Mirte izazvane bortezomibom izravno epigenetsko prigušivanje lokusnih gena i pokreću apoptozu kod leukemije | stanična smrt i bolest

Mirte izazvane bortezomibom izravno epigenetsko prigušivanje lokusnih gena i pokreću apoptozu kod leukemije | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Leukemija
  • farmakogenetika

Sažetak

Predloženo je da mikroRNA (miRNA) potiskuju transkripciju vezanjem 3 'netransuliranih područja mRNA. Međutim, sudjelovanje i detalji epigenetske regulacije posredovane miRNA-om, posebno u ciljanju genomske DNK i posredovanju epigenetske regulacije, i dalje su uglavnom neistraženi. U ovom istraživanju, transkripcijski faktor CCAAT / pojačivač vezivnog proteina delta (CEBPD) reagirao je na antikancerogeni lijek bortezomib, klinički i visoko selektivni lijek za liječenje leukemije, i pridonio smrtnoj stanici uzrokovanoj bortezomibom. Zanimljivo je da smo, nakon identifikacije miRNA-a izazvanih CEBPD, otkrili da miR-744, miR-3154 i miR-3162 mogu ciljati otoke CpG u 5 'bočnoj regiji CEBPD gena. Prethodno smo pokazali da je kompleks proteina Yin Yang 1 (YY1) / polikomba (PcG) / DNK metiltransferaze (DNMT) važan za inaktiviranje gena delta proteina CCAAT / pojačivača (CEBPD); Nadalje smo otkrili da Argonaute 2 (Ago2) interaktivno djeluje s YY1 i veže se za CEBPD promotor. Kompleks proteina / DNMT grupe miRNA / Ago2 / YY1 / PcG povezao je inaktivaciju CEBPD-a i gena koji su susjedni njegovom 5'-bočnom području, uključujući katalitički polipeptid aktiviran protein-kinazom ( PRKDC ), minichromosom-nedostatak 4 ( MCM4 ) i enzim ubikvitin-konjugirajući E2 varijanta 2 ( UBE2V2 ) nakon liječenja bortezomibom. Nadalje, otkrili smo da je vezanje miRNA potrebno za YY1 / PcG grupu proteina / DNMT složeno epigenetsko utišanje gena i povezano je s metilacijom izazvanom bortezomibom na genomskoj DNK. Ova studija uspješno je karakterizirala interakcije proteina / DNMT kompleksa miRNA / Ago2 / YY1 / PcG grupe i pružila nova saznanja za epigenetsku regulaciju posredovanu miRNA u zaustavljanju leukemičnih stanica i borbenoj smrti uzrokovanoj bortezomibom.

Glavni

MikroRNA (miRNA) sastavljena su od 21–24 RNA nukleotida koji reguliraju više gena i stanične funkcije u progresiji tumora. 1, 2 Interakcijom s članovima proteinske podskupine Argonaute (Ago), miRNA primarno ciljaju homologna mjesta u netransuliranim regijama (UTRs) mRNA, pridonoseći tako translacijskoj inhibiciji ili razgradnji mRNA. 3, 4 Na temelju nalaza analize transkripta, preko 70% promotora gena preklapalo se s nekodirajućim RNK transkriptima koji bi mogli poslužiti kao ciljna mjesta miRNA. 5, 6 Iako miRNA primarno posreduju post-transkripcijsko siljenje gena (PTGS) u citoplazmi, nedavna istraživanja pokazuju da miRNA također prelaze u jezgru i stupaju u interakciju s promotorskom DNA, čime inaktiviraju ekspresiju gena. 7 Pored toga, egzogeni mali RNA uključeni su u agon-posredovanu modifikaciju histona i metilaciju DNA genskih transkripata 8, 9, 10 i poznati su po pretapanju šutnje gena (TGS). Argonaute 2 (Ago2) ima većinu utvrđene uloge u RNAi kao katalitičkom motoru koji pokreće cijepanje mRNA. 11 Ago1 i Ago2 imaju pozitivno nabijene površine koje su pogodne za vezanje RNA i usklađivanje s komplementarnom nukleinskom kiselinom. Prethodne studije su pokazale da Importin 8 posreduje nuklearni transport miRNA i pridruženih Ago proteina koji reguliraju modifikaciju kromatina. 12, 13 Međutim, posljedični učinci i mehanizmi kao odgovor na epigenetsku regulaciju posredovanu miRNA-om ostaju u velikoj mjeri neistraženi.

Predloženi su transkripcijski faktori da reguliraju biogenezu miRNA. 14, 15 CCAAT / delta proteina koji veže pojačivač (CEBPD) je faktor transkripcije koji doprinosi diferencijaciji stanica, pokretljivosti i smrti. 16, 17 Obilje CEBPD je obično u većini stanica normalno u normalnim fiziološkim uvjetima, ali brzo se inducira vanjskim podražajima. 18, 19 Međutim, biologija miRNA kao odgovor na aktivaciju CEBPD i posljedični učinci i dalje su uglavnom nepoznati. Prethodno smo pokazali da CEBPD može služiti kao supresija tumora aktivacijom apoptoze i zaustavljanjem rasta kod raka prostate, grlića maternice i dojke. 18, 20, 21, 22 Također smo pokazali da se CEBPD ekspresija može ublažiti u stanicama karcinoma Yin Yang 1 (YY1) / polkomb grupa (PcG) / DNA metiltransferaza (DNMT) posredovana epigenetskom regulacijom. 20, 22 U leukemije, CEBPD je potisnut u fazi blastne krize kronične mijeloične leukemije 23 i akutne mijeloidne leukemije (AML). 24 Međutim, leukemija i dalje je otvoreno pitanje posredovano CEBPD-om i detaljna regulativa, posebno kao odgovor na lijekove protiv raka.

Bortezomib, prvi selektivni inhibitor proteasoma koji je došao do kliničkih ispitivanja, uzrokuje zaustavljanje i apoptozu G2-M staničnog ciklusa blokirajući djelovanje 26S proteasoma. Pokazalo se da je Bortezomib imao in vitro i in vivo aktivnost protiv raznih malignih oboljenja, uključujući multipli mijelom, 26 kroničnu limfocitnu leukemiju, 27 karcinom prostate, 28 karcinoma gušterače 29 i rak debelog crijeva. 30 Nedavno istraživanje pokazalo je da bortezomib povećava efikasnost mitotičkog zaustavljanja izazvanog volasertibom u AML in vitro i produžuje preživljavanje in vivo . 31 Iako je apoptotska aktivacija povezana s transkripcijom kao odgovor na bortezomib sugerirana, 32, 33 mehanizmi i novi uvidi, posebno u regulaciji posredovanoj PTGS-om, ostaju u velikoj mjeri neistraženi.

