak nije primijećen kod miševa liječenih kontrolnom, standardnom dijetom (SD). Tako je dugotrajno LPD uspjela aktivirati autofagiju u mdx miševima.

Image

Produljena indukcija autofagije pomoću LPD amelioratne distrofije u mdx miševima. WT i mdx miševi hranjeni su s LPD ili SD tijekom 3 mjeseca. ( a i b ) Reprezentativni zapadni mrlje homogenata (60 μg po traku) iz mišića TA ( a ) i dijafragme ( b ) pokazuju da LPD pojačava ekspresiju LC3 II i p62, dok smanjuje fosforilaciju Akt i 4E-BP1 i u WT i mdx miševi. (c) Kvantitativna RT-PCR analiza nivoa LC3β , Atg12 , Gaparapl1 i Bnip3 mRNA u TA koja se hrani sa SD ili LPD. ( d ) In vivo analiza mišićne sile mjerena je kao količina sile izvlačenja cijelog tijela, izračunata kao sila u odnosu na tjelesnu težinu u WT i mdx . WBT10 predstavlja medij od 10 FPT-ova, izmjereno kao gram napetosti, podijeljeno s tjelesnom težinom. WBT5 predstavlja medij prvih pet FPT-ova podijeljenih s tjelesnom težinom. LPD je poboljšao mišićnu silu kod mdx miševa. ( e ) TA i dijafragmalni mišići obojeni su H&E; izbrojene su centronuklerirane i nekrotične miofibre. LPD smanjuje nekrotične miofibre i povećava središnje miofibre. Linija mjerila 110 μ m. ( f ) Distribucija CSA vrijednosti 700 miofibrea TA mišića WT i mdx liječenih LPD ili SD. LPD normalizira distribuciju CSA u mdx-u . Slike i zapadnjačka mrlja na raznim pločama su reprezentativni, a kvantifikacija odgovara 15 životinja u skupini. Zvezdice pokazuju statističku značajnost prema WT (* P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001); križevi pokazuju statističku značajnost u odnosu na mdx koji se normalno hrani ( + P <0, 05; ++ P <0, 01 i +++ P <0, 001). Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

Zatim smo istražili terapijsku učinkovitost liječenja LPD-om. U mdx- miševima tretiranim LPD-om, mjerenje napetosti cijelog tijela, koje određuje ukupnu faznu napetost povlačenja naprijed koju su istegli mišići prednjeg i stražnjeg udova, 24, 25, značajno je poboljšano u usporedbi sa životinjama tretiranim SD-om (slika 5c). Histološke analize bojenjem hematoksilinom i eozinom (H&E) pokazale su degenerirani mišićni status mdx tretiranih SD; nasuprot tome, mišićna arhitektura bila je gotovo normalna kod miševa tretiranih LPD-om, sa znatno manjim brojem nekrotičnih miofibresa (Slika 5d). Blagotvoran učinak prehrane također je bio očit kada je ispitano područje poprečnog presjeka miofibre (CSA). Heterogenost miofibre CSA opažena kod mdx tretiranih SD-om u kojima su se vrijednosti kretale između 250 i 3000 µm 2, pri čemu su najveći promjeri bili znak degeneracije (patološka hipertrofija) (slika 5e) normalizirani kod životinja tretiranih LPD-om, sa značajno više homogenih histograma frekvencije i CSA vrijednosti koje se ne razlikuju značajno od onih opaženih u WT životinjama.

Postotak apoptotskih jezgara, mjeren pomoću TdT-posredovane dUTP-biotin nick end metode označavanja (TUNEL), bio je značajno niži kod LPD-a tretiranih mDx miševa, i TA i dijafragme (slika 6c). Ovaj nalaz sugerira da je liječenje LPD-om smanjilo i programiranu smrt miofibre. Zanimljivo je da je LPD tretman mdx miševima povećao i broj miofibre koji su bili u središnjem stanju (Slika 5d), što ukazuje na korist za regeneraciju mišića. U skladu s tim, fibroza i nakupljanje kolagena smanjene su u životinjama tretiranim LPD-om, što je procijenjeno Masson-ovim obojenjem trihromom (slika 6a).

