Axl receptorska kinaza je posrednik onkogenih funkcija ovisnih o žutici u hepatocelularnom karcinomu | onkogena

Axl receptorska kinaza je posrednik onkogenih funkcija ovisnih o žutici u hepatocelularnom karcinomu | onkogena

Anonim

teme

  • Stanična signalizacija
  • Rak jetre
  • onkogeni

Sažetak

Da-povezani protein (YAP) je silazni efekt Hippo signalnog puta koji kontrolira ekspanziju organa i razvoj tkiva. Nedavno smo definirali tumorigenski potencijal i klinički značaj YAP1 onkogena u humanom hepatocelularnom karcinomu (HCC). Cilj ove studije je definiranje tumorigenskih svojstava YAP u HCC-u i objašnjenje mehanizma signalizacije nizvodno. U studiji dobivanja funkcije pokazali smo da ektopična povećana ekspresija YAP-a u immortaliziranoj ne-tumorigenskoj hepatocitnoj staničnoj liniji MIHA daje tumorigenske i metastatske potencijale, što je dokazano (1) pojačanim sklonostima u staničnoj održivosti, rastu neovisnom o sidru, migracije i invazije; (2) stvaranje tumora u mišjem modelu ksenografta; i (3) indukcija HCC biomarkera α-fetoproteina i aktiviranje mitogen-aktivirane proteinske kinaze. Nadalje, identificirali smo AXL, receptor tirozin kinazu, kao ključni cilj nizvodno koji pokreće onkogene funkcije ovisne o YAP-u. RNAi-posredovano obaranje AXL ekspresije smanjilo je sposobnost MIHA-eksprimirajućih MIHA stanica i primarne HCC stanične linije da se razmnožavaju i upadaju. Ovi rezultati pokazuju da je AXL posrednik onkogenih aktivnosti ovisnih o YAP-u i implicira ga kao potencijalni terapeutski cilj HCC-a.

Uvod

Signalni put Hipoa, koji je nedavno otkriven u Drosophili , ima važnu ulogu u kontroli veličine organa tijekom embrionalnog razvoja, a također predstavlja novi put supresorskog tumora (Liu i sur., 2010; Oh i Irvine, 2010). Genskim skriningom komponenti signala za Hipo su identificirane kao skupina molekula kinaze, uključujući Merlin (Mer), Expanded (Ex), Hippo (Hpo), Salvador (Sav), Mob kao supresor tumora (Mats) i Bradavice (Wts ). U osnovi, učinak kaskadne signalne kaskade Hippo je fosforilacija i inaktivacija Yorkie (Yki) efektorske molekule citoplazmatskom sekvestracijom i proteolitičkom razgradnjom (Edgar, 2006; Zeng i Hong, 2008; Zhao i sur., 2008a, 2010). Disregulacija hipo signalizacije rezultira defosforilacijom proteina Yki i nuklearnom akumulacijom, gdje zajedno s TEA domenom (TEAD) / familijom faktora povećava transkripcije faktora transkripcije (na primjer, Scalloped), Yki može transaktivirati više genskih ciljeva kao što su ciklin E , diap1 i bantam microRNA (Thompson i Cohen, 2006; Bandura i Edgar, 2008; Wu i sur., 2008). Prekomjerna ekspresija Yki / Scalloped ciljnih gena dijelom objašnjava staničnu proliferaciju i inhibiciju apoptoze, a nepravilno funkcioniranje uzlaznih signalnih kinaza Hipoa uzrokuje prekomjerni rast tkiva ili povećanje organa (Huang i sur., 2005; Buttitta i Edgar, 2007; Pan, 2007; Yin i Pan, 2007).

Da-povezani protein (YAP, YAP1 ili YAP2) i njegov paralog TAZ identificirani su kao Yki ortolozi kod ljudi, sa sličnim regulatornim mehanizmima (Zhao i sur., 2007; Hao i sur., 2008; Lei i sur., 2008 ). I YAP1 i TAZ su transkripcijski koaktivatori TEAD-ova (Zhao i sur., 2008a; Chan i sur., 2009). Koristeći integrativne onkogenomske i proteomske pristupe, započeli smo otkrivati ​​nove tumorske supresore i onkogene u karcinogenezi hepatocelularnog karcinoma (HCC) (Zender i sur., 2006, 2008), a nedavno smo identificirali YAP1 kao bona fide onkogen u karcinomu jetre miša (Zender i sur., 2006). Nadalje, transgeni miševi YAP pokazali su značajno povećanje veličine jetre i na kraju razvijeni tumori jetre (Camargo i sur., 2007; Dong i sur., 2007). Prekomjerna ekspresija YAP1 u normalnoj staničnoj liniji epitela dojke MCF10A inducirala je prijelaz epitela u mezenhim, rezistenciju na apoptozu i pojačanu sposobnost rasta neovisnog za sidrenje (Overholtzer i sur., 2006). Nadalje, YAP aktivacija može nadjačati inhibiciju kontakta stanica i stanica i pospješiti stanični rast (Zhao i sur., 2007). U kliničkim uzorcima, zabilježena je prekomjerna ekspresija i nuklearna akumulacija YAP-a kod raka prostate, debelog crijeva, dojke, nemalićelijskog karcinoma pluća, kao i kod raka jajnika i jetre (Zhao i sur., 2007; Steinhardt i sur., 2008 ), a naša klinička studija u skupini od 177 bolesnika s HCC-om nadalje je pokazala da je YAP neovisni prognostički marker povezan s lošim preživljavanjem bez bolesti i ukupnim preživljavanjem HCC-a (Xu i sur., 2009).

