Karnitin smanjuje lipoperoksidativno oštećenje membrane i apoptozu nakon indukcije staničnog stresa kod eksperimentalnog glaukoma | stanična smrt i bolest

Karnitin smanjuje lipoperoksidativno oštećenje membrane i apoptozu nakon indukcije staničnog stresa kod eksperimentalnog glaukoma | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Metabolizam energije
  • Eksperimentalni modeli bolesti
  • farmakodinamiku

Sažetak

Patološka oštećenja uzrokovana glaukomom povezana su s visokim intraokularnim tlakom. Očni hiperton najvjerojatnije je posljedica neispravnog izljeva vodenog humora iz prednje komore oka. Očna hipertenzija uzrokuje apoptotsku smrt ganglijskih stanica mrežnice i prekomjernu ekspresiju molekularnih markera tipičnih za stanični odgovor i apoptozu. U ovom radu izvještavamo o neuroprotektivnom, antiapoptotskom i antioksidacijskom djelovanju prirodne tvari, -karnitina. Ovaj spoj poznat je po svojoj sposobnosti da poboljšava rad mitohondrija. Analiziramo brojne stanične i molekularne markere, tipične za očnu hipertenziju i općenito za stanični odgovor na stres. Konkretno, L-karnitin smanjuje ekspresiju glijalnog fibrilarnog kiselinskog proteina, inducibilnu sintazu dušičnog oksida, ubikvitin i kaspazu 3, tipične markere staničnog stresa. Pored toga, morfološka analiza optičkog živca dokazala je smanjenje patološkog iskopa optičkog diska. Ovaj eksperimentalni hipertonski protokol izaziva ozbiljnu lipoperoksidaciju koja se značajno smanjuje L-karnitinom. Cjelokupna interpretacija je da smrtnost stanica mrežnice nastaje zbog oštećenja membrane.

Glavni

Progresija glaukoma detaljno je opisana: 1, 2, jedna od njegovih glavnih karakteristika sastoji se u visokom intraokularnom tlaku (IOP), koji se podiže iznad statistički normalnih vrijednosti. Ovo povećanje može se pripisati, strogo fizički gledano, neispravnom izljevu vodenog humora iz prednje komore oka. 3 Procijenjeno je da je glaukom drugi uzrok sljepoće kod ljudi i da 68 milijuna pacijenata pati od ove patologije, a oko sedam milijuna pojedinaca ima bilateralnu sljepoću. 4 Zajedničko obilježje patologije uključuje iskopiranje optičkog diska (cup-to-disk), koji se proširuje do njegovih ruba. Nekoliko studija pokazuje da se rane lezije javljaju na razini optičkog živca, posebno u blizini glave optičkog živca na razini lamine cribrosa; međutim, sugeriše se i početna zahvaćenost mrežnice. 5 Prikazana je apoptotska smrt mrežastih ganglionskih stanica (RGC) 6, a pored toga učinak intraokularne hipertenzije uzrokuje značajnu prekomjernu ekspresiju kaspaze 3, što je općeprihvaćeni marker programirane stanične smrti. 7, 8 Smrt značajnog broja RGC-a najvjerojatnije smanjuje broj aksona koji tvore optički živac. Evolucija ovog fenomena rezultira patološkim povećanjem normalnog iskopa optičke papile, što na kraju rezultira ozbiljnim nedostatkom vida. 9 Dokazana je i relevantna uloga mikro- i makroglija stanica u degeneraciji RGC-a. 10, 11, međutim, glialne stanice imaju neuroprotektivnu ulogu u patološkoj situaciji; mogu pridonijeti oštećenju neurona. Posebno, tijekom napredovanja glaukoma, astrociti su uključeni u preuređivanje lamine cribrosa i mogli bi djelovati kao pokretači patologije. 12 Studije na eksperimentalnim modelima očne hipertenzije i ljudskog glaukoma dokazale su hipertrofiju astrocita i gubitak organizacije i mrežnice i optičkog živca. Uregulacija glijalnog vlaknastog kiselog proteina (GFAP) također je primijećena kod uzgojenih astrocita uzgajanih pod visokim hidrostatičkim tlakom. 13, 14 GFAP se smatra vrlo važnim pokazateljem stresa kod različitih patologija mrežnice i u eksperimentalnim modelima očne hipertenzije. 8, 15, 16 Aktivacija glijalnih stanica može imati štetne posljedice na neurone, jer mogu prouzrokovati mehanička oštećenja i promjene mikroenviromenta. 12, 17 To pokreće oslobađanje i / ili proizvodnju neurotoksičnih i proapoptotskih spojeva poput sinteze dušičnog oksida (NOS). 18, 19 Tako proizveden dušični oksid (NO) reaktivni je slobodni radikal prisutan u stanicama kao odgovor na povećane unutarćelijske koncentracije Ca2 + . 20 Poznato je da NOS povećava cerebralnu ishemiju 21, a prekomjerna ekspresija ovog enzima uzrokuje relevantna oštećenja tkiva: ukupni rezultat je štetno djelovanje na staničnu membranu. 21, 22 Nedavna istraživanja pokazala su da je višak NO toksičan i da se taj spoj povećava kao posljedica očne hipertenzije. 23 Kod glaukoma je također predloženo uključivanje inducibilnog NOS-a (iNOS). 24 Oksidativni stres i porast IOP-a također uzrokuju povećanje regulacije ubikvitina (Ub) i stimulaciju Ub-proteasomskog puta: 8, 25 to možda proizlazi iz aktiviranja apoptotičkog programa. 26, 27, 28 U ovom smo radu istražili mogućnost da L-karnitin može modulirati učinke očne hipertenzije. Ta se hipoteza temelji na opažanju da je ta tvar sposobna poboljšati metabolizam mitohondrija 29 i ima antiapoptotsko djelovanje. 30, 31 Djelovanje L-karnitina povezano je s poboljšanjem performansi mitohondrija jer oštećenja ovih organela imaju ključnu ulogu u dovršenju apoptotičkog procesa. 32, 33 Nekoliko studija pokazuje da L-karnitin ima neuroprotektivno djelovanje kod različitih neurodegenerativnih patologija, poput sindroma Parkinsona i Alzheimera, gdje se također opažaju mitohondrijska kvar i oksidativni stres. 34, 35 Prijavljena je potencijalna terapijska uloga L-karnitina i za AIDS i za ishemiju, gdje je također uključena apoptoza. 36, 37 Njegova zaštitna uloga pripisana je sposobnosti da inhibira aktivaciju kaskade kaspaze. 30, 31 Nedavno je objavljeno da, pored L-karnitina, njegov acetilirani derivat također može smanjiti apoptozu u kulturama primarnih neurona i u stabilnim mišjim fibroblastnim linijama. 38 Pokazano je da antiapoptotsko djelovanje proizlazi iz sposobnosti L-karnitina za obnavljanje i stimuliranje tipičnih mitohondrijskih funkcija poput aktivnosti piruvat dehidrogenaze. 29, 38 Uzimajući u obzir sve navedeno, istraživali smo ulogu ovog spoja u neuroprotekciji i u kontroli degenerativnih i apoptotskih pojava. Konačno, zabilježeno je da nakon ishemije / reperfuzije na razini mrežnice dolazi do značajnog povećanja peroksidacije lipida. 39 Naši podaci pokazuju da liječenje L-karnitinom značajno smanjuje razinu peroksidacije membrane.

