Matične stanice karcinoma dojke oslanjaju se na fermentativnu glikolizu i osjetljive su na liječenje 2-deoksiglukozom | stanična smrt i bolest

Matične stanice karcinoma dojke oslanjaju se na fermentativnu glikolizu i osjetljive su na liječenje 2-deoksiglukozom | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Rak dojke
  • Metabolizam raka
  • Matične stanice raka
  • Kombinirana terapija lijekovima

Sažetak

Brojne studije sugeriraju da su matične stanice karcinoma ključne za rast tumora, a ako ciljanje ovih stanica ne može rezultirati recidivom tumora. Kako se pokazalo da je ova populacija stanica otporna na zračenje i kemoterapiju, važno je razumjeti njihovu biologiju i identificirati nove terapijske pristupe. Ciljanje metabolizma raka potencijalna je alternativna strategija za suzbijanje rasta i recidiva tumora. Ovdje smo primijenili proteomsku i ciljanu metabolomsku analizu kako bismo ukazali na glavne metaboličke razlike između stanica karcinoma dojke koje se uzgajaju kao sfere i tako obogaćene matičnim stanicama karcinoma uspoređene s istim stanicama uzgojenim u adekvatnim uvjetima razlikovanja. Ovaj integrirani pristup omogućio nam je identificiranje metaboličkog fenotipa povezanog sa stabljičnim stanjem i pokazuje da matične stanice karcinoma dojke (BCSC) prelaze iz mitohondrijske oksidacijske fosforilacije prema fermentativnoj glikolizi. Funkcionalna validacija proteomskih i metaboličkih podataka daje dokaze o povećanim aktivnostima ključnih enzima anaerobne glukoze, kao što je piruvat kinaza M2 izoform, laktat dehidrogenaza i glukoza 6-fosfat dehidrogenaza u matičnim stanicama karcinoma, kao i različiti redoks statusi. Štoviše, pokazujemo da liječenje 2-deoksiglukozom, dobro poznatim inhibitorom glikolize, inhibira proliferaciju BCSC ako se koristi sam i pokazuje sinergijski učinak ako se koristi u kombinaciji s doksorubicinom. Zaključno, predlažemo da inhibicija glikolize može biti potencijalno učinkovita strategija ciljanja BCSC-a.

Glavni

Jedan od glavnih problema u terapiji tumora dojke je dugotrajni recidivi. To se dijelom može objasniti neuspjehom da se iskorijeni podskup stanica unutar tumora koje su tada sposobne održati rast tumora. Te stanice dijele brojne značajke sa matičnim stanicama i stoga su nazvane matične stanice karcinoma (CSC). CSC su izolirani iz različitih solidnih tumora, uključujući rak dojke 1 i čini se da imaju ulogu u otpornosti na liječenje kao i u stvaranju metastaza. 2 Doista, CSC-ovi predstavljaju nekoliko intrinzičnih mehanizama rezistentnosti na konvencionalne antitumorske lijekove i zračnu terapiju, poput prekomjerne ekspresije transportera adenosin trifosfata (ATP), kaseta koji vežu adekvatni trifosfat (ABP), aktiviranja puteva preživljavanja, povećane proizvodnje anti-apoptotičkih faktora, veće zaštite protiv oksidativnog stresa i efikasnog popravljanja oštećenja DNA. 3 Stoga je hitno potrebna razvoj i validacija novih terapijskih strategija usmjerenih na CSC kako bi se poboljšao klinički ishod.

Nedavno je porastao interes za proučavanje metabolizma raka i tzv. Warburg efekt jer ciljanje specifičnih metaboličkih putova može biti obećavajući pristup terapiji raka. 4, 5 Warburg-ov efekt definira ovisnost raka o fermentativnoj glikolizi koja omogućava preusmjeravanje ključnih metabolita u stanične biosintetske puteve u proliferacijskim stanicama karcinoma 6, uključujući CSC, pa se sugerira da se može iskoristiti za razvoj novih farmakoloških tretmana koji mogu suzbiti hemo-otpornost ovih stanica. 7, 8

Također se pretpostavlja da metaboličke promjene mogu imati uzročnu ulogu u indukciji različitih fenotipskih stanja stanica karcinoma. Kao primjer, Dong i sur. 9 su pokazale da prigušivanje glukoneogenog enzima fruktoza-1, 6-bifosfataza koji aktivira fermentativnu glikolizu rezultira fenotipom sličnim stabljici. Unatoč njihovoj važnosti, metaboličke značajke CSC-a i dalje su uglavnom nepoznate. Nedavno je pokazano da CSC-ovi izolirani iz nekoliko čvrstih tumora pokazuju značajnu izmjenu energetskog metabolizma i više su glikolitički u usporedbi s diferenciranijim staničnim stanicama 10, 11, 12, 13 ili normalnim matičnim stanicama. 14 Međutim, to je i dalje kontroverzno pitanje jer su prethodne studije pokazale da su CSC-ovi manje glikolitični od diferenciranih. 15

Ovdje, koristeći integrirani proteomski i ciljani metabolomski pristup, pokazujemo da je metabolizam matičnih stanica karcinoma dojke (BCSC) uzgajanih kao sfere snažno povezan s fermentativnom glikolizom u usporedbi s istim stanicama koje se uzgajaju u adekvatnim razlikovnim uvjetima (srodne stanice povezane sa sferoidima ( SDACs)). Na temelju tih dokaza pokušali smo testirati učinak dobro karakteriziranog glikolitičkog inhibitora, 2-deoksi-D-glukoze (2-DG), 16, 17, sami ili u kombinaciji s široko korištenim kemoterapijskim doksorubicinom (Doxo) o rastu i proširenju BCSC-a. Naši rezultati pokazuju da su BCSC-ovi vrlo osjetljivi na 2-DG koji također pokazuje sinergijski učinak s Doxo tretmanom.

Rezultati

Diferencijalna analiza proteomike pokazuje pomak prema fermentativnom metabolizmu glukoze u sferama BCSC

U ovom su istraživanju analizirani različiti profili ekspresije proteina BCSC-a i SDAC-a. Kao što je ranije izviješteno, 18 in vitro model usvojen za diferencirane stanice, uobičajeno prijavljene kao SDAC, oslanja se na ćelije sfere uzgajane u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (DMEM) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u adekvatnim uvjetima. Ove stanice izražavaju veće razine diferencijacije u klasteru 24 (CD24) kako se očekuje za SDAC (dopunska slika S1). 19, 20

U usporedbi s gel-elektroforezom-masenom spektrometrijom (GC-MS) proteomičnim pristupom, tabelarna masna spektrometrija bez oznaka (LC-MS / MS) omogućuje visoku propusnost i jeftinu analitičku metodu za karakterizaciju složenih proteinskih smjesa s odgovarajućom osjetljivošću i ponovljivosti. Procjenjena je identifikacija proteina, kvantifikacija i kvaliteta podataka točnih skupina zadržavanja mase (EMRT), koje su zabilježene vrste masa povezane s njihovom točnom masom i vremenima zadržavanja. Ukupno je utvrđeno 39 379 i 39 379 EMRT za usporedbu BCSC-ova uzgajanih kao sfera sa SDAC-ovima 3, 5, odnosno 7 dana. Za svaki ponovljeni uvjet, raspodjela pogreške mase bila je ispod 15 ppm (slike 1a, d i g za BCSCs i SDAC prikupljene nakon 3, 5 dana, odnosno 7 dana), koeficijent varijacije intenziteta izražen kao postotak (% intenziteta CV) imao je Gaussova raspodjela sa svim vrijednostima <4, 5% (Slike 1b, e i h za BCSC i SDAC prikupljene nakon 3, 5 dana, odnosno 7 dana), a koeficijent zadržavanja u varijaciji izražen kao postotak (% CV RT) bio je <10% ( Slike 1c, f i i za BCSC, SDAC prikupljen nakon 3, 5 dana, odnosno 7 dana) s većinom vrsta <5%. Primjenjujući stroge kriterije identifikacije i kvantifikacije proteina opisanih u Materijalima i postupcima, identificirali smo 54 i 28 proteina različito izraženih u BCSC-ima u usporedbi sa SDACima prikupljenim nakon 3, 5 i 7 dana u uvjetima diferenciranja. Popisi različitih proteina prikazani su u suplementarnim tablicama S1 i S2, dok su detalji o peptidnim identifikacijama izneseni u dodatnim tablicama S3 i S4.