Unatoč svojoj kliničkoj važnosti, molekularni mehanizmi YAP-a ili TAZ-a kao onkogenih pokretača u karcinoma čovjeka ostaju uglavnom nepoznati. Ovdje smo upotrijebili studiju o dobivanju funkcije u besmrtnom staničnom liniju MIHA non-tumorigenskih hepatocita i studiju gubitka funkcije u primarnoj staničnoj liniji HCC-a PLC / PRF / 5 da bismo razjasnili ulogu tirozin kinaze AXL receptora ( AXL, pretpostavljeni cilj YAP-a (Zhao i sur., 2008b)) kao kritični posrednik onkogenih funkcija ovisnih o YAP-u.

Rezultati

Onkogena transformacija ne-tumenske hepatocitne linije MIHA pomoću YAP1

Ljudski YAP1 gen (NM_006106.3) bio je stabilno transfektiran u humanu hepatocitnu staničnu liniju MIHA, a dva neovisna klona (MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b) su naknadno uspostavljena radi istraživanja o funkciji (vidi dodatnu sliku 1a). Prvo smo istražili staničnu vitalnost i proliferaciju svakog MIHA-YAP klona MTT testom (slika 1a; lijeva ploča); oba klona MIHA-YAP1 pokazala su brže stope rasta u usporedbi s kontrolom praznih vektora (MIHA-Vec) kada su uzgajane u kompletnom mediju kulture. U nedostatku seruma, međutim, MIHA i MIHA-Vec stanice nisu mogle rasti. Zapanjujuće je da su MIHA stanice koje eksprimiraju bile sposobne preživjeti i razmnožiti se (Slika 1a; središnja ploča), sugerirajući da YAP onkoprotein može spasiti ne-tumorigensku hepatocitnu liniju MIHA od zaustavljanja rasta ili pružiti signale preživljavanja / rasta u uvjetima izgladnjelih u serumu., Suprotno tome, kada je endogena ekspresija YAP u tumorigenskoj primarnoj staničnoj HCC stanici (PLC / PRF / 5) bila potisnuta malim interferencijskim RNA (vidi dopunsku sliku 1b), brzina rasta PLC-siYAP1a i PLC-siYAP1b stanica je značajno oslabljena (Slika 1a; desna ploča).

Image

In vitro funkcionalni testovi YAP1 tumogena svojstva u HCC. Ustanovili smo dva stabilna klona za transfektanse (MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b) u humanoj besmrtnoj hepatocitnoj liniji MIHA. Vektorske (MIHA-Vec) i roditeljske MIHA kontrole također su uključene u ispitivanja. ( a ) MTT test. Kloni i kontrole MIHA-YAP1 uzgajani su u prisustvu seruma (lijeva ploča) ili u mediju bez seruma (srednja ploča) i testirani na staničnu održivost i rast pomoću MTT metode. Ektopična ekspresija YAP značajno je potaknula rast MIHA stanica i spasila stanice u nedostatku seruma. U studiji o gubitku funkcije, siRNA posredovano obaranje YAP ekspresije u primarnoj staničnoj liniji HCC-a PLC / PRF / 5 značajno je oslabilo brzinu rasta stanice (desna ploča), kao što je prikazano u PLC-siYAP1a i PLC-siYAP1b, ali ne u kontroli kodiranja (PLC-siCon). Svi su pokusi izvedeni u tri primjerka u tri neovisna pokusa. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± 2 × sem ( b ) AFP testa. Supernatanti kulture iz stabilnih klonova MIHA, MIHA-Vec i MIHA-YAP1 sakupljeni su 5. dana za mjerenje biomarkera raka jetre AFP. Primijećeno je značajno povišenje razine AFP-a u oba MIHA-YAP1 klona, ​​ali ne i u vektorskom i roditeljskom nadzoru. Eksperimenti su provedeni u duplikatu i ponovljeni su dva puta. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± sd ( c ) test mekog agarja. Oba klona MIHA-YAP1 pokazala su rast neovisan o sidrištu formirajući kolonije uzgojene u mekom agaru. Rezultati su izvedeni iz dva neovisna ispitivanja i prikazani su kao srednji broj kolonija ± sd Kontrolisana siRNA transverznom ili kodiranom stanicom i roditeljske stanice nisu dale razlike u svim slučajevima. * P <0, 05 (Studentovim t- testom između transfektanta i vektorske ili siCon kontrole).