Rezultati i rasprava

Karnitin smanjuje ekspresiju markera stresa na razini mrežnice

Nakon indukcije hipertenzivnog stresa nakon ubrizgavanja metilceluloze (MTC) u prednju komoru, ekspresija GFAP-a se povećava na razini RGC-a i u Mullerovim stanicama, što je dokazano iz morfoloških promjena slojeva mrežnice (slika 1a, 3). Nakon indukcije hipertona i paralelnog liječenja karnitinom, ekspresija ovog markera glijalnih stanica se značajno smanjuje (slika 1a, 2). Kod kontrola se doista opaža bazalna ekspresija GFAP-a, ali to je topografski ograničeno na unutarnji sloj mrežnice (Slika 1a, 1) i kod kontrola i kod životinja koje nisu podvrgnute hipertenzivnom šoku, već su jednostavno tretirane karnitinom (nije prikazano). Smanjena ekspresija ovog općeprihvaćenog markera oštećenja neurona 8, 16 jasan je pokazatelj da karnitin može smanjiti neurotoksične posljedice hipertenzivnog stresa.

Image

Smanjenje ekspresije markera stresa na razini mrežnice inducirano karnitinom. ( a ) Imunolokalizacija GFAP-a procijenjena imunofluorescencijom u mrežnici štakora. 1: mrežnica iz netretiranog kontrolnog oka. 2: Kontralateralno oko tretirano metilcelulozom u prisustvu karnitina. 3: Oko tretirano samo metilcelulozom. Povećanje je bilo × 500 u svim slučajevima. ( b ) Western blot na ukupnom proteinu iz ekstrakta mrežnice za procjenu ekspresije iNOS-a, ubikvitina i a -tubulina kao standardne reference. Na ovoj i sljedećim slikama, trake 1, 2 i 3 prikazuju rezultate dobivene u istim eksperimentalnim uvjetima kao na ploči a; to jest: kontrola, MTC plus L-karnitin i samo MTC

