Kalumenin-15 olakšava stvaranje filopodije promičući transkripciju tgf-β superfamilije citokina gdf-15 | stanična smrt i bolest

Kalumenin-15 olakšava stvaranje filopodije promičući transkripciju tgf-β superfamilije citokina gdf-15 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • andfilopodia
  • Metastaza
  • Transkripcija

Sažetak

Filopodije, koje su membranski ispupci slični aktinima, imaju važnu ulogu u staničnoj migraciji i metastazama tumora. Ovdje identificiramo 13 novih izoformi kalumenina (Calu) (Calu 3–15) proizvedenih alternativnim spajanjem i nalazimo da Calu-15 potiče stvaranje filopodije i staničnu migraciju. Calu-15 štitnici između jezgre i citoplazme kroz interakciju s uvozinom α , Ran GTPase i Crm1. Fosforilacija treonina u položaju 73 (Thr-73) kazein kinazom 2 (CK2) je bitna za nuklearni uvoz Calu-15, a bilo mutacija Thr-73 ili inhibicija CK2 prekida njegovu nuklearnu lokalizaciju. U jezgri, Calu-15 povećava transkripciju faktora diferencijacije rasta-15 (GDF-15), člana transformiranog faktora rasta -P (TGF- β ) super-porodice, vezanjem na promotorno područje. Nadalje, Calu-15 inducira stvaranje filopodija posredovanih s GDF-15. Zajedno, prepoznajemo da Calu-15, nova izoforma Calu-a s nuklearnom lokalizacijom ovisnom o fosforilaciji, ima ključnu ulogu u promicanju stvaranja filopodije i staničnih migracija ureguliranjem transkripcije GDF-15.

Glavni

Filopodije, koje su projekcije na prstima potpomognute čvrsto paralelno vezanim vlaknastim aktinom, uključene su u mnoge ključne fiziološke i patološke procese, 1, 2, 3, dok se za obilne filopodije smatra da su u korelaciji s pojačanom migracijom stanica i metastazama tumora. 3, 4, 5 Filopodija sadrži receptore za različite izvanstanične signale, uključujući citokine i čimbenike rasta, kako bi se osjetilo okruženje stanice tijekom migracije stanica, zatim pokrenulo formiranje početnih mjesta adhezije, regrutovanje žarišta adhezije i konačno reorganizacija actin mreža. Zabilježeno je da 3, 6, 7, 8 transformirajući faktor rasta -P (TGF- β ), citokin, inducira ekspresiju paksilina, komponente žarišta adhezijskog kompleksa i fascina, proteina koji veže vlakna aktina, što zauzvrat potiče stvaranje filopodije i staničnu migraciju. 4, 7 Stoga, TGF- β i fascin se pojavljuju kao potencijalni ciljevi za terapiju raka. 4, 9

Faktor diferencijacije rasta-15 (GDF-15) član je TGF- β proteklih obitelji. 10, 11 Poznat je i kao inhibitor makrofaga citokin-1, faktor koji proistječe iz prostate, morfogenetski protein placente kosti, nesteroidni protuupalni gen aktiviran protuupalnim lijekom i placentni TGF- β . 10, 11 Slično drugim članovima super-obitelji TGF- β , GDF-15 se najprije sintetizira kao pro-protein, a zatim se cijepi i izlučuje u svom aktivnom zrelom obliku. 12 Zabilježeno je da ima uloge u vrstama staničnih procesa kao što su stanična proliferacija, migracija, diferencijacija i apoptoza. 13, 14, 15, 16, 17 GDF-15 ima i anti- i pro-tumorigenske funkcije u skladu s različitim tipovima stanica i različitim razvojnim stadijima tumora. 13, 17, 18 Visoka razina GDF-15 u serumu povezana je s lošim preživljavanjem bolesnika u kolorektalnom karcinomu i karcinomu prostate, 19, 20, a razina GDF-15 također se bilježi da raste tijekom prijelaza kolonične lezije na inicijacija raka. 19 Međutim, postoje i dokazi da prekomjerna ekspresija GDF-15 inducira apoptozu stanica karcinoma dojke i inhibira tumorsku sposobnost LN-Z308 stanične linije glioblastoma. 21, 22 Stoga je otkrivanje molekularnih mehanizama koji reguliraju GDF-15 ključna točka za razumijevanje i liječenje zloćudnog tumora.