Slika pune veličine

Klinička korelacijska analiza otkrila je snažnu povezanost razine ekspresije YAP-a s razinom α-fetoproteina (AFP) u serumu i recidivom tumora u HCC-u (Xu i sur., 2009). Stoga smo slijedeće procijenili hoće li YAP transformirane MIHA stanice izraziti AFP biomarker za HCC. Klinička granična vrijednost za dijagnozu HCC je 400 ng / ml; razine AFP-a u kulturama supernanata klonova MIHA-YAP1 kretale su se u rasponu od 2000 do 4500 ng / ml tijekom 5 dana, ali AFP nije bio moguće otkriti u roditeljskom MIHA i vektorskom nadzoru (Slika 1b). Kada se uzgajaju na mekom agaru, oba MIHA-YAP1 klona su stvorila kolonije neovisne o sidrenju (Slika 1c), što sugerira da YAP može suzbiti anoikise i nadvladati inhibiciju kontakta, pružajući signale preživljavanja i rasta.

Da bismo odredili metastatski potencijal YAP1 onkogena, istraživali smo staničnu pokretljivost i invazijsku sposobnost MIHA-YAP1 klonova pomoću ispitivanja zacjeljivanja rana (slika 2a) i testa komore matrigela (slika 2b). U usporedbi s kontrolom MIHA-Vec, primijećeno je brže zatvaranje rana u klonovima MIHA-YAP1 u 48 h, a više prodora u stanicu u Matrigelu u 72 h.

Image

YAP1 povećava sposobnost migracije i invazije MIHA stanica. ( a ) Analiza zacjeljivanja rana. U 48 h, i MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b kloni pokazali su brže zatvaranje praznine nego MIHA-Vec stanice. Slike su uzete odmah nakon ogrebotina kultura 0 h, 24 h i 48 h kasnije. Uvećanje: × 200, ljestvica: 40 µm. ( b ) Matrigelov test invazije. Prikazana su reprezentativna polja invazivnih stanica na membrani. Penetrirane stanice obojene su 0, 1% kristalno ljubičastom bojom. Klonovi MIHA-YAP1 bili su u stanju prodrijeti kroz Matrigelovu membranu nakon 72-satne inkubacije. Histogrami na donjem panelu pokazali su prosječan broj upadalih stanica. Povećanje × 100, ljestvica: 80 µm; uvećanje: × 400, ljestvica ljestvice: 20 µm.

Slika pune veličine

Tumorigenski potencijal MIHA-transfektiranih stanica in vivo

MIHA je stanična linija hepatocita koja nije tumora, a koja ne može formirati tumore u modelu potkožnog golog miša ksenografa. Nakon transformacije YAP1, i MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b kloni mogu formirati vidljive tumore in vivo , weeks 4 tjedna nakon inokulacije (Slika 3a). Histološkim pregledom tumora otkriveni su istaknuti intratumoralni mikroveseli, proizvodnja AFP-a i snažni pozitivni signali Ki-67 u jezgrama tumora koji su u korelaciji s povećanom ekspresijom YAP proteina (Slika 3b).

Image

Transformacija MIHA stanične linije do stvaranja jetrenih tumora u ksenograft miševa. ( a ) Krivulje rasta tumora MIHA-YAP1 kloniraju se do 8 tjedana nakon potkožne inokulacije. I MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b, ali ne i MIHA-Vec stanice, inducirali su stvaranje tumora u golih miševa. Rezultati su prikazani kao srednja veličina tumora ± sd ( n = 5 po grupi) u svakoj točki. ( b ) Histologija eksplantata tumora MIHA-transformiranog tumora (u 8 tjedana nakon inokulacije). Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) otkrilo je tumorsku arhitekturu i intratumoralne mikrovesile (naznačene strelicama). Imunostanje reseciranih tumora pokazuje snažnu citoplazmatsku i nuklearnu ekspresiju YAP, nuklearnog Ki-67 signala u proteinima i citosolnim proteinima AFP i AXL receptora. (gornja ploča: × 100, ljestvica: 80 µm; donja ploča: × 400, ljestvica: 20 µm.)

