C2238 / αanp modulira apolipoprotein e kroz egr-1 / mir199a u vaskularnim stanicama glatkih mišića in vitro | stanična smrt i bolest

C2238 / αanp modulira apolipoprotein e kroz egr-1 / mir199a u vaskularnim stanicama glatkih mišića in vitro | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • ateroskleroza
  • Stanična signalizacija
  • Genska ekspresija
  • lipoproteini

Sažetak

Ispitanici koji nose varijantu gena T2238C za ANP imaju veći rizik da će pretrpjeti moždani udar ili infarkt miokarda. Moraju se u potpunosti razjasniti mehanizmi pomoću kojih T2238C / α ANP djeluje štetno na vaskularne učinke. U ovom smo radu imali za cilj istražiti utjecaj C2238 / α ANP (mutirani oblik) na putove povezane sa aterosklerozom. Kao prvi korak, provedena je makroarray analiza ekspresije gena za aterosklerozu u vaskularnim stanicama glatkih mišića (VSMCs) izloženim ili T2238 / α ANP (divlji tip) ili C2238 / α ANP. Glavno otkriće je da je ekspresija gena za apolipoprotein E ( ApoE ) značajno smanjena C2238 / α ANP i da je regulirana T2238 / α ANP. Naknadno smo otkrili da C2238 / α ANP inducira smanjivanje ApoE kroz natriuretski peptidni receptor tipa C (NPR-C) koji uključuje uravnavanje miR199a-3p i miR199a-5p i smanjivanje regulacije DNAJA4. U stvari, NPR-C knockdown spasio je razinu ApoE. Uregulacija miR199a NPR-C posredovana je povećanjem reaktivnog faktora transkripcije proteina-1 (Egr-1) koji ovisi o reaktivnom kisiku. Zapravo, pad Egr-1 ukinuo je utjecaj C2238 / α ANP na ApoE i miR199a. Treba napomenuti da je smanjivanje količine ApoE C2238 / α ANP povezano sa značajnim povećanjem upale, apoptoze i nekroze koje je potpuno spasilo egzogena primjena rekombinantnog ApoE. Zaključno, naša je studija secirala novi mehanizam vaskularnog oštećenja uzrokovan C2238 / α ANP koji je posredovan smanjenjem ApoE. Dajemo prvu demonstraciju da C2238 / α ANP snižava ApoE u VSMC-ovima aktivacijom Egr-1 ovisnom o NPR-C i posljedičnom regulacijom miR199a. Vraćanje razine ApoE moglo bi predstavljati potencijalnu terapijsku strategiju za suzbijanje štetnih učinaka C2238 / α ANP.

Glavni

Atrijski natriuretski peptid (ANP) igra važne citoprotektivne kardiovaskularne funkcije, poput antihipertrofičnih, antiproliferativnih i prosurvivalnih učinaka u kardiomiocitima, staničnim glatkim mišićnim stanicama (VSMCs), fibroblastima i endotelnim stanicama. 1 Nedavno je pokazalo da je molekularna varijanta α ANP (C2238 / α ANP), koja je karakterizirana C-terminalnim produženjem peptida s dva ostatka arginina i sekundarna je supstituciji timina citozinom na položaju 2238 od gena ANP , ima štetne vaskularne učinke. U stvari, mi i druge skupine ranije smo pokazale da subjekti koji nose varijantu gena T2238C za ANP imaju značajno veći rizik od moždanog udara ili infarkta miokarda i pokazuju značajno povećanje cirkulirajućih markera aktivacije leukocita. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Sveukupno, ovaj dokaz ističe potrebu pronalaska terapijskih ciljeva za sprečavanje ili smanjenje štetnih učinaka varijante gena C2238 / α ANP, što je relativno često u općoj populaciji. Međutim, to je moguće samo ako su potpuno razjašnjeni molekularni mehanizmi preko kojih C2238 / α ANP pogoduje razvoju vaskularne disfunkcije, ateroskleroze i kardiovaskularnih nesreća.

Ranije smo izvijestili da C2238 / α ANP molekularna varijanta potiče staničnu apoptozu, nekrozu i oksidativni stres, dok smanjuje proliferaciju stanica, angiogenezu i vazodilataciju. 9, 10, 11 Mehanički smo utvrdili da su štetni učinci varijante C2238 / α ANP posredovani dereguliranom aktivacijom natriuretičkog receptora za nariuretski tip (NPR-C) s posljedičnim padom razine cAMP i aktivnosti PKA. 10, 11 Otkriveno je da je nenormalna aktivacija NPR-C povezana sa smanjenjem Akt / eNOS puta i povećanjem aktivnosti reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) iz NADPH oksidaze u endotelnim stanicama. 9, 10 Pored toga, epigenetski fenomen koji uključuje miR21 značajno je pridonio štetnim učincima C2238C / α ANP na staničnu vitalnost i funkciju u VSMC. 11 Međutim, ovi molekularni mehanizmi mogu objasniti samo štetna svojstva C2238 / α ANP na stabilnost aterosklerotskog plaka. S druge strane, interakcija C2238 / α ANP s više gena / proteina izravno povezanih s aterosklerotskim procesom ostaje nepoznata. Ova posljednja mogućnost je podržana poznatim sudjelovanjem natriuretičkih peptida u aterosklerozi. 1

Iz tog razloga, proveli smo analizu genske ekspresije makroarray u VSMCs, ključnom staničnom elementu u razvoju ateroskleroze 12 i cilju ANP, 1 kako bismo istražili potencijalni utjecaj T2238C / α ANP na mehanizme koji stoje na osnovi ateroskleroze. Otkrili smo da C2238 / α ANP inducira značajnu redukciju ekspresije gena za apolipoprotein E ( ApoE ), kodirajući poznati antiaterosklerotski i protuupalni protein, aktivacijom signalnog puta NPR-C / Egr-1 / miR199a / DNAJA4 koji ovdje seciramo prvi put. Otkriveno je da je za smanjenje regulacije ApoE odgovorna štetna stanična abnormalnost izazvana T2238C / α ANP u VSMC.