Kalumenin (Calu) pripada obitelji CREC proteina, koja se sastoji od Cab45, retikulokalbin-1, retikulokalbin-2 (poznat i kao ERC-55), retikulokalbin-3 i Calu. 23, 24 Ovi proteini sadrže više domena EF-ruku i kodiraju ih pet gena. 23, 24 Zanimljivo je da većina ovih gena proizvodi izoforme alternativnim spajanjem mRNA i ti izoformi obično imaju različite subcelularne lokalizacije i fiziološke funkcije. 23, 24 Izvješteno je da gen CALU proizvodi dvije izoforme, Calu-1 i Calu-2 (poznate i kao crocalbin), 25, 26 jednake duljine (315 aminokiselina (aa)), pri čemu su izmjenjeni samo eksoni 3 i 4. 23 Nedavno, standardni test razgradnje Edmana pokazao je da i Calu-1 i Calu-2 posjeduju signalni peptid N-terminala (19 aa), 27 što dovodi do njihove translokacije u ER ili Golgi lumen. 28 Funkcionalno, Calu-1 i Calu-2 reguliraju aktivnost γ -karboksilacije ovisnu o vitaminu K 29 i sudjeluju u cikličkom ciklusu interakcijom s rjanodin receptorom-1 i ER Ca2 + -ATPase SERCA2. 30, 31

Ovdje smo se odlučili utvrditi postoje li druge Calu izoforme i identificirati da CALU gen stvara 13 novih izoforma (nazvanih Calu 3–15) alternativnim spajanjem, pri čemu samo jedan od njih, Calu-15, ima nuklearnu lokalizaciju. Calu-15 prekriva između jezgre i citoplazme, a taj se proces regulira njegovom fosforilacijom. Funkcionalno, Calu-15 povećava razinu transkripcije GDF-15 u jezgri, što pak inducira stvaranje filopodije i potiče migraciju stanica.

Rezultati

Identifikacija Calu izoforma i njihovih subcelularnih lokalizacija

Da bismo pretražili više alternativno spojenih izoforma CALU gena, dizajnirali smo par primera lokaliziranih u prvom i posljednjem egzonu (dopunska slika S1a), te obavili PCR analizu. Iz cDNA HeLa ćelija je amplificirano nekoliko pojasa (dopunska slika S1b), a 13 novih inačica spajanja identificirano je sekvenciranjem. Nazvali smo ove 13 novih inačica Calu 3–15 (pristupni broj GenBank: HM002604 – HM002616; Slika 1a).

Image

Petnaest izoforma kalumen (Calu) i njihove subcelularne lokalizacije. ( a ) Shematska slika prikazuje egzonsku organizaciju 15 Calu izoforma koje kodira CALU gen. Broj na vrhu slike je exon broj. Crne regije predstavljaju kodirajuću sekvencu, bijele regije predstavljaju neprevedeni slijed mRNA. ( b ) Subcelularne lokalizacije pojačanih fuzijskih proteina zelenog fluorescentnog proteina (EGFP) Calu izoforma (zeleno). GRIP1-mRFP (crveno) označava Golgijev aparat. Bar, 10 µm

Slika pune veličine

Prethodna izvješća pokazala su da Calu-1 i Calu-2 imaju osam egzona s duljinom mRNA od ∼ 3, 4 kb. 25, 26 Kada smo usporedili egzonsku organizaciju ovih izoforma, otkrili smo da Calu-3 i Calu-4 posjeduju novi egzon (egzon 2 na slici 1a), što dovodi do povećanja duljine mRNA na to 4, 2 kb. Pored toga, Calu-3 i Calu-4 imali su dodatnih 8 aa na N-kraju u usporedbi s Calu-1 i Calu-2 (dopunska slika S1c). Kako su N-terminal 19 aa Calu-1 i Calu-2 signalni peptid, 27, 28, ispitali smo je li dodatnih 8 aa prekinuo ovaj signal. Fluorescentna analiza pokazala je da su Calu-3-EGFP i Calu-4-EGFP također kolokalizirani s GRIP1-mRFP, markerom Golgijeva aparata, sličnim Calu-1-EGFP i Calu-2-EGFP (slika 1b). Nadalje, EGFP fuzija s N-terminalom 27 aa (8 + 19 aa) Calu-3 i Calu-4 također je kolokalizirana s GRIP1-mRFP (dopunska slika S1d). Ovi rezultati sugeriraju da N-terminal 27 aa Calu-3 i Calu-4 i dalje djeluju kao signalni peptid.

Također smo utvrdili subcelularne raspodjele ostalih identificiranih izoforma pretjeranim ekspresijom njihovih EGFP fuzijskih proteina u stanicama HeLa. Otkrili smo da samo Calu-15 nedostaje signalni peptid i pokazuju nuklearnu akumulaciju (Slika 1b). Zajedno, CALU gen kodira 15 izoformi, a samo Calu-15 nedostaje N-terminalni signalni peptid i pokazuje nuklearnu lokalizaciju.

