Bifidobacterium breve ucc2003 metabolizira oligosaharide ljudskog mlijeka lakto-n-tetraose i lakto-n-neo-tetraose kroz preklapajuće, ali različite puteve | znanstvena izvješća

Bifidobacterium breve ucc2003 metabolizira oligosaharide ljudskog mlijeka lakto-n-tetraose i lakto-n-neo-tetraose kroz preklapajuće, ali različite puteve | znanstvena izvješća

Anonim

teme

  • Bakterijska genomika
  • Biologija bakterijskih sustava

Sažetak

U ovom istraživanju pokazujemo da prototip soja B. breve UCC2003 posjeduje specifične metaboličke puteve za korištenje lakto-N-tetraze (LNT) i lakto-N-neotetraose (LNnT), koji predstavljaju središnje dijelove tipa I i tipa II oligosaharidi iz humanog mlijeka (HMO). Korištenjem kombinacije eksperimentalnih pristupa, identificirani su i okarakterizirani enzimski mehanizmi koji su uključeni u metabolizam LNT-a i LNnT-a. Homolozi ključnih genetskih lokusa koji sudjeluju u korištenju ovih HMO supstrata identificirani su u B. breve, B. bifidum, B. longum subsp. infantis i B. longum subsp. longum korištenjem bioinformatskih analiza, a pokazalo se da su varijabilno prisutni među ostalim članovima roda Bifidobacterium , s izrazitim obrascem očuvanja među bifidobakterijskim vrstama povezanim s ljudima.

Uvod

Konzumiranje majčinog majčinog mlijeka ili njegov nedostatak utječe na sastav mikrobiote crijeva novorođenčeta 1, 2, 3 . Nepravilan razvoj ili poremećaj ove mikrobne zajednice doprinosi poremećajima kao što su nekrotizirajući enterokolitis, infantilna dijareja i neonatalna infekcija streptokokne skupine B 4, 5, 6, 7, 8 . Izuzetno je što je fekalna mikrobiota zdrave dojene djece obogaćena za određene vrste roda Bifidobacterium 9, koje su visoko-G + C Gram-pozitivni anaerobi i članovi Actinobacteria phylum-a. Prirodno pronađeni kao simbionti probavnog trakta sisavaca, ptica ili insekata, bifidobakterije uživaju znatnu znanstvenu pažnju zbog svojih navodnih korisnih svojstava 2, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 .

Dok laktoza (Galβ1-4Glc) sadrži glavnu ugljikohidratnu komponentu ljudskog majčinog mlijeka i kolostrum (~ 90%), oligosaharidi ljudskog mlijeka (HMO) predstavljaju sljedeću najznačajniju frakciju ugljikohidrata, ispred glikolipida 2, 17, i obično se nalaze u koncentracija ≥4 g / L (i veća od 15 g / L) 2, 18, 19, 20 . HMO predstavljaju heterogenu glikansku mješavinu, od kojih je identificirano> 200 različitih struktura 18 . Većina ovih HMO struktura razvrstane je u dvije vrste. Obilni HMO tipa I sadrže lakto-N-tetraozu (LNT; slika 1) (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ-4Glc), koja je sastavljena od laktoze povezane s lakto-N-biozom (LNB) (Galβ1-3GlcNAc). HMO tipa II sadrže LNT izomer lakto-N-neotetraose (LNnT; sl. 1) (Galβ-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), koji je sastavljen od laktoze povezane s N-acetillaktozaminom (LacNAc) (Galβ1-4Glcomer, od LNB-a. Veće HMO vrste I i II mogu sadržavati daljnje LNB ili LacNAc podjedinice, a mogu biti fukozilirane ili sialilirane 2, 18, 21 .

Image

Slika pune veličine

Unatoč obilju HMO-a u majčinom mlijeku, dijete ne može metabolizirati te glikane te se trenutno vjeruje da oni olakšavaju uspostavljanje mikrobiote crijeva specifične za novorođenčad, a bifidobakterije su posebno obilne 16, 22 . Česte među posljednjim su Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum subsp. infantis i subsp. longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium pseudocatenulatum i Bifidobacterium kashiwanohense 9, 23, 24, 25, 26, 27 . Ne iznenađuje da se pokazalo da određene bifidobakterijske vrste mogu metabolizirati (posebno) HMO 18, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 . Prethodne studije su rasvijetlile neke metaboličke puteve za upotrebu HMO od strane B. bifidum i B. longum subsp. infantis , s posebnim naglaskom na LNT i LNnT 28 . B. longum subsp. infantis naročito internira , netaknute HMO male mase, uključujući (prekursore) LN (n) T 18, 28, 35, koje se zauzvrat hidroliziraju u lakto-N-triozu i galaktozu pomoću dvije HMO tipične β-galaktozidaze ( tj. jedan enzim koji djeluje na LNT, drugi na LNnT) 29 . Lakto-N-trioza se nadalje hidrolizira N-acetilheksosaminidazom u N-acetilglukozamin (GlcNAc) i laktozu, čiji se posljednji hidrolizat a β-galaktozidazom 30 u galaktozu i glukozu ulazi u leloir i fruktozu-6- putevi fosfat (F6P) fosfoketolaze i put metabolizma amino šećera (za GlcNAc) 28, 31, koji se unose u ukupni metabolički put Bifidobacteriaceae, poznat kao Bifid Shunt.

B. bifidum ima dva različita i naizgled jedinstvena puta za metabolizam LN (n) T. HMO velikog tipa I i II razgrađuju se izvanstanične fukozidaze, sialidaze i glikozidne hidrolaze kako bi se oslobodili LNT i LNnT 28 . LNT se hidrolizira na svojoj središnjoj β-1, 3-vezi izvanstaničnom glikozidnom hidrolatom u laktozu i LNB, pri čemu se potonji transportiraju u stanicu i potom razgrađuju pomoću dvije različite LNB fosforilaze (LNBP), oslobađajući galaktozu 1-fosfat i GlcNAc 32, 33 . Oslobođena laktoza je ili hidrolizirana izvanstaničnom P-galaktozidazom u galaktozu i glukozu (koja je stanica međusobno internalizirana), ili se transportira u stanicu, gdje se na sličan način hidrolizira intracelularnim β-galaktozidazama 28, 32, 36 . Ti monosaharidi se potom metaboliziraju istim putevima kao i oni opisani za B. longum subsp. infantis . Metabolizam HMO ovog tipa I primijećen je i kod nekih vrsta B. longum subsp. longum 32, 37 . Pored toga, B. bifidum ima zaseban put za razgradnju i korištenje LNnT. Izvanstanična β-galaktozidaza cijepa LNnT na ostatku Galβ-1, 4, oslobađajući galaktozu i lakto-N-triozu 34 . Lakto-N-trioza se zatim hidrolizira izvanstaničnom N-acetilheksosaminidazom, oslobađajući GlcNAc i laktozu, pri čemu se potonji hidrolizira gore spomenutim izvanstaničnim β-galaktozidazama u glukozu i galaktozu (koji se transportiraju u stanicu) 36 ili internaliziraju a zatim se degradira kako je opisano. Jednom unutar stanice, ti monosaharidi se metaboliziraju kao što je spomenuto gore 34 .

Treba napomenuti da postoji specifičan put za LNB metabolizam, poznat kao GNB / LNB put. U B. bifidumu , kao što je već spomenuto, LNB se fosforolizira u monosaharide bilo kojim od dva različita LNBP enzima, dok je u B. infantis , LNB fosforoliziran jednim enzimom LNBP, čiji gen dijeli homolognost s oba B. bifidum LNBP gena 28, 31 . Čini se da je ovaj put GNB / LNB prisutan u bifidobakterijskim vrstama koje se obično nalaze u fekalijama novorođenčadi 28 . Očigledna odsutnost ovog puta GNB / LNB i, konkretno, gena koji kodira LNBP u bifidobakterijama povezanim sa odraslima (kao što je B. adolescentis ) očituje se kroz njihovu nesposobnost da koriste LNB ili druge HMO kao izvor ugljika za rast, a mogu stoga objasnite, barem djelomično, njihovu odsutnost ili nisko obilje u mikrobioti dojene djece 18 .