Rezultati

Diferencijalna ekspresija ApoE gena u VSMC inducirana TT2238 / α ANP i CC2238 / α ANP

Profil ekspresije gena za aterosklerozu stanica glatkih mišića pupčane vene (HUVSMC) izloženih bilo TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP, u usporedbi s nesimuliranim stanicama, prikazan je u Tablici 1. Među nizovima koji su bili značajno i različito regulirani (barem 5 puta) od dva α ANP oblika, ApoE gen značajno je smanjen CC2238 / α ANP, dok je izrazito stimuliran TT2238 / α ANP. Rezultat makroarrifikacije potvrdili smo demonstrirajući da su i nivo mRNA ApoE i ekspresije proteina smanjeni u oba HUVSMC (slike 1a i b) i SMCs koronarne arterije (slike 1c i d) pomoću CC2238 / α ANP, dok su ih regulirali TT2238 / α ANP. Budući da je poznato da ApoE djeluje kritično na antiaterosklerotičko i protuupalno djelovanje, 13 odlučili smo procijeniti da li slaba regulacija ApoE posreduje štetnim učincima CC2238 / α ANP.

Tablica pune veličine

Image

Diferencijalna regulacija ApoE mRNA i razine proteina pomoću TT2238 / α ANP i CC2238 / α ANP u HUVSMC i CAMSCs. Rezultati RT-PCR ( a i c ) i zapadnog blotiranja ( b i d, uz odgovarajuću denzitometrijsku analizu) za nivoe ekspresije ApoE u HUVSMCs (gornji dio) i u CASMCs (donji dio). Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD Broj neovisnih pokusa = 6. Δ P <0, 005 za TT2238 / α ANP nasuprot CTR. ** P <0, 0001 za TT2238 / α ANP nasuprot CC2238 / α ANP ( a i b ) i za CC2238 / α ANP nasuprot i CTR i TT2238 / α ANP ( b i d ). CC2238 / α ANP, varijanta α ANP; TT2238 / α ANP, divlji tip α ANP; CTR, kontrola

Slika pune veličine

CC2238 / α ANP inducira smanjivanje ApoE kroz mehanizme ovisne o NPR-C povezanima sa regulacijom miR199a

Zatim smo secirali mehanizme preko kojih CC2238 / α ANP inducira redukciju ApoE ekspresije. Prethodni rad iz našeg laboratorija pokazao je da CC2238 / α ANP izaziva štetne vaskularne učinke dereguliranom aktivacijom NPR-C. 10, 11 Stoga smo istražili da li NPR-C posreduje učinke CC2238 / α ANP na nivoe ekspresije ApoE. Naši rezultati potvrdili su ovu hipotezu, budući da smo otkrili da je pad NPR-C spasio nivo ekspresije ApoE u HUVSMC i stanicama glatkih mišića koronarne arterije (CASMC) izloženim CC2238 / α ANP (slike 2a i 3a).

Image

C2238 / α ANP inducira smanjivanje ApoE kroz mehanizme ovisne o NPR-C povezanima sa regulacijom miR199a i Egr-1 u HUVSMC. ( a ) Analiza pomoću RT-PCR i zapadnim mrljanjem nivoa ApoE ekspresije na CC2238 / α ANP u NPR-C nije utihnuta i utihnuta ćelija. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale uzorke. ( b ) miR199a-3p, miR199a-5p, DNJA4 mRNA razine bilo pod TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP (gornji dio ploče) i u NPR-C nisu prigušene i utišane stanice pod CC2238 / α ANP (donji dio ploče). Dvije specifične siRNA korištene su za dobivanje prigušivanja gena NPR-C. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP nasuprot TT2238 / α ANP i CTR. Δ P <0, 005 za TT2238 / α ANP nasuprot CTR i za CC2238 / α ANP nasuprot CTR (miR199a-3p i miR199a-5p). ( c ) Reprezentativno zapadno mrlje Egr-1, s odgovarajućom denzitometrijskom analizom bilo pod TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP izloženošću (lijeva strana) i ispod CC2238 / α ANP u NPR-C, a nisu prigušene i prigušene stanice (desna strana), ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale uzorke. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD Broj neovisnih pokusa = 6. CC2238 / α ANP, varijanta α ANP; TT2238 / α ANP, divlji tip α ANP; siRNA1, prigušivač gena NPR-C 1; siRNA2, prigušivač gena NPR-C 2; hsa-miR199a, ljudska mikroRNA199a; Egr-1, protein ranog odgovora-1; CTR, kontrola

Slika pune veličine

Image

C2238 / α ANP inducira smanjivanje ApoE kroz mehanizme ovisne o NPR-C povezanima sa regulacijom miR199a i Egr-1 u CASMC-ima. ( a ) Analiza pomoću RT-PCR i zapadnim mrljanjem nivoa ApoE ekspresije na CC2238 / α ANP u NPR-C nije utihnuta i utihnuta ćelija. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale uzorke. ( b ) miR199a-3p, miR199a-5p, DNJA4 mRNA razine bilo pod TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP (gornji dio ploče) i u NPR-C nisu prigušene i utišane stanice pod CC2238 / α ANP (donji dio ploče). Dvije specifične siRNA korištene su za dobivanje prigušivanja gena NPR-C. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP nasuprot TT2238 / α ANP i CTR. Δ P <0, 005 za TT2238 / α ANP nasuprot CTR i za CC2238 / α ANP nasuprot CTR (miR199a-3p i miR199a-5p). ( c ) Reprezentativno zapadno mrlje Egr-1, s odgovarajućom denzitometrijskom analizom bilo pod TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP izloženošću (lijeva strana) i ispod CC2238 / α ANP u NPR-C, a nisu prigušene i prigušene stanice (desna strana), ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale uzorke. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD Broj neovisnih pokusa = 6. Za kratice vidi sliku 2

Slika pune veličine

Napominjemo, prethodni dokazi pokazali su da su razine ekspresije ApoE epigenetički regulirane miR199a-3p i miR199a-5p, koje zauzvrat mogu izravno ciljati na ApoE ili ciljati protein toplinskog udara DNAJA4, koji potiče povećanje regulacije ApoE. 14 U skladu s ovim dokazima, otkrili smo da su nivoi ekspresije miR199a-3p i miR199a-5p značajno regulirani CC2238 / α ANP, dok ih TT2238 / α ANP smanjuje. S druge strane, razina ekspresije DNAJA4 rezultirala je smanjenjem vrijednosti CC2238 / α ANP, dok je ona ostala nepromijenjena u stanicama izloženim TT2238 / α ANP (slike 2b i 3b). Zanimljivo je da smo opazili da je pad NPR-C spasio nivo ekspresije miR199a-3p, miR199a-5p i DNAJA4 u obje VSMC linije tretirane s CC2238 / α ANP (slike 2b i 3b). Ovi podaci sugeriraju da NPR-C regulira razinu ApoE regulacijom miR199a-3p, miR199a-5p i DNAJA4.