U ovom istraživanju identificirane su CEBPD-reaktivne miRNA u leukemijskim stanicama. Nadalje, geni protein kinaze aktivirani DNA katalitičkim polipeptidom ( PRKDC ), nedostatkom održavanja minokromosoma 4 ( MCM4 ) i genima ubikvitin-konjugirajućih enzima E2 varijante 2 ( UBE2V2 ), koji se nalaze u 5 'uzvodno regiji gena CEBPD , važni su za Popravak DNK i regulacija staničnog ciklusa. 34, 35, 36 Otkrili smo da se miR-744, miR-3154 i miR-3162 koji reagiraju na CEBPD mogu vezati za promotorske regije CEBPD i njegove 5 'uzvodne gene PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . U određenim vrstama raka, aktivnost CEBPD-a prigušuju epigenetski regulatori YY1, PcG kompleks i DNMT pomoću poboljšane metilacije DNA. 20, 37 Nadalje, pokazali smo dalje da miRNA, kao odgovor na CEBPD, mogu komunicirati s Ago2 i doprinijeti metilaciji histona i DNA vrbovanjem vezanja YY1 / PcG proteina / DNMT kompleksa. Ovo vezanje je inhibiralo CEBPD i njegove 5 'uzvodne gene PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Nova regulacija posredovana miRNA / Ago2 omogućila je novi uvid u staničnu smrt uzrokovanu bortezomibom u leukemijskim stanicama.

Rezultati

CEBPD aktivira bortezomib i doprinosi leptokemijskoj apoptozi uzrokovanoj bortezomibom

CEBPD-u je sugerirano da odgovori na mnoge lijekove protiv raka i da doprinese apoptozi induciranoj tim lijekovima protiv raka. 38, 39 Predviđeno je da antikancerogeni lijek bortezomib služi kao inhibitor proteasoma i uobičajeni terapijski lijek protiv leukemije. Slijedom opažanja da je CEBPD reagirao na liječenje bortezomibom u leukemijskim stanicama (slika 1a i dodatna slika S1a), dodatno smo ispitali učinak bortezomiba na indukciju apoptoze i testirali uključenost CEBPD u smrt leukemijskih stanica izazvanih bortezomibom. Ispitivanje 3- i 4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazolijum bromida (MTT) i protočna citometrija izvedeni su za ispitivanje staničnog preživljavanja i procjenu sub-G1 stanične populacije. Smanjena stanična vitalnost i povećana populacija pod-G1 te apoptoza THP-1 i U937 stanica primijećeni su nakon liječenja bortezomibom (slike 1b i c i dodatna slika S2). Nadalje, primijećen je oslabljeni apoptotički učinak nakon iscrpljivanja CEBPD-a u stanicama THP-1 tretiranim bortezomibom (Slika 1d). Zatim smo potvrdili uključenost CEBPD-a u indukciju apoptoze leukemijskih stanica. Analiza stanične vitalnosti provedena je putem doksiciklinskih (dox) -inducibilnih ekspresijskih sustava CEBPD da se provjeri proapoptotska uloga CEBPD u leukemijskim stanicama. Kao što se očekivalo, indukcija CEBPD mogla bi umanjiti održivost stanica THP-1 (Slike 2a i b). Ovi podaci sugeriraju da CEBPD ima proapoptotsku ulogu u apotezi leukemijskih stanica izazvanoj bortezomibom.

Image

CEBPD, koji pridonosi apoptozi leukemičnih stanica, reagira na bortezomib. ( a ) Bortezomib povećava ekspresiju CEBPD. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) 6 h u stanicama THP-1, skupljena RNA i proteinski lizati su sakupljeni i analizirani pomoću qPCR i western blot analize. ( b ) Bortezomib inhibira vitalnost stanica. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) tijekom 24 sata, mjerenje vitalnosti leukemijskih stanica (THP-1 i U937) mjereno je MTT testom. ( c ) Bortezomib inducira zaustavljanje rasta leukemijskih stanica. Nakon obrade bortezomibom (50 nM) tijekom 24 sata, sub-Gl faza THP-1 i U937 stanica analizirana je protočnom citometrijom. ( d ) Atenuirana CEBPD vraća vitalnost ćelije smanjenu bortezomibom u THP-1 stanicama. THP-1 stanice sa IPTG-inducibilnim CEBPD sustavom obrušavanja prethodno su tretirane s IPTG (500 µM) tijekom 3 sata. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) tijekom 24 sata, mjerljivost stanica je mjerena korištenjem MTT testa. Podaci su predstavljeni kao srednja ± standardna pogreška eksperimenata izvedenih u tri primjerka (* P <0, 05, ** P <0, 01, Studentov t- test). NS, nije značajno

Slika pune veličine

Image

CEBPD inhibira stope preživljavanja THP-1 stanica. ( a ) Dox uspješno inducira CEBPD ekspresiju u THP-1 stanicama u Dox-inducible CEBPD ekspresijskom sustavu. THP-1 stanice su tretirane s Dox (1 µg / ml) 6 h, a zatim qPCR-om za analizu ekspresije CEBPD. ( b ) CEBPD smanjuje održivost stanica THP-1. THP-1 stanice s dox-inducibilnim CEBPD ekspresijskim sustavom su tretirane s Dox (1 µg / ml), a stanična vitalnost mjerena je pomoću MTT testa. Podaci su predstavljeni kao srednja ± standardna pogreška eksperimenata izvedenih u tri primjerka (* P <0, 05, ** P <0, 01, Studentov t- test). NS, nije značajno

Slika pune veličine

CEBPD negativno autoregulira i koordinira inaktivaciju gena smještenih u 5 'uzvodno regiji CEBPD gena