Slika pune veličine

YAP pojačava ekspresiju AXL receptora kinaze u MIHA stanicama

Kinaza AXL receptora pretpostavljena je meta YAP-a (Zhao i sur., 2008b), a aktiviranje AXL može dovesti do aktivacije putova kinaze fosfoinozid 3-kinaze / Akt i ERK1 / 2 minagen-aktivirane proteine ​​(MAP) (Hafizi i Dahlback, 2006). Zanimljivo je također da smo otkrili da je ekspresija AXL regulirana u YAP1-MIHA eksplantatima ksenografta reseciranim od golih miševa (Slika 3b). Zatim smo testirali 10 pari kliničkih uzoraka HCC imunohistokemijom. Nađeno je da i ovi YAP1-pozitivni HCC koeksprimiraju AXL protein u tumorima, ali ne i u susjednim tkivima (dopunska slika 2a). Da bismo dalje istražili je li AXL pod kontrolom YAP-a u HCC-u, pregledali smo AXL promotorsko područje i identificirali četiri moguća TEAD-vezujuća mjesta (TB) koja se nalaze unutar 1200 bp uzvodno od početnog mjesta transkripcije AXL. Kao što pokazuje analiza imunoprecipitacije kromatinom (ChIP) u lizatima MIHA-YAP1b (slika 4a), imunoprecipitacija anti-YAP antitijelom, ali ne i IgG kontrolom, dala je pozitivan signal na PCR amplifikaciju AXL promotora koji obuhvaća TB1-TB2 (AXL-1) i TB3-TB4 (AXL-2). Isto tako, vezivanje proteina YAP na promotor AXL (oba mjesta TB1-TB2 i TB3-TB4) također je otkriveno u primarnoj HCC stanici PLC / PRF / 5 (PLC-kontrolna siRNA (siCon)), ali ne u PLC-siYAP1c i PLC-siYAP1d ćelije, za koje je YAP ekspresija utišala RNAi knockdown (Slika 4b).

Image

Transkripcijska aktivacija AXL receptor kinaza YAP-om. ( a ) ChIP test u MIHA-YAP1 stanicama. Pronađeno je četiri moguća TB (TB1-4) područja promotora AXL (gornja ploča). Proveden je AXL-specifičan promotor PCR koji pokriva TEAD-vezujuće sekvence TB1-TB2 ili TB3-TB4 (donja ploča). Otkriven je PCR pojas pomoću anti-YAP antitijela, ali ne i IgG kontrole, što sugerira da YAP aktivira AXL putem faktora transkripcije TEAD. ( b ) Imunobloting i ChIP test u PLC-siYAP1 ćelijama. Imunoprecipitacija (IP) YAP iz PLC-siYAP1c i PLC-siYAP1d stanica, praćena imunoblotiranjem (IB) anti-YAP antitijelom, pokazala je smanjenu razinu YAP nakon tretmana siRNA, u usporedbi sa siCon kontrolom. Ukupni unosi lizata i β-aktin su uključeni kao reference. Analiza ChIP istih imunokompleksa pokazala je smanjeni signal AXL promotorskih sekvenci u PLC-siYAP1 ćelijama. ( c ) Luciferazni izvještajni test u stanicama PLC / PRF / 5 s prekomjernom ekspresijom ili prezaduženošću YAP-a. Stanice koje su bile transficirane vektorima pGL3-osnovne uključene su kao kontrole. PLC / PRF / 5 stanice transficirane pGL3-AXL pokazale su značajno povišenu reporter aktivnost u usporedbi s kontrolama; u međuvremenu, stanice koje su kofeficirane pcDNA3.1-YAP1 pokazale su dodatno pojačano luciferarazno djelovanje. Za PLC / PRF / 5 stanice s YAP underexpressionom, siCon-transfektirane stanice su uključene kao kontrole. PLC / PRF / 5 stanice transficirane pGL3-AXL i siYAP1 pokazale su značajno smanjenu aktivnost reportera u usporedbi s kontrolama. Stanice su skupljene 24 sata nakon transfekcije za mjerenje aktivnosti luciferaze u svim eksperimentima. Ukupne količine DNA i RNA su održavane konstantnim. Svi su pokusi provedeni u tri primjerka i ponovljeni su tri puta. Podaci su prikazani kao srednja ± 2 × sem (** u usporedbi s kontrolama, P <0, 001; ## u usporedbi s pcDNA3.1 i pGL3-AXL ko-transfektantom, P <0, 01). ( d ) Smanjena ekspresija AXL-a nakon prolaznog rušenja YAP1 u četiri različite HCC stanične linije - H2P, Hep3B, MHCC97L i MHCC97H. YAP1 stealth RNAi siRNA (# HSS115942 za siYAP1c i # HSS115944 za siYAP1d) upotrijebljeni su za oborenje YAP1 ekspresije u HCC stanicama. Imunoblotiranje YAP i AXL proteina (gornja ploča) i kvantitativni PCR test AXL transkripta (donji) provedeni su prema gore opisanim postupcima ** P <0, 01.