NPR-C regulira miR199a aktiviranjem ranog odgovora proteina-1 (Egr-1)

Zatim smo pokušali razjasniti mehanizme signalizacije putem kojih NPR-C potiče regulaciju miR199a-3p i miR199a-5p, smanjivanje DNK44 i na kraju smanjivanje nivoa ApoE ekspresije kao odgovor na CC2238 / α ANP. Prije je utvrđeno da transkripcijski faktor Egr-1 potiče povećanje regulacije miR199a. 15 Pored toga, Egr-1 se često nalazi aktiviran u vaskulaturi za vrijeme stresa i opisano je da uključuje u aterosklerotski proces. 16 Stoga smo procijenili je li Egr-1 uključen u regulaciju miR199a-3p i miR199a-5p ovisnu o NPR-C i kao odgovor na CC2238 / α ANP. Otkrili smo da je Egr-1 poviše reguliran kao odgovor na CC2238 / α ANP, a taj učinak je poništen NPR-C padom (slike 2c i 3c). Poznato je da CC2238 / α ANP inducira aktiviranje NADPH oksidaze ovisno o NPR-C i proizvodnju ROS. 9, 10 Egr-1 može aktivirati ROS. 17 U skladu s tim, otkrili smo da je regulacija Egr-1 ovisno o C2238 / α ANP bila potaknuta apocininom, inhibitorom NADPH oksidaze (dopunska slika S1). Konačno, otkrili smo da je pad Egr-1 normalizirao nivo miR199a i DNAJA4 i blokirao smanjivanje ApoE u obje VSMC linije tretirane CC2238 / α ANP (slika 4). Općenito, ovi podaci pokazuju da CC2238 / α ANP dovodi do regulacije miR199a i smanjenja ApoE u VSMC-ovima kroz proizvodnju ROS ovisne o NPR-C, što zauzvrat dovodi do aktiviranja Egr-1.

Image

Utjecaj ušutkivanja Egr-1 gena na ApoE regulatorni put u HUVSMC i CAMSCs. ( a ) Uticaj prigušivanja gena Egr-1 na nivoe ekspresije Egr-1, miR199-3p, miR199-5p, DNAJA4 (što je otkriveno RT-PCR) i na nivoe ApoE ekspresije (što je otkriveno i RT-PCR i zapadnim blottingom) ) u HUVSMC-ovima. Za dobivanje poremećaja gena Egr-1 korištene su dvije specifične siRNA. ( b ) Utjecaj prigušivanja gena Egr-1 na nivoe ekspresije Egr-1, miR199-3p, miR199-5p, DNAJA4 (kao što je detektirano RT-PCR) i na nivoe ApoE ekspresije (što su otkrili i RT-PCR i zapadni mrlja) u CASMC-ovima. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD Broj neovisnih pokusa = 4 za svaku staničnu liniju. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale točke. siRNA1, Egr-1 prigušivač gena 1; siRNA2, Egr-1 prigušivač gena 2; za ostale kratice vidi slike 2 i 3

Slika pune veličine

CC2238 / α ANP modulira apoptozu, nekrozu i upalu u VSMCs redukcijom ApoE ovisne o NPR-C

Zatim smo procijenili biološku važnost redukcije ApoE u stanicama izloženim CC2238 / α ANP. Dodatne slike S2 ​​i S3 prikazuju rezultate zapadnjačke blot analize kako bi se procijenila razina ekspresije cijepljene kaspaze-3, staničnog represora gena stimuliranog E1A (CREG), i fosforiliranog i ukupnog oblika JNK i p38MAPK u HUVSMC (dopunska slika S2 ) i u CASMC-ovima (dopunska slika S3) u prisutnosti CC2238 / α ANP. Odcepljena kaspaza-3 povećana je CC2238 / α ANP (dopunske slike S2A i S3A). S druge strane, smanjena je ekspresija CREG-a, antiapoptotskog faktora (dopunske slike S2B i S3B). U skladu s prethodnim istraživanjima koja pokazuju da CREG inhibira VSMC apoptozu inhibicijom p38MAPK i JNK signalnih putova18, primijetili smo paralelno povećanu fosforilaciju i p38MAPK i JNK u obje HUVSMC i CASMCs tretirane s CC2238 / α ANP u usporedbi s kontrolnim stanicama (dopunska Slike S2C, D, S3C i D). Napominjemo da je NPR-C uništenje u potpunosti spasilo efekte AN22 CC2238 / α na odcjepljenu kaspazu-3, fosfo-p38MAPK, fosfoJNK i CREG. Stanična razina NF- κ B i Smad4, poznatih markera upale, također je značajno porasla i za HUVSMC i CASMC izložene CC2238 / α ANP (dopunske slike S2E, F, S3E i F). Šutnja gena NPR-C pojačala je porast i NF- κ B i Smad4 usprkos prisutnosti CC2238 / α ANP u obje VSMC linije (dopunske slike S2E, F, S3E i F). Sve u svemu, ovi nalazi pokazuju da C2238 / α ANP inducira apoptozu i upalu u VSMC-ima kroz mehanizme ovisne o NPR-C.

Napominjemo, otkrili smo da su ovi mehanizmi posredovani smanjenjem ApoE. Prije svega, analiza sekvenciranja otkrila je da HUVSMC izražavaju ApoE izoformu 2 i 3 (APOE2 / APOE3), dok CASMC izražavaju ApoE izoformu 3 i 4 (APOE3 / APOE4) (dopunska slika 4). Što je još važnije, otkrili smo da je obnavljanje razina ApoE u oba HUVSMC (slika 5a) i CASMC (slika 5b) tretirano CC2238 / α ANP kroz istodobnu egzogenu primjenu odgovarajućeg ApoE rekombinantnog izoforma uspjelo spasiti vitalnost stanica, što je bilo značajno oslabljen samo CC2238 / α ANP u usporedbi s netretiranim stanicama. Primjena ApoE značajno je smanjila i ranu i kasnu apoptozu i nekrozu uzrokovanu CC2238 / α ANP. Pored toga, VSMC pokazali su značajno smanjenje upale pod izlaganjem rekombinantnom ApoE unatoč prisutnosti CC2238 / α ANP (slika 6).