CEBPD je poznati faktor transkripcije i sugerirano mu je da promiče apoptozu aktivacijom apoptotskih gena. 21, 22 Međutim, uključenost CEBPD-a u regulaciju miRNA i povezanost s posljedičnim staničnim odgovorima, posebice u njegovoj proapoptotskoj ulozi, ostaje slabo razumljiva. Prvo smo obavili miRNA i mRNA analizu mikrorasta u stanicama THP-1 kako bismo istražili vezu između miRNA-reguliranih CEBPD i mRNA. Koristeći javni pristupni program miRTar, istražili smo povezanost između regulirane mRNA uzrokovane CEBPD (dopunska tablica 1) i ureguliranih profila miRNA (dopunska tablica 2). Zanimljivo je da među 490 mRNA-a kojima je regulirana CEBPD-a, 407 (83%) mRNA-osjetljivih CEBPD-a nije bilo ciljano od strane miRNA-reaktivnih miRNA-a u svojim UTR-ima (Slika 3a i Dodatna tablica 3). Ovi nalazi podrazumijevali su da se regulirane mRNA koje reagiraju na CEBPD aktivaciju mogu regulirati pomoću drugih UTR neovisnih mehanizama. Nedavno je predloženo da se miRNA uključe u epigenetsku regulaciju putem izravnog ciljanja DNA. 40, 41 Otkrili smo da je nekoliko top-10 mirangu reagiranih na CEBPD koji su reagirali na 10 pokazali potencijal vezivanja za 5 'bočno područje CEBPD gena. Kao što je gore spomenuto, geni PRKDC , MCM4 i UBE2V2 , koji se nalaze u 5 'uzvodno regiji CEBPD gena, imaju moćnu ulogu u promicanju ulaska u S-fazu staničnog ciklusa ili inhibiranju apoptoze. 34, 35, 36 Važno je da smo otkrili da egzogeni ekspresioniranje CEBPD može oslabiti endogene CEBPD transkripte (dopunska slika S3). Nadalje, iako transkripcija gena PRKDC , MCM4 i UBE2V2 nije odmah reagirala na liječenje bortezomibom, njihova je transkripcija koordinirano oslabljena inaktiviranjem CEBPD u dugoročnom liječenju bortezomibom (dopunska slika S4). Ta su promatranja pokrenula naše interese za ispitivanje može li aktivirani CEBPD povećati miRNA da bi inaktivirao transkripciju samog CEBPD-a i gena PRKDC , MCM4 i UBE2V2 u leukemijskim stanicama liječenim bortezomibom.

Image

CEBPD i miRNA koji odgovaraju na njih doprinose inaktivaciji okolnih gena. ( a ) 3'-UTR-ove većine mRNA-a reguliranih CEBPD-om ne ciljaju miRNA-ove regulirane CEBPD-om. MiBRK regulirane u CEBPD i ponovno podešavanje mikroračunanja mRNA analizirano je korištenjem programa predviđanja miRTar. Pita dijagram prikazuje postotak mRNA-a reguliranih CEBPD-om u 3'-UTR, koji sadrži sjemenske sekvence miRNA-ureguliranih CEBPD. ( b ) CEBPD sudjeluje u inaktivaciji okolnih gena. THP-1 stanice s ekspresivnim sustavom CEBPD-induciranim s Dox-om tretirane su s Dox (1 µg / ml) 18 h; sakupljena je ukupna RNA da bi se izveo qPCR (lijeva ploča), a ukupni protein je sakupljen da se izvrši analiza Western blot-a (desni panel). ( c ) Bortezomib suzbija ekspresiju PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Nakon tretiranja bortezomibom (50 nM) tijekom 16 sati, skupljena je ukupna RNA da bi se izveo qPCR (lijeva ploča), a ukupni protein je sakupljen da bi se izvršila analiza Western blot-a (desna ploča). ( d ) Shematski prikaz koji prikazuje mjesto gena i pretpostavljeni motivi koji vežu miRNA. ( e ) miR-744, miR-3154 i miR-3162 smanjuje CEBPD okolne gene. Stanice THP-1 s dox-inducibilnim miR-744, miR-3154 i miR-3162 ekspresijskim sustavom su tretirane s Dox (1 µg / ml) 18 h. Ukupna RNA je sakupljena da bi se izveo qPCR (lijeva ploča), a ukupni protein je sakupljen da se izvrši analiza Western blot-a (desna ploča). ( f ) Atenuirana CEBPD vraća ekspresiju gena inhibiranu bortezomibom u stanicama THP-1. THP-1 stanice sa IPTG-inducibilnim CEBPD sustavom obrušavanja prethodno su tretirane s IPTG (500 µM) tijekom 3 sata. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) tijekom 16 h, skupljena je ukupna RNA da bi se izveo qPCR (lijeva ploča), a ukupni protein je sakupljen za obavljanje analize Western blot-a (desna ploča). Podaci su prikazani kao srednja ± standardna pogreška eksperimenata izvedenih u tri primjerka (* P <0, 05, ** P <0, 01, Studentov t- test)

Slika pune veličine

Kvantitativni rezultati PCR pokazali su da su PRKDC , MCM4 i UBE2V2 transkripti oslabljeni nakon indukcije CEBPD nakon egzogeno eksprimirajućeg tretmana CEBPD ili bortezomibom u THP-1 ili U937 stanicama (slike 3b i c i dodatna slika S1b). U međuvremenu, analizom s programom miRTar , u UTRs mRNA CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 mRNA nisu predviđene sumnjive sekvence miRNA- reakcija koje reagiraju na CEBPD . Iznenađujuće, predviđeno je da komplementarne sjemenske sekvence miR-744, miR-3154 i miR-3162 (dopunska tablica 2) koje reagiraju na CEBPD pretpostavljaju da vezuju promotorne regije gena PRKDC , MCM4 i UBE2V2 (slika 3d). Stoga smo testirali da li PRKDC , MCM4 i UBE2V2 mRNA mogu biti regulirane pomoću ove tri miRNA. Rezultati su pokazali da su PRKDC , MCM4 i UBE2V2 transkripti smanjeni nakon porasta ove tri miRNA (slika 3e i dodatna slika S8a). Zanimljivo je da je, pored ova tri gena, egzogena ekspresija CEBPD-a također oslabila endogene CEBPD transkripte (dopunska slika S3a). Rezultat je podrazumijevao da indukcija CEBPD može negativno autoregulirati transkripciju CEBPD-a u leukemijske stanice. Nadalje, gubitak CEBPD povećao je ekspresiju PRKDC , MCM4 i UBE2V2 nakon liječenja bortezomibom (Slika 3f). Rezultati su nagađali da bi CEBPD mogao biti prvi responzivni gen nakon liječenja bortezomibom; štoviše, indukcija CEBPD povećala je ekspresiju miR-744, miR-3154 i miR-3162. Nakon toga, ove miRNA mogu povratne informacije za suzbijanje transkripcije samih CEBPD i PRKDC , MCM4 i UBE2V2 gena.