Image

Produljena indukcija autofagije pomoću LPD amelioratne distrofije u mdx miševima. WT i mdx miševi hranjeni su s LPD ili SD tijekom 3 mjeseca. ( a ) Reprezentativni odjeljci TA i dijafragmnih mišića obojeni postupkom Masson-ovog trihroma otkrivaju smanjenu akumulaciju kolagena i fibroze u mdxu tretiranom LPD-om nasuprot mdx -u tretiranom sa SDD-om . Linija mjerila 110 μ m. Grafikon prikazuje kvantificiranje provedeno u pet odjeljaka po životinji. ( b ) Oštećenje vlakana vlakna, ocijenjeno procjenom unosa EBD-a, kvantificirano softverom Slika 1, 63 (Scion Corporation) kao% Evansovih plavih pozitivnih stanica. Reprezentativne slike pokazuju da LPD smanjuje unos EBD-a u mdx miševe. Linija mjerila 110 μ m. Grafikon prikazuje kvantificiranje provedeno u pet odjeljaka po životinji. ( c ) Kvantifikacija TUNEL-pozitivnih jezgara u TA mišićima WT i mdx miševa; LPD smanjuje broj TUNEL-pozitivnih jezgara u usporedbi s mdx-om . Kvantifikacija (broj TUNEL-pozitivnih jezgara normaliziranih na mm 2 ) provedena je softverom Image 1.63 (Scion Corporation). Slike na raznim pločama su reprezentativne, a kvantifikacija odgovara 10 životinja u skupini. Zvezdice pokazuju statističku značajnost prema WT (* P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001). Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

Mišići mdx tretiranih LPD pokazali su unos iv injektiranog plavog bojila (EBD), što je značajno smanjeno u odnosu na miševe tretirane SD-om (slika 6b). Budući da su mrlje EBD oštetile miofibre, 26 ovo otkriće ukazuje na to da je liječenje smanjilo krhkost sarkolemmi u mdx miševima. 26

Važno je napomenuti da je dugotrajna indukcija autofagije u WT-u dovela do manjih mišićnih promjena, što su prethodno pokazali i drugi, 11 uključujući porast apoptotske degeneracije miofibresa, što pokazuje povišeni broj TUNEL-pozitivnih jezgara (Slika 6c). To je bilo očekivano, jer su prethodna ispitivanja već pokazala da prekomjerna indukcija autofagije štetno djeluje na homoeostazu mišića u zdravim uvjetima, dodatno ističući važnost uravnoteženog autfagijskog toka.

Autophagija je neispravna u bolesnika s DMD-om kod ljudi

Procijenili smo da li se defekt u autofagiji primijećen kod mdx miševa primjenjuje i na ljudsku bolest. Analizirali smo mišićne biopsije pet pacijenata oboljelih od DMD-a i četiri relativne kontrole. Sva tkiva kod pacijenata sa DMD pokazala su značajno niže razine LC3 II i značajno nakupljanje p62 u odnosu na tkiva iz kontrolnih skupina (slika 7a). Pored toga, pokazali su pojačanu fosforilaciju Akt i 4E-BP1 (slika 7b), što ukazuje da je put zahvaćen u bolesnika sa DMD-om identičan onome koji je opažen kod mdx miševa što dovodi do inhibicije autofagije u više koraka.