Image

Učinak rekombinantnog ApoE na vitalnost stanica u prisutnosti CC2238 / α ANP i u HUVSMC ( a ) i u CASMCs ( b ) ćelije su istodobno izložene rekombinantnom ApoE i CC2238 / α ANP. Na kraju stimulacije staničnu vitalnost analizirao je FACS. Svaka ploča s slikama prikazuje reprezentativne ploče raspršivanja za svako eksperimentalno stanje (lijeva strana) i odgovarajuću denzitometrijsku analizu (desna strana). Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD Broj neovisnih pokusa = 3 za svaki ApoE izoform. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale točke. CC2238 / α ANP, varijanta α ANP; CTR, kontrola; PI, propidijev jodid; ApoE, apolipoprotein E; CTR, kontrola

Slika pune veličine

Image

Učinak rekombinantnog ApoE na markere upale u prisutnosti CC2238 / α ANP u oba HUVSMC ( a ) i CASMC ( b ). Stanice su istodobno izložene rekombinantnom ApoE i CC2238 / a ANP. Dvadeset i četiri sata nakon završetka stimulacije, ukupni proteini su analizirani na markere upale Western blot-om. ( a ) Reprezentativni zapadni dio Nf- κ B i Smad4, s odgovarajućom denzitometrijskom analizom, u HUVSMC. ( b ) Reprezentativni zapadni dio Nf- κ B i Smad4, s odgovarajućom denzitometrijskom analizom, u CASMC-u. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD Broj neovisnih pokusa = 3 za svaki ApoE izoform. ** P <0, 0001 za CC2238 / α ANP u odnosu na sve ostale točke. CC2238 / α ANP, varijanta α ANP; ApoE, apolipoprotein E; CTR, kontrola

Slika pune veličine

Rasprava

T2238C / α ANP genetska varijanta novi je faktor kardiovaskularnog rizika koji se ne može mijenjati. U stvari, ispitanici koji nose ovu genetsku varijantu imaju veći rizik od pojave kardiovaskularnih nuspojava, poput moždanog udara i infarkta miokarda. Pored toga, ovi ispitanici pokazuju znakove endotelne disfunkcije već u mladoj dobi. Ovdje smo analizirali utjecaj varijante gena T2238C / α ANP na mehanizme povezane sa aterosklerozom. Otkrili smo da C2238 / α ANP značajno smanjuje ekspresiju ApoE gena u VSMCs kroz mehanizme ovisne o NPR-C. Također smo pokazali da C2238 / α ANP ima taj efekt selektivnom epigenetskom regulacijom ApoE koja uključuje Egr-1 i dvije male nekodirajuće RNA (miR199a-3p i miR199a-5p). Najvažnije je da smo pružili dokaze da se štetni učinci izazvani osi C2238 / α ANP – NPR-C u VSMCs, poput povećane stope apoptoze, nekroze i upale, mogu u potpunosti oporaviti rekombinantnim dodavanjem proteina ApoE (Slika 7).

Image

Shematski prikaz putanje koja uključuje NPR-C, Egr-1, miR199a-3p i miR199a-5p na ApoE modulaciji nakon izlaganja CC2238 / α ANP u VSMCs. Pozitivni učinci dodatka ApoE na VSMC, unatoč izloženosti CC2238 / α ANP, podržavaju snažan doprinos ovog puta u promicanju vaskularnog oštećenja kroz konačnu redukciju ApoE. C2238 / α ANP, varijanta α ANP; NPR-C, natriuretski peptidni receptor tipa C; ROS, reaktivne vrste kisika; Egr-1, protein ranog odgovora-1; miR199a, mikroRNA199a; CREG, stanični supresor gena stimuliranog E1A; JNK, c-jun N-terminalna kinaza

Slika pune veličine

Ovi podaci značajno proširuju naše prethodne dokaze koji pokazuju da C2238 / α ANP inducira smrt endotelne ćelije i oksidativni stres, smanjuje angiogenezu i potiče endotelnu disfunkciju kroz dereguliranu aktivaciju signala NPR-C / cAMP i smanjenje puta PKA / Akt / eNOS. 9, 10 Osim toga, nedavno smo otkrili da C2238 / α ANP povećava oksidativni stres i staničnu migraciju i potiče vazokonstrikciju putem signalnog puta NPR-C / cAMP / PKA / CREB / miR21. 11 Trenutna studija pokazuje prvi put izravan utjecaj C2238 / α ANP na mehanizme na kojima ateroskleroza stoji u VSMC-u, ključni element u ovom procesu. Zapravo, C2238 / α ANP inducira značajnu silaznu regulaciju ApoE što igra važnu ulogu u razvoju ateroskleroze. 19, 20 ApoE je protein od 34 kDa koji sudjeluje u mobilizaciji i distribuciji kolesterola i ostalih lipida među raznim tkivima u tijelu. 20 Poznato je da samo nedostatak ApoE potiče razvoj aterosklerotičnih plakova u aorti kod miševa. 21 Prethodne studije pokazale su da ApoE također ima pleiotropne antiaterosklerotske i protuupalne stanične učinke. Prethodno je pronađeno da se ApoE eksprimira u VSMC-ima gdje je sniženje regulacije ApoE pozitivno povezano s tipičnim markerima upale kao što su Smad4 22 i NF- κ B. 23 Osim toga, ApoE koči protuupalne funkcije upalnih stanica. 24 Kod ljudi, gdje je nedostatak ApoE rijedak, rizik od ateroskleroze snažno je povezan s tri uobičajena apoE izoforma reda APOE4> APOE3> APOE2. 20 Nadalje, poznato je da ApoE igra ulogu u razvoju kardiovaskularnih i neuroloških bolesti. 26 Stoga, naša studija može sugerirati da C2238 / α ANP inducira stanične abnormalnosti inhibicijom gore opisanih pleiotropnih učinaka ApoE. Nadalje, budući da su u Apo - / - miševima zabilježene veće razine mieloperoksidaze, 27 možemo pretpostaviti da se C2238 / α ANP može barem djelomično povezati s višim razinama mijeloperoksidaze, kao što je ranije izviješteno u bolesnika s koronarnom arterijom, 4 zahvaljujući njenoj sposobnosti smanjiti ekspresiju gena ApoE.