Slika pune veličine

Da bismo dodatno pokazali kotranskripcijsku aktivnost YAP-a na ekspresiji AXL-a, proveli smo reportera luciferaze u dvije različite stanične linije: HEK293-T (YAP nizak ) i PLC / PRF / 5 (YAP visok ) (Slika 4c). PGL3-bazični Luc vektor subkloniran s AXL (1180bp do -235bp, uključujući TB1-TB4) promotor (nazvan u nastavku pGL3-AXL) i pcDNA3.1-YAP1 plazmidom je kofeficiran u svaku staničnu liniju i nakon 24 h mjerili smo aktivnosti luciferaze. Aktivnosti luciferaze AXL promotora značajno su poboljšane u stanicama HEK293-T kada su kofeficirane s genom YAP1 , ali ne i s vektorskom kontrolom ( P <0, 001, vidi dodatnu sliku 2b). Što se tiče PLC / PRF / 5 stanica koje eksprimiraju visoki endogeni YAP protein, transfekcija samim pGL3-AXL vektorom značajno regulira reportersku aktivnost ( P <0, 001); kotransfekcija s pcDNA3.1-YAP1 vektorom dodatno je poboljšala luciferazni signal ( P <0.01, slika 4c). Kad je ekspresija YAP1 smanjena transfekcijom siYAP1a ili siYAP1b u stanicama PLC / PRF / 5, aktivnost reportera AXL promotora vidno je smanjena u usporedbi s onom u kontrolnim stanicama koje su transficirane siRNA (obje P <0, 001, slika 4c). Pored toga, oborenje YAP1 ekspresije također je smanjilo razinu AXL (i proteina i mRNA) u četiri druge HCC stanične linije, H2P, Hep3B, MHCC-97L i MHCC97-H, što je pokazalo visoke endogene razine AXL (Slika 4d).

AXL je kritični posrednik YAP onkogene signalizacije u HCC-u

Zatim smo izmjerili nivo ekspresije AXL (protein i mRNA) u MIHA-YAP1 i PLC-siYAP1 stanicama. Na ektopičnoj ekspresiji YAP1 u MIHA staničnoj liniji, postojale su povećane razine ekspresije AXL proteina (slika 5a) i mRNA (vidi dodatnu sliku 3a), kao što je prikazano u klonovima MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b. U osnovi, AXL protein nije bilo moguće otkriti u MIHA-Vec stanicama imunoblotiranjem, i nakon indukcije YAP1, postojala je snažna imunoreaktivnost AXL u stabilnim transfektantima uz istodobno povećanje razine ekspresije YAP. Prilikom mjerenja fosforiliranog oblika AXL pomoću enzimski povezanog imunosorbenskog testa (slika 5d), došlo je do značajne regulacije p-AXL u oba MIHA-YAP1 klona kada je uzgojen u prisustvu seruma ili u uvjetima seruma koji gladuju. Mjerili smo i 6 ligand za zaustavljanje rasta za AXL receptor kvantitativnim PCR-om (slika 5e). Zanimljivo je da su razine mRNA specifične za zaustavljanje rasta značajno smanjene u stanicama MIHA-YAP1 u usporedbi s kontrolom MIHA-Vec, što implicira moguću negativnu petlju povratnih informacija.

Image

YAP1-inducirana AXL ekspresija i aktiviranje ERK1 / 2. ( a ) Western blot analiza pokazala je povećanu razinu ekspresije YAP, AXL, konstitutivnu fosforilaciju ERK1 / 2 i Akt kinaza u MIHA-YAP1a i MIHA-YAP1b stanicama u usporedbi s MIHA-Vec kontrolom. ( b ) Western blot pokazuje smanjenu razinu ekspresije YAP, AXL i fosforiliranog ERK1 / 2 u stanicama PLC-siYAP1a i PLC-siYAP1b u usporedbi s kontrolnom kontrolom transficiranom siRNA (PLC-siCon), dok fosforilirane Akt razine nisu značajno promijenjene. ( c ) Rezultati Western blottinga pokazali su da MIHA-YAP1b-siAXL stanice imaju smanjenu ekspresiju AXL i fosforilaciju ERK1 / 2 u usporedbi s MIHA-YAP1b-siCon, ali njihova YAP ekspresija i fosforilirani nivoi Akt nisu promijenjeni. P-aktin je uključen kao kontrola. Također je proveden eksperiment sa shAXL1 i shAXL2 reagensima, koji su pokazali slične nalaze (Dopunska slika 3c). ( d ) Analizom enzima povezanih imunosorbentom pokazalo je da postoji značajna regulacija razine fosforiliranih AXL u stanicama MIHA-YAP1 nego u stanicama MIHA-Vec, kada su stanice uzgajane sa ili bez seruma. ( e ) Kvantitativni PCR pokazao je da su 6 mRNA specifične za zaustavljanje rasta značajno smanjene u stanicama MIHA-YAP1 nego u MIHA-Vec stanicama ** P <0, 01.