Image

Autophagija je neispravna u bolesnika s DMD-om kod ljudi. ( a ) Analiza omjera LC3 i p62 u biopsiji ljudskih mišića četiri kontrolna ispitanika i pet bolesnika s DMD-om. p62 ekspresija se normalizira na GAPDH. ( b ) Western blot za pAKT i p4E-BP1 u proteinskim lizatama ljudske biopsije koristeći isti protein ekstrakt panela a . Pacijenti s DMD pokazuju veću fosforilaciju Akt i 4E-BP1 u usporedbi s kontrolama. Western blots su reprezentativni, a kvantifikacija odgovara rezultatima biopsije pet pacijenata s DMD-om i četiri kontrole. Zvezdice pokazuju statističku značajnost u odnosu na kontrole (* P <0, 05 i ** P <0, 01). Trake pogrešaka predstavljaju SEM

Slika pune veličine

Rasprava

U ovom istraživanju izvješćujemo da je autofagija neispravna u DMD-u, da oštećenja autofagije značajno doprinose patologiji DMD-a i da farmakološke strategije koje ponovno aktiviraju autofagiju imaju korisne učinke koje se mogu iskoristiti u terapijskoj perspektivi. Nadalje, okarakteriziramo mehanizme signalizacije koji su uključeni u autofagični nedostatak DMD-a.

Poraz autofagije pokazao se biokemijskim i ultrastrukturnim analizama. Pronašli smo značajno smanjenje LC3 II, aktivnog, lipidiranog oblika LC3, u mišićima oboje od DMD bolesnika i mdx miševa. Smanjenje LC3 II bilo je popraćeno jasnim znakovima oslabljene autofagije na ultrastrukturalnoj razini, s pojačanom prisutnošću oštećenih organela. Smanjenje autophagičnog fluksa dodatno je potvrđeno povećanjem razine p62. Oštećenje autofagije u modelu miša nije se moglo spasiti do 15 sati posta, tretman za koji se zna da potiče autofagičnu signalizaciju u drugim uvjetima. 23 Obnova autofagije, koja je dovela do povišene razine LC3 II i smanjene razine p62, umjesto toga zahtijeva dugotrajno (3 mjeseca) liječenje snažnim lijekom za reakciju autofagije (LPD). Ovi nalazi sugeriraju da je defekt u autofagiji posljedica sveukupnog nedostatka autfagijske mašinerije, a ne zbog jednostavne inhibicije signalnih putova koji stimuliraju autofagiju.

Kad smo istražili autofagičke signalne putove i njihovu promjenu u mišićnoj distrofiji, otkrili smo da inhibicija autofagije ovisi o aktivaciji Akt, što pokazuje i njegova uporna fosforilacija koja je reverzibilna nakon reaktivacije autofagije. Iako ne možemo isključiti intervenciju više mehanizama, poput lizosomalnih oštećenja, otkrili smo da su nizvodno od Akt bili uključeni i mTOR i FoxO3 putovi, što pokazuje ustrajna fosforilacija 4E-BP1, i smanjivanje Atg12 , Bnip3 i Gabarapl1 preokrenuta kada se autofagija reaktivirala.

Iako je uloga signalizacije FoxO3 u autofagiji u koštanim mišićima već procijenjena i istražena u potpunosti, 15, 16, naše je opažanje značajne uključenosti mTOR signalizacije u autofagiju neočekivano otkriće. Do danas je uloga mTOR-a u mišićnoj autofagiji, ispitivana u uvjetima drugačijim od DMD-a, odnosno mišićnoj atrofiji i uvjetima gladovanja, bila manja. 15, 16, 27 Zaista, inhibicija mTOR-a rapamicinom ili njegovo smanjivanje prigušivanjem RNA posredovanim u tim okruženjima nije bilo dovoljno za izazivanje tvorbe autofagosoma 15, 16, 27 i samo je blago povećalo razgradnju proteina. 16 Promatranje važne uloge mTOR-a kod mdx miševa sugerira da autofagija u DMD-u ima karakteristike i molekularna ograničenja jedinstvena u odnosu na autofagiju u drugom patofiziološkom stanju skeletnog mišića. Moguće objašnjenje ove specifičnosti nalazi se u specifičnostima DMD-a i ulozi mTOR-a u njemu. Za distrofični mišić karakteriziraju se ponovljeni ciklusi degeneracije / regeneracije, s prisutnošću regenerirajućih i hipertrofičnih vlakana koja nastaju kao kompenzacijski mehanizam, djelomično djelomično zbog hiperaktivacije Akt i mTOR. 13, 14 Iako je važno, ova funkcionalna nadoknada dovodi i do inhibicije autofagije.