S druge strane, naši trenutni rezultati pokazuju da divlji tip AN AN može imati fiziološke antiaterosklerotske učinke ureguliranjem razine ApoE. Ovu mogućnost podržavaju prethodni dokazi koji sugeriraju blisku vezu natriuretičkih peptida (NP) i ateroskleroze. U stvari, NP su značajno izraženiji u ljudskim koronarnim eksplantima uznapredovalih aterosklerotskih lezija. 28 Inhibicija razgradnje NP-a inhibitorom NEP-a kandidokatril spriječila je masno naslage na modelu kunića. 29 Cirkulirajuće razine NP povećavaju se paralelno s porastom stenoze koronarnog plaka, dostižući razinu platoa na najvišem stupnju stenoze posuda. 30

Značajno je da je raniji rad pokazao da ateroskleroza raste na životinjskom modelu kojem nedostaju i NPR-A i ApoE (Npr1 - / - ApoE - / - miševi), 31 sugerirajući da nedostatak NPR-A može izazvati rast VSMC putem signalizacije drugih receptora, dakle pojačavaju negativni vaskularni efekti zbog nedostatka ApoE.

Drugi izvorni nalaz naše studije je dokaz da C2238 / α ANP inducira smanjivanje ApoE putem regulacije Egr-1 ovisne o NPR-C. Ovaj učinak je posredovan aktivnošću NADPH oksidaze, budući da je apocinin ukinuo učinke C2238 / α ANP na aktivaciju Egr-1. Koliko znamo, ovo je prvi put da se u vaskularnom kontekstu pokazuje negativna epigenetska regulacija ApoE od strane Egr-1. Ovo otkriće također proširuje prethodne dokaze koji zagovaraju ulogu aktiviranja Egr-1 u razvoju ateroskleroze i može sugerirati da aktivacija Egr-1 može doprinijeti aterosklerozi putem smanjivanja ApoE. Zanimljivo je da je raniji rad pokazao da je ateroskleroza smanjena u dvostrukom nokaut modelu Egr-1 i ApoE miševa, u usporedbi s onim primijećenim samo u ApoE - / - knockout modelu, sugerirajući tako da nedostatak Egr-1 štiti zaštitnu fazu od ApoE. 32 Naša studija proširuje ovaj dokaz pokazujući da Egr-1 može biti uzvodno od ApoE, negativno regulirajući njegovu ekspresiju.

Napominjemo, otkrili smo da aktiviranje Egr-1 pomoću C2238 / α ANP potiče povećanje regulacije miR199a-3p i miR199a-5p, potvrđujući na taj način prethodna otkrića koja pokazuju da Egr-1 regulira miR199a. Ovi podaci sugeriraju da Egr-1 može epigenetski regulirati ApoE kroz ta dva mikroRNA (miRNA). U stvari, Pencheva i sur. 14 su nedavno pokazali da miR199a-3p i miR199a-5p reguliraju stvaranje metastaza melanoma kroz smanjivanje razine ApoE. Autori su otkrili da ove miRNA mogu ili ciljati ApoE izravno ili neizravno inhibirati razine ApoE putem ciljanja DNAJA4, proteina toplinskog šoka koji stimulira razinu ApoE. U skladu s ovim dokazima, također smo otkrili da signalizacija C2238 / α ANP / NPR-C / Egr-1 / miR199a potiče smanjivanje razine DNAJA4.

Važno je da ovi nalazi pojačavaju dostupne dokaze koji razjašnjavaju ulogu miRNA u patogenezi VSMC abnormalnosti i vaskularnih bolesti općenito. U vezi s tim, ranije smo otkrili da disregulacija miR21 doprinosi VSMC derangiranju nakon stimulacije C2238 / α ANP. 11 Nadalje, nađeno je da regulacija miR23b u ozlijeđenoj vaskularnoj stijenci modulira VSMC fenotipsku prebacivanje uključivanjem i SMAD3 i FOXO4. 33 Općenito, ovi dokazi podržavaju saznanje da epigenetski mehanizmi ovisni o miRNA mogu visoko integrirati način regulacije patogeneze ljudskih bolesti.

Prethodne isporuke ljudskog ApoE3 intramuskularnom injekcijom plazmida i adenovirusa, 34 sintetskim apolipoprotein mimetičkim peptidima 35 ili pomoću stanične platforme 36 inhibirale su razvoj aterosklerotičnih lezija. Prvo smo procijenili specifičnu ApoE izoformu izraženu s dvije VSMC linije korištene u našim studijama, o kojima do sada nije bilo izvještaja. Slijedom toga, uočili smo potpunu korist od izlaganja VSMC-a specifičnoj rekombinantnoj ApoE izoformi, unatoč prisutnosti C2238 / α ANP. Pleiotropni učinci ApoE mogu dobro objasniti naše rezultate, budući da je ovaj protein ateroprotektivan ne samo svojim učinkom na smanjenje lipida, već i antioksidacijskim i protuupalnim aktivnostima. 19 Korisni rezultati dobiveni ApoE tretmanom oštećenih VSMC izloženih C2238 / α ANP ukazuju na potencijalnu ključnu ulogu ove molekule u liječenju ateroskleroze kod osoba sa C2238 / α ANP varijantom, mada za kliničku primjenu još uvijek postoji nekoliko ograničenja.

Ukratko, izvještavamo o prvim dokazima novog mehanizma vaskularne bolesti u VSMC-ima posredovanih NPR-C, koji uključuju Egr-1 i dvije male nekodirajuće RNK, što u konačnici vodi do snižavanja regulacije ApoE, u prisutnosti varijante gena C2238 / α ANP, novi čimbenik kardiovaskularnog rizika. Ova novootkrivena kaskada transdukcije doprinosi širokom rasponu štetnih vaskularnih djelovanja zbog C2238 / α ANP koja su u suprotnosti s poznatim korisnim svojstvima divljeg tipa AN ANP. Štoviše, naša nova otkrića otkrivaju nepoznata pleiotropna djelovanja NPR-C u vaskularnim stanicama kroz njegovo sudjelovanje u epigenetskoj regulaciji vaskularnih antiaterosklerotskih proteina, poput apolipoproteina E.