Malo je podataka o korištenju HMO-a od strane B. breve-a , iako se sugerira da B. breve djeluje kao "pročistač" kroz hranjenje monosaharidima koji su dobiveni HMO-om, a koji se oslobađaju zbog izvanćelijskih hidroliznih djelovanja drugih mikrobiota dojenčadi članovi 18 . Međutim, novija istraživanja pokazuju da B. breve može koristiti određene HMO, kao što su fukosilaktoza, LNT i sijalil-LNT, ili izvedene strukture poput LNB i sialinske kiseline 17, 38, 39, 40 .

U ovom istraživanju pokazujemo da B. breve posjeduje metaboličke strojeve za razgradnju i iskorištavanje LNT-a i LNnT-a. Nadalje, ocjenjujemo prisutnost i distribuciju ključnih genskih lokusa uključenih u LNT i LNnT pri korištenju pripadnika roda Bifidobacterium .

Rezultati

Rast sojeva B. breve na LNT i LNnT

Da bi se utvrdilo da li su sojevi B. breve sposobni za metabolizam LNT i / ili LNnT, procijenjen je rast modificiranog MRS medija (mMRS) dopunjenog s 1% (w / vol) LNT, LNnT ili laktozom (kao pozitivna kontrola) za šesnaest sojeva B. breve mjerenjem OD 600 nm nakon 24 sata anaerobnog rasta na 37 ° C. Za sve ispitivane vrste B. breve općenito je opaženo da dobro rastu (konačni OD 600 nm > 0, 8) na oba LNT i LNnT, s određenom varijabilnošću između sojeva na jednom ili oba HMO supstrata (dopunski Sl. S1).

Transkriptna analiza B. breve UCC2003 uzgojena na LNT i LNB

Da bi se identificirali geni koji su uključeni u metabolizam HNO tipa I HMO centralnog dijela i njegove sastavne komponente LNB, globalna ekspresija gena određena je analizom mikrorasta tijekom rasta B. breve UCC2003 u mMRS dopunjenom LNT ili LNB i uspoređena u transkript soja kada se uzgaja u mMRS-u dopunjenom ribozom. Riboza je odabrana kao prikladna transkriptomska referenca, jer je metabolički put i profil ekspresije gena za rast UCC2003 na ribozi poznat i ranije je korišten kao referentna 39, 41 . Geni za koje se pokazalo da su značajno regulirani u transkripciji iznad označenog presjeka (promjena nabora> 2, 5, P <0, 001) prikazani su u tablici 1. Geni uregulirani u izrazu uključuju one koji odgovaraju lokusima Bbr_0526-530, Bbr_1551- 1553, Bbr_1554-1560 i Bbr_1585-1590. Moguća uključenost ovih gena u LNT / LNB metabolizam bit će dodatno obrađena u nastavku.

Tablica pune veličine

Genetska organizacija gena uključenih u metabolizam LNT-a

Na temelju rezultata mikroarkira i funkcionalnog predviđanja ovih LNT (i LNB) reguliranih gena, impliciramo genske nakupine Bbr_0526-0530, Bbr_1554-1560, Bbr_1585-1590 i eventualno Bbr_1551-1553 (prikazane na slici 2) u LNT-u i LNB metabolizam u B. breve UCC2003.

Image

Duljina strelica proporcionalna je veličini otvorenog okvira za čitanje, a na vrhu je dan naziv lokusa gena, što ukazuje na njegovu pretpostavljenu funkciju. Za gene koji su prikazani crvenom bojom predviđa se da kodiraju proteine ​​s unutarćelijskom lokalizacijom, geni prikazani zelenom bojom predviđaju da kodiraju proteine ​​s transmembranskom lokalizacijom, a geni prikazani plavom bojom predviđaju da kodiraju proteine ​​s izvanćelijskom lokalizacijom i signalnom peptidnom sekvencom.

Slika pune veličine

Bbr_0527 i Bbr_0528 (ovdje označeni kao lntP1 i lntP2 ) predviđaju da kodiraju permeazne komponente ABC prijenosnog sustava. Također se u ovom klasteru nalazi (Sl. 2) Bbr_0529 (označen s lntA ), koji kodira predviđenu β-galaktozidazu iz porodice GH42 glikozid hidrolaze. Bbr_0530 (ovdje označen kao lntS ) kodira pretpostavljeni vezni protein koji se veže za ABC transportni sustav. Smješten neposredno uzvodno od ovog klastera, Bbr_0526 (označen lntR ) kodira pretpostavljeni regulator transkripcije tipa LacI. Prethodno smo umiješali Bbr_0526-530 grozd u metabolizam galakto-oligosaharida 42, gdje su geni označeni gosR (lntR ), gosD (lntP1 ), gosE (lntP2 ), gosG (lntA ) i gosC (lntS ). Ovdje smo odlučili ponovno imenovati ovaj klaster kao cluster lnt , jer se čini da je njegova glavna funkcija u metabolizmu LNT i LNnT (vidi dolje).

Bbr_1551 (ovdje označen kao lacS ) kodira galaktozidni simporter, a predviđa se da djeluje u transportu laktoze i galakto-oligosaharida u stanicu. LacS gen smješten je u klasteru koji također sadrži gene Bbr_1552 (označene kao lacZ6 ), β-galaktozidazu (GH2) za koju se prethodno pokazalo da je uključena u metabolizam galakto-oligosaharida 42 i Bbr_1553 (označen kao lacI ), regulator lacl-tipa.

Predviđa se da Bbr_1555 (označeno nahR ) kodira Nag-type transkripcijski regulator. Bbr_1556 (označeno nahA ) kodira pretpostavljenu β-N-acetilheksosaminidazu (GH20). Uzvodno od nahR je gen koji kodira pretpostavljeni solutni vezivni protein (Bbr_1554 i ovdje je označen kao nahS ), dok se nizvodno od nahA nalaze Bbr_1558 ( nahP1 ), Bbr_1559 ( nahP2 ) i Bbr_1560 ( nahT ), za koje se predviđa da određuju dvije permeaze i ATP-vezujući protein; odnosno (Sl. 2).

Bbr_1587 (ovdje označen kao lnbP ) kodira jasan homolog (89, 84% sličnost BBPR_1055 B. bifidum PRL2010, i 97, 62% Blon_2174 iz B. longum subsp. Infantis ATCC 15697) prethodno karakteriziranog LNBP-a, koji pripada 1, 3-P-galaktozil-N-acetilheksosamin fosforilaza (GH112) 31, 43, 44 . Pretpostavljena funkcija ovog proteina u UCC2003 je cijepanje i istodobna fosforilacija LNB-a i njegovo prolazak u put GNB / LNB 43, 44, 45, 46, 47 . LnbP gen smješten je u klasteru Bbr_1585-1590, koji također uključuje gene koji kodiraju 4-epimerazu UDP-glukoze (Bbr_1585; galE ), protein porodice fosfotransferaze (Bbr_1586; nahK ), dva proteina permeze (Bbr_1588 i Bbr_1589; galP1 i galP2 , odnosno proteina koji veže rastvore (Bbr_1590; galS ) (Sl. 2), za koga se pretpostavlja da djeluje u metabolizmu GNB / LNB.