Uloga autofagije u patofiziologiji DMD-a i njegova važnost kao terapijskog cilja istražena je u dugotrajnom liječenju mdx miševa s LPD-om. Pažljivo smo procijenili nekoliko nepovezanih markera mišićne funkcije, oštećenja i regeneracije i upalnih reakcija. Ovi su markeri ispitivani korištenjem više različitih pristupa u mdx miševima nakon 3 mjeseca liječenja s malo proteina ili SD-a. Naši rezultati jasno pokazuju da LPD tretman ima terapijsku efikasnost i poboljšava distrofični fenotip mdx miševa. Dapače, primijetili smo značajan oporavak mišićne funkcije, što pokazuje poboljšanje napetosti cijelog tijela, popraćeno smanjenom mišićnom fibrozom, smanjenim taloženjem kolagena u mišićima, smanjenom apoptozom miofibre i smanjenim nakupljanjem oštećenih organela. Nadalje, tretman je sačuvao regenerirajuću sposobnost mišića, koja je procijenjena kao povećani broj miofibrika sa središnjim cijepanjem i ujednačena raspodjela CSA. Ovi posljednji rezultati sugeriraju posebno da LPD održava broj i funkcije stanica miogenih prekursora. Dokazano je da autofagija djeluje kao promotor održavanja matičnih stanica i u raznim procesima diferencijacije stanica, uključujući i stanično reprogramiranje. 28 Naši rezultati podudaraju se sa sličnom ulogom autofagije također u stanicama miogenih prekursora.

Ne možemo isključiti da povoljni učinci liječenja LPD-a ovise o mehanizmima koji nisu autofagija, na primjer, povećanom mišićnom homoeostazom. 29 Međutim, svejedno, naša otkrića sugeriraju da pravilan autfagični tok značajno pridonosi spašavanju distrofičnog fenotipa i da stimulacija autofagije predstavlja novu farmakološku strategiju u DMD-u.

Naši rezultati doprinose objašnjavanju nedavnih otkrića o poboljšanju distrofičnog fenotipa primjenom mTOR inhibitora. 30 Rapamicin, međutim, možda neće biti prikladan dugoročni tretman za ljudski DMD, jer u potpunosti blokira rast mišića koji regenerira miofibre 31, 32 i ima unutarnju toksičnost. Naši rezultati objašnjavaju i zašto pojačavanje autofagije pomoću agensa koji stimulira AMP-protein 5-aminoimidazol-4-karboksamid- β -D-ribofuranosid, ispitan posebno u dijafragmi mdx miševa, dovodi do funkcionalnog i strukturnog poboljšanja mišića. 33 Iako se ovaj spoj može dalje razviti za kliničku primjenu u DMD-u, djelotvornost liječenja o kojem ovdje izvještavamo može se testirati odmah i sigurno.

Nekoliko drugih spojeva koji djeluju na putove drugačije od autofagije sada se istražuje u novim terapijskim strategijama za DMD. Između ovih pristupa preskakanju egzonova i matičnih stanica čini se značajan korak naprijed prema odlučnoj terapiji, iako još nije razvijen do dovoljne razine učinkovitosti, kao što pokazuju rezultati posljednjih kliničkih ispitivanja. 2, 34, 35, 36 Klasični farmakološki pristupi temeljeni na lijekovima koji ciljaju upalu, fibrozu, epigenetske modifikacije DNA i redox modifikacije također se ispituju, s povoljnim perspektivama. 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 U ovom scenariju terapijski pristup koji mi predlažemo izgleda od značajne vrijednosti: iako ne očekujemo da rezultira pristupačan cilj samo autofagije, on se može sigurno koristiti u kombinacija sa staničnim i genskim terapijama i s ostalim lijekovima koji se trenutno istražuju za liječenje DMD. Na taj način može se postići sinergijski učinak i eventualno dovesti do režima koji štede lijekove. Osobito, u slučaju steroida, režim koji štedi lijekove može imati posebnu vrijednost koja ograničava njihove nuspojave, a koje izgledaju ozbiljno kod otprilike trećine liječenih bolesnika. 45