Calu-15 štitnici između jezgre i citoplazme, posredovani uvozom- α , Ran GTPase i Crm1

Da bismo potvrdili da Calu-15 pokazuje nuklearnu lokalizaciju, označili smo je s 2 × EGFP i utvrdili da je Calu-15–2 × EGFP također lokaliziran u jezgri (Slika 2a). Dosljedno, Kalu-15 je obilježen s β -Gal-EGFP također lokaliziran u jezgri, dok kontrolni β -Gal-EGFP nije (dopunska slika S2). Dakle, Calu-15 je u stanju povući 2 × EGFP i β -Gal-EGFP u jezgru.

Image

Calumenin (Calu) -15 štitnjača između jezgre i citoplazme, posredovanih importin- α , Ran GTPase i Crm1. ( a ) Subcelularna lokalizacija Calu-15-2 × pojačanog fuzijskog proteina zelenog fluorescentnog proteina (EGFP) (zeleni). Nuklearna DNA obojena je s DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; plava boja). Bar, 10 µm. Gornja ploča prikazuje arhitekturu domene Calu-15–2 × EGFP. ( b ) Imunoprecipitacija (IP) s antitijelom protiv EGFP izvedena je u lizatima HEK293T stanica koje eksprimiraju Calu-15-EGFP, nakon čega slijedi imunobloting (Western blotting (WB)) s antitijelom protiv Calu-1/2 (calu). Antitijelo protiv EGFP (EGFP) kao pozitivna kontrola. IgG kao negativna kontrola. ( c ) Imunobloting (WB) endogenog Calu-15 u citoplazmatskoj i nuklearnoj frakciji iz HeLa stanica. Zvezdice označavaju pojas Calu-1/2 ili Calu-15. Tubulin i lamin označavaju citoplazmatsku i nuklearnu frakciju. ( d ) IP s antitijelom protiv EGFP-a proveden je u lizatima HEK293T stanica koje eksprimiraju Calu-15-EGFP ili EGFP, nakon čega slijedi imunobloting (WB) s naznačenim antitijelima. ( e ) HeLa stanice koje su kotransficirane s Calu-15-2 × EGFP i RanQ69L-mRFP su tretirane s (desna ploča) ili bez (lijeva ploča) leptomicin B (LMB) 3 h, zatim fiksirane za promatranje. Nuklearna DNK obojena je DAPI (plava boja). Bar, 10 µm

Slika pune veličine

Da bismo odredili subcelularnu lokalizaciju endogenog Calu-15, koristili smo antitijelo protiv Calu-1 i Calu-2, koje je također moglo prepoznati prekomjerno eksprimirani Calu-15-EGFP slično kao EGFP antitijelo (Slika 2b). Pomoću ovog antitijela analizirali smo proteine ​​nuklearne i citoplazmatske frakcije izvađeni iz HeLa stanica zapadnim blotmanom i otkrili da su Calu-1 i Calu-2 u citoplazmatskoj frakciji koja sadrži tubulin, dok je Calu-15 uglavnom otkriven u nuklearnoj frakciji zajedno s laminarkom nuklearnog markera (slika 2c).

Nakon što smo potvrdili da je Calu-15 lokaliziran u jezgri, slijedili smo istražiti je li klasičnim putem trebalo ući u jezgro. Izvršili smo eksperimente imunoprecipitacije i otkrili smo da je Calu-15 povezan s uvozinom- α (slika 2d), bjelančevinama koji sudjeluju u procesu ulaska u nuklearni pogon. 32, 33 Osim toga, imunoprecipitacija pokazala je da Calu-15 također komunicira s Ran GTPase-om (slika 2d), za kojeg se navodi da razdvaja kompleks uvoza-tereta i da je potreban za nuklearni uvozni postupak. 33, 34 Štoviše, kotransfekcija s RanQ69L, koji je mutant oštećen u aktivnosti GTPaze, 35, u velikoj mjeri inhibira nuklearnu lokalizaciju Calu-15 (slika 2e). Stoga je postupak uvoza nuklearne tvari Calu-15 posredovan importin- a, a regulirao ga Ran GTPase.