Image

Procjena kvalitete podataka, Vennova analiza i omjer ekspresije za značajno regulirane proteine ​​u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ovima. Analitička reproducibilnost masenih spektra procijenjena je u BCSC-ima i stanicama je ostavljeno da se diferenciraju kao SDAC tijekom 3, 5 i 7 dana. Bar grafikoni prikazuju relativni maseni odstupanje mase (RSD) i koeficijente varijacije intenziteta i vremena zadržavanja (% CV) tačnih retencijskih masenih klastera otkrivenih u BCSCs ( a, b, c ) i SDAC-ove prikupljene u 3, 5 dana ( d, e, f ) i 7 dana ( g, h, i ) post-diferencijacija (pd). ( j ) Četverosmjerna Vennova dijagramska analiza različito izraženih proteina identificira 15 lokusa. Brojevi u zagradama predstavljaju ukupan broj identificiranih proteina nakupljenih u svakom lokusu. BCSC-ovi u usporedbi sa SDAC-ovima 3, 5 dana pd pokazuju 25 i 5 proteina koji su posebno regulirani, odnosno regulirani prema dolje; BCSC pokazuju 4 proteina gore regulirana u usporedbi sa SDAC-ovima 7 dana pd; BCSC pokazuju 19 i 5 proteina prema gore i prema dolje regulirano, odnosno u usporedbi sa SDAC bez obzira na vrijeme diferencijacije. Swiss-Prot pristupni brojevi navedeni su u tablici (vidi Dodatne tablice S1 i S2 za detaljan opis). Analiza je provedena korištenjem četverosmjernog Vennovog dijagrama generatora koji je slobodno dostupan na //www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn4.cgi. ( k ) Bar grafikon prikazuje srednje omjere nivoa ekspresije proteina ( n = 3) od 19 i 5 proteina prema gore i dolje regulirano, odnosno u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-om bez obzira na vrijeme diferencijacije. Crvena linija označava omjer izraza = 1

Slika pune veličine

Vennova analiza (slika 1j) pokazuje da je 19 proteina bilo regulirano u sferama u usporedbi s obje vremenske točke diferencijacije, dok je 5 bilo podregulirano u istim eksperimentalnim uvjetima. Zanimljivo je da se razina ekspresije ovih proteina nije mijenjala između 3, 5 i 7 dana u adhezivnim uvjetima (Slika 1k), što sugerira da su razlike strogo povezane sa stabljikom. Stoga smo odlučili koristiti SDAC prikupljene nakon 3, 5 dana u adhezivnim uvjetima za sve naredne studije, usredotočujući se na rane promjene između BCSC i SDAC stanja.

Bioinformatska analiza ovih različito proteinskih proteina identificirala je dvije značajne proteinske mreže koje se preklapaju u vezi s hematološkim, imunološkim i upalnim bolestima (skor = 62) i uklanjanjem slobodnih radikala i putovima raka (skor = 3) (slike 2a i b). Funkcionalna analiza utemeljena na GO izrazima pokazala je da je nekoliko različito eksprimiranih proteina strogo povezano s glikolizom ( P = 3 × 10 -13 ) i glukoneogenezom ( P = 2 × 10 -8 ) (Slika 2c). Konkretno, povećane razine ekspresije ključnih enzima fermentativne glikolize poput piruvat kinaze M2 (PKM2) i laktatne dehidrogenaze A (LDH-A) u sferama u usporedbi sa SDAC-om mogu ukazivati ​​na to da sfere u osnovi metaboliziraju glukozu neoksidativnim putem čak i ispod normoksični uvjeti. Ova hipoteza je u skladu s prijavljenom pojačanom regulacijom faktora 1 α (HIF-1 α ) hipoksije u CSC 12, 21 i s predviđenom aktivacijom putanje ovisne o HIF-1 α, kako je predloženo ( z -score = 2.791) viša ekspresija u BCSC u usporedbi sa SDACs nekoliko proteina koji su uključeni u taj put kao što su trioza-fosfatna izomeraza 1, fosfoglicerat kinaza 1, galektin 1, LDH-A, 70-kDa protein toplotnog šoka, gliceraldheid 3-fosfat dehidrogenaza, enolaza 1, i aldolaza A. Analiza Western blottinga (WB) potvrđuje da BCSC izražavaju više razine HIF-1 α u usporedbi sa SDACima (slika 2d).

Image

Funkcionalna analiza i mreža proteina pokazuje pojačanu glikolitičku aktivnost i aktiviranje HIF-1 α puta u BCSC. Analiza puta intenziteta različito proteinskih proteina u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-om rezultira u dvije interakcijske mreže povezane s ( a ) hematološkim, imunološkim i upalnim bolestima i ( b ) uklanjanjem slobodnih radikala i putom raka. Dijagrami pokazuju gene gena za fokusiranje (različito izraženi proteini) koji su prikazani zeleno (dolje regulirano) ili crveno (ugulirano). Čvrste i isprekidane linije označavaju izravne i neizravne interakcije, a strelice označavaju modulacijsku ulogu proteina ili endogenih kemikalija. ( c ) Kanonski putevi povezani s BCSC su glikoliza, glukoneogeneza i radikalna degradacija superoksida. Funkcionalna analiza staze provedena je korištenjem alata za analizu puta Inenuity za značajno regulirane proteine ​​u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ovima. Vrijednosni grafikon prikazuje rezultate (−log 10 P ) povezane sa stazama obogaćenim reguliranim proteinima, kako je određeno korištenjem točno rečenog Fisher-ovog testa s pragom <0, 050. Žuta linija označava omjer izračunat kao broj bjelančevina na određenom putu koji zadovoljavaju kriterije odrezavanja ( P = 0, 050) podijeljen s ukupnim brojem molekula koje čine taj put. ( d ) BCSC reguliraju normoksični HIF-1 α . Nuklearni ekstrakti su procijenjeni na HIF-1 a i laminin p WB. Svjetska banka pokazuje da razina ekspresije HIF-1 α značajno opada u stanicama kojima je dopušteno da se diferenciraju kao SDAC 3, 5 dana

Slika pune veličine

Ciljana metabolomika pokazuje povećanu brzinu mliječne fermentacije i inhibiciju beta-oksidacije masnih kiselina (FA) u BCSC

Da bismo provjerili jesu li BCSC-ovi bili glikolitičniji kada se uzgajaju kao sferoidi, nego kada se uzgajaju kao SDAC-i, proveli smo ciljanu metabolomsku analizu intermedijata glikolize. Otkrili smo da su razine fruktoze 1, 6-difospata, piruvata, mliječne kiseline i riboza 5-fosfata značajno veće u BCSC-ima (Slika 3a, Dopunska tablica S5). Pored toga, nismo pronašli značajne razlike u koncentracijama Krebsovih intermedijara s izuzetkom jantarne kiseline koja je bila značajno veća u BCSC-ima (slika 3a, Dopunska tablica S5) i fumarne kiseline koja je bila veća u BCSC-ima, ali razlika s SDAC-i nisu bili statistički značajni (prosjek ± SD = 1995 ± 257 i 1233 ± 638 ng / mg -1 u BCSC-u i diferenciranim stanicama; P = 0, 204).