Heterološka ekspresija, pročišćavanje i biokemijska karakterizacija LntA i NahA, te enzimska aktivnost na LNT

Kako bi se istražilo predviđene enzimske aktivnosti kodirane s lntA (Bbr_0529) i nahA (Bbr_1556) na jezgri HNO strukture I tipa HNO, odgovarajući LntA i NahA proteini su pročišćeni kao His-označene verzije (LntA His i NahA His ; vidi Materijal i metode). Biokemijske i specifične karakteristike supstrata provedene su inkubiranjem LntA His i NahA His samostalno ili u kombinaciji s LNT i analizom produkata reakcije HPAEC-PAD. Pročišćeni LntA His pokazao je da uklanja dio galaktoze na ne reducirajućem kraju supstrata LNT (Sl. 3a), pokazujući hidroliznu aktivnost prema Galβ-1, 3GlcNAc u HMO strukturama tipa I, i ukazuje na ključnu ulogu u hidrolizi i korištenje LNT-a.

Image

Profili HPAEC kromatograma ( a ) LNT i ( b ) LNnT, kada se inkubiraju u MOPS puferu (pH7) sa: (I) samim LntA, (II) samim NahA, (III) LntA i NahA zajedno, i (IV) LntA, nakon čega slijedi korak denaturacije i naknadno dodavanje NahA.

Slika pune veličine

Kada se NahA His inkubirao sam s LNT-om, nije primijećeno propadanje tetrasaharidne strukture (Sl. 3a). Međutim, kada su LntA His i NahA His bili inkubirani zajedno s LNT-om, primijećen je potpuni raspad LNT-a na monosaharidne sastojke. Kada je LNT inkubiran prvo s LntA His, nakon čega je uslijedio korak enzimatske denaturacije topline, a zatim inkubiran sa NahA His, primijećeni su različiti profili produkata reakcije. Uzorci uzeti nakon početne denaturacije prije dodavanja NahA His pokazali su prisutnost lakto-N-trioze i galaktoze. Zatim su uzeti uzorci nakon naknadne inkubacije s NahA His. Ukazivali su na prisutnost galaktoze, GlcNAc i laktoze.

Ovi rezultati pokazuju da LntA hidrolizira LNT, oslobađajući galaktozu i lakto-N-triozu. Lakto-N-trioza se potom hidrolizira NahA, oslobađajući laktozu i GlcNAc. Laktoza se potom razgrađuje LntA (i vjerojatno drugim p-galaktozidazama in vivo ), oslobađajući galaktozu i glukozu.

Fenotipska analiza sojeva B. breve koji se nalaze u mutacijama gena uključenih u LNT metabolizam

Da bi se istražilo utječe li prekid pojedinih gena lnt klastera na sposobnost UCC2003 da koristi LNT, procijenjeni su brojni umetnuti mutanti, koji su ili ranije generirani, ili koji su ovdje izgrađeni. Umetani mutant je konstruiran u lntS , što rezultira sojem B. breve UCC2003-lntS. Umetni mutanti u lntP1 i lntA , generirajući sojeve B. breve UCC2003-lntP1 i B. breve UCC2003-lntA, generirani su u prethodnoj studiji (tada su imenovani B. breve UCC2003-gosD i B. breve UCC2003-gosG, respektivno ) 42 . Ovi sojevi analizirani su na njihovu sposobnost rasta u mMRS-u dopunjenom LNT ili LNB, s kontrolama laktoze, u usporedbi s B. breve UCC2003. Potpuni nedostatak rasta zabilježen je za B. breve UCC2003-lntA u mediju koji sadrži LNT, za razliku od normalnog rasta divljim tipom u istom mediju (Sl. 4a). U mediju koji sadrži LNB nije prikazan rast ovog mutantnog soja (nije prikazan). Kao što se očekivalo, ponovno uvođenje lntA gena na plazmid pBC1.2 pod kontrolom konstitutivnog p44 promotora 48 (vidi Materijali i postupci) u UCC2003-lntA mutantu obnovilo je sposobnost mutanta da raste na LNT (Supplementarna slika S3). Dakle, transkriptni podaci, profili hidrolize supstrata i rezultati mutantnog rasta pokazuju da je ova β-galaktozidaza posebno potrebna za hidrolizu LNT-a tipa HMO tipa I na njenom ostatku Galβ1-3GlcNAc, oslobađajući galaktozu i lakto-N-triozu za daljnji metabolizam obrada. Umetnuti mutanti B. breve UCC2003- lntP1 i B. breve UCC2003- lntS pokazali su da dostižu istu konačnu optičku gustoću kao i divlji tip soja UCC2003 tijekom rasta mMRS-a dopunjenog LNT (slika 4a), što ukazuje da bilo koja od ovih predviđenih transportnih komponenti djeluje ne igraju ulogu u metabolizmu LNT-a ili da postoje kompenzacijski transportni sustavi za ovaj supstrat.

Image

( a ) Konačne vrijednosti OD 600nm nakon 24 sata rasta divljeg tipa B. breve UCC2003 i mutanti B. breve UCC2003-lntP1, B. breve UCC2003-lntA, B. breve UCC2003-lntS, B. breve UCC2003-nahA, B Breve UCC2003-nahS, B. breve UCC2003-lacZ2, B. breve UCC2003-lacS i B. breve UCC2003-lacZ6 u modificiranom MRS koji sadrži 1% (tež. / vol.) laktoze, 1% (tež. / vol.) LNT ili 1% (tež. / vol.) LNnT kao jedini izvor ugljika. ( b ) Konačne vrijednosti OD 600 nm nakon 24 sata rasta divljeg tipa B. breve UCC2003 i mutanti B. breve UCC2003-lacZ2, B. breve UCC2003-lntA, B. breve UCC2003-lacZ6 i B. breve UCC2003-lnbP u modificiranom MRS koji sadrži 1% (tež. / vol.) laktoze, 1% LNB, 1% (tež. / vol.) LNT, 1% (tež. / vol.) LNnT kao jedini izvor ugljika. Rezultati su srednje vrijednosti dobivene ručno iz dva odvojena pokusa (zbog ograničene dostupnosti određenih ugljikohidrata). Trake pogrešaka predstavljaju standardno odstupanje.

Slika pune veličine

Da bi se istražilo da li poremećaj lnbP utječe na sposobnost UCC2003 da koristi LNT i / ili LNB, iz prethodne studije 46 i u usporedbi s divljim tipom B usvojen je Tnt5 mutant za ubacivanje transpozona (označen B. breve UCC2003-lnbP). uzgajati UCC2003 zbog njegove sposobnosti rasta u mMRS juhi dopunjenoj LNT ili LNB ili laktozom kao kontrolom. Kao što se i očekivalo, za razliku od divlje vrste, B. breve UCC2003- lnbP pokazao je gotovo potpunu nemogućnost rasta na LNB-u (Sl. 4b). Ovaj mutant dostigao je konačnu razinu OD 600nm na LNT i laktozu koji su usporedivi s vrstom divljeg tipa (slika 4b), potvrđujući ključnu ulogu lnbP u metabolizmu LNB-a, dok također pokazuje da lntA ne igra izravnu ulogu in vivo u metabolizmu LNB-a,

Da bi se istražilo da li poremećaj lacS, nahS ili nahA utječe na sposobnost UCC2003 da koristi LNT, procijenjeni su ubacivani mutanti u tim genima. Umetni mutant B. breve UCC2003-lacS 42 nije pokazao značajnu razliku u konačnom OD postignutom nakon rasta na LNT u usporedbi s divljim tipom (slika 4a). Umetni mutant u nahS (generiran u ovoj studiji), označen kao B. breve UCC2003-nahS, također nije pokazao razliku u konačnom OD nakon rasta u mediju koji sadrži LNT (u usporedbi s divljim tipom, (Sl. 4a). sugerira da ili nahS nije uključen u LNT transport ili da, iako nahS i drugi dijelovi transportnog sustava nah lokusa mogu biti uključeni u transport LNT-a u stanicu, njihova se funkcija nadoknađuje aktivnošću jednog ili više drugih prijevoza Umetanje mutanta u nahA (generirano u ovoj studiji), označenog B. breve UCC2003-nahA, pokazalo je da pokazuje potpuni nedostatak rasta u mediju koji sadrži LNT (slika 4a). Ponovno uvođenje gena nahA u trans plazmid pBC1.2, pod nadzorom transkripcije vlastitog promotora 48 (vidi Materijali i postupci), u mutantu UCC2003-nahA vratio je sposobnost rasta na LNT (suplementarna slika S3). Ovi nalazi pokazuju da je nahA presudan za LNT metabolizam, odgovorni za hidroliza lakto-N-trioze, čime se oslobađa laktoza i GlcNAc.