CEBPD aktivira transkripciju miR-744, miR-3154 i miR-3162

Kako bismo otkrili gore opisane nalaze, prvo smo ispitali može li CEBPD inducirati transkripciju miR-744, miR-3154 i miR-3162 direktnim aktiviranjem njihovih promotora. Rezultati su pokazali da egzogeni tretman HA / CEBPD i bortezomibom može aktivirati transkripciju miR-744, miR-3154 i miR-3162 u THP-1 i U937 stanicama (slike 4a i b i dodatna slika S5). Nadalje, inaktivacija CEBPD atenuiranih transkripata miR-744, miR-3154 i miR-3162 nakon stimulacije bortezomiba (Slika 4c). Pored toga, miR-3154 je intergena miRNA koja ima svoj promotor. Intrageni miR-744 i miR-3162 pripadaju dva pojedinačna gena, MAP2K4 i SNHG11 , a prekomjerno izraženi CEBPD mogao bi aktivirati ekspresiju MAP2K4 i SNHG11 (dopunska slika S7). Dalje smo istražili može li CEBPD izravno aktivirati promotore gena koji kodiraju miR-744, miR-3154 i miR-3162. Klonirali smo i generirali tri izvjestitelja koji nose promotorske regije s ove tri lokacije miRNA (slika 4d, gornja ploča). Rezultati novinarskog testa pokazali su da egzogeni ekspresija CEBPD može inducirati promotorsku aktivnost gena koji kodiraju tri pojedinačna miRNA (slika 4d, donja ploča). Nadalje, test inhibicije DNA in vivo pokazao je da se CEBPD može izravno vezati za promotorske regije gena koji kodiraju miR-744, miR-3154 i miR-3162 (Slika 4e). Ovi rezultati sugeriraju da CEBPD reagira na bortezomib i izravno aktivira transkripciju miR-744, miR-3154 i miR-3162.

Image

miR-744, miR-3154 i miR-3162 su miRNA-reaktivne reakcije CEBPD. ( a ) CEBPD inducira ekspresiju miR-744, miR-3154 i miR-3162. Stanice THP-1 transficirane su s HA-CEBPD 18 h. Ukupna RNA je sakupljena, a razine miRNA (miR-744, miR-3154 i miR-3162) potvrđene su qPCR-om. ( b ) Bortezomib povećava ekspresiju miR-744, miR-3154 i miR-3162. qPCR izveden je korištenjem ukupne RNA sakupljene iz THP-1 stanica tretiranih bortezomibom (50 nM) 6 h. ( c ) Gubitak CEBPD smanjio je bortezomib izazvan miR-744, miR-3154 i miR-3162. THP-1 stanice sa IPTG-inducibilnim CEBPD sustavom obrušavanja prethodno su tretirane s IPTG (500 µM) tijekom 3 sata. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) 6 h, vrijednosti ekspresije miR-744, miR-3154 i miR-3162 izmjerene su pomoću qPCR. ( d ) CEBPD aktivira promotorsku aktivnost miRNA. Shematski prikaz reporterskih konstrukcija s miR-744, miR-3154 i miR-3162 promotorima. Otprilike mjesto navodnih CEBPD motiva koji se vežu označeno je ovalom. Aktivnost luciferaze procijenjena je nakon ko-transfekcije izvještača i ekspresijskih vektora u THP-1 stanicama kako je naznačeno. ( e ) CEBPD se direktno veže na miR-744, miR-3154 i miR-3162 promotore in vivo . Proveden je ChIP test u THP-1 stanicama s Dox-inducible CEBPD ekspresijskim sustavom. Sonicirani kromatin podvrgnut je ChIP-qPCR analiziranju pomoću CEBPD ili kontrolnih IgG antitijela. Podaci su predstavljeni kao srednja ± standardna pogreška pokusa izvedenih u tri primjerka (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, Studentov t- test)

Slika pune veličine

Ago2 stupa u interakciju s YY1 i veže se za promotorske regije s PcG kompleksom i HP-1

Zrele miRNAs vode komplekse koji sadrže Ago da ciljaju djelomično komplementarne sekvence sjemena na mRNA i induciraju represiju ekspresije gena na nivou stabilnosti ili translacije mRNA. CEBPD aktivira ekspresiju miR-744, miR-3154 i miR-3162 u THP-1 stanicama. Štoviše, naši trenutni rezultati pokazali su da povećanje ovih miRNA može inaktivirati transkripciju samog CEBPD i PRKDC , MCM4 i UBE2V2 gena. Dakle, slijedeće smo secirali moćan mehanizam koji stoji na osnovi miRNA posredovanog transkripcijskog prigušivanja na genomskoj DNK (gDNA). Rezultati ispitivanja imunoprecipitacije pokazali su da se Ago2, ali ne Agol, mogao specifično povezati s YY1 u stanicama 293T i THP-1 sa ili bez tretmana bortezomibom (Slike 5a i b). Pored toga, naša prethodna studija pokazala je da se YY1 / PcG / DNMT kompleks može regrutovati na CpG otoke u promotoru regije CEBPD gena, te da je presudan za posredovanje epigenetskog prigušivanja gena CEBPD . 20 Nadalje, pretpostavljeni motivi YY1 koji se vežu mogu se predvidjeti i u promotornim regijama gena PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Stoga smo potvrdili da li se Ago2, YY1, PcG kompleks i DNMT1 mogu regrutovati u promotorske regije CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 gena primjenom kromatinskog imunoprecipitativnog (ChIP) kvalitativnog PCR (qPCR) testa. Povišeno vezanje Ago2, YY1, SUZ12, EZH2 i DNMT1 uočeno je u regijama odgovarajućih primera za naznačene promotore nakon tretmana bortezomibom (Slika 5c). Pored toga, vezivanje HP-1, što dovodi do stvaranja heterokromatina i inaktivacije gena, detektirano je i na promotorskim regijama gena CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 (Slika 5c). Ovi rezultati sugeriraju da Ago2 djeluje na YY1 i YY1-interakciju proteina, uključujući PcG proteine, DNMT1 i HP1, tijekom liječenja bortezomibom.