Materijali i metode

Stimulacija HUVSMC-a s TT2238 i CC2238 / α ANP i RNA ekstrakcijom za analizu makrorasta ateroskleroze

Komercijalno dostupni HUVSMC stimulirani su bilo sintetskim divljim tipom (TT2238) ili mutantom (CC2238) / α ANP u konačnoj koncentraciji od 10 9 mol / l tokom 12 h, kao što je prethodno opisano. 9, 10, 11 Kontrolne pločice primile su medij bez ANP-a. Obavljena su tri pokusa. Ukupna RNA, dobivena na kraju stimulacije, korištena je za sintezu cDNA, a zatim i za analizu makroarray-a. Potvrda modulacije ApoE gena i proteina na CC2238 / α ANP i TT2238 / α ANP dobijena je naknadno u neovisnim eksperimentima na HUVSMCs i također u CASMC (broj eksperimenata = 6 za svaku staničnu liniju) pomoću RT-PCR-a, temeljenog na SYBR Green metodologiji, i zapadnjačkim upijanjem ukupnih proteina.

Utjecaj prigušivanja gena NPR-C na modulaciju ApoE gena i proteina na CC2238 / α ANP

Stimulacija HUVSMC i CASMC s CC2238 / α ANP ponovljena je i u prisutnosti i u odsutnosti NPR-C (broj eksperimenata = 6) kako bi se potvrdila uloga ovog receptora u posredovanju učinaka CC2238 / α ANP na ApoE gen i razina proteinske ekspresije, prema našim prethodnim izvješćima. 10, 11

Uloga aktiviranja miRNA199a-3p i miRNA199a-5p ovisna o NPR-C i modulacije ApoE CC2238 / α ANP. Uključivanje Egr-1

Da bi se provjerilo je li poznata epigenetska modulacija ApoE, ovisna o miRNA199a-3p i 199a-5p, 14 igrala ulogu u našem eksperimentalnom kontekstu, ukupna RNA, izvađena iz oba NPR-C nije utihnuta i utihnuta HUVSMCs i CASMC, je pročišćena da se izolira male RNA pomoću komercijalno dostupnog kompleta. Za RT-PCR DNAJA4, korišten je poznati miRNA199a, test 14 ekspresije gena TaqMan. Zatim, na osnovu prethodnog saznanja da su razine ekspresije miRNA199a modulirane s Egr-1, 15, procijenili smo razinu ekspresije proteina Egr-1 ili na TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP zapadnom blottingom. Također smo utvrdili ulogu Egr-1 u ApoE modulaciji pod CC2238 / α ANP dodatnim eksperimentima. Prvo, poznata uloga oksidacijskog stresa na Egr-1 stimulaciju 17 provjerena je izlaganjem VSMCs CC2238 / α ANP kako u odsutnosti tako i u prisutnosti apocinina (broj eksperimenata = 3), slijedeći prethodno opisane uvjete. 9 Razina ekspresije Egr-1 stoga je procijenjena Western blottingom. Potom je određena modulacija i miRNA199a-3p i miRNA199a-5p, DNAJA4 i ApoE u VSMC-ima prigušenih Egr-1 izloženim CC2238 / α ANP (broj eksperimenata = 4).

Procjena eksprimirane kaspaze-3, CREG, JNK, p38MAPK, Nf- k Bp65 i TGF β (Smad4) nivoa ekspresije kao markera apoptoze, nekroze i upale na CC2238 / α ANP i u prisutnosti i u odsustvu NPR-C

Da bi se potvrdilo da li je smanjivanje ekspresije ApoE u našim eksperimentalnim uvjetima povezano, očekivano, s povećanom stopom apoptoze, nekroze i upale, analizirano je 13 ukupnih proteina upotrebom sljedećih specifičnih primarnih antitijela: anti-cijepljena kaspaza-3, anti-CREG, anti-fosfoJNK, anti-JNK, anti-fosfo-p38MAPK, anti-p38MAPK, anti-NF κ Bp65, anti-Smad4, anti- β- aktin. Potonji se koristio kao protein za održavanje. Nakon inkubacije s sekundarnim antitijelom konjugiranim peroksidazom iz hrena, otkriveni su signali kako je opisano u nastavku.

Utjecaj izloženosti rekombinantnom ApoE na vitalnost stanica, apoptozu, nekrozu i upalu u HUVSMC i CASMC u prisutnosti CC2238 / α ANP

Kako bi se testirala sposobnost dodavanja ApoE za spašavanje štetnih učinaka izazvanih CC2238 / α ANP, a na temelju rezultata sekvenciranja specifičnih ApoE izoforma izraženih u dvije stanične linije, HUVSMCs su bili izloženi 12 h CC2238 / α ANP i bilo rekombinantnom ApoE2 ili ApoE3 protein (10 µg / ml; Sigma). CAMSC su bili izloženi CC2238 / α ANP i rekombinantnom ApoE3 ili ApoE4 proteinu (10 μg / ml; Sigma). Rekombinantni proteini za ApoE dodani su u VSMC kao što je prethodno opisano. 37

Dvadeset i četiri sata nakon završetka izloženosti CC2238 / α ANP i specifične rekombinantne ApoE izoformi, brojanje apoptotskih stanica izvršeno je protočnom citometrijskom analizom (FACS), a ukupni proteini su ekstrahirani za Western blot analizu Nf- κ Bp65 i Smad4.

Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka za svaki ApoE izoformu.

Kultura stanica

Komercijalno dostupni HUVSMC-i, kupljeni od ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA), uzgajani su u Kaighnovom mediju F12 koji sadrži 2 mM 1-glutamin, 1, 5 g / l natrijevog bikarbonata i nadopunjen sa 0, 1 mg / ml heparina, 0, 03 mg / ml dodatak za rast endotelnih stanica, 10% goveđi serum fetusa. Komercijalno dostupni CASMC-i (kupljeni od Lonza, Walkersville, MD, SAD) uzgajani su u glatkom mišićnom rastu srednje (2) (SmgM-2; Lonza). Četiri šarže korištene su za svaku staničnu liniju za obavljanje svih pokusa.

Stanice su korištene unutar petog prolaza i pri 70% utoku. Za stimulaciju s TT2238 ili CC2238 / α ANP, sadili su ih u ploče s 24 jažice (8 × 10 4 stanice / jažici), uzgajali u odgovarajućem mediju za rast 24 sata, nakon čega su gladovali i stimulirali s AN ANP u konačnoj koncentraciji od 10 9 mol / l tokom 12 h uz prisustvo 10% fetalnog seruma teleta. Kontrolne pločice primale su medij bez ANP-a.