Image

Ciljana metabolomija otkriva značajne promjene glikolitičkih intermedijara, nebitnih aminokiselina koje dobivaju glukoza, slobodnog karnitina i AcC, sugerirajući pojačanu mliječnu fermentaciju i inhibiciju FAoksidacije u BCSC. Stupni grafikoni prikazuju srednje koncentracije intermedijara ( a ) glikolitičkog i Krebsovog ciklusa i ( b ) aminokiselina i slobodnog karnitina u BCSC i SDACs. Rezultati ciljane metabolomske analize dostupni su u Dodatnoj tablici S5. Razlike prikazane u grafikonima sve su značajne (dvostruki t- test, P <0, 050). Koncentracije su izražene kao ng / mg (mokra težina). Trake pokazuju srednju vrijednost ± SD ( n = 6)

Slika pune veličine

Naši podaci također pokazuju relevantne promjene profila acilkarnitina (AcCs) i aminokiselina (AA) u BCSC. Koncentracije valina (Val), ornitina, fenilalanina, arginina (Arg), tirozina, serina, histidina (His), prolina, glicina (Gly) i lizina / glutamina povećane su u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ima (slika 3b; dodatna tablica S5). I LC-MS / MS ne razlikuju Lys i Gln i uspjeli smo procijeniti njihovu ukupnu koncentraciju. Suprotno tome, alanin (Ala) se značajno smanjio u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ima (Slika 3b; Dodatna tablica S5).

Treba napomenuti da smo pronašli značajno niže razine slobodnog karnitina u sferama u usporedbi sa SDAC-ovima (Slika 3b, Dopunska tablica S5), što sugerira inhibiciju sinteze AcCs i konačno FA-beta oksidaciju. U skladu s ovom hipotezom, ACC-ovi kratkog, srednjeg i dugog lanca nisu bili prepoznatljivi u BCSC-ima. Suprotno tome, AcCs je bilo kvantificirati u SDAC-ovima (dopunska tablica S5).

BCSC pokazuju veću aktivnost ključnih enzima anaerobnog metabolizma glukoze

Nadalje smo potvrdili razinu ekspresije PKM2 i LDH-A, ključnog enzima aerobne glikolize, WB analizom proteinskih ekstrakata prikupljenih iz BCSC i SDAC. Potvrdili smo da su PKM2 i LDH-A značajno regulirani u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ovima (Slika 4a, P = 0, 008 i 0, 034, respektivno, n = 3). Nadalje, BCSC pokazali su porast PK (prosjek ± SD = 2, 5 ± 0, 7 i 1, 0 ± 0, 2 μ mol / mg proteina / min u BCSCs i SDACs; P = 0, 0001; n = 6) i LDH-A (prosjek ± SD = 2, 0 ± 0, 8 i 1, 3 ± 0, 1 μ mol / mg Protein / min u BCSCs i SDACs, P ; 0, 0 = 0, 044; n = 6) aktivnost (Slike 4b i c).

Image

Razine ekspresije i aktivnosti glikolitičkih enzima povećane su u BCSC i koreliraju s promijenjenom energijom i redoks statusom BCSC. ( a ) WB pokazuje PKM2, LDH-A i G6PDH ekspresiju u BCSCs u usporedbi sa SDACs. P- Aktin koristi se kao kontrola punjenja proteina. Prikazana je reprezentativna Svjetska banka od tri neovisna eksperimenta. ( b ) PK i ( c ) LDH i enzimske aktivnosti ocijenjene u sferama (BCSC) u usporedbi s diferenciranim stanicama (SDAC). Stupni grafikoni prikazuju srednju aktivnost ( n = 6) izraženu u μ mol / mg proteina / min, a šipke predstavljaju SEM ( d ) WB koji pokazuje ekspresiju PKM2 i LDH-A u stanicama sortiranim prema CD24 ekspresiji. P- Aktin koristi se kao kontrola opterećenja. ( e ) PK i ( f ) LDH aktivnost u CD24 - / niskim stanicama u usporedbi s CD24 + BCSC. Stupni grafikoni prikazuju srednju aktivnost ( n = 6) izraženu u μ mol / mg proteina / min, a šipke predstavljaju aktivnost enzima SEM ( g ) G6PDH procijenjena u sferama (BCSCs) u usporedbi s diferenciranim stanicama (SDACs). Stupni grafikoni prikazuju srednju aktivnost ( n = 6) izraženu u μ mol / mg proteina / min, a šipke predstavljaju SEM ( h ) NADP + / NADPH, ( i ) NADP / / NADH i ( j ) ADP / ATP omjere u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ovima. Tretman rotenonom ne utječe na proizvodnju ATP-a u BCSC, dok snažno povećava omjer ADP / ATP i inhibira proizvodnju mitohondrijalnog ATP-a u SDAC-ima. Nisu primijećene promjene u omjeru ADP / ATP u BCSC i SDAC nakon dodavanja dimetilsulfoksida (DMSO) samog koji se koristi kao kontrola vozila. Trake pokazuju srednju vrijednost ± SD ( n = 3). * P <0, 050 (neparni dvostruki t -test ili dvo-faktor ANOVA)

Slika pune veličine

Da bismo potvrdili da su opažene metaboličke razlike doista posljedice razlike između CSC-a i više diferenciranih stanica karcinoma, sortirali smo CD24 - / niske stanice unutar sfere kulture, za koje se pretpostavlja da su manje diferencirane više matičnih stanica i uspoređivali ih sa diferenciranija populacija koja izražava više razine CD24. Procijenili smo razinu ekspresije i enzimske aktivnosti LDH i PK u CD24 - / low i CD24 + BCSC. U skladu s više glikolitnim fenotipom, CD24 - / niske stanice pokazuju više razine (slika 4d) i aktivnosti PK (srednja ± SD = 19, 2 ± 0, 3 i 2, 0 ± 0, 4 μ mol / mg proteina / min u CD24 - / niska i CD24 + stanice, odnosno; P = 6 × 10 -13 ; n = 6) i LDH (srednja ± SD = 3, 6 ± 0, 3 i 2, 5 ± 0, 5 μ mol / mg proteina / min u CD24 - / low i CD24 + stanicama, respektivno; P = 0, 002; n = 6) (Slike 4e i f) u usporedbi sa stanicama CD24 + .

Glukozna 6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH) je ključni enzim pentoz fosfatnog procesa, metaboličkog procesa koji NADPH pruža stanicama potrebnim za anaboličke putove. Naši proteomski podaci također pokazuju da je G6PDH više izražen u BCSCs iako razlika sa SDAC-om nije statistički značajna (podaci nisu prikazani). Doista analizom WB-a pokazujemo da je G6PDH reguliran u sferama u usporedbi sa SDAC-ovima ( P = 0, 036; n = 3; Slika 4a), a njegova aktivnost je značajno povećana (srednja vrijednost ± SD = 2, 3 ± 0, 8 i 1, 2 ± 0, 3 μ mol / mg proteina / min u BCSCs i diferenciranim stanicama, P ; 0, 004; n = 6; Slika 4g). Prema povećanju ekspresije i aktivnosti G6PDH, pronašli smo smanjeni omjer NADP + / NADPH u sferama (prosjek ± SD = 0, 94 ± 0, 05 i 1, 063 ± 0, 004 u BCSCs odnosno SDACs; P = 0, 013, slika 4h). Ovi rezultati sugeriraju pojačanu biosintezu NADPH kroz pentose fosfatni put u BCSCs u usporedbi sa SDAC-om.