Image

Bortezomib inducira stvaranje Ago2 / YY1 kompleksa i vezanje PcG kompleksa. ( a i b ) Bortezomib izaziva interakciju Ago2 i YY1. Stanice 293T transficirane su zastavom-YY1 i tretirane bortezomibom (50 nM) 5 h. Ukupni lizati su sakupljeni i analizirani korištenjem imunoprecipitacije koristeći antitijelo ( a ) protiv zastave. THP-1 stanice su tretirane bortezomibom (50 nM) 12 h. Ukupni lizati su sakupljeni i analizirani korištenjem imunoprecipitacije koristeći anti-YY1 antitijelo ( b, gornja ploča), a kvantitativni rezultati pokazali su intenzitet interakcije između YY1 i Ago2 ( b, dno). ( c ) Ago2-PcG kompleks (SUZ12, DNMT, EZH2) i HP-1 izravno se vežu na uzvodno područje CEBPD i okolne gene. Proveden je ChIP test primjenom THP-1 stanica tretiranih bortezomibom (50 nM). Sonicirani kromatin THP-1 stanica odvojeno je imunoprecipitiran koristeći specifična antitijela protiv Ago2, SUZ12, DNMT, EZH2, HP-1 i kontrolni IgG. Imunoprecipitirana DNA amplificirana je qPCR koristeći različite primere kao što je naznačeno na gornjoj ploči. Podaci su predstavljeni kao srednja ± standardna pogreška pokusa izvedenih u tri primjerka (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, Studentov t- test)

Slika pune veličine

miR-744, miR-3154 i miR-3162 posreduju TGF izravno vezanjem gDNA

Djelomični komplementarni slijed sjemena miR-744, miR-3154 i miR-3162, te konsenzusni YY1-vezivni motivi primijećeni su u promotornoj regiji gena CEBPD . Kako bi secirao vezujući scenarij miRNA i YY1 u epigenetski posredovanom siljenju gena, konstruirano je nekoliko heterolognih CEBPD izvjestitelja (slika 6, gornja ploča) za procjenu njihovog pojedinačnog doprinosa i regulacije. Rezultati istraživačkog testa pokazali su da bortezomib nije imao utjecaja na pGL3-promotor-CEBPD (PC) izvjestitelj (1938 / -590 CEBPD promotor koji sadrži motive vezanja YY1), ali je značajno potisnuo aktivnost računala s mjestima vezanja za miRNA ( PCmi) reporter (1938 / -590. CEBPD promotorsko područje koje sadrži motive vezanja YY1 i spojeno s komplementarnim sjemenskim sekvencama miR-744, miR-3154 i miR-3162). Važno je da je aktivnost PCmi sa mutiranim YY1 vezivnim mestima (PCmiMY) reporter (-1938 / -590 CEBPD promotor regija koja sadrži mutirajuće YY1-vezivne motive i spojena sa komplementarnim sjemenskim sekvencama miR-744, miR-3154 i miR-3162) je obrnuto nakon liječenja bortezomibom (Slika 6a). Pored toga, naša prethodna studija pokazala je da YY1 može regrutovati DNMT-ove i metilirati CpG otoke na CEBPD promotoru. 20 Zatim, kako bismo istražili mogu li miRNA utjecati na status metilacije DNA, obnovili smo transficirane izvještače i liječili uzorke bisulfitom, nakon čega je slijedila PCR specifična za metilaciju. Otkrili smo da bortezomib poboljšava metilaciju DNA u regiji promotora CEmija -1938 / -590 CEBPD , ali da je efekt metilacije značajno smanjen u regiji promotora CEBPD -1938 / -590 CEBPD za PC i PCmiMY (Slika 6b).

Image

miR-744, miR-3154 i miR-3162 posreduje TGS izravnim vezanjem na gDNA. ( a ) Vezanje miRNA i YY1 povezano je s prigušivanjem i metiliranjem razine epigenetskih gena izazvanih bortezomibom. miR-744, miR-3154 i miR-3162 potrebni su za YY1 / PcG složeno epigenetsko prigušivanje gena. Shematski prikaz reporterskih konstrukcija samo s CEBPD promotorom (PC), CEBPD promotorom konstruiranim sa veznim mjestima za miRNA (PCmi) i PCmi s mutiranim YY1 veznim mjestima (PCmiMY). Aktivnost luciferaze procijenjena je nakon transfekcije različitih konstrukata, kako je naznačeno, u 293T stanice i naknadne obrade stanica bortezomibom (50 nM). ( b ) Vezanje miRNA i YY1 povećavaju razinu metilacije otoka CpG na promotorima CEBPD . Nakon transfektiranja konstrukata u 293T sa ili bez tretmana bortezomibom (50 nM), postignuta je razina metilacije otoka CpG na izvještačima (PC, PCmi i PCmiMY) koristeći kvantitativni metilacijski specifični PCR. ( c ) miR-744, miR-3154 i miR-3162 kritični su za metilaciju DNA izazvane bortezomibom. Nakon transfektiranja konstrukata u 293T s IPTG-inducibilnim miR-744/3154/3162 sustavom prigušivanja, stanice su prethodno tretirane s IPTG (500 µM ) 3 sata i tretirane bortezomibom (50 nM) 16 h. Razina metilacije CpG otoka na reporteru (PCmi) postignuta je korištenjem kvantitativnog PCR-a za metilaciju. ( d ) Inhibicija miR-744, miR-3154 i miR-3162 poništava vitalnost ćelije smanjenu bortezomibom u THP-1 stanicama. THP-1 stanice sa IPTG-inducibilnim miRNA-744/3154/3162 sustavom prigušivanja prethodno su tretirane s IPTG (500 μM ) 3 h. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) tijekom 24 sata, vitalnost stanica izmjerena je MTT testom. ( e ) Atenuirani miR-744, miR-3154 i miR-3162 poništavaju ekspresiju PRKDC , MCM4 i UBE2V2 reducirane bortezomibom. Stanice THP-1 sa IPTG-inducibilnim sustavom mirovanja-miR-744/3154/3162 prethodno su tretirane s IPTG (500 µM ) tijekom 3 sata. Nakon tretmana bortezomibom (50 nM) 16 h, vrijednosti ekspresije PRKDC , MCM4 i UBE2V2 izmjerene su qPCR-om. Podaci su prikazani kao srednja ± standardna pogreška eksperimenata izvedenih u tri primjerka (* P <0, 05, ** P <0, 01, Studentov t- test)