Slika pune veličine

Inducibil NOS (iNOS) poznat je kao jedan od glavnih enzima koji sudjeluju u peroksidaciji lipida mitohondrije i u neuropatiji. 20 Kako se oštećenja neurona smanjuju, u našem eksperimentalnom modelu uklanjanjem peroksida8 ispitali smo mogućnost da hipertenzivni šok može potaknuti regulaciju iNOS-a. Rezultati prikazani na slici 1b pokazuju da hipertenzija dobivena primjenom metilceluloze 8 uzrokuje dramatično povećanje iNOS-a koji je uključen u izvršenje apoptotičkog puta (traka 3). Karnitin koji se daje životinji zajedno s metilcelulozom snažno smanjuje ekspresiju ovog genskog proizvoda (traka 2). Stoga karnitin poboljšava cjelokupni homeostatski odgovor na hipertenzivne uvrede i može ograničiti apoptotske pojave.

Inducibilna dušična sintaza je prekomjerno izražena kao odgovor na oksidativni stres i također je uključena u napad apoptoze. Podaci iz literature pokazuju da se proteasomski put posredovan Ub aktivira kao posljedica oksidativnog stresa u endotelnim stanicama mrežnice i u uzgojenim stanicama. 25, 26 Rezultat na slici 1 pokazuje da je bazalna razina ubikvitina otkrivena u ukupnom proteinskom ekstraktu iz kontrolnih mrežnica (linija 1). Nakon indukcije hipertona, otkrivena je snažna pozitivnost na Ub (traka 3), koja se značajno smanjuje u mrežnici koja se istodobno liječi karnitinom (traka 2). Smanjenje Ub signal je poboljšane stanične homeostaze, što podrazumijeva smanjenu razgradnju proteina uzrokovanu reakcijom na stres. U stvari, aktiviranje puta Ub / proteasoma izravno je povezano s izvršenjem apoptotske smrti. 8, 26, 27, 28 Zaključno, karnitin može posredovati u smanjenju markera stresa čija je regulacija uzrokovana hipertenzivnim stresom zbog MTC tretmana u eksperimentalnom glaukomu. Kako karnitin smanjuje unutarćelijsku koncentraciju tipičnih markera stanične supsije i / ili apoptoze, naši podaci snažno sugeriraju da lijek ima negativnu kontrolu nad napredovanjem apoptotičke smrti na razini stanica mrežnice.

Smrt apoptotske ćelije koja je posljedica očne hipertone kontrolira se u prisutnosti karnitina

Da bismo procijenili vremensku prognozu karnitin može uistinu smanjiti izvršenje apoptoze nakon indukcije hipertona, procijenili smo opseg stanične smrti bojenjem TUNEL-om i otkrivanje općeprihvaćenog markera apoptoze: kaspaze 3. Ova dvostruka procjena potrebna je kao fluorescentna reakcija TUNEL mogu stvoriti nejasne rezultate. Zapravo, ova metoda nije dovoljno specifična za razlikovanje nekroze i apoptoze, unatoč činjenici da se ova metoda često koristi za procjenu ove vrste stanične smrti. 40 Slika 2a pokazuje rezultate tipične TUNEL fluorescentne reakcije u prisutnosti (2) i u odsutnosti (3) karnitina. Rezultati pokazuju da lijek snažno smanjuje fluorescentnu reakciju. To se može racionalizirati smanjenjem fragmentacije DNK jer je ovaj proces povezan sa staničnom smrću na razini astrocita i RGC-a. Kaspaza 3 je proteaza uključena u pokretanje i izvršenje apoptoze. Podaci prikazani na slici 2b dokazali su da se u retinama liječenim hipertenzivno / MTC-om pojavljuje dramatičan izraz kaspaze 3 (traka 3). Razina ovog enzima snažno je snižena ako je hipertenzivni šok paralelan s liječenjem karnitinom (linija 2). Stoga možemo s pravom zaključiti da je lijek sposoban značajno smanjiti izvršenje programa stanične smrti.

Image

Karnitin smanjuje apoptotsku staničnu smrt kao posljedicu očne hipertone. ( a ) Procjena oštećenja DNA testom TUNEL. Povećanje je bilo × 500 u svim slučajevima. ( b ) Western blot na ukupnim proteinima ekstraktima mrežnice za procjenu ekspresije kaspaze 3. Podaci prikazani u 1, 2 i 3 izvješću istim redoslijedom dobivenim rezultatima u eksperimentalnim uvjetima kao na slici 1