Zaključno, ova studija pokazuje postojanje oštećenja autofagije u mišićnoj distrofiji ljudi i miša i da tretman obnavljanjem autofagije poboljšava distrofični fenotip. Čini se da inhibicija oštećenja i upale mišića, kao i održavanje mišićne regenerativne sposobnosti objašnjava terapeutski učinak ovog tretmana.

Materijali i metode

Životinje i tretmani

Miševi C57BL / 6 WT (soj C57Bl10SnJ) kupljeni su od Charles River-a (Wilmington, MA, USA), mdx miševi (C57Bl10- mdx soj) iz Jackson-a (Bar Harbour, ME, USA) i tretirani u skladu sa smjernicama Europske zajednice i uz odobrenje Institucionalnog etičkog odbora.

Miševi su smješteni u sobnoj kontroli koja kontrolira okoliš (23 ° C, ciklus 12 sati svijetlo-tamno) i davali su im hranu i vodu ad libitum . Za specifične eksperimente, skupine miševa (15 životinja po skupini) hranjene su ili SD ili LPD (vidjeti tablicu 1 za njegov sastav). Za pokrete izgladnjivanja, muha je uklonjena ujutro i miševi (15 životinja po grupi) održavani su 6 ili 15 sati bez hrane, ali bez slobodnog pristupa vodi. U eksperimentima s klorokinom, mdx miševi (15 životinja po skupini) podvrgnuti su intraperitonealnoj injekciji s klorokvin difosfatom (50 mg / kg tjelesne težine; Sigma-Aldrich, Milano, Italija) svakih 24 sata tokom 7 dana.

Tablica pune veličine

Uzorak ljudskog mišića

Normalni i DMD uzorci mišića dobiveni su iz 'Banke DNK, staničnih linija i živčano-mišićnog srčanog tkiva' Neurološke jedinice Fondacije IRCCS Ca 'Granda-Ospedale Maggiore Policlinico iz Milana, koja je dio mreže Telethon Genetic Biobank Italije.

In vivo funkcionalni testovi

Postupak zatezanja cijelog tijela korišten je za određivanje sposobnosti miševa da ispoljavaju napetost u manevru izvlačenja prema naprijed koji se izvodi udarcem o rep. Napetost cijelog tijela odražava maksimalnu akutnu faznu silu koju miš može postići kako bi izbjegao potencijalno štetan događaj. Repovi miševa (SD ili LPD-a) bili su spojeni na Grass FT03 pretvarač (Astro-Med Industrial Park, West Warwick, RI, SAD) s svilenom niti od 4, 0 (jedan kraj niti je vezan za rep i drugi kraj pretvarača). Svaki je miš postavljen u malu cijev izrađenu od metalnog zaslona s razmakom rešetke od 2 mm. Miševi su ušli u aparat i pokazali malu napetost odmora na pretvaraču. Pokreti naprijed prema naprijed izvukli su se standardiziranim potezom repa nazubljenim pincetama, a odgovarajuće napetosti povlačenja prema naprijed zabilježene su korištenjem sustava za snimanje Grass Polyview. Između 20 i 30 udaraca repa, napetosti povlačenja prema naprijed obično su zabilježene tijekom svake sesije. Napetost cijelog tijela određena je dijeljenjem prosjeka napetosti povlačenja gornjih 5 ili 10 gornjih 10 prema naprijed na tjelesnu težinu.