Ukupna ekstrakcija RNA

Ukupna RNA dobivena je korištenjem reagensa Trizol (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, SAD), podvrgnut tretmanu DNK I (Qiagen, Venlo, Nizozemska) i potom pročišćen pomoću RNeasy Mini Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača. Cjelovitost RNK procijenjena je denaturacijom elektroforeze gela od agaroze, a njena koncentracija provjerena je korištenjem NanoDrop2000c UV-Vis spektrofotometra (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

RT-PCR analiza makronaredbi

Provedena su tri eksperimenta sa svakim podražajem i RNA je sakupljena za analizu makroarray-a. Dva mikrograma ukupne RNA korištena su za sintezu cDNA pomoću RT 2 First Strand Kit (Qiagen). Proveli smo kvantitativnu RT-PCR makroarezu pomoću PCR array za humanu aterosklerozu RT 2 kupljenog od Qiagen-a. Eksperimenti su izvedeni kao što je prethodno opisano. 9 Ukratko, cDNA predložak je pomiješan s onim koji je spreman za upotrebu RT 2 Real-time SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Odabrani niz sadrži ploču od 84 seta prajmera za gene usmjerene na put (ljudska ateroskleroza), pet gena za domaćinstvo i tri kontrole kvalitete RNA i PCR. Smjesa je alikvotirana u svaku jažicu iste ploče koja sadrži predisponirane gensko-specifične sekvence prajmera i PCR je proveden na ViiA 7 PCR sustavu u stvarnom vremenu (Life Technologies). Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Analiza podataka provedena je korištenjem web portala za analizu podataka PCR Array (//www.superarray.-com/pcrarraydataanalysis.php) i ΔΔCt metodom. 38 Rezultati su izraženi kao relativne razine mRNA svakog gena pod učinkom CC2238 ili TT2238 / α ANP koji se odnose na ekspresiju ovog gena u nestimuliranim stanicama (koje su odabrane da predstavljaju 1x ekspresiju svakog gena). Rezultati su smatrani značajnim kada je ekspresija mRNA bila 5 puta veća ili niža od one nestimulirane stanice.

Kvantitativni RT-PCR ApoE, NPR-C, Egr-1 (SYBR Green metodologija)

Dva mikrolita cDNA pomiješana su s 5 μl matične mješavine SYBR Green PCR (Life Technologies) i 0, 5 μl specifičnih primera: ApoE (naprijed 5 '-GAGCAAGCGGTGGAGACAG-3' i reverzno 5 '-CATCAGCGCCCTCAGTTCC-3'); NPR-C (naprijed 5 '-GGAAGACATCGTGCGCAATA-3' i natrag 5'-GATGCTCCGGATGGTGTCA-3 '); Egr-1 (naprijed 5 '-ACCGCAGAGTCTTTTCCTGACA-3' i natrag 5 '-GGTGCAGGCTCCAGGGAAAA-3').

P- aktin je korišten kao gen za održavanje (unaprijed 5 '-GCAAGAGATGGCCACGGCTG-3' i reverzni 5 '-CACAGGACTCCATGCCCAG-3'). RT-PCR je proveden na ViiA 7 PCR sustavu u stvarnom vremenu s biciklističkim uvjetima od 50 ° C u trajanju od 2 minute, 95 ° C u trajanju od 10 minuta, nakon čega je 95 ° C 15 s i 60 ° C tokom 60 s ukupno od 40 ciklusa. Mjerenja su izvršena u tri primjerka u svakom ispitivanju. Rezultati su izraženi kao relativna razina mRNA svakog gena u usporedbi s kontrolnim stanicama.

Kvantitativni RT-PCR miRNA199a-3p, miRNA199a-5p, DNAJA4 (TaqMan metodologija)

Ukupna RNA je pročišćena da izolira male RNA s posebnim kitom (miRNeasy Mini Kit; Qiagen) u skladu s uputama proizvođača. Za sintezu cDNA miR199a-3p, miR199a-5p i kontrolni miRU87, 1 µg pročišćene RNA pomiješa se sa 3 μl kompleta za sintezu cDNA NCode VILO miRNA (Life Technologies) i 1 × RT-primer (Life Technologies) u a ukupni volumen reakcije 20 µl. Reakcija se inkubira 30 minuta na 16 ° C, 30 minuta na 42 ° C i 5 minuta u 85 ° C u termičkom biciklu T-100 (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). Zatim je dodano 2 μl reakcije RT u 1 μl specifičnog TaqMan MicroRNA testa 20 × (miR199a-3p, miR199a-5p, miRU87; Life Technologies) i 10 μl TaqMan Universal PCR Master Mix II s UNG (Life Technologies) u konačnoj zapremini od 20 μl. RT-PCR je proveden pomoću ViiA 7 PCR sustava u stvarnom vremenu s cikličkim uvjetima od 95 ° C u trajanju od 10 minuta, nakon čega slijedi 95 ° C tijekom 15 s i 60 ° C tokom 60 s tokom ukupno 40 ciklusa. Svaka TaqMan analiza vođena je u tri primjerka. Rezultati su izraženi kao relativne razine svake miRNA pod utjecajem različitih tretmana u odnosu na nestimulirane stanice.

Za RT-PCR DNAJA4, 2 μl cDNA pomiješa se sa 10 μl TaqMan Universal Master Mix II s UNG-om i 1 μl DNAJA4 TaqMan gena ekspresije gena (Life Technologies) u konačnom volumenu od 20 μl. P -Aktin korišten je kao gen za održavanje kuće. RT-PCR je proveden pomoću ViiA 7 PCR sustava u stvarnom vremenu s cikličkim uvjetima od 50 ° C u trajanju od 2 minute, 95 ° C u trajanju od 10 minuta, nakon čega je 95 ° C 15 s i 60 ° C 60 s ukupno 40 ciklusa. Svako ispitivanje izvedeno je u tri primjerka. Rezultati su izraženi kao razina mRNA pod utjecajem različitih tretmana u odnosu na nestimulirane stanice.