Slika pune veličine

Prolazno oborenje YAP1 ekspresije siRNA-om u stanicama PLC / PRF / 5 smanjilo je i razinu proteina (Slika 5b) i transkripciju (vidi dodatnu sliku 3b) AXL-a. Kako su MAP i Akt kinaze dobro dokumentirani AXL nizvodni signalni put, izmjerili smo aktivnosti ERK1 / 2 i Akt i otkrili da razina ekspresije YAP / AXL očigledno utječe na fosforilaciju ERK1 / 2 i Akt (S-473) (slika 5a), Kako YAP ne posjeduje kinaznu domenu za izravno aktiviranje ERK1 / 2 ili AKT, predlažemo da se ovaj efekt može pripisati AXL kinazi, a nalaz podrazumijeva da je YAP povezan s održavanjem tumora i onkogenim signalnim putovima povezanim s HCC. U međuvremenu, regulacija YAP1 u stanicama PLC / PRF / 5 smanjila je fosforilaciju ERK1 / 2, uz istodobno smanjenje razine AXL (Slika 5b). Nadalje, kao što je prikazano u klonu MIHA-YAP1b, spuštanje ekspresije AXL posredovano siRNA reduciralo je fosforilaciju ERK1 / 2, ali ne i nivo YAP ekspresije (Slika 5c). Međutim, na razinu p-AKT naizgled nije utjecala ili su otkrivene neprimjerene promjene, što sugerira da se Akt može aktivirati putovima (puta) koji nisu AXL.

AXL posreduje YAP1-induciranu staničnu proliferaciju i migraciju u HCC

Da bismo istražili da li AXL kinaza posreduje onkogene funkcije YAP1 u HCC, prolazno smo srušili ekspresiju AXL u MIHA-YAP1b stabilnom transfektantu (koji je izrazio višu razinu YAP proteina) i testirali tumorigenske i metastatske potencijale kao što je gore prikazano. U usporedbi s vektorskom kontrolom (MIHA-YAP1b-shCon), i shAXL1 i shAXL2 transfektanti pokazali su nižu staničnu vitalnost i proliferaciju, posebice kada se uzgajaju u mediju bez seruma (slika 6a). Slični učinci oborenja zabilježeni su kod invazije (slika 6b) i sposobnosti zacjeljivanja rana (slika 6c) u stanicama MIHA-YAP1b-shAXL. Konačno, da potvrdimo ulogu AXL u posredovanju YAP signalizacije u HCC-u, proveli smo "spasilački" eksperiment proliferacije stanica i fenotipa za zacjeljivanje rana kada se AXL vrati u PLC / PRF / 5 sustav, u kojem je YAP1 oboren dolje (slika 7a). AXL bi mogao djelomično spasiti, ako ne i sve, aktivnosti migracije i proliferacije stanica, kao što je pokazano u ispitivanjima zacjeljivanja rana (slika 7b) i MTT (slika 7c). To može značiti da YAP aktivira više putova, a kinaza AXL receptora jedan je od ključnih medijatora onkogeneze jetre ovisne o YAP.

Image

AXL je potreban za staničnu vitalnost i invaziju u klonu MIHA-YAP1. ( a ) MTT analiza pokazala je da smanjena regulacija AXL prolaznom transfekcijom kratke dlačice AXL kratkom dlačicom (MIHA-YAP1b-shAXL1 i MIHA-YAP1b-shAXL2) smanjuje staničnu održivost i rast u MIHA-YAP1b stanicama u prisutnosti seruma u usporedbi s transficiranim vektorima kontrole (MIHA-YAP1b-shCon) (lijeva ploča, usporedba transfektanta i vektorske kontrole, svaki dan, koristeći Studentov t- test; * P <0, 05 na dan 2 i 3). U mediju bez seruma, MIHA-YAP1b-shAXL1 i MIHA-YAP1b-shAXL2 pokazali su oslabljenu staničnu vitalnost i rast u usporedbi s MIHA-YAP1b-shCon (desna ploča, usporedba kao što je gore opisano; * P <0, 05 na dane 2, 3, 4 i 5). Svi su pokusi izvedeni u tri primjerka u tri neovisna pokusa. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± 2 × sem ( b ) Analiza invazije Matrigela pokazala je da MIHA-YAP1b-shAXL1 ili MIHA-YAP1b-shAXL2 ne mogu prodrijeti u membranu matrigela u roku od 72 sata od kulture. Prikazana su reprezentativna polja invazivnih stanica na membrani (lijeva ploča). Penetrirane stanice obojene su 0, 1% kristalno ljubičastom bojom. Gornja ploča: × 100, ljestvica: 80 µm; donja ploča: × 400, ljestvica: 20 µm. MIHA-YAP1b-shAXL ćelije pokazale su značajno smanjen broj prodiranih stanica (desni panel) ** P <0, 01. ( c ) Migracija stanica zahvaćena AXL-om u YAP prekomjerno eksprimirajućim MIHA stanicama. MIHA-YAP1b-shAXL1 i MIHA-YAP1b-shAXL2 stanice pokazale su umjereno usporenu migraciju tijekom 48 h u usporedbi s MIHA-YAP1b-shCon stanicama (lijeva ploča). Uvećanje: × 200, ljestvica: 40 µm. U usporedbi s kontrolnim stanicama, postoci zatvaranja rana umjereno su smanjeni u MIHA-YAP1b-shAXL stanicama (desni panel) * P <0, 05.