BCSC pokazuju povećanu smanjenu potrošnju nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) i proizvodnju ATP u citosolu

Omjer adenosin-difosfata (ADP) / ATP i NAD + / NADH su indeksi aerobnog ili anaerobnog metabolizma energije, staničnog prometa energije i redox staničnog stanja. Otkrili smo da su omjeri NAD + / NADH značajno veći u BCSC-ima u usporedbi s SDAC-om (prosjek ± SD = 11, 9 ± 0, 6 i 6, 7 ± 0, 3 u BCSC-u i diferenciranim stanicama; P = 2 × 10 −4, slika 4i). To je povezano s povećanjem potrošnje NADH i smanjenjem proizvodnje NAD + u BCSC-ima. U stvari, koncentracije NADH (srednje ± SD = 0, 06 ± 0, 04 i 0, 13 ± 0, 02 μ mol / l u BCSCs odnosno SDACs, P ; 0, 050), kao i razine NAD + (srednje ± SD = 0, 73 ± 0, 04 i 0, 88 ± 0, 07 μ mol / l u BCSCs odnosno SDACs; P = 0, 045) značajno se smanjuje BCSCs u usporedbi sa SDACs.

BCSC pokazuju i povećan omjer ADP / ATP (prosjek ± SD = 0, 23 ± 0, 03 i 0, 15 ± 0, 06 u BCSC i diferencirane stanice; P = 0, 016, slika 4j).

Napominjemo, otkrili smo da tretman rotenonom, odvajajućim sredstvom transportnog lanca elektrona (ETC), povećava omjer ADP / ATP u SDAC-u (srednja vrijednost ± SD = 0, 13 ± 0, 02 i 0, 247 ± 0, 006 za kontrolu i SDAC-ove tretirane rotenonom, respektivno; P = 0, 001), iako ne utječe na proizvodnju ATP-a u BCSC-u (srednja vrijednost ± SD = 0, 21 ± 0, 02 i 0, 20 ± 0, 01 za kontrolu, a BCSC-i tretirani rotenonom, respektivno; P = 0, 732). Ovi nalazi sugeriraju da odvajanje ETC-a izrazito inhibira proizvodnju ATP-a u SDAC-ovima, ali ne i u BCSC-ima koji se oslanjaju na mliječnu fermentaciju (Slika 4j).

2-deoksiglukoza (2-DG) inhibira rast i opstanak BCSC-a

Općenito, naši podaci pokazuju da BCSC-ovi prikazuju anaerobni fenotip metabolizma u usporedbi sa SDAC-om. Stoga smo testirali učinak spoja za koji se zna da inhibira prvu fazu glikolize, na rast i preživljavanje BCSC-ova, sam ili u kombinaciji s Doxo, kemoterapijskim sredstvom koje se koristi za liječenje raka dojke.

Naši rezultati pokazuju da Doxo djeluje citostatički na BCSC, ali vrlo skroman, ako postoji, toksični učinak (slike 5a i b). Značajno su da su BCSC-ovi bili znatno blokirani u G2 fazi staničnog ciklusa (podaci nisu prikazani). Suprotno tome, 2-DG pruža značajan vremenski ovisan citotoksični učinak izazivajući do 44% apoptoze nakon 48 sati liječenja (Slika 5b).

Image

2-DG inducira apoptozu BCSC-a, a njegov učinak se povećava kombinacijom s doksorubicinom. ( a ) BCSC-ovi se tretiraju samo doksorubicinom (Doxo) i 2-deoksiglikozom (2-DG) ili kombinacijom Doxo-a i 2-DG (Doxo + 2-DG). Liječenje doxo-om daje citostatski učinak, ali broj stanica se ne razlikuje značajno 24 i 48 h nakon primjene Doxo-a (Fischerov LSD post-hoc test, P = 0, 768). Suprotno tome, liječenje samo s 2-DG smanjuje broj BCSC-a u usporedbi s kontrolom, 24 h (Fischerov post-hoc test, P = 0, 055) i 48 h ( P = 8 × 10 -4 ) Doxo tretmanom. Tretman Doxo + 2-DG značajno smanjuje broj stanica u usporedbi s 24 h ( P = 0.0009) i 48 h ( P = 1 × 10 - 6 ) Doxo tretmanom i 48 h liječenja samo s 2-DG (Fischerov post-hoc test, P = 0, 002). Procjena apoptoze u ( b ) BCSC-ima i ( c ) SDAC-ovima koji su 48 sati tretirani s 2-DG, Doxo ili kombinacijom dvaju. Prikazuje se postotak hipo-diploidnih događaja koji je procijenjen protočnom citometrijom nakon bojenja propidijum-jodidom

Slika pune veličine

Zanimljivo je da kombinacija 2-DG-a i Doxo-a rezultira većim citotoksičnim učinkom u usporedbi s liječenjem samo Doxo-om ili samim 2-DG-om nakon 2 dana dostizanja 80% apoptoze nakon 48 h (slika 5b). Kao što se i očekivalo, diferencirane ćelije više reagiraju na Doxo; no čini se da su manje osjetljivi na 2-DG od BCSC-a (slika 5c). To je u skladu s manje metabolizmom glikolatnosti. Opet, kombinirani tretman rezultira puno većim odgovorom i kod SDAC-a (slika 5c).

Rasprava

Sve veći dokazi pokazuju da je podskup stanica raka, poznat kao CSC, ključni pokretači progresije tumora, što je klonogenska populacija koja podržava rast tumora. Prema CSC modelu, neuspjeh da se iskorijene ove stanice trenutnim terapijama može rezultirati recidivom tumora. Kako su ove stanice općenito vrlo hemo- i radiootporne, postoji hitna potreba za terapijskim agensima za selektivno ciljanje ove populacije. 2, 3 Pokazano je da nekoliko putova transdukcije signala doprinose matičnom fenotipu i predloženo je kao potencijalni terapijski cilj; štoviše, nedavna istraživanja pokazuju da ciljanje metabolizma CSC-a u kombinaciji s klasičnim kemoterapijskim sredstvima može pružiti dragocjenu strategiju za iskorjenjivanje CSC-a. Naša integrirana proteomska i ciljana metabolomijska analiza sugerira da BCSC ovise više o anaerobnom metabolizmu glukoze nego o više diferenciranih tumorskih stanica.

Pojačana proizvodnja glikolitičkog fluksa i laktata, čak i u prisutnosti kisika, sugerira prelazak BCSC metabolizma s oksidativne fosforilacije na aerobnu glikolizu, fenomen poznat kao Warburg efekt. Nadalje, pokazalo se da uregulacija aerobne glikolize korelira s povećanom agresivnošću tumora i razvojem otpornosti na više lijekova. 22, 23

Warburgov učinak smatra se staničnim odgovorom na hipoksične uvjete u mikrookolju tumora i adaptivnom prekomjernom ekspresijom transkripcijskog faktora HIF-1 α koji može pospješiti preživljavanje stanica raka. Viša razina HIF-1 α u sferama, predviđena silikonom i učinkovito promatrana u BCSC, čak i pod normoksičnim uvjetima, rezultira povećanom razinom ekspresije proteina uključenih u transport glukoze i metabolizma, kao i proizvodnje laktata indukcijom LDH-A, ključni enzim fermentacije glukoze. 24 Pokazano je da laktat i piruvat, nađeni značajno povećani u BCSC-ima, povećavaju hipoksiju inducibilne gene neovisno o hipoksiji potičući akumulaciju HIF-1 α . 25 Zanimljivo je da smo također otkrili da su BCSC obogaćeni u Krebsovom ciklusu intermedijat sukcinata i pokazuju trend povećanja koncentracije fumarata. Sukcinat i fumarat potiču akumulaciju HIF-1 α inhibicijom enzima domene prolil hidroksilaze ovisnih o kisiku koji kataliziraju razgradnju HIF-1 α , pružajući tako potkrepljujuće dokaze za porast HIF-1 α u BCSC u normoksičnim uvjetima.