Slika pune veličine

Uzeto zajedno, ovi rezultati sugeriraju da miRNA djeluju kao inicijatori, a YY1 funkcionira kao efektorski protein za prigušivanje DNA metilacijom prigušivanjem transkripcije gena CEBPD. Kako bismo dodatno potvrdili važnost ovih miRNA, uveli smo u stanice THP-1 IPTG-inducibilne miR-744-, miR-3154- i miR-3162-utišavajuće vektore. Nakon indukcije antagomira miR-744, miR-3154 i miR-3162, izgubljena metelacija DNA izazvana bortezomibom na području -1938 / -590 CEBPD iz PCmi reportera (slika 6c i dodatna slika S8b). U međuvremenu, vitalna redukcija stanica smanjena bortezomibom i ekspresija snažnih onkogena, PRKDC , MCM4 i UBE2V2 , također su značajno oslabljeni (Slike 6d i e). Rezultati sugeriraju važnost miR-744, miR-3154 i miR-3162 posredovane autoregulacije CEBPD gena i inaktivacije PRKDC, MCM4 i UBE2V2 gena za staničnu vitalnost izazvanu bortezomibom.

Rasprava

Obilje CEBPD može se regulirati putem P38 / CREB-regulirane transkripcijske aktivacije 21 i RNA-vezujućeg proteina CEBPD mRNA-proteina. 42, 43 Prethodno istraživanje pokazalo je da bortezomib potiče prebacivanje HuR proteina u citoplazmu i povećava učinkovitost prevođenja njegovih ciljanih gena nizvodno u stanice raka. 44 Nadalje, nedavno istraživanje pokazalo je da tirozin kinaza Src može smanjiti stabilnost proteina CEBPD aktiviranjem SIAH2 E3 ubikvitin ligaze. Osim toga, onkoprotein BCR-ABL u leukemijskim stanicama inhibira aktivaciju Src kinaze. 46 Međutim, mehanizam (i) koji stoje iza ekspresije CEBPD-a izazvane bortezomibom u leukemijskim stanicama i dalje je otvoreno pitanje i zahtijeva daljnje ispitivanje.

U ovom istraživanju otkrili smo da snažan supresira tumora CEBPD reagira na antikancerogeni lijek bortezomib u leukemijskim stanicama (Slika 1a). Zanimljivo je da se inaktivacija gena PRKDC , MCM4 i UBE2V2 dogodila paralelno sa smanjenjem transkripcije CEBPD (dopunska slika S4). Važno je da je inaktivacija ova četiri gena uslijedila nakon porasta ekspresije miR-744, miR-3154 i miR-3162 koji reagiraju na CEBPD (Slika 3f i Dopunska slika S6). Ovdje smo predložili scenarij da CEBPD, koji privremeno provodi bortezomib, aktivira transkripciju miR-744, miR-3154 i miR-3162. Ago2 bi mogao dalje prebaciti ove tri miRNA u jezgru i ciljati promotorske regije gena koji nose sjemenske sekvence komplementarne tim miRNA. Nadalje, inicijator miRNAs / Ago2 kompleks djeluje s YY1 i regrutuje epigenetske regulatore, PcG kompleks / DNMT, da inaktivira transkripciju gena, uključujući CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 (Slika 7).

Image

Shematski model za CEBPD isključio je lokus gene i rezultirao leukemijskom staničnom smrću uslijed miRNA / Ago2 / YY1 / PcG grupe proteina / DNMT složeno epigenetskog prigušivanja. Kao odgovor na antikancerogeni lijek bortezomib, aktivira se transkripcijski faktor CEBPD i transkripcijski aktivira miR-744, miR-3154 i miR-3162. Ove miRNA formiraju kompleks s Ago2 i translociraju se u jezgru kako bi usmjerili svoja komplementarna mjesta koja vežu slijed DNK na promotorima regije CEBPD, PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Iniciracijski miRNA / Ago2 kompleks djeluje s YY1 i regrutuje epigenetske regulatore, PcG kompleks / DNMT, kako bi utišao četiri genska lokusa, uključujući i sam CEBPD. Neaktivacija ovih moćnih onkogena, PRKDC , MCM4 i UBE2V2 dovodi do smrti od leukemijskih stanica putem epigenetskog prigušivanja miRNA posredovanog CEBPD,

Slika pune veličine

MCM4 je marker proliferacije i član je šest proteina minichromosoma koji održavaju 47 proteina i ključan je za porijeklo replikacije DNK prije S faze. 48, 49 Akumulirajući dokazi upućuju na to da MCM4 doprinosi proliferaciji ne-staničnih stanica pluća. 50 PRKDC gen je pored gena MCM4 na kromosomu i ima ključnu ulogu u nehomolognom krajnjem spajanju. 51, 52 Razina ekspresije PRKDC povišena je u bolesnika s neuroblastomom, povezana s lošom prognozom i uznapredovalim stupnjem tumora. 53 Štoviše, gen za popravak DNA UBE2V2 djeluje kao prognostički marker u karcinomu dojke. 54 Prethodna studija sugerirala je da atenuirani UBE2V2 povećava citotoksične učinke oštećenja DNA izazvanih UV zračenjem. 55 Akumulacijski rezultati pokazali su da miRNA mogu funkcionirati kao supresori tumora u leukemiji. U kombinaciji s opažanjima da CEBPD izaziva zaustavljanje rasta, sudjeluje u staničnoj smrti uzrokovanoj bortezomibom (slike 1d i 2b) i aktivira miR-744, miR-3154 i miR-3162, nadalje smo pružili novi mehanizam koji miRNA služi kao supresija tumora izbacivanjem metilacije DNA na gDNA u leukemijskim stanicama. Ova studija također po prvi put pokazuje da aktivacija CEBPD izaziva smrt leukemijskih stanica potiskivanjem nakupina moćnih onkogena putem epigenetskog prigušivanja posredovanog miRNA-om. Pored miR-744, miR-3154 i miR-3162, predloženo je i nekoliko CEBPD neregulisanih miRNA, uključujući miR-150, miR-142 i miR-29a / b kako bi se spriječilo napredovanje leukemije. 56, 57, 58 Additionally, another CEBPD-responsive miR-744 was suggested to act as a tumor suppressor in various cancers, resulting in chromosomal instability and oncogene inactivation. 59, 60 Consistently, these CEBPD-responsive miRNAs further agree with the involvement of CEBPD in promoting cell differentiation and apoptosis.