Ukupna ekstrakcija proteina i zapadnjavanje

Ukupni proteini izvađeni su iz stanica 24 sata nakon završetka izloženosti TT2238 / α ANP ili CC2238 / α ANP. Uzorci su lizirani u 1: 10 težina / volumen u puferu za liziranje (50 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7, 4, 1 mM etilendiaminetetra octene kiseline (EDTA), 1% SDS) sa dodatkom inhibitora proteaze i fosfataze (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, SAD), inkubira se na ledu 15 minuta. centrifugirano na 13 000 okr / min tijekom 15 minuta. Koncentracija proteina određena je DC Protein Assay Kit (Bio-Rad) slijedeći upute proizvođača. Proteinski lizati su kuhani na 95 ° C 5 min u prisutnosti pufera za punjenje gela (Bio-Rad). Pedeset mikrograma svakog uzorka stavljeno je na 10% SDS-poliakrilamidni gel i pokrenuto je 120 min pri 100 V. Proteini su zatim preneseni na polivinilidene difluoridne membrane (PVDF; Bio-Rad) koristeći Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad ). Nespecifična mjesta vezanja blokirana su na sobnoj temperaturi 1 sat u 5% albuminu goveđeg seruma u Tris-puferiranom fiziološkom puferu sa 0, 1% Tween 20 (Sigma) (TBS-T). Membranes were incubated at 4 °C overnight with the following primary antibodies:

anti-ApoE (1 : 1000; Millipore, Temecula, CA, USA), anti-Egr-1 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-phosphoJNK (1 : 200; Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), anti-JNK (1 : 200; Santa Cruz), anti-phospho-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-NF κ Bp65 (1 : 200; Santa Cruz), anti-cleaved caspase-3 (1 : 1000; Cell Signaling), anti-Smad4 (1:1000; Cell Signaling); anti-CREG (1:1000; R&D System, Minneapolis, MN, USA), anti- β -actin (1 : 1000; Santa Cruz).

Following three washes of 10 min in TBS-T, membranes were incubated for 1 h at room temperature with 1 : 5000 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat (for ApoE) or goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies diluted in TBS-T. After three washes of 10 min in TBS-T, signals were revealed with an enhanced chemiluminescence detection system (Luminata Crescendo; Millipore, Darmstadt, Germany) and the immunoreactivity of bands was visualized using ChemiDoc XRS+Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were scanned and quantified densitometrically. They were finally normalized using β-actin levels.

NPR-C and Egr-1 gene silencing

NPR-C and Egr-1 gene silencing was performed with specific siRNAs (Mission siRNA; Sigma) by following conditions previously described. 10, 11 Twenty-four hours after transfection, both silenced and not silenced cells were exposed to CC2238/ α ANP for 12 h and subsequently extracted for total RNA and total proteins. Efficiency of gene silencing was assessed by RT-PCR, following conditions described above.

Role of oxidative stress in the Egr-1 induced increase by CC2238/ α ANP

The known role of oxidative stress on Egr-1 stimulation 17 was verified by exposing VSMCs to CC2238/ α ANP both in the absence and in the presence of apocynin, following conditions previously described. 9 Egr-1 expression levels were therefore assessed by western blotting.

Sequencing of apoE gene expressed in HUVSMCs and CASMCs

Genomic DNA was isolated from both HUVSMCs and CASMCs using a commercially available kit (Qiagen, Chicago, IL, USA). In order to identify the three allelic forms of human ApoE gene (allele ɛ2, ɛ3, ɛ4) PCR reactions were set up by using a specific pair of primers: forward 5′-CTCCCACTGTGCGACACC-3′, reverse 5′-CTGCTCCTTCACCTCGTCC-3′. DNA was first amplified by PCR with 40 cycles at an annealing temperature of 55 °C using a T-100 Thermal Cycler (Bio-Rad). Following purification of the PCR product (562 bp) with MinElute PCR purification kit (Qiagen), sequence reactions were prepared using the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Unincorporated dye terminators from sequencing reactions were removed using DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen). Purified fragments were electrophoresed on an ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol. All sequencing results were compared with those present in the NCBI databases using BLAST to confirm the allelic variants.

Flow-cytometry analysis

Twenty-four hours after completion of exposure to CC2238/ α ANP and the specific recombinant ApoE isoform, counting of apoptotic cells was performed by FACS using Annexin V-Fitc and propidium iodide (PI) staining (ImmunoStep, Salamanca, Spain). For this purpose, cells were harvested by incubation with 1 ml of trypsin/EDTA (Lonza) for 3 min at 37 °C. Trypsinization was stopped by addition of medium and the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 5 min at 4 °C. Each pellet was washed with cold phosphate-buffered saline (PBS 1 × ). Then, tubes were vortexed thoroughly and centrifuged again as before. Cells were gently resuspended and vortexed in binding buffer at a concentration of 3 × 10 6 cells/ml. Then, 100 μ l of cell suspension was added to 5 μ l of Annexin V and 10 μ l of PI. Samples were mixed for 15 min in the dark at 4 °C and 400 μ l of PBS 1x was added to the solution. Ten thousand cells were analyzed by FACS on a BD Accuri C6 flow cytometer (Biosciences, Erembodegem-Dorp, Belgium) to count apoptotic cells. Both negative control (untreated cells) and positive control (cells treated with hydrogen peroxide) were included in the analysis.

Statistička analiza

Continuous variables are expressed as mean±SD Comparisons between two groups were performed using Student's t- test. When the analysis was adjusted for the multiplicity of compared groups, one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test was performed. Normality of variables distribution was tested by the Kolmogorov–Smirnov test. GraphPad Software (San Diego, CA, USA; version 5.0) and SPSS statistical software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA; version 12.0) were used for statistical analysis. P <0, 05 se smatra značajnim.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

Akt

protein kinase B

ApoE

apolipoprotein E

ANP

atrial natriuretic peptide

TT2238/ α ANP

wild-type atrial natriuretic peptide at pos. 2238

CC2238/ α ANP

mutant atrial natriuretic peptide at pos. 2238

kamp

ciklički adenozin monofosfat

CREG

cellular repressor of E1A-stimulated gene

CREB

cAMP responsive element binding protein

DNAJA4

DnaJ (Hsp40) homolog

Egr-1

early growth response protein-1

NOS

endotelna sintaza dušičnog oksida

EDTA

ethylenediaminetetracetic acid

FOXO4

forkhead box O4

FACS

analiza protočne citometrije

JNK

c-jun N-terminalna kinaza

Mirna

mikrornk

NADPH

nikotinamid adenin dinukleotid fosfat-oksidaza

Nf- κB

nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells

NPR-C

type C natriuretic peptide receptor

NPR-A

type A natriuretic peptide receptor

PKA

protein kinaza A

ROS

reaktivne vrste kisika

RT-PCR

real time-polymerase chain reaction

Smad4

mothers against decapentaplegic Homolog 4

TGF

tumor growth factor

VSMC

vaskularna stanica glatkih mišića

HUVSMC

human umbilical vein smooth muscle cell

CASMC

coronary artery smooth muscle cell

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)