Smatra se da je LDH-A glavni molekularni posrednik Warburgovog učinka. LDH-A i LDH-B geni kodiraju dva proteina, odnosno M i H, koji se kombiniraju da bi dobili pet izoenzima koji se razlikuju u elektroforetskoj pokretljivosti i Michaelis-Menten konstanti za laktat i piruvat. LDH-A, prekomjerno izražen u BCSC, povezan je s pretvorbom piruvata u laktat, što sugerira pojačanu mliječnu fermentaciju u tim stanicama. Ovu je hipotezu potkrijepio porast aktivnosti LDH PyrLac i mliječne kiseline pronađene u sferama. Povećana lokalna koncentracija toksične mliječne kiseline i smanjeni izvanstanični pH nedavno su povezani s Warburg učinkom i čini se da su oni povoljni za invaziju i tumorerigenezu. 26, 27, 28

PKM2 je izoforma PK niske aktivnosti koja potiče aerobnu glikolizu i doprinosi anaboličkom metabolizmu. 17, 29 Poznato je da PKM2 zamjenjuje normalni PK enzim u proliferacijskim i tumorskim stanicama, a 30 i PKM1 (visoko aktivna PK izoforma) na PKM2 izoformni prekidač povezani su s povećanim fermentacijskim metabolizmom, povećanom proizvodnjom piruvata i laktata i nižim potrošnja kisika. 17 Značajno da se aktivnost PKM2 oslanja na alosteričnu aktivaciju fruktoze 1, 6-difosfata 31 i serina. 32 Pojačana PK aktivnost u BCSCs podudara se s našim podacima koji pokazuju značajno povećanje ova dva alosterna efektora u BCSC-ima u usporedbi sa SDAC-ovima. Nadalje, PK ima globalnu regulatornu ulogu u biosintetskom metabolizmu AA i utječe na koncentraciju slobodnih AA-a. 33 Pokazalo se, posebno, da regulacija PKM2 potiče biosintezu serina de novo , 34 što zauzvrat može alosterično aktivirati PKM2, u skladu s višim razinama serina koje smo pronašli u BCSC-ima. Porast regulacije PKM2 i porast PK aktivnosti mogu također biti u korelaciji s povećanjem ranije Arg, Val i His. 33 Veća brzina biosinteze glukoze ne-esencijalnih AA-a povezanih s povećanjem PK aktivnosti sugerira da BCSC preusmjeravaju ugljik dobiven od glukoze u puteve koji ne stvaraju ATP koji podržavaju povećanje stanične biomase.

Povećana razina ekspresije i aktivnosti G6PDH i porast 5-fosfata riboze u BCSC jasno ukazuje na aktiviranje pentoznog fosfatnog puta. Ovi nalazi podržavaju ideju da se BCSC prebace iz kataboličkog metabolizma usmjerenog na proizvodnju energije prema anaboličkom stanju usmjerenom na opskrbu prekursora biosinteze, poput NADPH. Prema ovoj hipotezi, odnos NADP / NADPH u sferama značajno je smanjen, što ukazuje na povećanu razinu unutarćelijskih NADPH.

BCSC također pokazuju visok omjer ADP / ATP koji može ukazivati ​​na smanjenu proizvodnju oksidativno mitohondrijalnog ATP-a, i na taj način alternativne ATP-generirajuće staze u BCSC-u, kao i povećane razine citosolne ADP, potrebne za održavanje visoke stope glikolize. Treba napomenuti da liječenje rotenonom, inhibitorom mitohondrijskog kompleksa I, značajno smanjuje ATP proizvodnju stanica nakon diferencijacije bez značajnih učinaka na BCSC. Stoga su BCSC-ovi manje ovisni o aktivnosti mitohondrija nego normalne stanice karcinoma i oslanjaju se na aerobnu glikolizu za proizvodnju ATP-a.

Objavljeno je da glikolitičke stanice pokazuju nizak omjer citosolne i mitohondrijske NAD + / NADH koji inhibira ciklus trikarboksilnih kiselina (TCA), pogodujući anaerobnoj glikolizi. 35 Nadalje, povećanje razine NAD + / NADH inhibira tumourigenesis i metastaze kod raka dojke. 36 Neočekivano, BCSC-ove karakterizira viša razina NAD + / NADH u usporedbi sa SDAC-ovima. Čini se da je to u suprotnosti s agresivnim fenotipom tih stanica i njihovom sposobnošću stvaranja tumora. Međutim, naši su podaci u skladu s hipotezom da BCSC-ovi mogu konzumirati NADH bez stvaranja ATP-a iz mitohondrijskog transporta elektrona. Smanjenje nivoa NADH i odgovarajuće povećanje omjera NAD + / NADH u BCSC-ovima moglo bi biti povezano s povećanjem brzine homolaktičke fermentacije radi regeneracije dovoljnog bazena NAD + i održavanja visokih stopa glikolize, povećanja potrošnje NADH ili inhibicije TCA ciklus. U stvari, poznato je da povećana koncentracija međuprodukata ciklusa TCA inhibira ciklus. Povećanje koncentracije sukcinata i trend značajnog porasta fumarata u BCSC-ima mogu dijelom objasniti povećani omjer NAD + / NADH inhibicijom TCA ciklusa. Snažna inhibicija beta-oksidacije FA koju smo primijetili u BCSC daje daljnje dokaze prigušivanja aktivnosti mitohondrija. Iako je trenutno nejasna uloga inhibicije inhibicije oksidativnog katabolizma FA, ovi preliminarni rezultati opravdavaju daljnja ispitivanja.

Vrijedno je napomenuti da je Warburg učinak povezan s stabilnošću mitohondrija i stanično-redoks ravnotežom u stanicama raka. 37 Poticanje glikolize i ograničavanje mitohondrijske aktivnosti može inhibirati proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta mitohondrija (ROS). Nedavno je pokazano da niska razina stvaranja ROS-a kroz glikolitički pomak doprinosi održavanju fenotipa CSC-a. 9 Otkrili smo da se BCSC oslanjaju ne samo na aerobnu glikolizu, već i snažno prekomjerno eksprimiraju nekoliko antioksidativnih enzima poput mitohondrijske superoksidne dismutaze i sintetiziraju više NADPH nego diferencirane stanice. Pojačana biosinteza NADPH može ukazivati ​​na povećani izvor redukcije ekvivalenta i na poboljšanje antioksidacijske obrane kroz sustave proksiredoksina, tioredoksina i glutation. Valja napomenuti, nedavno je pokazano da ključni regulator aerobne glikolize PKM2 ima relevantnu ulogu u održavanju stanične redoks homeostaze omogućavajući veću preusmjeravanje glikolitičkih intermedijara u pentoz fosfatni put i NADPH biosintezu kao odgovor na oksidativni stres. 38 Stoga je moguće da su BCSC-i pokrenuli takve mehanizme za suzbijanje ROS-a.

Farmakološkim ciljanjem aerobne glikolize nadvladava lijek rezistentnost CSC-a izoliranih iz nekoliko čvrstih tumora. Konkretno, pokazano je da inhibicija glikolize vraća osjetljivost na lijekove u visokim zloćudnim stanicama tumora putem inaktivacije ABC transportera koji osiguravaju mehanizam za ispuštanje kemoterapijskih lijekova u CSC-u. 39 Analog sintetičke glukoze, 2-DG je jedan od inhibitora glikolize za kojeg se pokazalo da inhibira rast čvrstog tumora i trenutno je u fazi I / II kliničkog ispitivanja. 40, 41 Treba napomenuti da je nedavno sugerirano da kombinacija 2-DG-a s široko korištenim kemoterapeuticima poput trastuzumaba može biti vrijedna strategija za prevladavanje BCSC-a otpornih na lijekove. 42 Ovdje pokazujemo da akutno liječenje s 2-DG ima značajan citotoksični učinak i inducira apoptozu BCSC-a. Ovi su nalazi u skladu s podacima koji pokazuju da 2-DG značajno utječe na sposobnost CSC-a da formiraju sferoide. 14. Citotoksični učinak 2-DG prethodno je objašnjen ne samo inhibicijom glikolize i sljedećim metaboličkim stresom, već i neizravnim učincima na nekoliko signalnih putova, kao što je inhibicija sisavca cilja signala rapamicina 43 ili izravnim učincima na pro-apoptotičke proteine, kao što je Bcl-2 homologni antagonist / ubojica. 44