CEBPD has been suggested to positively regulated peroxisome proliferator-activated receptor- γ (PPAR γ ) transcription and protein expression in vascular smooth muscle cells and cancer cells. 37, 61, 62 Moreover, the activation of PPAR γ could suppress protein expression and transcription of CEBPD via the inactivation of signal transducer and activator of transcription 3 in vascular smooth muscle cells. 61 These findings implied that CEBPD could be negatively autoregulated following PPAR γ activation. In this study, we provide support for a novel feedback regulation of the CEBPD gene via miRNA-mediated autoregulation. However, the issue whether this feedback regulation occurs in tissue cells or other cancer cell needs to be examined in the future. Furthermore, significantly higher PPARγ mRNA was observed in primary AML patients. 63 Therefore, in addition to revealing the contribution of epigenetic- and PPAR γ -mediated inactivation of CEBPD in leukemic cells, the issue of how to efficiently activate CEBPD for executing its tumor suppressor role in leukemia remains an open question.

The highly evolutionarily conserved Ago proteins bind to non-coding RNA and have an essential role in miRNA-mediated post-transcriptional regulation. 12 Accumulating evidence has demonstrated that Ago proteins are present in the nuclear fraction of human cells. Several reports have shown that Ago proteins form a complex with lnRNA and bind to genomic DNA, thereby inducing direct TGS. 64, 65, 66, 67 Additionally, Ago1 has been implicated in the YY1/Suz12/Dicer1 complex-mediated repression of the NFI-A gene via competing RNA polymerase II binding. 68 Ago2 was also suggested to interact with the transcriptional repressor, SETDB1, for the repression of gene activation. 69 In the present study, we provided the first evidence that Ago2, but not Ago1, Ago3 or Ago4, interacts with YY1 and binds to gDNA, and that these interactions further recruit the epigenetic regulators PcG proteins and DNMTs to direct TGS (Figure 5). The results also implied that Ago1 and Ago2 have distinct roles, at least in part, to independently contribute to PcG protein- and DNMT-mediated epigenetic regulation.

Furthermore, the PcG complex and HP-1 interact and contribute to the silencing effects at the nuclear periphery. 70, 71 Our results showed the binding of HP-1 and the PcG complex on the promoter regions of CEBPD and its 5′ upstream genes (Figure 5c). A previous study showed that Ago1 is dispersed throughout the nuclear interior, whereas Ago2 is localized in the inner nuclear periphery, implying that this area is a transcriptionally repressive compartment. 72 Our study raised several important issues: (1) the location of HP-1 associates with Ago1 and Ago2 distribution in the cell nucleus, (2) the location of miRNAs on gDNA associates with Ago1 and Ago2 and (3) the annotation of miRNAs associated with the cell functions in response to the epigenetic regulation. In addition to providing in vivo evidence associated with the physiological phenomenon, these results are consistent with those of a previous study showing that the loss of Ago2 abrogates TGS. 73 Taken together, Ago2 not only serves as a post-transcriptional regulator via miRNA binding in the 3′-UTR but might also, at least in part, be involved in epigenetic regulation by recruiting PcG proteins and DNMT1.

Materijali i metode

materijali

The TRIsure RNA extraction reagent, Opti-MEM medium, SuperScript III, Dulbecco's modified Eagle's medium and Roswell Park Memorial Institute medium were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fetal bovine serum (FBS) was purchased from HyClone Laboratories (Logan, UT, USA). SensiFAST SYBR was purchased from Bioline (Taunton, MA, USA). A luciferase assay system was purchased from Promega (Madison, WI, USA). The α -tubulin antibody (T6199) was purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA), and antibodies against CEBPD (SC-636), Ago2 (sc-32877), Ago3 (sc-32662), Ago4 (sc-374220) and YY1 were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). The anti-Ago1 antibody (no. 07-599) was purchased from Millipore (Billerica, MA, USA). The anti-SUZ12 antibody was purchased from Abcam (Cambridge, UK). The anti-DNMT1 antibody was purchased from IMGENEX (San Diego, CA, USA). All oligonucleotides were synthesized at MDBio Inc. (Taipei, Taiwan).

Stanična kultura

The human monocytic leukemic cell line THP-1 and the human myeloid cell line U937 were maintained in Roswell Park Memorial Institute medium supplemented with 10% FBS, 100 μ g/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin. The human embryonic kidney cell line 293T and human epithelial cells Ampho were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS, 100 μ g/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin.

Reverse transcription-polymerase chain reaction

THP-1 cells were treated with Dox or bortezomib. Total RNA was extracted using TRIsure. The isolated RNA was subjected to reverse transcription using SuperScript III for cDNA synthesis. The following oligonucleotide primers were used in the qPCR analysis: GAPDH (F): 5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′ and GAPDH (R): 5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′; CEBPD (F): 5′-GCCATGTACGACGACGAGAG-3′ and CEBPD (R): 5′-TGTGATTGCTGTTGAAGAGGTC-3′; PRKDC (F): 5′-CATGGAAGAAGATCCCCAGA-3′ and PRKDC (R): 5′-TGGGCACACCACTTTAACAA-3′; MCM4 (F): 5′-GGCTCTCATCGAGGCTTATG-3′ and MCM4 (R): 5′-TTCCACATCAATGGCTTCAA-3′; UBE2V2 (F): 5′-AAGGAGTAGGCGACGGTACA-3′ and UBE2V2 (R): 5′-ACGGAGGAGCTTCTGGGTAT-3′.

Stanična održivost

For the cell survival assay, THP-1 cells were cultured on 12-well plates. The cells were grown for 24 and 48 h after treatment with bortezomib. Next, the experimental cells were incubated with diluted MTT reagent for 3 h. Subsequently, the samples were spectrophotometrically measured at 595 nm using an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader.

TaqMan reverse transcription-PCR for miRNA quantification

Total RNA was isolated using TRIzol according to the manufacturer's instructions, reverse transcribed using the TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit and subjected to real-time PCR using the TaqMan microRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).