Zanimljivo je da je Calu-15 također komunicirao s proteinom Exportin Crm1 (slika 2d), za kojeg se izvješćuje da posreduje nukleocitoplazmatski transport. 33, 36 Stoga je razumna hipoteza da bi se Calu-15 mogao izvesti iz jezgre stazom ovisnom o Crm1. Da bismo to testirali, koristili smo leptomicin B (LMB), malu molekulu koja ometa vezivanje Crml-tereta, 37 za suzbijanje izvoza nuklearnog izvoza o Crm1. U stanicama koje su prekomjerno izražavale Calu-15–2 × EGFP zbog visoke razine nuklearne akumulacije, liječenje LMB-om nije moglo povećati nuklearnu akumulaciju Calu-15 (slika 2e). Međutim, u prisutnosti RanQ69L, LMB tretman očito je inducirao Calu-15 da se lokalizira u jezgri (Slika 2e). Stoga se Calu-15 može probiti između jezgre i citoplazme, a to posreduje importin- α , Ran GTPase i Crm1.

Nuklearna lokalizacija Calu-15 ovisi o fosforilaciji u Thr-73 pomoću CK2

S obzirom da fosforilacija može regulirati nuklearno-citoplazmatski propadanje proteina, 38, 39, analizirali smo aminokiselinsku sekvencu Calu-15 pomoću alata za bioinformatiku 40 i otkrili da treonin u položaju 73 (Thr-73) može biti fosforiliran kazein kinazom 2 (CK2). Ovaj nalaz potaknuo nas je da istražimo ima li ovo mjesto ulogu u nuklearno-citoplazmatskom protjerivanju Calu-15. Mutirali smo ovu aminokiselinu na alanin (T73A) i glutaminsku kiselinu (T73E) da oponašamo nefosforilirano i fosforilirano stanje, te ispitali njihove subcelularne lokalizacije. Da bismo odredili uzorak lokalizacije, svrstali smo ga u tri vrste: (1) stanice s pretežno nuklearnom lokalizacijom fuzijskog proteina EGFP (N> C); (2) s nuklearnom i citoplazmatskom lokalizacijom ( N = C); i (3) s pretežno citoplazmatskom lokalizacijom (NC), Calu-15-T73A nije pokazao nuklearnu lokalizaciju (0% N> C), dok nije opažena značajna razlika između vrste Calu-15-T73E i divljeg tipa (slika 3a, P = 1.41 × 10 -33 i P = 0.10, respektivno). Stoga ovi rezultati sugeriraju da je fosforilacija Calu-15 u Thr-73 povezana s njegovom nuklearnom lokalizacijom.

Image

Kazein kinaza 2 (CK2) fosforilira kalumenin (Calu) -15 u treoninu u položaju 73 (Thr-73) i olakšava njegovu nuklearnu lokalizaciju. ( a ) Subcelularna lokalizacija Calu-15 divljeg tipa (WT), T73A ili T73E. Lijeve ploče, reprezentativne slike. Nuklearna DNA obojena je s DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; plava boja). Bar, 10 µm. Desna ploča, graf prikazuje postotak stanica s pretežno nuklearnim (N> C), nuklearnim i citoplazmatskim (N = C) ili pretežno citoplazmatskim (N b ) lizati stanica HEK293T koji eksprimiraju Calu-15–2 × EGFP WT ili T73A mutante (gornja ploča) i lizati HEK293T stanica koje izražavaju Calu-15–2 × EGFP tretirane dimetilsulfoksidom (DMSO) ili 4, 5, 6, 7-tetrabromo-2-azabenzimidazol (TBB; donja ploča) razdvojen je Phos-tag SDS-poliakrilamid gel elektroforezom, a zatim imunoblotiran antitijelom protiv EGFP. Strelice označavaju fosforilirani oblik. ( c ) HeLa stanice transficirane s Calu-15-2 × EGFP WT ili T73E mutantom su tretirane DMSO ili TBB 10 sati nakon transfekcije, a zatim fiksirane za promatranje. Lijeve ploče, reprezentativne slike. Nuklearna DNK obojena je DAPI (plava boja). Bar, 10 µm. Na desnoj ploči grafikoni pokazuju postotak ćelija s različitim obrascima lokalizacije ( n = 3;> 50 stanica po eksperimentu). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001; ns, nema značajne razlike (test tablice za slučaj slučajnosti za neovisnost). ( d ) HeLa stanice transficirane s Calu-15-2 × EGFP WT, T73A ili T73E tretirane su sa ili bez leptomicina B (LMB) prije fiksacije i promatranja. Nuklearna DNK obojena je DAPI (plava boja). Bar, 10 µm. Grafikoni prikazuju postotak stanica s različitim obrascima lokalizacije ( n = 3;> 50 stanica po pokusu). Podaci su srednji ± SEM; ns, nema značajne razlike (test tablice za slučaj slučajnosti za neovisnost)