Suprotno tome, široko korišteni kemoterapeutski lijek Doxo daje samo citostatski učinak na CSC-ove, a dokazano je da dovodi do obogaćivanja stanica s CSC karakteristikama unutar populacije, što potencijalno povećava otpornost i rizik od ponovne pojave. 45 Zanimljivo je da smo otkrili da kombinacija Doxo-a i 2-DG pokazuje sinergijski učinak, značajno poboljšavajući smrt BCSC-a na vremenski ovisan način. Nadalje, kombinirano liječenje ima važan učinak i na više diferencirane stanice karcinoma, što sugerira da ova kombinacija može ciljati na različite populacije stanica karcinoma. Poznato je da Doxo povećava proizvodnju ROS-a koji može posredovati na mitohondrijskom oštećenju i apoptozi na p53 neovisan način. 46, 47 Također je poznato da liječenje 2DG-om dovodi do povećanja ROS-a. 48, 49 Ovo može pružiti razlog za poboljšanje učinka Doxo od strane 2-DG. S druge strane, kombiniranje 2-DG-a s drugim lijekovima može povećati nisku in vivo citotoksičnost 2-DG 40 i također prevladati citostatski učinak klasičnih kemoterapijskih sredstava. U stvari, ciljano aerobna glikoliza s 2-DG osjetno nadmašuje Doxo otpornost BCSC-a, pružajući tako obećavajuću farmakološku primjenu protiv BCSC-a.

Materijali i metode

Kemikalije

Sve kemikalije isporučivale su Sigma-Aldrich (Shnelldorf, Njemačka) i Fluka (Shnelldorf, Njemačka), osim ako nije drugačije navedeno.

Skupljanje tkiva, izolacija i kultura stanica raka

Tkiva raka dojke kod ljudi dobivena su od pacijenata koji su bili podvrgnuti operaciji u skladu s etičkim standardima institucionalnog odbora za eksperimentiranje na ljudima (autorizacija br. CE-ISS 09/282). Tumorsko tkivo mehanički i enzimski je probavljeno kolagenazom (1, 5 mg / ml; Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA) i hijaluronidazom (20 mg / ml) u DMEM-u (Gibco), mućkajući 1 sat na 37 ° C. Rezultirajuća stanična suspenzija posadila se u ultra-niske tipove za pričvršćivanje (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) u mediju bez seruma uz dodatak osnovnog faktora rasta fibroblasta (10 ng / ml) i faktora rasta epidermalnog rasta (20 ng / ml). prethodno opisano. 50 Ovaj postupak je dao BCSC linije koje su bile podvrgnute genotipizaciji kako bi se potvrdila individualnost svake stanične linije i dodatno su testirane na njihovu sposobnost stvaranja ksenografta tumora koji su replicirali histologiju roditeljskog tumora. Da bi se postigla in vitro diferencijacija BCSC, stanice disocirane sfere uzgajane su u DMEM-u naznačena vremena (3, 5 ili 7 dana) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u adekvatnim uvjetima. Te su stanice konvencionalno označene kao SDAC. 18

Test stanične proliferacije

Stabilnost ćelije određena je na 24 i 48 sati ispitivanjem izlučivanja plavim bojama nakon tretiranja BCSC s 35 mmol / l 2-DG kao što je ranije izvješteno, 14 doksorubicin hidroklorida (1 µ mol / l) i kombinacije dvaju lijekova u istim koncentracijama. Kontrolni uzorci izvedeni su u otopini puferiranoj fosfatima (PBS).

Citofluorimetrijska analiza

Procjena sadržaja protočne citometrijske stanične DNA u skladu s Nicoletti i sur. 51 Ukratko, stanice su sakupljene tripsinom, granulirane su na 800 × g tokom 10 minuta i fiksirane u 70% -tnom etanolu preko noći na -20 ° C. Uzorci su zatim isprani u PBS-u i inkubirani na 37 ° C, tokom 15 minuta s 13 Kunitz-ovih jedinica RNAse A otopine i 20 min s 50 μg / ml propidijum-jodida. Dvadeset tisuća događaja je nabavljeno (FACSCanto II Instrument, BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD) i analizirano pomoću programa BD FACSDIVA (BD Biosciences).

Provedena citometrijska analiza površinskih markera CD24 i klastera diferencijacije 44 (CD44) provedena je na 2 × 10 5 stanica po uzorku. Stanice su isprane u PBS-u, resuspendirane u 100 μl specifičnog antitijela (antitijelo-CD24-R-fikoeritrin-cijaninsko bojilo7 (anti-CD24-PE-Cy7), 561646, BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ, SAD); CD44-alofikocijanin (anti-CD44-APC), 559942, BD Pharmingen) razrijeđen je u 0, 5% goveđeg serumskog albumina i inkubiran 20 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Cell viability solution (555815, BD Biosciences) was used for detection of non-viable cells according to manufacturer's protocol. Samples were then washed and stored at 4 °C in the dark until acquisition. A FACSCantoII flow cytometer, running with FACSDiVa software (BD Biosciences), was used for sample acquisition and analysis.

Cell sorting of CD44 + /CD24 + and CD44 +/ CD24 −/low sub-populations was performed on single cell suspension from BCSC double stained with anti-CD24-PE-Cy7 antibody and anti-CD44-APC antibody. Cells were sorted with fluorescence-activated cell sorting Aria III cell sorter (BD Biosciences). Sub-populations of cells co-expressing CD44 and CD24 at higher levels or CD24 weak/absent were collected, and a small amount of cells were re-analysed to check for purity.

imunoblatin

Cells grown as BCSCs and SDACs were collected by centrifugation at 1200 revolutions/min. Cell pellets were washed twice with ice-cold PBS, resuspended in a 50 mmol/l tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)/HCl (pH 7.5), 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 1 mmol/l NaF, 10% Glycerol (V/V), 1 mmol/l MgCl, 1% Triton X-100 (V/V) ice-cold buffer containing proteinase inhibitor cocktail and incubated for 30 min on ice. Sample lysates were centrifugated at 10 000 × g for 10 min, and supernatants were collected. Equal amounts of whole proteins extracts and nuclear extract (B-625 Sigma N-XTRACT, Shnelldorf, Germany) for HIF-1 α immunodetection were resolved on 10% sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis gel using a mini-gel apparatus (GmbH Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA), transferred onto polyvinylidene fluoride membranes and subsequently blocked with 5% non-fat dry milk in PBS/0.1% (V/V) Tween 20. Immunodetection was performed by incubating the membranes with the different primary antibodies diluted in blocking buffer for 2 h at room temperature or overnight at 4 °C. The following antibodies were used: anti-LDH (PA5-27406, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), anti-PKM2 (PA-23034, Thermo Scientific), anti-G6PD (PA5-27359, Thermo Scientific), anti-HIF-1 α (NB100-449, Novus Biologicals, Cambridge, UK), anti-Actin (clone AC-15, A5441 Sigma-Aldrich), and anti-Laminin β (M-20) (sc-6217, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Immunoreactive bands were visualized with SuperSignal West Dura Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA).