Plasmids construction and reporter assays

The 5′-flanking region of CEBPD , MAP2K4 (host gene of intronic miR744), SNHG11 (host gene of intronic miR-3162) and miR-3154 were cloned from THP-1 cells using the DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Düsseldorf, Germany) and PCR. The following primers were used for PCR and cloning the 5′-flanking regions: CEBPD (F) (−1938) Kpn I – 5′-GGTACCTTTGTGCTACAACTTTTTCTGG-3′ and (R) (−589) Nhe I – 5′-GCGAGCGCACCGCACTCGGG-3′; MAP2K4 (F) Kpn I – 5′-GGGGTACCCCGATCACACAATGCTTCTAAAT-3′ and (R) Xho I – 5′- CCGCTCGAGCGGTGTTGGGAGTGAAGAGC-3′; SNHG11 (F) Kpn I – 5′- GGGGTACCCCAGAACGCATAGCAGAAAATGTTC-3′ and (R) Xho I – 5′- CCGCTCGAGCGGGAGCCGCCGCCG-3′; miR-3154 (F) Kpn I – 5′- GGGGTACCCCCATTTCCTGACTGCAGAGAC-3′ and (R) Xho I – 5′- CCGCTCGAGCGGTCCATCCAGGCAGT-3′. After verification via sequencing, the PCR products were cloned into the multicloning sites of the pGL3-promoter or pGL3-basic vector. The complete complementary sequences of mature miR744/3154/3162 were cloned into the PC reporter construct via Nhe I/ Hind III restriction enzyme sites to generate PCmi. Furthermore, two YY1 binding sites on PCmi were mutated by site-directed mutagenesis using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA), according to the manufacturer's instructions, to generate PCmiMY. These reporter constructs were transfected into 293T cells using TransIT-2020 transfection reagent (Mirus, Madison, WI, USA) according to the manufacturer's instructions. The transfectants were cultured in complete medium supplemented with HA-CEBPD or bortezomib. Luciferase activity was measured in the lysates of the transfectants.

Western blot assay

Cells were harvested and lysed in modified RIPA buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM DDT, 10 mM NaF, 1 mM PSMF, 1 μ g/ml aprotinin, 1 μ g/ml leupeptin and 1 mM Na 3 VO 4 ). Following lysis, the lysates were resolved by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis using a 12% polyacrylamide gel, and the proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride nylon membrane and probed with primary antibodies for target proteins overnight at 4 °C. The target proteins were after incubation with peroxidase-conjugated secondary antibodies for 1 h at room temperature. The signals were revealed using an Enhanced Chemiluminescence Western Blot System (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Kromatinske imunoprecipitacije

ChIP assay was conducted according to Ju-Ming Wang and co-workers. 74 Briefly, THP-1 cells were treated with 1% formaldehyde for 15 min. The crosslinked chromatin was subsequently prepared and sonicated to an average size of 500–1000 bp. The DNA fragments were immunoprecipitated with antibodies specific for Ago1–4, SUZ12, EZH2, DNMT1, HP-1, CEBPD and control immunoglobulin G 75 at 4 °C for 12–16 h. After the reversal of the crosslinking, the immunoprecipitated chromatin was amplified using primers specific for regions of the genomic locus of the target genes. The primers are as indicated below. MAP2K4 (F): 5′-CTCCTTTGAGGGTGTTCTGTG-3′ and (R): 5′-ACCAGGGAACAGGGCAGTA-3′; miR-3154 (F): 5′-GACTGCAGAGACCAGGAAGG-3′ and (R): 5′-CCGCTCCTACCTAGTGTCCA-3′; SNHG11 (F): 5′-TGTTTCTTTCATTCTCCAAGAATTT-3′ and (R): 5′-AAGTTTACCTGTAAGGAGAAGAACAG-3′; A (F): 5′-AGAAGTTGGTGGAGCTGTCG-3′ and (R): 5′-GGTATGGGTCGTTGCTGAGT-3′; B (F): 5′-GGCGAGACACAACGTTTTCA-3′ and (R): 5′-ATGGGGTGTATTATGGGTGT-3′; C (F): 5′-TATTTCTCTTGCCCTGCCCC-3′ and (R): 5′-GCGCTTCTCTGTGTTTAGATGA-3′; D (F): 5′-CCCCGGTTCAAACGATTCTC-3′ and (R): 5′-ATAAGTTCATGAGGGCCGGG-3′.

Co-imunoprecipitaciju

The lysates of 293T cells were prepared using an immunoprecipitation lysis buffer (50 mM NaCl, 0.5% NP-40 and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)). The supernatant was collected and incubated with anti-YY1 antibody at 4 °C for at least 4 h. Protein-A/G agarose beads were added to the lysates, and the mixtures were incubated and rotated at 4 °C for 1 h. The beads were collected using centrifugation and washed three times with modified RIPA buffer. The proteins that were bound to the beads were eluted after adding 2 × electrophoresis sample buffer and were subsequently subjected to western blot analysis.

Methylation-specific PCR

After treating the genomic DNA with sodium bisulfite (Zymo Research, Irvine, CA, USA), the DNA was PCR-amplified using primers specific for the methylated sequences. The primers used for the amplification of methylated and unmethylated promoters of CEBPD were designed using the MethPrimer website. The primers used were as follows: methylation (F): 5′-AGGTGTTAGAATATTTTTTTATCGA-3′ and (R): 5′-TTCCATTACACTCCAACCTAAACA-3′; nnmethylation (F): 5′-AGGTGTTAGAATATTTTTTTATTGA-3′ and (R): 5′-TTCCATTACACTCCAACCTAAACA-3′.

Pre-miR-744/3154/3162 and antisense of miR-744/3154/3162-inducible stable cells

Pre-miR-744/3154/3162 were generated by PCR and then inserted into pAS4w.1.Pneo, a tetracycline-inducible system of lentiviral expression vector. The antisense of miR-744/3154/3162 was inserted into pLAS1w.3xLacO, a lentiviral expression vector. Stable THP-1 cells containing pre-miR-744/3154/3162 and the antisense of miR-744/3154/3162 were generated by transfecting pLAS.AS3w.aOn.Pbsd lentiviral-expressing cells and parental THP-1 cells, respectively. Dox (1 μ g/ml) was used to induce miR-744/3154/3162 expression. IPTG (500 μ M) was used to induce antisense of miR-744/3154/3162 expression. The lentiviral expression vectors were obtained from the National RNAi Core Facility located at the Genomic Research Center of Institute of Molecular Biology, Academia Sinica (Taiwan).

Statistička analiza

All experiments were repeated at least three times, and the data were analyzed for statistical significance using Student's t -test in the Prism 5 Software (La Jolla, CA, USA). The data were expressed as the means±SEM Differences indicated with asterisks were considered statistically significant.

Bilješka izdavača

Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)