Slika pune veličine

Da bismo potvrdili da je Calu-15 fosforiliran u Thr-73, upotrijebili smo SDS-PAGE s 50 µM Phos-akrilamidom, u kojem fosforilirane trake migriraju sporije. 41 Otkrivena fosforilirana traka Calu-15 otkrivena je u divljom tipu, dok je ovaj pojas gotovo nestao u mutantu Calu-15-T73A (slika 3b). Zatim, kako bismo utvrdili je li CK2 fosforilira Thr-73 iz Calu-15 i utječe li na njegovu nuklearnu lokalizaciju, upotrijebili smo 4, 5, 6, 7-tetrabromo-2-azabenzimidazol (TBB) da specifično inhibira aktivnost CK2 42 odmah nakon transfekcija Calu-15–2 × EGFP. Tretmanom TBB-a smanjena je razina fosforilacije Calu-15 (slika 3b), a nuklearna lokalizacija Calu-15 također je značajno prekinuta (sa 75, 3% na 32, 3% N> C) nakon 10 h liječenja TBB-om (Slika 3c, P = 5, 27 × 10-10 ). Međutim, liječenje TBB nije promijenilo subcelularnu lokalizaciju mutanta Calu-15-T73E (slika 3c, P = 0, 78), sugerirajući da CK2 promiče nuklearnu lokalizaciju Calu-15 putem fosforilacije u Thr-73. Kako je gubitak fosforilacije u Thr-73 doveo do nuklearne lokalizacije Calu-15 (slika 3a), tada smo ispitali je li to zbog smanjenja uvoza nuklearnog plina ili povećanja postupka izvoza nuklearnog izvoza. Liječenje inhibitorom nuklearnog izvoza LMB nije moglo povećati nuklearnu lokalizaciju Calu-15-T73A (slika 3d, P = 0, 84), sugerirajući da razlog zašto mutant Calu-15-T73A nije pokazao nuklearnu lokalizaciju nije povećanje nuklearni izvoz. Zajedno zaključujemo da je fosforilacija Calu-15 u Thr-73 CK2 neophodna za njegovu nuklearnu lokalizaciju.

Calu-15 promovira GDF-15 transkripciju

Kako bismo otkrili fiziološku funkciju Calu-15 u jezgri, ispitali smo razine transkripcije skupine gena (slika 4a). Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu pokazala je da se razina mRNA GDF-15 značajno povećala u HeLa staničnoj liniji stabilno eksprimirajući Calu-15-EGFP (Slika 4a, P = 6, 85 × 10 −6 i Dodatna slika S3). U skladu s tim, razina proteina GDF-15 povećana je i kod prekomjernog ekspresije Calu-15–2 × EGFP-a, što je otkriveno zapadnim mrljanjem (Slika 4b, P = 0, 0006).

Image

Kalumenin (Calu) -15 potiče transkripciju faktora diferencijacije rasta-15 (GDF-15). ( a ) Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu relativnih razina ekspresije mRNA navedenih gena u stanicama HeLa koja stabilno eksprimiraju Calu-15-EGFP ( n = 3). ABHD2, a- / β- hidrolazna domena koja sadrži protein 2; NELL2, neuralni epidermalni faktor rasta 2; ITPR1, inozitol 1, 4, 5-trifosfatni receptor, tip 1; PML, promeelocitna leukemija; EGFP, kao kontrola. Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( b ) Lizati stanica HEK293T koji eksprimiraju Calu-15-2 × EGFP ili 2 × EGFP imunoblotirani su (zapadni blotting (WB)) s naznačenim antitijelima. Desna ploča, graf prikazuje relativnu razinu proteina GDF-15 ( n = 4). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( c ) Analiza promotora aktivnosti GDF-15 dvostrukim luciferaznim izvještačem. Lijeva ploča prikazuje shematske strukture plazmida različitih duljina promotora GDF-15, a slijedi gen luciferaze. Desni graf označava relativnu aktivnost luciferaze u stanicama Calu-15-EGFP prekomjerne ekspresije HeLa transfektiranim naznačenim plazmidima ( n = 4). EGFP, kao kontrola. Podaci su srednji ± SEM; ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 (neparni dvostruki studentov t- test). ( d ) Test imunoprecipitacije kromatinom (ChIP) za HeLa stanice koje eksprimiraju Calu-15-EGFP ili EGFP. ( e ) Kvantifikacija aktivnosti promotora GDF-15 u stanicama HeLa koja eksprimira Calu-15-2 × EGFP divljeg tipa (WT), T73A ili T73E ( n = 3). Podaci su srednji ± SEM; * P < 0, 05 (neparni dvoredni t -test učenika)