Differential proteomic analysis

Sample preparation, data acquisition and data processing were performed as previously described. 52, 53, 54 A total of 100 μ g of protein extracts from the different conditions in separate experiments were precipitated with a mix of ethanol, methanol, and acetone (ratio 2 : 1 : 1, V/V) and then dissolved in 100 mmol/l Tris/HCl pH 7.9 containing 6 M urea and 0.1% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate and sonicated. The reduction of proteins was performed by adding 100 mmol/l dithiothreitol (DTT) (1 h at 36 °C) and 200 mmol/l iodoacetamide (1 h at room temperature). Protein samples at a final concentration of 2 μ g/ μ l were digested with 1 : 20 (w/w) sequence-grade trypsin (Promega, Madison, WI, USA) at 36 °C overnight. The reactions were stopped by adding 1 μ l of 10% (V/V) trifluoroacetic acid. A total of 0.25 μ g of the protein digestion was loaded onto the nanoACQUITY UPLC System (Waters Corporation, Milford, MA, USA) coupled to a quadrupole-time of flight (Q-Tof) Premier mass spectrometer (Waters Corporation). Before loading, a digested enolase from Saccharomyces cerevisiae (Waters Corporation) was added to the sample as internal standard at a final concentration of 200 fmol/l. Samples were injected onto a Symmetry C18 5 μ m, 180 μ m × 20 mm precolumn (Waters Corporation) for preconcetration and desalting and were subsequently separated using a NanoEase BEH C18 1.7 μ m, 75 μ m × 25 cm nanoscale LC column (Waters Corporation) maintained at 35 °C. Mobile phase A was water with 0.1% formic acid, and mobile phase B was 0.1% formic acid in acetonitrile. Peptides were eluted by a gradient of 3–40% mobile phase B over 150 min at a flow rate of 250 nl/min followed by a gradient of 40–90% mobile phase B over 5-min and a 15-min rinse with 90% mobile phase B. The Q-Tof Premier mass spectrometer (Waters Corporation) was programmed to step between low (4 eV) and high (15–40 eV) collision energies using a scan time of 1.5 s over 50–1990 m / z . Samples from each condition were run at least in triplicate. The best replica for each condition was used for the subsequent analysis. The Continuum LC-MS data were processed and searched using ProteinLynx GlobalServer v2.3 (PLGS) (Waters Corporation). Protein identification was performed using the embedded ion accounting algorithm of the software and by searching a Uniprot/SWISSProt human database release 2011_02 (20253 entries), to which the sequence from the enolase of S. cerevisiae was appended. The parameters for the database search were as follows: automatic tolerance for precursor ions, automatic tolerance for product ions, minimum of three fragment ions matched per peptide, minimum of seven fragment ions matched per protein, minimum of two peptides matched per protein, one missed cleavage, and carbamidomethylation and oxidation of methionine as modifications. The false positive rate of the identification algorithm is typically 3–4% with a randomized database appended to the original one, which is five times the size of the original utilized database. 55, 56 The identified proteins displayed in the protein table were normalized against the P00924 entry (Enolase S. cerevisiae ), and peptides from Enolase S. cerevisiae digestion that were the most reproducible for retention time and intensity deriving ( m / z 807.42, m / z 814.49, m / z 1286.71, m / z 1288.70, m / z 1755.94, m / z 1789.83, m / z 1840.89) were used to normalize the EMRT table, the list of paired peptide exact masses and retention time. The list of normalized proteins was screened according to the following criteria: proteins that were identified in at least two out of the three injections of the same conditions; proteins with 0< P <0.05 or 0.95< P 1.3 on decimal scale. If 0< P 95%, and if 0.95< P 95%. Setting the threshold of ratio at 1.3 on a decimal scale allowed us to consider the average relative fold change ±0.30 on a natural log scale. This setting is typically 2–3 times higher than the estimated error of the intensity measurements. 56

Targeted metabolomic analysis by GC–MS

GC–MS analysis of cell lysates was performed as previously described. 57 Briefly, cell samples (approximately 1.5 × 10 6 cells) were extracted with a solution of ethanol/water (50 μ l, 80 : 20, V:V), and cell homogenate (50 μ l) were precipitated with 100 μ l of cold 0.1% (V/V) methanolic trichloroacetic acid immediately after homogenization. Internal standards ( 13 C 4 malic acid, 13 C 4 succinic acid, 13 C 6 glucose; IS) were then added to give a final concentration of 10 μ g/ml. Samples were centrifuged at 10 000 × g for 30 min, and supernatants were collected and dried in a SpeedVac system (ThermoSavant, Waltham, MA, USA). The dried extracts were derivatized with 20 μ l of 20 mg/ml of methoxyamine hydrochloride solution in pyridine for 60 min at 70 °C followed by reaction with 20 μ l of N, O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% of trimethylchlorosilane for 60 min at 70 °C. GC–MS analysis was performed using a 6890N gas-chromatograph equipped with a 7863 Series auto-sampler and coupled with a 5973N mass spectrometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) operating in electron impact ionization mode. Three microlitres were injected in pulsed-splitless mode by applying a pressure of 80 psi. The injector temperature was kept at 250 °C. Chromatographic separations were obtained using a fused silica capillary column HP-5MS (30 mx 0.25 mm, Agilent Technologies). Helium was used as carrier gas at a constant flow rate of 1 ml/min. The GC oven was programmed as follows: start at 70 °C (hold time 1 min), which was raised at 4 °C/min to 300 °C (hold time 5 min). The mass spectrometer was automatically calibrated using per-fluoro tributylamine as calibration standard. For quantification, the mass spectrometer was used in the selective ion monitoring mode, and mass spectra were recorded in positive modes by monitoring the following ions: m / z 174 (pyruvic acid; IS: 13 C 3 pyruvic acid, m / z 177), m / z 147 (lactic acid; IS: 13 C 4 succinic acid, m / z 251), m / z 247 (succinic acid; IS: 13 C 4 succinate, m / z 251), m / z 245 (fumaric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 233 (malic acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236); m / z 328 (glyceraldheyde 3-phosphate; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 357 (3-phosphoglyceric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 375 (citric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 319 (glucose; IS: 13 C 6 glucose, m / z 323), m / z 387 (glucose 6-phosphate; IS: 13 C 6 glucose, m/z 323), and m / z 459 (fructose 1, 6-diphosphate; IS: 13 C 6 fructose 1, 6-diphosphate, m / z 462). Mass spectrometer operating parameters were: interface temperature 300 °C, ion source 250 °C, and quadrupole 150 °C. The external standard method and internal standard correction were applied for quantification of target metabolites. Data acquisition was performed using the G1701CA ChemStation software (Agilent Technologies).

Determination AAs and AcCs

AA and AcCs analysis was performed by LC-MS/MS as previously described. 58, 59 Cell samples (approximately 1.5 × 10 6 cells) were extracted with a solution of Ethanol/Water (50 μ l, 80 : 20, V:V). The samples were then sonicated and centrifuged (15 600 rpm at 4 °C for 20 min), and the supernatant was recovered. The lysate (7 μ l) were added to 100 μ l of the stable isotope-labeled IS obtained from the NeoBase Non-derivatized MSMS Kit (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). The sample were analysed by direct infusion mass spectrometry using a LC-MS/MS system consisting of an Alliance HT 2795 HPLC Separation Module coupled to a Quattro Ultima Pt ESI tandem quadrupole mass spectrometer (Waters Corporation). The instrument was operated in positive electrospray ionization mode using MassLynx V4.0 Software (Waters Corporation). A detailed description of electrospray ionization mass spectrometry acquisition parameters are available in Supplementary Table S6. Auto data processing was performed using the NeoLynx (Waters Corporation) software.

Pyruvate kinase activity

PK activity was measured by converting the product pyruvate into lactate using LDH, with a concomitant conversion of NADH to NAD +, resulting in a decrease in absorbance at 340 nm. 60 In all, 7 × 10 6 cells were lysed in 200 μ l of buffer containing 10 mmol/l Tris–HCl (pH 7.5), 1.5 mmol/l MgCl 2, 20 mmol/l NaCl, 1 mmol/l DTT, 1 mmol/l phenylmethylsulfonyl fluoride, and protease inhibitor cocktail. After two centrifugations at 17 000 × g for 30 min each, PK activity was measured in the supernatant by a LDH-coupled assay. The 200- μ l reaction mixture was prepared on ice containing 100 mmol/l Tris–HCl (pH 8.0), 100 mmol/l KCl, 10 mmol/l MgCl2, 0.5 mmol/l EDTA, 0.2 mmol/l NADH, 1.5 mmol/l ADP, 5 mm phosphoenolpyruvate, and 200 units/ml LDH. The reaction was initiated by the addition of 0.7 μ g of total cell extract. PK activity was calculated at 37 °C by monitoring the absorbance at 340 nm every 30 s for 5 min in an microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). A unit of PK activity is defined here as the amount of enzyme required to oxidize 1 μ mol of NADH per minute under these experimental conditions.