Transkriptomna analiza B. breve UCC2003, uzgojena na LNnT, laktozamin i laktozu

Da bi se istražilo koji su geni uključeni u metabolizam centralne grupe tipa II LNnT i njegove sastavne komponente LacNAc, globalna ekspresija gena određena je mikroarrijskom analizom tijekom rasta B. breve UCC2003 u mMRS-u dopunjenom sa svakim dotičnim šećerom, kao i laktozom (koji također posjeduje ostatak Galβ-1, 4) u usporedbi s ekspresijom gena tijekom rasta u mMRS-u dopunjenom ribozom (NB. Koristili smo hidrokloridnu sol laktozamina umjesto LacNAc, jer potonji nije bio komercijalno dostupan u pristupačnoj količini), Geni za koje je pokazano da su značajno regulisani u transkripciji iznad određenog graničnog preseka (promjena nabora> 2, 5, P <0, 001) prikazani su u Tablici 1. Geni uregulirani u izrazu uključuju one koji se nalaze u lokusima Bbr_0526-530, Bbr_1551- 1553, Bbr_1554-1560 i Bbr_1585-1590. Moguća uključenost ovih gena u metabolizam LNnT / LacNAc procijenjena je u nastavku.

Genetska organizacija gena uključenih u metabolizam LNnT

Na temelju rezultata provedenih mikroskopskih analiza i funkcionalne oznake LNnT / LacNAc-reguliranih gena, predlažemo da se uključe proizvodi genske skupine Bbr_0526-0530, Bbr_1551-1553 i Bbr_1554-1560 (shematski prikazano na slici 2). u metabolizmu LNnT i LacNAc (prisutni kao centralne jedinice u tipu II HMO) u B. breve UCC2003.

Heterološka ekspresija, pročišćavanje i biokemijska karakterizacija LntA, LacZ2, LacZ6, NahA i enzimska aktivnost na tipu II HMO strukture LNnT

Kako bi se istražilo predviđene pojedinačne i kombinirane enzimske aktivnosti proteinskih proizvoda lacZ2 (Bbr_0010), lntA (Bbr_0529), lacZ6 (Bbr_1552) i nahA (Bbr_1556) na jezgri HMO strukture II tipa LNnT, odgovarajući proteinski proizvodi bili su prekomjerno proizvedeno i pročišćeno. Biokemijske i specifične karakteristike supstrata provedene su inkubiranjem pojedinih enzima ili njihovih kombinacija s određenim supstratom i analizom HPAEC-ovih reakcijskih produkata u odnosu na brojne standarde supstrata i kontrole reakcija. Pročišćeni LntA His bio je sposoban ukloniti galaktozni dio na reducirajućem kraju LNnT (Sl. 3b), kao i laktozu (podaci nisu prikazani), pokazujući trostruku specifičnost za Galβ-1, 3GlcNAc, Galβ-1, 4GlcNAc i Galβ-1, 4Glc glikozidne veze, a time i središnji dijelovi HMO tipa I i tipa II i laktoza. Pročišćeni LacZ2 His i LacZ6 His bili su, pod primijenjenim uvjetima, također sposobni hidrolizirati LNnT i laktozu (podaci nisu prikazani).

Kada su i LntA His i NahA His inkubirani s LNnT, primijećena je potpuna hidroliza LNnT na njegove sastavne monosaharide. Kad je LNnT inkubiran prvo s LntA His, nakon čega je uslijedio korak enzimske denaturacije topline, a zatim inkubiran sa NahA His, primijećeni su različiti profili produkata reakcije. Uzorci uzeti nakon početne denaturacije prije dodavanja NahA His pokazali su prisutnost lakto-N-trioze i galaktoze. Uzorci uzeti nakon dodavanja NahA His i kasnije inkubacije pokazali su prisutnost galaktoze, GlcNAc i laktoze (Sl. 3b).

Slični rezultati odvojenih i kombiniranih reakcija dobiveni su korištenjem LacZ2 His ili LacZ6 His, zajedno s NahA His na supstratu LNnT (Dopunska slika S2).

Ovi se rezultati slažu s modelom metabolizma HMO tipa II koji je ovdje predložen; pri čemu LntA, LacZ2 i / ili LacZ6 (i možda druge p-galaktozidaze) hidroliziraju LNnT, oslobađajući galaktozu i lakto-N-triozu, za razliku od LNT, koji ni pročišćeni LacZ2 ni LacZ6 nisu pokazali sposobnost hidrolize (podaci nisu prikazani). Lakto-N-trioza se zatim hidrolizira NahA, oslobađajući laktozu i GlcNAc. Laktoza se zatim razgrađuje pomoću LntA (i drugih P-galaktozidaza, uključujući LacZ2 i LacZ6, in vivo ), oslobađajući galaktozu i glukozu. Zbog toga, ove dvije p-galaktozidaze mogu provesti hidrolizu tip II HMO središnjih dijelova (zajedno s LntA).

Fenotipska analiza sojeva B. breve koji se nalaze u mutacijama gena uključenih u LNnT metabolizam

Da bi se istražilo utječe li prekid pojedinih gena lnt klastera na sposobnost UCC2003 da koristi LNnT, procijenjeni su brojni insercijski mutanti. B. breve UCC2003-lntP1, B. breve UCC2003-lntS i B. breve UCC2003-lntA analizirane su na njihovu sposobnost rasta u mMRS nadopunjenom LNnT kontrolom laktoze, u usporedbi s divljim tipom B. breve UCC2003. B. breve UCC2003-lntA postigao je istu konačnu optičku gustoću nakon rasta na mediju koji je sadržavao LNnT u usporedbi s divljim tipom UCC2003 (slika 4a). Podaci transkripta i ispitivanja hidrolize ugljikohidrata (vidi gore) pokazali su da lntA sudjeluje u metabolizmu LNnT, ali njegovu funkciju mogu obavljati i druge glikozidne hidrolaze, kao što je spomenuto. Umetajući mutanti B. breve UCC2003-lntP1 i B. breve UCC2003-lntS nisu pokazali značajnije umanjenje rasta ni na LNnT ni na laktozu, u usporedbi s divljim tipom (slika 4a), što ukazuje na to da ili ove predviđene transportne komponente djeluju ne igraju ulogu u metabolizmu LN (n) T ili da postoje dodatni transportni sustavi koji omogućuju internalizaciju LNnT. Najvjerojatnije je da lntP1, lntP2 i lntS doista djeluju i u transportu izvanćelijskog LNnT u citoplazmu, ali da njihovu funkciju mogu dopuniti ili doista nadomjestiti drugi stanični transportni sustavi. Pokazano je da mutant za ubacivanje lnbP , B. breve UCC2003- lnbP , dostiže konačne razine OD 600 nm bilo u laktozi ili u LNnT koje su usporedive s onim sojeva divljeg tipa (slika 4b), što sugerira da lnbP ne igra izravnu ulogu u korištenju LNnT,