Slika pune veličine

Da bismo istražili da li Calu-15 mijenja razinu ekspresije GDF-15 kroz interakciju s njegovim promotorom, izveli smo reporterski test s dual-luciferazom i otkrili da je pod kontrolom promotora GDF-15 (1 kb) relativna aktivnost luciferaze u velikoj mjeri povećana u stanicama koje izražavaju Calu-15-EGFP (Slika 4c, P = 3, 67 × 10-3 ). Daljnja analiza pokazala je da je samo 200-bp regije promotora GDF-15 bilo dovoljno (Slika 4c, P = 1, 13 × 10 –3 ). Štoviše, ChIP test potvrdio je interakciju između Calu-15 i promotora GDF-15 (slika 4d). Da bismo dodatno potvrdili naša otkrića, pokazali smo da nefosforilacijski imitirajući mutant T73A, s uzorkom lokalizacije citoplazme, nije dovoljan za povećanje relativne aktivnosti luciferaze, koja je bila pod nadzorom 200-bp regije promotora GDF-15, dok je i divlji tip i fosforilacijski mimitirani mutant T73E mogli su (Slika 4e, P = 0, 0337). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da nuklearni Calu-15 regulira transkripciju GDF-15 putem vezanja na svoju promotorsku regiju.

Calu-15 olakšava stvaranje filopodija putem staze posredovane s GDF-15

Zanimljivo je da smo otkrili da prekomjerna ekspresija Calu-15-EGFP potiče migraciju stanica u ispitivanju zacjeljivanja rana (slika 5a i dodatna slika S4). Osim toga, Calu-15 je također značajno povećao broj i veličinu filopodija (Slika 5b, P = 9, 59 × 10 –5 ), što olakšava migraciju stanica putem visoko aktivnog preuređenja aktina. 13 Prema tome, fosforilacijski mimitirani mutant T73E također je inducirao stvaranje filopodije, dok je nefosforilacijski mitivni mutant T73A propao (slika 5c, P = 1, 46 × 10 –5, P = 5, 03 × 10 −6 i P = 3, 84 × 10 −5, respektivno), Sva su ta opažanja u skladu s prijašnjim izvještajima da je GDF-15 uključen u regulaciju stanične migracije. 13 Uzimajući u obzir da je GDF-15 citokin i izlučuje se u vanćelijskom prostoru, testirali smo kondicionirani medij iz Calu-15–2 × EGFP-ekspresionirajućih HEK293T stanica i također je inducirana tvorba filopodije (Slika 5d, P = 1, 38 × 10–4 ). Nadalje, srušili smo GDF-15 u Calu-15-2 × EGFP prekomjerno eksprimirajućim HeLa stanicama i otkrili smo da iscrpljivanje GDF-15 inhibira funkciju Calu-15 na formaciju filopodije (Slika 5f, P = 9, 20 × 10–4 ). Skupno, ovi podaci sugeriraju da Calu-15 može izazvati stvaranje filopodije putem GDF-15, što zauzvrat potiče migraciju stanica.

Image

Kalumenin (Calu) -15 potiče migraciju stanica i olakšava stvaranje filopodija na putu ovisnog o faktoru rasta-15 (GDF-15). ( a ) Veličine rana HeLa stanica koje izražavaju Calu-15-EGFP ili EGFP u naznačenim vremenskim točkama ( n = 3). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( b ) HeLa stanice transficirane s Calu-15-2 × EGFP ili 2 × EGFP obojene su s Atto 565 faloidinom kako bi se prikazala lokalizacija i distribucija filamentog (F) -aktina. Lijeva ploča, reprezentativne slike. Bar, 10 µm. Desna ploča, graf prikazuje postotak stanica s filopodijama ( n = 3;> 100 stanica po pokusu). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( c ) HeLa stanice transficirane s Calu-15-2 × EGFP divljeg tipa (WT), T73A ili T73E obojene su s Atto 565 faloidinom. Lijeva ploča, reprezentativne slike. Bar, 10 µm. Desna ploča, graf prikazuje postotak stanica s filopodijama ( n = 3;> 100 stanica po pokusu). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( d ) Kondicionirani medij prikupljen iz HEK293T stanica transfektiranih s Calu-15-2 × EGFP ili 2 × EGFP dodan je u kulture HeLa stanica, a zatim su HeLa stanice obojene Atto 565 faloidinom. Lijeva ploča, reprezentativne slike. Bar, 10 µm. Desna ploča, graf prikazuje postotak stanica s filopodijama ( n = 3;> 100 stanica po pokusu). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( e ) 48 sati nakon transferacije gDF-15 shRNA, razina proteina GDF-15-EGFP u stanicama HEK293T ispitana je imunoblotingom (Western blotting (WB)). NC, negativna kontrola; 88, 91 i 92 označavaju GDF-15 shRNA s različitim ciljnim nizovima; Bazen, mješavina GDF-15 shRNA 88, 91 i 92. ( f ) 48 sati nakon kotransfekcije s bazenom šRNA Calu-15-2 × EGFP i GDF-15 (bazen, donje ploče) ili NC shRNA (gornji paneli ), HeLa stanice obojene su s Atto 565 faloidinom. Lijeva ploča, reprezentativne slike. Bar, 10 µm. Desna ploča, graf prikazuje postotak stanica s filopodijama ( n = 3;> 100 stanica po pokusu). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). ( g ) Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu relativnih razina ekspresije mRNA Calu-15 i GDF-15 u stanicama raka SW480 i SW620 ( n = 5). Podaci su srednji ± SEM; *** P < 0, 001 (neparni dvostrani t-test učenika). Za b, c, d i f, za kvantificiranje broja stanica s filopodijama, stanice su ocijenjene pozitivnim kada su prikazane duljine najmanje 10 filopodija ≥4 μm