Histologija i imunohistokemija

Životinje su ubijene dislokacijom vrata maternice, a TA ili dijafragma mišići su secirani i odmah zamrznuti u tekućem N2 hlađenom izopentanu. Za histološke analize, dobiveni su serijski odjeljci mišića i obojeni u H&E prema standardnim postupcima. 46 Broj nekrotičnih i centronuliranih vlakana je izbrojen i analiziran pomoću softvera javne domene MBF_ImageJ za mikroskopiju (//www.macbiophotonics.ca/index.htm).

Za mjerenje CSA pojedinačnih miofibresa, mišićni odsjeci obojeni su antitijelom protiv laminina A (L1293; Sigma-Aldrich). Laminin, glavna komponenta bazalne lamine, otkrivena je primjenom odgovarajućeg sekundarnog antitijela, a jezgre su vizualizirane DNA bojom 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Masson-ovo trihromsko obojenje korišteno je za identificiranje kolagena unutar mišićnog tkiva, slijedeći standardne protokole. 40

morfometrijom

Morfometrijske analize provedene su na odjeljcima prikupljenim iz sličnih regija svakog TA i dijafragmatskog mišića. Dvije slike snimljene su iz svakog odjeljka, a slika 1.63 (Scion Corporation, Frederick, MD, SAD) korištena je za određivanje CSA-a od 700-1000 miofibre po presjeku. 47

Injekcija EBD

Kao mjera propusnosti membrane korišten je vitalni boja EBD. Svemu je 50 ml / g tjelesne težine 5 mg / ml otopine EBD (Sigma-Aldrich) pripremljene u fiziološkoj fiziološkoj otopini ubrizgano iv kroz repnu venu. Miševi su ubijeni 18 sati nakon injekcije EBD.

Analiza apoptoze

Apopotsis je procijenjen TUNEL metodom na 10 µm kriosekcijama pomoću in situ uređaja za otkrivanje apoptoze (DeadEnd Fluorometric TUNEL System; Promega, Milano, Italija), prema protokolu proizvođača. Sekcije su suprotstavljene DAPI i montirane s Vectashieldom (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Podaci su izraženi kao TUNEL indeks, izračunato računanjem broja TUNEL-pozitivnih jezgara podijeljenih s DAPI-pozitivnim jezgrama. Indeks TUNEL izračunat je iz četiri slučajna i ne preklapajuća se polja.

Snimanje i manipulacija fluorescentnom i fazno-kontrastnom slikom

Fluorescentne i fazno-kontrastne slike snimljene su na mikroskopima (Leica DMI4000 B automatizirani invertirani mikroskop; leće: HCX PL FLUOTAR × 10 / 0, 30, HI PLAN I × 40 / 0, 59 i HCX PL FLUOTAR × 100 / 1, 30). Slike su dobivene pomoću digitalnog fotoaparata u boji DFC490 (Leica Microscopy Systems, Heerbrugg, Švicarska) i softvera LAS AF (Leica Microscopy Systems). Slike su sastavljene u panele pomoću Photoshopa 7.0 (Abobe System Software, Dublin, Irska).

Elektronska mikroskopija

Za analizu elektronske mikroskopije (TEM) analizu, cijele dijafragme i TA od WT i mdx miševa seciraju nakon ubijanja i fiksiraju 1 sat u otopini koja sadrži 4% paraformaldehid i 0, 5% glutaraldehida u 0, 1 M kakodilatnom puferu, pH 7, 4, imobilizirano na Petrijeva posuda s obloženom Sylgardom kako bi se spriječila mišićna kontrakcija. Mišići su isprani istim puferom i dalje razdijeljeni na manje blokove (1 mm 3 ) koji su naknadno obrađeni za TEM kao što je opisano drugdje. 48 Ukratko, uzorci su naknadno fiksirani osmijum tetroksidom (2% u puferu kakodilata), isprani i blokirani s 1% uranil acetata u 20% etanolu, dehidrirani i ugrađeni u epoksidnu smolu (Epon 812; Electron Microscopy Science, Hatfield, PA (SAD, SAD) koja se pekla 48 sati na 67 ° C. Dobiveni su tanki presjeci ultramikrotomom (Reichert Ultracut E i UC7; Leica Microsystems, Beč, Austrija), obojeni uranilom acetatom i olovnim citratom, te na kraju ispitani s Philips CM10 TEM (FEI, Eindhoven, Njemačka).