LDH activity

Direct LDH activity (LDH PyrLac ) was spectrometrically assayed as previously described 61, 62 using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices). Briefly, cell pellets were lysed in 0.010 mol/l PBS (20 ml/g of pellet, wet weight; pH=7.4). Cell lysates were centrifuged at 2000 × g for 3 min at 4 °C to remove cell debris. Supernatants were further centrifuged 8000 × g for 10 min at 4 °C in order to obtain cytosolic fractions. Protein concentration was determined according to the Bradford assay. 63 Therefore, pyruvate (25 μ l, 2.50 g/l) and NADH (100 μ l, 0.3 g/l) were added to the samples (10 μ l corresponding to 0.5 μ g of total proteins) and the decrease of absorbance at 340 nm was measured at 37 °C every 30 s for 5 min. LDH PyrLac activity is expressed as μ mol/mg protein /min.

G6PDH activity

G6PDH was assayed using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices), according to the spectrophotometric methods previously described 64 with minor modifications. Cell pellets were homogenized, and protein quantification were performed as described for LDH activity assay. To measure G6PDH activity, the sample (10 μ l corresponding to 0.5 μ g of total proteins) was added to a solution containing glucose 6-phosphate (0.2 mmol/l), NADP + (0.1 mmol/l), Tris/HCl buffer (50 mmol/l, pH=8.1), and MgCl 2 (1 mmol/l). The final volume was 150 μ l. The increase of absorbance at 340 nm was measured every 30 s for 5 min at 37 °C. G6PDH activity was expressed as μmol/mg protein/min.

NAD + /NADH and NADP + /NADPH determination

NAD + /NADH ratio were measured by a ultrasensitive colorimetric assay (EnzyChrom NAD + /NADH Assay Kit (E2ND-100), BioAssay Systems, Hayword, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. This assay is based on a LDH cycling reaction. 65 Briefly, cells were lysed with either 100 μ l NAD + extraction buffer for NAD + determination or 100 μ l NADH extraction buffer for NADH determination. After heating at 60 °C for 5 min, 20 μ l of assay buffer and 100 μ l of the opposite extraction buffers (NADH extraction buffer or NAD + extraction buffer, respectively) were added. The samples were then centrifuged at 14 000 rpm for 5 min, and the supernatants (40 μ l) were used for NAD + /NADH assays. The optical density (OD) was read at 565 nm in a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices) for time 0 and after 15 min. NAD + and NADH concentrations were measured as: (ΔOD- b 0)/ b 1, where b 0 and b 1 are the intercept and slope of the external calibration curve.

NADP + /NADPH ratio were measured by a ultrasensitive colorimetric assay (EnzyChrom NADP + /NADPH Assay Kit (ECNP-100), BioAssay Sistems) following the manufacturer's instructions. This assay is based on a glucose dehydrogenase cycling reaction. 65 The absorbance was measured at 565 nm using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices), and the same procedure applied for NAD + /NADH determination was performed. All analysis were performed in triplicate.

ADP/ATP ratio determination

ADP/ATP ratio was measured based on luciferin–luciferase reaction using Enzylight ADP/ATP ratio assay kit (ELDY-100) (BioAssay Systems) following the manufacturer's instructions. Briefly, BCSCs cells were seeded in a 96-well flat-bottom plate and incubated for 3 days to allow for cell differentiation and recovery (1 × 10 4 cells at 100 μ l per well). BCSCs (1 × 10 4 cells) were treated with the assay buffer (90 μ l) containing luciferin–luciferase. After 1 min, luminescence (relative light units (RLU) A) was recorded by Lumat LB 9507 Ultra Sensitive Tube Luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA). The luminescence was read also after 10 min (RLU B). This measurement provided background before measuring ADP. Therefore, 5 ml ADP reagent was added to each well, and after 1 min, luminescence (RLU C) was obtained. ADP/ATP ratio was measured as: (RLU C−RLU B)/RLU A. All analysis were performed in triplicate. The same procedure was applied for the measurement of ADP/ATP ratio in BCSCs and SDACs following treatment with rotenone (50 μ mol/l) for 60 min.

Statistical and bioinformatic analysis

Differences between the protein expression levels, enzymatic activities, and metabolite concentrations in BCSCs and SDACs were assessed by unpaired two-tailed t -test. Two-factor ANOVA followed by Fisher's least significant difference (LSD) post-hoc test was performed in order to assess the significance of the treatment effects. Data were ranked and aligned where Levene test failed to show homoscedasticity. Aligned rank transformation (ART) of data was performed using the ART web software available at //faculty.washington.edu/aimgroup/proj/art/artweb/. 66 Treatment (PBS, Doxo, 2-DG, and Doxo+2-DG) and the treatment time (24 or 48 h) were the independent factors. P -values <0.050 were considered statistically significant. Statistical analysis was performed using the Statistica 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK), XLStat2007.1 (Microsoft, Redmond, WA, USA) and Microsoft Excel software.

Protein network analysis was performed using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) application (Ingenuity System, //www.ingenuity.com). IPA constructs hypothetical protein interaction clusters on the basis of the Ingenuity Pathways Knowledge Base. Direct and indirect relationships between the identified proteins were shown as networks on the base of all genes, and endogenous chemicals present in the Ingenuity Knowledge Network scores are calculated as −log ( P -value) and indicate the likelihood that focus genes (ie, the identified proteins within a specific network) are clustered together. Biological functions and canonical pathways over-represented among the identified proteins were also assigned to networks stored in the Ingenuity Pathways Knowledge Base. Biological functions and canonical pathways were ranked in accordance to their significance. Significance was evaluated by exact Fisher's test. A P -value of 0.01 corresponding to a score of 2 was considered the cutoff for the analysis.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska slikovna legenda

  2. 2.

    Dopunska tablica S1

  3. 3.

    Dopunska tablica S2

  4. 4.

    Dopunska tablica S3

  5. 5.

    Dopunska tablica S4

  6. 6.

    Dopunska tablica S5

  7. 7.

    Dopunska tablica S6

Glosar

2-DG

2-deoxy-D-glucose

AA

amino acid

abeceda

ATP-binding cassette

AcCs

acylcarnitines

ADP

adenosine diphosphate

ATP

adenozin trifosfat

anti-CD24-PE-Cy7

antibody-CD24-R-phycoerythrin-cyanine dye7

anti-CD44-APC

antibody-CD44-allophycocyanin

Arg

arginin

BCSC

breast cancer stem cell

bFGF

osnovni faktor rasta fibroblasta

CD24

cluster of differentiation 24

CD44

cluster of differentiation 44

CSC

cancer stem cell

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle Medium

Doxo

doxorubicin

DTT

ditiotreitola

EGF

faktor rasta epiderme

EMRT

exact mass retention time cluster

ETC

electron transport chain

FA

fatty acid

G6PDH

glucose 6-phosphate dehydrogenase

GC–MS

gas-chromatography mass spectrometry

Gly

glycine

HIF-1α

hypoxia-inducible factor 1α

njegov

histidine

IPA

Ingenuity Pathway Analysis

LC-MS/MS

liquid chromatography tandem mass spectrometry

LDH

laktat dehidrogenaza

LDH-A

lactate dehydrogenase A

NAD

nicotinamide adenine dinucleotide

NADP

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PK

pyruvate kinase

PKM2

pyruvate kinase M2

PMSF

phenylmethylsulfonyl fluoride

RLU

relative light units

ROS

reaktivne vrste kisika

SDAC

spheroid-derived adherent cell

TCA

tricarboxylic acids cycle

Val

valine

WB

western blotting

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)