Da bi se istražilo da li poremećaj svakog od pet pojedinačnih gena lacZ2, lacZ6, lacS, nahS i nahA utječe na sposobnost UCC2003 da koristi LNnT, procijenjeni su mutanti ovih gena. U tu svrhu korišteni su prethodno navedeni mutanti nahS i nahA , pored insercijskih mutanata u genima Bbr_1551 ( lacS ), Bbr_1552 ( lacZ6 ), konstruiranim u prethodnoj studiji 42, kao i mutantu Tn5 transpozona u Bbr_0010 ( lacZ2 ), iz zasebne studije 49 . Ti su mutirani sojevi analizirani na njihovu sposobnost rasta u mMRS-u dopunjenom LNnT s laktozom (i ribozom, u slučaju B. breve UCC2003-lacZ2 i B. breve UCC2003-lacS) kontrolom, u usporedbi s B. breve UCC2003. Umetani mutanti B. breve UCC2003-lacZ2 i B. breve UCC2003-lacZ6 nisu pokazali značajnije umanjenje rasta na LNnT u usporedbi s divljim tipom, kao što ni ubacivački mutant B. breve UCC2003-lacS (Sl. 4a ). Iako ove analize rasta pokazuju da lacZ2 i lacZ6 nisu bitni za LNnT metabolizam, rezultati ispitivanja hidrolize i indukcija transkripcije ovisne o LNnT lacZ6 (opisani gore) sugeriraju da ove dvije glikozidne hidrolaze igraju ulogu u hidrolizi LNnT, vjerojatno u suglasju s lntA , Ukazni mutant B. breve UCC2003-nahS pokazao je gotovo potpuni nedostatak rasta medija dopunjenog LNnT, u usporedbi s divljim tipom uzgojenim u istom mediju (Sl. 4a). Kao što se i očekivalo, ponovno uvođenje gena nahS na plazmid pBC1.2, pod regulacijom vlastitog promotora 48 (vidi Materijali i postupci), u mutantu UCC2003-nahS preokrenuo je (gotovo potpunu) nemogućnost mutanata da raste na LNnT (dopunska slika .S3). Ovo ukazuje da nahS kodira protein koji veže rastvore pretežno potreban za unos LNnT i da je transportni sustav, kodiran nah lokusom, od presudne važnosti za transport centralnog tetrasaharida tipa II u ćeliju. Za razliku od divljeg tipa, B. breve UCC2003-nahA nije uspio rasti u mediju koji sadrži LNnT (Sl. 4a). Kao što se i očekivalo, ponovno uvođenje gena nahA na plazmid pBC1.2, pod regulacijom vlastitog promotora 48 (vidi Materijali i postupci), u UCC2003-nahA mutantu je vratio nesposobnost mutanta da raste na LNnT (Dopunska slika S3). Ovaj rezultat pokazuje bitnu ulogu proizvoda nahA u metabolizmu LNnT, hidroliziranjem lakto-N-trioze na njegovoj GalNacβ1-3Gal vezivanju, oslobađanjem laktoze i GlcNAc.

Rast mutanata za umetanje nije oslabljen na laktozu, gdje su svi sojevi dostigli konačnu razinu OD 600 nm usporedivu s onom postignutom u UCC2003, osim B. breve UCC2003-lacZ2 i B. breve UCC2003-lacS, jer su prekinuti geni u ovim mutantima za koje se zna da su presudni za metabolizam laktoze 42, 49 (Sl. 4a). B. breve UCC2003-lacZ2 i B. breve UCC2003-lacS postigle su konačne vrijednosti OD 600nm slične onima UCC2003 kada su uzgajane na ribozi (podaci nisu prikazani).

Raspodjela gena povezanih s korištenju HMO središnjeg dijela u rodu Bifidobacterium

Na osnovu gornjih rezultata za B. breve UCC2003 (dodatna tablica S3) identificirana su dva gena za potpis, koji kodiraju glikozidne hidrolaze bitne za kataboličke puteve HMO središnjih dijelova LNT, LNnT i LNB u B. breveu. NahA gen je identificiran kao ključan za razgradnju i LNT i LNnT (hidrolizom lakto-N-trioze), a lnbP je identificiran kao ključan za korištenje LNB. Uz to je identificiran jedan gen signala , lnbB , u B. bifidumu , koji kodira ključnu glikozidnu hidrolazu potrebnu za metabolizam LNT-a, na temelju prethodne literature 32 (Dopunska tablica S3). Druga specifična glikozidna hidrolaze potrebna za metabolizam LNT-a na isti način, lnbX , identificirana je u soju B. longum subsp. longum Sakurama i sur . 37, te je tako i odabran (Dopunska tablica S3). Nisu odabrani geni iz B. longum subsp. infantis , kako se čini da ova vrsta i B. breve dijele iste funkcionalne homologe i tako koriste iste puteve za metabolizam LN (n) T i LNB. Izvedene sekvence aminokiselina ova četiri gena korištene su kao referentne sekvence u višestrukom poravnanju svih dostupnih Bifidobacterium genoma, dobivenih iz NCBI baze podataka, kako je opisano, i predstavljene u toplinskoj mapi, temeljene na graničnom preseku od 70% iterativne sličnosti preko 50% duljine proteina i e-vrijednosti <0, 0001 (Sl. 5). Dobivena reprezentacija, poredana podrijetlom izolacije, otkriva raspodjelu tih ključnih gena, a time i metaboličkih putova, potrebnih za iskorištavanje LN (n) T / LNB kroz rod Bifidobacterium . Gen B. bifidum lnbB i B. longum subsp. čini se da su longum geni lnbX (čiji su proizvodi odgovorni za hidrolizu LNT-a u LNB i laktozu) pojedinačno jedinstveni za B. bifidum i (ovu vrstu) B. longum subsp. longum , odnosno bez jasnih homologa u bilo kojoj drugoj vrsti Bifidobacterium, uključujući i drugu. Dva gena B. breve potpisa korištena u pretraživanju dala su više značajnih pogodaka za homologe, ali u različitom stupnju. Analiza je identificirala relativno mali broj, tj. Četiri homološka nahA gena u rodu: jedan u vrsti povezane s novorođenčadom B. longum subsp. infantis , dvije vrste povezane s marmozetom i jedna vrsta povezana s tamarinom, B. callittrichos , B. ruteri i B. saguini . S druge strane, lnbP je donio 16 značajnih podudarnosti homolognim genima u drugim vrstama Bifidobacterium , izoliranim iz ljudskih i drugih izvora. Značajne razlike u očuvanju tih gena u rodu ukazuju na važnost specifičnih putova koji koriste glikanski dio u bifidobakterijama.

Image

Genski proizvodi iz reprezentativnih genoma sojeva svih vrsta Bifidobacterium na mreži sa značajnom homologijom od 70% iterativne sličnosti preko 50% duljine proteina predstavljeni su u matrici koja koristi kodiranje gradacijom boja koja predstavlja stupanj sličnosti sljedova, vrste naručene podrijetlom izolacije. Bbr_1556 ( nahA ) i Bbr_1587 ( lnbP ) odabrani su iz B. breve UCC2003, BLLJ_1505 ( lnbX ) je odabran od B. longum subsp. longum JCM1217 i BBPR_1438 ( lnbB ) odabran je iz B. bifidum PRL2010.

Slika pune veličine

Rasprava

Uloga HMO kao selektivnog supstrata za specifične bakterijske vrste u neonatalnom crijevu danas se široko predlaže kao jedan od ključnih čimbenika u razvoju zdrave mikrobiote u ranom životu. Visok udio bifidobakterija, osobito vrsta B. breve, B. longum subsp. infantis i B. bifidum , u mikrobioti dojene djece ukazuje na njihovu sposobnost korištenja tih ugljikohidrata kao faktora rasta. Naši nalazi omogućuju nam da predložimo model korištenja HMO-a LN (n) T od B. breve (Sl. 6). U ovom modelu, LN (n) T je internaliziran u stanici i nakon toga razgrađen unutarćelijskim putem u monosaharide za proizvodnju energije. Dok je B. breve u stanju metabolizirati manje HMO komponente, poput fukoze, fukosilaktoze i sialne kiseline, koje se oslobađaju vanćelijskom hidrolizom većih molekula 16, 17, 22, 39, 40, naši nalazi jasno pokazuju da B. breve također može koristiti veće HMO strukture. Ovo proširuje naše viđenje ovog komenzalnog crijeva od samo čistača, do aktivnog i izravnog HMO-a.