Slika pune veličine

Image

AXL djelomično spašava tumorigenske fenotipe obrušavanja YAP1 u stanicama PLC / PRF / 5. ( a ) Western blot i kvantitativna PCR analiza ekspresije AXL i YAP u PLC / PRF / 5 na dan 3. i 5. nakon ko-transfekcije siYAP1 i pCI-AXL. siCon i pCI-neo bili su vektorska kontrola u svakom pokusu, a β-aktin je unutarnja kontrola opterećenja u western blotu. ( b ) Analiza zacjeljivanja rana pokazala je sličnu stopu zatvaranja rana u kontroli siCon + vektora i u siYAP1 + AXL, dok je siYAP1 + vektor kasnio u zatvaranju. ( c ) MTT test: AXL djelomično spašava brzinu proliferacije stanica u stanicama siYAP1 PLC / PRF / 5. Podaci su prikazani kao srednja ± 2 × pol. Eksperimenti su provedeni u tri primjerka i ponovljeni su najmanje dva puta.

Slika pune veličine

Rasprava

Tumori su složeni biološki sustavi koji proizlaze iz progresivne sekvence genetskih promjena koje pokreću malignu transformaciju normalnih stanica i invazivnost novotvorine. Pojava integrativnih pristupa onkogenomiji među vrstama započela je otkrivati ​​genetske promjene u genomu karcinoma kodiranja tumorageneze i metastaza (Peeper i Berns, 2006 .; Zender i Lowe, 2008). Naša nedavna studija u mozaičnom HCC modelu miša identificirala je žarišnu leziju na lokusu 9qA1 (sintetički za humani 11q22), u kojem je YAP1 definiran kao nepošteni onkogeni pokretač u karcinogenezi jetre (Zender i sur., 2006). U ovom istraživanju, istraživali smo molekularne mehanizme tumorageneze izazvane YAP1 u ne-neoplastičnoj staničnoj liniji hepatocita, MIHA, i razjasnili novu molekulsku vezu između signalnog i MAP puta Hippo putem aktivacije AXL receptor kinaze u HCC.

YAP1 je moćan transkripcijski koaktivator koji kontrolira veličinu organa i apoptozu. Trenutno postoje snažni dokazi koji pokazuju da disregulacija hipo signalizacije i YAP1 ekspresije može uzrokovati tumorigenezu i gubitak kontrole veličine organa. Korištenjem uvjetnog transgeničnog modela miša, otkriveno je da YAP nije reguliran u jetri i pojačana je transkripcija određenih ciljnih gena, poput Ki67 , c-myc , SOX4 , H19 i AFP , što uglavnom utječe na proliferaciju hepatocita (Dong i sur., 2007). Podaci predstavljeni u ovoj studiji pružaju snažne dokaze za onkogena svojstva YAP1 u transformaciji ne-tumorigenskih hepatocitnih staničnih linija MIHA u tumorigenske fenotipove koji pokazuju rast neovisan o sidrištu, inhibiciju apoptoze, staničnu proliferaciju, pokretljivost i invaziju in vitro , i da transducirati stvaranje tumora u modelima potkožnih ksenografskih golih miša. Međutim, točni mehanizmi nizvodno koji uzrokuju tumogena svojstva YAP-a i dalje su neizdrživi.

Fenotipske promjene potaknute YAP1 mogu uključivati ​​dediferencijaciju jetrenih MIHA stanica u embrionalni stadij, nakon čega slijedi transformacija u stanice slične HCC-u. Primijetili smo smanjenu regulaciju YAP1 transkripcije tijekom stanične diferencijacije (neobjavljeni podaci), što je u prilog nedavnom istraživanju da YAP ima sposobnost induciranja dediferencijacije i ekspanzije multipotentnih stanica porijekla u tankom crijevu (Camargo i sur., 2007). Kolektivno, onkogeni učinci onkogena YAP1 u hepatocitima slični su fenotipovima izraslih iz Drosophila ortologa Yki, koji povećavaju proliferaciju stanica i smanjuju staničnu smrt (Huang i sur., 2005; Dong i sur., 2007). Da li YAP1 također ima ulogu u svojstvima HCC-a „matiranje“ ostaje da se dalje razrađuje u budućim istraživanjima.