Slika pune veličine

Da bismo dodatno potvrdili povezanost između Calu-15, GDF-15 i tumorskog metastatskog potencijala, izvršili smo kvantitativnu PCR analizu u stvarnom vremenu u staničnoj liniji kolorektalnog karcinoma SW480 i SW620, koje su bile od istog pacijenta. U usporedbi s primarnim klonom SW480, SW620 koji je nastao iz metastatskog limfnog čvora pokazuje veći metastatski potencijal tumora. 43, 44 Dosljedno tome, i razina mRNA Calu-15 i GDF-15 značajno je povećana u stanicama SW620 (Slika 5g, P = 2, 25 × 10 -7 i P = 5, 13 × 10-14, respektivno), što sugerira značajnu povezanost između Calu-a -15, GDF-15 i tumor metastatski potencijal.

Rasprava

U ovom istraživanju otkrili smo da gen CALU kodira 13 novih izoforma osim Calu-1 i Calu-2. Među njima, samo Calu-15 pokazuje nuklearnu lokalizaciju. Pokazujemo da Calu-15 fosforilira u Thr-73 pomoću CK2, a zatim ulazi u jezgru radi promicanja transkripcije GDF-15 vezanjem na njegov promotor, što rezultira pojačanom tvorbom filopodije i staničnom migracijom (Slika 6). Nadalje, ulazak Calu-15 u jezgru posreduje importin- a i Ran GTPase, dok njegov izvoz iz jezgre posreduje Crm1.

Image

Predloženi radni model kalumenina (Calu) -15. Kalu-15 se podvrgava fosforilaciji treonina na položaju 73 (Thr-73) kazein kinazom 2 (CK2), a zatim pospješuje ulazak u jezgru. U jezgri, Calu-15 može aktivirati transkripciju faktora diferencijacije rasta-15 (GDF-15) vezanjem na njegovu promotorsku regiju, a zatim dovodi do stvaranja filopodija, što zauzvrat potiče migraciju stanica

Slika pune veličine

Jedan gen može proizvesti više od jedne izoforme kako bi funkcioniralo slično ili različito. 23 Naši rezultati pokazuju da CALU gen stvara 15 izoforma u ljudskim stanicama alternativnim spajanjem, dok je 13 identificirano prvi put. Među tih 15 izoforma, Calu 1–14 svi posjeduju signalni peptid s N-terminala i mogu se lokalizirati u lumenu endomembranskog sustava. Međutim, samo Calu-15, kojem nedostaje N-terminal 151 aa, pokazuje nuklearnu akumulaciju i ima nove funkcije kao regulator transkripcije. Zanimljivo je da homologni gen Drosophila melanogaster , SCF , također kodira nuklearnu izoformu DmSCF (DNK faktor prekrivanja) alternativnim spajanjem. 45 Stoga sugerira da je proizvodnja nuklearne izoforme gena CALU evolucijski sačuvana i da ima značajnu fiziološku funkciju.