Image

Slika pune veličine

Naši višestrani pristupi otkrivaju aktivnosti pojedinih komponenata i time sveukupne puteve koji olakšavaju korištenje LNT-a i LNnT-a od strane B. breve UCC2003. LntA pokazuje trostruku specifičnost za Galβ-1, 3GlcNAc i Galβ-1, 4GlcNAc veze LNT i LNnT, kao i dio laktoze Galβ-1, 4Glc, kao što je prethodno sugerirano 42 . Međutim, sposobnost UCC2003-lntA da raste na LNnT, ali ne i na LNT, ukazuje da dok LNT može biti intracelularno hidroliziran samo LntA, hidroliza LNnT se ne može pripisati isključivo ovoj β-galaktozidazi i može je razgraditi drugim stanične glikozidne hidrolaze kao LacZ6 i LacZ2, oslobađajući lakto-N-triozu za hidrolizu NahA i galaktoze. Treba napomenuti da su i za lacZ2 i za lacZ6 prethodno pokazali da su uključeni u metabolizam laktoze i galakto-oligosaharida 42 . Zanimljivo je da se ovi rezultati zrcale od onih koje su prethodno pokazali Yoshida i sur . 29, koji je u B. longum subsp. infantis ATCC15697, pokazao je preferencijalne aktivnosti jedne GH42 porodične glikozidne hidrolaze (Bga42A) u hidroliziranju HMO tipa I i jedne GH2 porodične glikozidne hidrolaze (Bga2A) u hidroliziranju HMO tipa II i laktoze.

Transkriptomski rezultati jasno impliciraju nahS, lntS, lntP1 i lntP2 u korištenju i LNT i LNnT, koji su uključeni u internalizaciju ovih šećera u stanicu. Nemogućnost da mutant UCC2003-nahS raste na LNnT sugerira ulogu transportera kodiranog nah lokusom kao jedinog sustava odgovornog za internalizaciju LNnT od strane UCC2003. Suprotno tome, s obzirom da UCC2003-nahS prikazuje rast LNT-a usporediv s vrstom divljeg tipa, nah transportni sustav možda neće biti uključen u LNT transport, ili može biti, ali zato što njegova funkcija pomaže jedan ili više dodatnih transportnih sustava. Sposobnost UCC2003-lntP1 i UCC2003-lntS da raste u mMRS-u dopunjenom LNT-om pokazuje da transportni sustav lnt također nije isključivo, niti potencijalno uopće, odgovoran za internalizaciju LNT-a. Stoga predlažemo da ili ova dva prometna sustava mogu imati barem djelomično preklapajuće se specifičnosti supstrata ili da je još neki neodređeni transportni sustav djelomično ili u potpunosti odgovoran za internalizaciju LNT-a.

Dok LNT i LNnT ulaze u stanicu B. breve kao različiti izomeri, njihovi produkti razgradnje su identični i provlače se istim metaboličkim putevima za proizvodnju energije, tj. Dvije molekule galaktoze i jedna glukoza do Leloir i F6P fosfoketolaze za put i jedan GlcNAc do put metabolizma amino šećera (na taj način se izravno i neizravno unosi u bifidski šant) (Sl. 6).

Iako se nalazi unutar molekularne strukture LNT-a, slobodni LNB se ne oslobađa tijekom degradacije centralne jedinice tipa I HMO B. breve UCC2003. Međutim, unatoč relativno malom obimu besplatnog LNB-a u majčinom mlijeku, a time i dojenčadi, dojenčad crijeva, B. breve UCC2003 ima različit put za korištenje LNB-a. Ranije je sugerirano da metabolizam LNB-a može biti proxy za korištenje HMO-a od strane Bifidobacteria 17, 28, što objašnjava prisutnost ovog puta u B. breveu , koji vjerojatno 'briše' slobodni LNB koji se oslobađa izvanstaničnom hidrolizom veće HMO strukture drugih članova mikrobiote, kao što je B. bifidum , i zatim je koriste putem staze GNB / LNB.

Opći model iskorištavanja LN (n) T i LNB u B. breveu zrcali se onaj koji je pronađen u B. longum subsp. infantis . Funkcionalni ekvivalent lacZ2 i lacZ6 u B. longum subsp. infantis ATCC15697 je bga2a 29 . Ortolog lntA je bga42a 29, a protivnik nahA je nagZ30 . Kopija lnbP nalazi se i u B. longum subsp. infantis ATCC15697 31 . Suprotno tome, upotreba središnjeg dijela HMO u B. bifidumu odstupa nekako od B. breve / B. longum subsp. infantis model. Dok B. bifidum posjeduje funkcionalno ekvivalentne ortologe lacZ2 / lacZ6 (bbgIII ) 50 i nahA (bbhI i bbhII ) 34, čini se da su svi ti izvanćelijski proteini, za razliku od (predviđene) unutarćelijske lokalizacije njihove B. breve kolege. Međutim, najveći faktor koji odvaja B. breve / B. longum subsp. model infantis i model B. bifidum čini se da je put hidrolize središnjeg dijela LNT tipa I. U B. bifidumu PRL2010 LnbB hidrolizira LNT izvanstanično na njegovoj vezi GlcNAcβ1-3Gal, oslobađajući LNB, koji je internaliziran, i fosforoliziran s lnbP1 i lnbP2 ; i laktoza, koja se hidrolizira aktivnostima β-galaktozidaze.

Odsutnost B. bifidum lnbB (i B. longum subsp. Longum JCM1217 lnbX ) homologa kod drugih vrsta Bifidobacterium ukazuje na njegovu jedinstvenu funkciju u metabolizmu HMO. To se podudara s prethodnim saznanjima o B. bifidumu (i jednom soju B. longum subsp. Longum ) koji koristi značajno različit put za iskorištavanje LNT-a i metabolizma HMO u usporedbi s B. breveom i B. longum subsp., infantis . Pretraga sličnosti dvaju gena s potpisom B. breve LN (n) T / LNB, nahA i lnbP , među bifidobakterijama pokazuje prisutnost homologa u različitim vrstama Bifidobacterium , ali se opseg njihove očuvanja znatno razlikuje. Šesnaest vrsta Bifidobacterium za koje se pokazalo da posjeduju lnbP homolog izolirano je iz niza okruženja, uključujući uzorke fekalija (dojenčadi i odraslih) ljudi, primata i drugih sisavaca. Očuvanje ovog gena u različitim bifidobakterijskim vrstama ukazuje na važnost ovog gena u putu GNB / LNB, što je zajedničko mnogim vrstama Bifidobacterium , a za koje se prethodno pokazalo da djeluje u ulogama poput metabolizma mucina 28, 46, 51, 52 . Zanimljivo je da su jasni homolozi nahA gena pronađeni samo u četiri druge bifidobakterijske vrste, humani izolat B. longum subsp. infantis , i tri druge vrste primata povezanih s B. callitrichos i B. reuteri , izvorno izolirane iz blata marmozeta i B. sanguini , izvorno izolirane iz fekalija tamarina. Kako se LNT i slične oligosaharidne strukture mogu naći u glikome primarnog mlijeka 53, očekuje se da će nahA homolozi igrati sličnu ulogu u vrstama Bifidobacterium povezanim s tim domaćinima. This suggests a common adaptation of the LNT/LNnT-utilisation pathway among bifidobacteria associated with the primate gut, using their respective milk oligosaccharides as substrates, thereby explaining co-evolution with and colonisation of this host.