Izolacija proteina i zapadnja mrlja

Uzorci tkiva iz TA i dijafragmnih mišića homogenizirani su u puferu za lizu koji sadrži 20 mM Tris · HCl (pH 7, 4), 10 mM EGTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glicerola nadopunjeni koktelom proteaze i fosfataze inhibitore (Sigma, St. Louis, MO, USA). Uzorci su centrifugirani na 1.000 × g 10 min na 4 ° C kako bi odbacili jezgre i stanične ostatke. Koncentracija proteina određena je testom bicinhoninske kiseline (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SAD). Homogenati su razdvojeni SDS-PAGE, a proteini su preneseni u nitrocelulozne membrane (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Membrane su ispitivane korištenjem slijedećih antitijela: fosfo-AMPK a (Thr172) (2531), AMPK α (2532), 4E-BP1 (9644), fosfo-4E-BP1 (Thr37 i Thr46) (2855), Akt ( 9272), fosfo-Akt (Ser473) (9271), S6 (2317) i fosfo-S6 (Ser240 i Ser244) (2215), a sve dobiveno iz Cell Signaling Technology (Billerica, MA, USA). Antitijela na p- aktin (A5441), LC3 (L7543) i p62 (P0067) bila su iz Sigma.

Nakon imuno obojenja s odgovarajućim kozjim anti-zečjim ili antisjelesnim antitijelima konjušarskih peroksidaza (iz Cell Signaling, Beverly, Kalifornija, USA, i Bio-Rad, Milano, Italija), otkriveni su trakovi pomoću Amersham ECL sustav detekcije (GE Healthcare, Fairfield, CT, USA) i kvantificiran denzitometrijom pomoću softvera javne domene MBF_ImageJ za mikroskopiju (//www.macbiophotonics.ca/index.htm).

PCR u stvarnom vremenu

Uzorci tkiva su homogenizirani, a RNA je ekstrahirana pomoću TRIzol protokola (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). After solubilisation in RNase-free water, first-strand cDNA was generated from 1 μ g of total RNA using the ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA). Specific sets of primer pairs, described in Table 2, were designed to hybridise to unique regions of the appropriate gene sequence. Real-time PCR was performed using the SYBR Green Supermix (Bio-Rad) on a Roche LightCycler 480 Instrument (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland). All reactions were run as triplicates. Samples were analysed using the Roche LightCycler 480 Software (release 1.5.0) and the second derivative maximum method. The fold increase or decrease was determined relative to a control after normalising to the internal standard 36b4.

Tablica pune veličine

Statističke analize

Values were expressed as means±SEM The statistical significance of the differences between means was assessed by independent Student's t -test or by one-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test to determine which groups were significantly different from the others. A probability of <5% ( P <0.05) was considered to be significant.

Promjena povijesti

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Supplemental Information

Glosar

DAPI

4′, 6-diamidino-2-phenylindole

DMD

Duchenne muscular dystrophy

mTOR

mammalian target of rapamycin

WT

wild-type

TA

tibialis anterior

LC3

microtubule-associated protein-1 light chain 3

4E-BP1

eukaryotic translation-initiation factor 4E-binding protein 1

SD

standard diet

LPD

low-protein diet

CSA

cross-sectional area

TUNEL

TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling

EBD

Evans blue dye

H&E

haematoxylin and eosin.

Supplementary Information accompanies the paper on Cell Death and Disease website (//www.nature.com/cddis)