Identificirali smo AXL kao jedan od najreguliranijih gena u MIHA transformiranoj staničnoj liniji; AXL je jedinstvena transmembranska recepcija tirozin kinaza koja se sastoji od suprotnih domena sličnih imunoglobulinu i ponavljanja fibronektina tipa III u izvanćelijskoj regiji (Hafizi i Dahlback, 2006). Prekomjerna ekspresija AXL uključena je u nekoliko zloćudnih bolesti, uključujući debelo crijevo (Craven i sur., 1995.), prostatu (Sainaghi i sur., 2005.), dojke (Berclaz i sur., 2001.), želudac (Sawabu i sur., 2007) i HCC (Tsou i sur., 1998). Nadalje, visoka razina AXL aktivnosti povezana je s metastatskim lezijama u melanomu (Bittner i sur., 2000), kao i sa lošim kliničkim ishodima u adenokarcinomu pluća (Shieh i sur., 2005). AXL se karakterizira kao onkogena kinaza svojim promicanjem preživljavanja, proliferacije, invazije i migracije stanica karcinoma. Najpoznatiji aspekt AXL u karcinomu je taj da on štiti od apoptoze zbog gladovanja u serumu (Goruppi i sur., 1996); ova zaštita rezultat je aktiviranja puteva preživljavanja poput nuklearnog faktora kappa B (Demarchi i sur., 2001.), fosfoinozitid 3-kinaze / Akt (Hasanbasic i sur., 2004.) i ERK 1/2 kinaza (Sainaghi i sur., 2005 ). AXL je također uključen u angiogenezu i u proces neovaskularizacije, kao i u regulaciji aktivnosti matrične metalopeptidaze-9 (Tai i sur., 2008). Zapravo, sve ove onkogene značajke primijećene su u YAP1 transformiranim MIHA tumorima, in vitro i in vivo : (1) povećani opstanak stanica i rast u uvjetima bez seruma, (2) poboljšane sposobnosti za sidrenje stanica neovisno rast, migracija i invazija, (3) fosforilacija MAP kinaza i (4) visoka mikrovaskularna gustoća i Ki67 proliferativni indeks u eksplantatima tumora ksenografta. Pored toga, otkrivena je značajna indukcija HCC biomarker AFP u supernatantu kulture klona MIHA-YAP1 kliničkim biokemijskim testom, kao i u jetri transformiranim MIHA-YAP1.

Bez obzira na činjenicu da je kinaza AXL receptora uvjerljivi nizvodno cilj YAP-a, dodatno smo pokazali vezanje YAP proteina na AXL promotor koji sadrži TEAD, pomoću luporiferaste reportera i ChIP testa. Dobro je utvrđeno da YAP regulira rast stanica putem faktora transkripcije TEAD i u stanicama raka i progenitorima (Cao i sur., 2008; Zhao i sur., 2008b), te da su ti faktori transkripcije obično potrebni za rast stanica uzrokovanih YAP-om, maligna transformacija i prijelaz epitela u mezenhim. Naši podaci također otkrivaju kritičnu ulogu AXL-a u onkogenim funkcijama posredovanim YAP1, jer je obustava ekspresije AXL-a ometala migraciju i invaziju MIHA-transformiranih stanica MIHA, kao i njihovu održivost u uvjetima serumske gladovanja, spašavajući AXL u YAP1-knockdown-u PLC / PRF / 5 HCC je u određenoj mjeri vratio staničnu proliferaciju i migracijske fenotipe. Ciljano AXL s monoklonskim antitijelom ili inhibitorom kinaze suzbijao je invazivnost i kemoresistenciju kanceroznih stanica karcinoma pluća (Lay et al., 2007) i karcinom dojke (Zhang i sur., 2008). U našim istraživanjima, oborenje YAP ili AXL ekspresije smanjilo je tumorigenske i metastatske potencijale HCC stanične linije. U tijeku su daljnja ispitivanja YAP-a kao cilja namijenjenog lijekovima na životinjskim modelima i kliničke studije potencijala AXL inhibitora (na primjer, sulfasalazin) za liječenje uznapredovalog HCC-a.

Zaključno, ovaj rad definira određena mehanička svojstva YAP onkogena u razvoju HCC-a, identificira novu molekularnu vezu između hipo signalizacije i MAP kinaznog puta kroz aktiviranje AXL posredovanog YAP / TEAD-om i potencijalno uključuje nove molekularno ciljane terapije za liječenje ove agresivnosti zloćudni tumor.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske slike 1–3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije prate rad na web stranici Oncogene (//www.nature.com/onc)