Materijali i metode

Bacterial strains, plasmids, and culture conditions

Bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Supplemental Table S2. B. breve UCC2003 was routinely cultured in either de Man Rogosa and Sharpe medium (MRS medium; Difco, BD, Le Pont de Claix, France) supplemented with 0.05% cysteine-HCl or reinforced clostridial medium (RCM; Oxoid Ltd., Basingstoke, England). Carbohydrate utilization by bifidobacterial strains was examined in modified de Man Rogosa and Sharpe (mMRS) medium prepared from first principles 54, and excluding a carbohydrate source. Prior to inoculation, the mMRS medium was supplemented with cysteine-HCl (0.05%, wt/vol) and a particular carbohydrate source (1%, wt/vol). It has previously been shown that mMRS does not support growth of B. breve UCC2003 in the absence of an added carbohydrate 55 . Carbohydrates used were lactose (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), LNB (Elicityl Oligotech, Crolles, France), lactosamine-hydrochloride (lactosamine-HCl) (Glycom, Lyngby, Denmark), LNT (Glycom, Lyngby, Denmark; Elicityl Oligotech, Crolles, France) and LNnT (Glycom, Lyngby, Denmark). A 1% wt/vol concentration of carbohydrate was considered sufficient to analyse the growth capabilities of a strain on a particular carbon source. The addition of these carbohydrates did not significantly alter the pH of the medium, and therefore subsequent pH adjustment was not required.

B. breve cultures were incubated under anaerobic conditions in a modular atmosphere-controlled system (Davidson and Hardy, Belfast, Ireland) at 37 °C. Lactococcus lactis strains were cultivated in M17 broth (Oxoid Ltd., Basingstoke, England) containing 0.5% glucose 56 at 30 °C. Escherichia coli strains were cultured in Luria-Bertani (LB) broth 57 at 37 °C with agitation. Where appropriate, growth media contained tetracycline (Tet; 10 μg ml −1 ), chloramphenicol (Cm; 5 μg ml −1 for L. lactis and E. coli , 2.5 μg ml −1 for B. breve ), erythromycin (Em; 100 μg ml −1 ) or kanamycin (Kan; 50 μg ml −1 ). Recombinant E. coli cells containing (derivatives of) pORI19 were selected on LB agar containing Em and Kan, and supplemented with X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) (40 μg ml −1 ) and 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-galactopyranoside). In order to determine bacterial growth profiles and final optical densities, 5 ml of freshly prepared mMRS medium, including a particular carbohydrate (see above), was inoculated with 50 μl (1%) of a stationary phase culture of B. breve UCC2003. Uninoculated mMRS medium was used as a negative control. Cultures were incubated anaerobically at 37 °C for 24 h, and the optical density at 600 nm (OD600) was determined manually, or using a PowerWave microplate spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., USA) in conjunction with Gen5 microplate software for Windows, at the end of this period, as described previously 55, 58 .

Bifidobacterium breve Growth Assays

Growth profiles of sixteen distinct Bifidobacterium breve strains from the UCC collection (listed in Supplemental Table S2) on LNT or LNnT, as the sole carbohydrate source, using lactose as a positive control, were determined in mMRS, using the microplate spectrophotometer, as described above. LNB and lactosamine-HCl were not included in these assays, as sufficient (and affordable) quantities of these carbohydrate substrates could not be obtained.

Growth profiles of insertion mutant, Tn5 transposon mutant, and complementation strains of B. breve UCC2003 generated in this and other studies, were determined, manually, as described above, adopting LNT, LNnT or LNB as carbohydrate source and in each case using lactose as a positive control.

Nucleotide sequence analysis

Sequence data were obtained from the Artemis-mediated 59 genome annotations of B. breve UCC2003 60 . Database searches were performed using non-redundant sequences accessible at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (//www.ncbi.nlm.nih.gov) using the basic local alignment search tool (BLAST) 61, 62 . Sequences were verified and analysed using the SeqMan and SeqBuilder programs of the DNAStar software package (version 10.1.2; DNAStar, Madison, WI, USA). Gene product (protein) localisation and signal peptide predictions were made using the TMHMM, v. 2.0 and SignalP, v. 4.1 63 servers, respectively, available at //www.cbs.dtu.dk/.

DNA Manipulations

Chromosomal DNA was isolated from B. breve UCC2003 as previously described 64 . Plasmid DNA was isolated from E. coli, L. lactis and B. breve using the Roche High Pure Plasmid Isolation kit (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). An initial lysis step was performed using 30 mg ml −1 of lysozyme for 30 minutes at 37 °C prior to plasmid isolation from L. lactis or B. breve . DNA manipulations were essentially performed as described previously 57 . All restriction enzymes and T4 DNA ligase were used according to the supplier's instructions (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). Synthetic single stranded oligonucleotide primers used in this study (Supplemental Table S1) were synthesized by Eurofins (Ebersberg, Germany). Standard PCRs were performed using Taq PCRmaster mix (Qiagen) or Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, United States) in a Life Technologies Proflex PCR System (Thermo Scientific, Waltham, United States). PCR products were visualized by ethidium bromide (EtBr) staining following agarose gel electrophoresis (1% agarose). B. breve colony PCR reactions were performed as described previously 65 . PCR fragments were purified using the Roche high Pure PCR purification kit (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). Plasmid DNA was isolated using the Roche High Pure Plasmid Isolation kit (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). Plasmid DNA was introduced into E. coli by electroporation as described previously 57 . B. breve UCC2003 66 and L. lactis 67 were transformed by electroporation according to published protocols. The correct orientation and integrity of all plasmid constructs (see also below) were verified by DNA sequencing, performed at Eurofins (Ebersberg, Germany).

Analysis of global gene expression using B. breve DNA microarrays

Global gene expression was determined during log-phase growth of B. breve UCC2003 in mMRS supplemented with either LNT, LNnT, LNB, lactosamine-HCl or lactose. The obtained transcriptome was compared to that determined for log-phase B. breve UCC2003 cells when grown in mMRS supplemented with ribose. DNA microarrays containing oligonucleotide primers representing each of the 1864 identified open reading frames on the genome of B. breve UCC2003 were designed and obtained from Agilent Technologies (Palo Alto, Ca., USA). Methods for cell disruption, RNA isolation, RNA quality control, complementary DNA synthesis and labelling were performed as described previously 68 . Labelled cDNA was hybridized using the Agilent Gene Expression hybridization kit (part number 5188-5242) as described in the Agilent Two-Colour Microarray-Based Gene Expression Analysis v4.0 manual (publication number G4140-90050). Following hybridization, microarrays were washed in accordance with Agilent's standard procedures and scanned using an Agilent DNA microarray scanner (model G2565A). Generated scans were converted to data files with Agilent's Feature Extraction software (Version 9.5). DNA-microarray data were processed as previously described 69, 70, 71 . Differential expression tests were performed with the Cyber-T implementation of a variant of the t-test 72 .

Construction of B. breve UCC2003 insertion mutants

An internal fragment of Bbr_0530 (designated here as lntS ) (465 bp, representing codon numbers 61 through to 216 of the 420 codons of this gene), Bbr_1554 (designated here as nahS ) (488 bp, representing codon numbers 92 through to 255 of the 442 codons of this gene), and Bbr_1556 (designated here as nahA ) (443 bp, representing codon numbers 70 through to 218 of the 660 codons of this gene) were amplified by PCR using B. breve UCC2003 chromosomal DNA as a template and primer pairs IM530F and IM530R, IM1554F and IM1554R, or IM1556F and IM1556R, respectively (Supplemental Table S1). The insertion mutants were constructed using a previously described approach 65 . Site-specific recombination of potential tet-resistant mutant isolates was confirmed by colony PCR using primer combinations tetWFw and tetWRv to verify tetW gene integration, and primers 530confirm1 or 530confirm2, 1554Confirm1 or 1554Confirm2, and 1556confirm1 or 1556confirm2 (positioned upstream of the selected internal fragments of Bbr_0530, Bbr_1554 and Bbr_1556, respectively) in combination with primer tetWFw to confirm integration at the correct chromosomal location (Supplemental Table S1).