U eukariotskim stanicama nuklearni receptor za uvoz kao što su importin- a i β prepoznaju signal nuklearne lokalizacije (NLS) proteina i tada s njima tvore uvozni kompleks za ulazak u jezgro, 33 dok izvozini poput Crm1 prepoznaju signal izvoza nuklearnog izvoza (NSZ) i formiraju izvozni kompleks za izlaz. 33, 36 U našem eksperimentu, Calu-15 surađuje s uvozom- α i Crm1. Međutim, nismo identificirali nijedan klasični NLS i NES u Calu-15, što sugerira da mogu postojati drugi proteini koji mogu posredovati u njegovom nuklearno-citoplazmatskom propadanju ili da Calu-15 sadrži neklasične NLS i NES. Osim toga, pokazujemo da je fosforilacija Calu-15 kod Thr-73 CK2 neophodna za njezinu nuklearnu lokalizaciju, što je slično nedavnim izvješćima da se nuklearno-citoplazmatski prebacivanje može regulirati modifikacijom proteina poput fosforilacije i defosforilacije. 38, 39 CK2 je izvijestio da regulira nuklearni izvoz S6K1 II, 46, ali u našoj studiji on djeluje kao regulator za olakšavanje nuklearnog uvoza Calu-15. Ipak, još uvijek ne znamo da li fosforilacija u Thr-73 olakšava vezanje Calu-15 izravno na importin- a ili na neke druge proteine ​​skele. Detaljniji mehanizam treba daljnju istragu.

GDF-15 djeluje kao citokin, sudjelujući u različitim staničnim procesima. 13, 14, 15, 16, 17 U međuvremenu, on ima pleiotropne funkcije u progresiji raka. 17 Zbog svoje važnosti, razina transkripcije GDF-15 pod strogom je kontrolom različitih regulatornih putova. Za mnoge faktore transkripcije objavljeno je da reguliraju njegovu ekspresiju, kao što su p53, protein ranog odgovora 1 (EGR-1), Sp1, nuklearni faktor-B, poli (ADP-riboza) polimeraza-1 i faktor-induciran hipoksijom - 1 α . 14, 47, 48, 49, 50, 51 Naši rezultati pokazuju da se Calu-15, kao novi regulator GDF-15, veže na promocijsko područje GDF-15, a naši preliminarni podaci sugeriraju da bi za to mogli biti potrebni i drugi faktori. vezivanje (podaci nisu prikazani). Područje vezivanja Calu-15 za GDF-15 identificirali smo raspone od -168 do +32 bp oko početnog mjesta transkripcije, gdje također sadrži jedan p53- (pri +21 bp), tri Sp1- (unutar −133 do +41 bp) i dva mjesta vezivanja EGR-1- (unutar -73 do -51 bp). 21, 47, 48 Da li Calu-15 djeluje koordinirano s njima u svrhu promicanja ekspresije GDF-15 ostaje nejasno, međutim, očito je da je ovo 200-bp područje promotora GDF-15 ključno za njegovu transkripciju. Pored toga, ne isključujemo mogućnost da Calu-15 regulira transkripcijske aktivnosti drugih gena.

Za GDF-15 objavljeno je da potiče stvaranje filopodije i metastaze stanica raka prostate kod ljudi putem signalnog puta žarišne adhezijske kinaze (FAK) -RhoA. 13 Ovdje pokazujemo da Calu-15 funkcionalno potiče migraciju stanica olakšavajući stvaranje filopodija, a ova funkcija ovisi o GDF-15. Stoga bi buduće istraživanje da bismo istražili da li Calu-15 također potiče stvaranje filopodije putem signalnog puta FAK-RhoA moglo olakšati naše razumijevanje detaljnog mehanizma. Osim toga, funkcija GDF-15 u progresiji tumora je višestruka, ali regulatorni mehanizam GDF-15 u stanicama karcinoma još uvijek nije u potpunosti razumljiv, dok je za tumorske stanice s obilnom filopodijom utvrđeno da su više zloćudne i invazivne tijekom progresije tumora. 3, 4, 5 Uzimajući u obzir dvije gore spomenute činjenice, Calu-15, kao novi regulator GDF-15, mogao bi imati pro-tumorsku ulogu u razvoju raka i poslužiti kao nova meta terapije raka.

primki

GenBank / EMBL / DDBJ

  • HM002604-HM002616

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

Calu

calumenin

Čip

kromatinska imunoprecipitacija

CK2

kazein kinaza 2

EGR-1

protein ranog odgovora 1

FAK

kinaza žarišne adhezije

GDF-15

faktor diferencijacije rasta-15

LMB

leptomicin B

NLS

signal nuklearne lokalizacije

NES

nuklearni izvozni signal

TBB

4, 5, 6, 7-Tetrabrom-2-azabenzimidazole

TGF- β

transformirajući faktor rasta- β

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)