Complementation of B. breve insertion mutants

DNA fragments encompassing Bbr_0529 (designated here as lntA ), Bbr_1554 ( nahS ) and Bbr_1556 ( nahA ) were generated by PCR amplification from B. breve UCC2003 chromosomal DNA using Q5 High-Fidelity Polymerase (New England BioLabs, Herefordshire, United Kingdom) and primer pairs: 529pNZ44F and 529pNZ44R, 1554PCB1.2F and 1554PBC1.2R, and 1556PBC1.2F and 1556PBC1.2R, respectively (Supplemental Table S1).

The resulting lntA -encompassing fragment was digested with PstI and XbaI, and ligated to the similarly digested pNZ44 73 . The ligation mixture was introduced into L. lactis NZ9000 by electrotransformation and transformants were then selected based on chloramphenicol resistance. The plasmid content of a number of Cm-resistant transformants was screened by restriction analysis. The integrity of the cloned insert of one of the recombinant plasmids, designated pNZ44-lntA, was confirmed by sequencing. The lntA -coding sequence, together with the constitutive p44 lactococcal promoter, specified by pNZ44, was amplified by PCR from pNZ44-lntA using Q5 High-Fidelity DNA polymerase and primer combination P44 Forward and 529pNZ44R (Supplemental Table S1). The resulting DNA fragment was digested with EcoRV and XbaI, and ligated to the similarly digested pBC1.2 74, generating pBC1.2-lntA.

PCR-generated DNA fragments encompassing nahS and nahA , including their presumed promoter regions, were digested with BamHI and XbaI, and ligated to the similarly digested pBC1.2 to generate pBC1.2-nahS or pBC1.2-nahA, respectively. The ligation mixtures were introduced into E. coli XL1-blue by electrotransformation and transformants selected based on tetracycline and chloramphenicol resistance. Transformants were checked for plasmid content using colony PCR, restriction analysis of plasmid DNA, and verified by sequencing. Plasmids pBC1.2-lntA, pBC1.2-nahS or pBC1.2-nahA were introduced into the insertion mutant B. breve UCC2003-lntA, B. breve UCC2003-nahS and B. breve UCC2003-nahA 42, respectively, by electrotransformation and transformants were selected based on tetracycline and chloramphenicol resistance.

Construction of overexpression vectors, protein overproduction and purification

For the construction of the plasmid pNZ-nahA, a DNA fragment encompassing the predicted N-acetylhexosaminidase-encoding gene nahA was generated by PCR amplification from chromosomal DNA of B. breve UCC2003 using Q5 High-Fidelity DNA polymerase and the primer combination 1556F and 1556R (Supplemental Table S1). An in-frame N-terminal His10-encoding sequence was incorporated into the forward primer 1556F to facilitate downstream protein purification. The generated amplicons were digested with PvuII and XbaI, and ligated into the ScaI and XbaI-digested, nisin-inducible translational fusion plasmid pNZ8150 75 . The ligation mixtures were introduced into L. lactis NZ9000 by electrotransformation and transformants were then selected based on chloramphenicol resistance. The plasmid content of a number of Cm-resistant transformants was screened by restriction analysis and the integrity of positively identified clones was verified by sequencing.

Nisin-inducible gene expression and protein overproduction was performed as described previously 76, 77, 78 . In brief, 400 ml of M17 broth supplemented with 0.5% (wt/vol) glucose was inoculated with a 2% inoculum of a particular L. lactis strain, followed by incubation at 30 °C until an OD600 of 0.5 was reached, at which point protein expression was induced by addition of cell-free supernatant of a nisin-producing strain 79, followed by continued incubation for a further 2 hours. Cells were harvested by centrifugation and protein purification achieved as described previously 76 . Protein concentrations were determined using the Bradford method 80 .

Assay of individual and combined β-Galactosidase activities

The individual or sequential hydrolytic activities specified by lntA (corresponding to Bbr_0529), nahA (corresponding to Bbr_1556), lacZ2 (corresponding to Bbr_0010) and lacZ6 (corrsponding to Bbr_1552) were determined essentially as described previously 78, using LNT, LNnT or lactose as a substrate. Briefly, a 50-μl volume of each purified protein (protein concentration of 0.5 mg/ml) was added to 20 mM morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (pH 7.0) buffer and 1 mg ml −1 (wt/vol) of one of the above-mentioned sugars in a final volume of 1 ml, followed by incubation for 24 hours at 37 °C. When sequential activities were assessed, a sample was heated to 85 °C for 15 minutes following 12 hour incubation with the first enzyme and a given substrate, before the addition of the addition of a second enzyme, which was then followed by a further 12-hour incubation at 37 °C. All samples were subject to a final enzyme denaturation step at 85 °C for 15 minutes, before storage at −20 °C.

HPAEC-PAD analysis

For HPAEC-PAD analysis, a Dionex (Sunnyvale, CA) ICS-3000 system was used. Carbohydrate fractions from the above-mentioned hydrolysis assays (25 μl aliquots) were separated on a CarboPac PA1 analytical-exchange column (dimensions, 250 mm by 4 mm) with a CarboPac PA1 guard column (dimensions, 50 mm by 4 mm) and a pulsed electrochemical detector (ED40) in PAD mode (Dionex). Elution was performed at a constant flow-rate of 1.0 ml/min at 30 °C using the following eluents for the analysis: eluent A, 200 mM NaOH; eluent B, 100 mM NaOH plus 550 mM Na acetate; eluent C, Milli-Q water. The following linear gradient of sodium acetate was used with 100 mM NaOH: from 0 to 50 min, 0 mM; from 50 to 51 min, 16 mM; from 51 to 56 min, 100 mM; from 56 to 61 min, 0 mM. Chromatographic profiles of standard carbohydrates were used for comparison of the results of their breakdown by LntA, LacZ2, LacZ6 and NahA proteins. Chromeleon software (version 6.70; Dionex Corporation) was used for the integration and evaluation of the chromatograms obtained. A 1 mg/ml stock solution of each of the carbohydrates, as well as their putative breakdown products (where available) used as reference standards was prepared by dissolving the particular sugar in Milli-Q water.

Bioinformatička analiza

Based on the analysis of the microarray results and functional characterisation of gene loci from B. breve UCC2003, as well as previously published data on HMO utilisation by B. longum subsp. infantis and B. bifidum and B. longum subsp. longum 18, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, four genes were identified as crucial for the utilisation of Type I central moieties LNT and LNB, and Type II HMO moiety LNnT. On-line available genomic data sets of bifidobacteria were first retrieved from the NCBI website (//www.ncbi.nlm.nih.gov) and aligned using an all-vs-all BLASTP approach 61, using 70% of iterative similarity across all available Bifidobacterium species over 50% of protein length and a 0.0001 e-value as a significance cut-off. The resulting alignment was subsequently clustered in MCL families of orthologous genes using the mclblastline algorithm 81 . The resulting output was used to first build a presence/absence binary matrix, and then the genes of interest were selected and represented in a heatmap employing a code colour grading that represents the degree of sequence similarity, with species ordered by origin of isolation. Bbr_1556 ( nahA ) and Bbr_1587 ( lnbP ) were selected from B. breve UCC2003, BLLJ_1505 ( lnbX ) from B. longum subsp. longum JCM1217 and BBPR_1438 ( lnbB ) was selected from B. bifidum PRL2010.

Microarray data accession number

The microarray data obtained in this study have been deposited in NCBI's Gene Expression Omnibus database and are accessible through GEO Series accession number GSE84710.

dodatne informacije

How to cite this article : James, K. et al . Bifidobacterium breve UCC2003 metabolises the human milk oligosaccharides lacto-N-tetraose and lacto-N-neo-tetraose through overlapping, yet distinct pathways. Sci. Rep. 6, 38560; doi: 10.1038/srep38560 (2016).

Napomena izdavača: Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na tvrdnje o nadležnosti u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.