Slika pune veličine

Poznato je da karnitin ima ulogu u stabilizaciji i funkciji membrane. Konkretno, ovaj spoj je uključen u transport dugolančanih masnih kiselina na nivou mitohondrijske membrane. 29, 30, 31, 35 To rezultira poboljšanim metabolizmom energije, što sprečava moguće procese smrti ćelije aktivirane na mitohondrijskoj razini, kao što je također sugerirano u prethodnom radu o analognoj acetiliranoj molekuli. Zapravo je stabilizacija mitohondrijske membrane potpomognuta opažanjem da primjena acetilkarnitina u uzgojenim stanicama smanjuje otpuštanje citokroma c iz mitohondrija. 38 Na temelju opažanja hipotezirali smo da karnitin, prirodna tvar koja se normalno proizvodi u organizmu, može ograničiti apoptozu smanjenjem peroksidacije lipida. Ovo smanjenje bi stabiliziralo mitohondrijsku membranu i na taj način poboljšalo ukupni energetski metabolizam. Ova hipoteza ispitana je mjerenjem proizvodnje malondialdehida (MDA) proizvedenog na razini membrane nakon oksidacije.

Morfološka analiza glaukomatskog izdvajanja optičkog diska

Patološko kutiranje optičkog diska vrlo je često uzrokovano glaukomom. Mnogo različitih uzročnika, koji nisu povezani s povišenim IOP-om ili glaukomatoznom bolešću optičkog živca, mogu rezultirati patološkim iskopom optičkog živca. U prethodnom radu uočeno je značajno patološko kuckanje glava optičkog živca, kao posljedica gubitka astrocita i živčanih vlakana. 8 Međutim, u slučaju hipertenzivnog liječenja u prisutnosti karnitina, opaža se dramatično smanjenje fenomena od očiju do šalice (slika 3). Kupovanje optičkim diskom posljedica je bezbrojnih poremećaja, ali u ovom slučaju njegovo smanjenje je očigledno smanjenom oksidativnom uvredom, što također omogućuje bolju kontrolu stanične homeostaze s posljedičnim spašavanjem astrocita i živčanih vlakana.

Image

Morfološke promjene kupa-na-oku. Kontrolni uzorci mrežnice (1); mrežnice tretirane metilcelulozom u prisutnosti (2); ili odsutnost karnitina (3). Povećanje je bilo × 500 u svim slučajevima

Slika pune veličine

Oksidativni stres uzrokuje povećanje oštećenja membrane

Stupanj oštećenja membrane procijenjen je mjerenjem proizvodnje MDA, široko prepoznatog markera lipoperoksidacije čija se proizvodnja događa u stanicama izravno zbog oštećenja strukture i funkcije membrane. Uzorci tretirani s MTC-om, s druge strane, pokazuju veliko lipoperoksidativno oštećenje, što pokazuje i vrlo visoka koncentracija citoplazme MDA (slika 4a, bar lijevo). Međutim, ovdje prikazani podaci jasno pokazuju da karnitin može samo umjereno zaštititi stanice od apoptotske smrti uslijed oksidativnog stresa. Zapravo, razine MDA koje se nadziru u mrežnicama tretiranim ovim spojem u prisutnosti metilceluloze samo su blago smanjene (slika 4a, središnja traka), te stoga apoptotska smrt stanica praćena u našem modelu sustava nije samo zbog oksidativni stres. U stvari, karnitin smanjuje proizvodnju MDA, ali ne vraća vitalnost stanica: tako MTC inducira apoptozu mehanizmima koji se ne mogu pripisati samo oštećenju mitohondrija.

Image

Razina membranske lipoperoksidacije u uzorcima mrežnice i uloga L-karnitina u kontroli apoptoze. ( a ) Stupci izvještavaju o razini malondialdehida (MDA) procijenjenom kako je naznačeno na dnu svake trake. Mtc, metilceluloza; Carn, L-karnitin. ( b ) Povećanje intraokularnog tlaka (IOP) rezultira oksidativnim stresom što pokazuje prekomjerna ekspresija inducibilne sintaze dušičnog oksida (iNOS). Mitohondrijska peroksidacija lipida uzrokuje nakupljanje intracelularnog MDA: znak lipoperoksidacije. Aktivacija puta proteasom-posredovanog s ubikvitinom (Ub) izravno je povezana s izvršenjem apoptotičke smrti što se pokazuje i stimulacijom ekspresije kaspaze 3. Tretman metilcelulozom u prisustvu karnitina smanjuje razinu svih markera apoptoze, pa L-karnitin također poboljšava ukupni homeostatski odgovor i ograničava apoptotske pojave

Slika pune veličine

Ukratko, ubrizgavanje metilceluloze u prednju komoru oka aktivira različite ćelijske i molekularne signale stresa na nivou RGC-a, poput uregulacije GFAP-a i oštećenja DNA. Metilceluloza u osnovi sprečava izlivanje tekućine iz Schlemmovih kanala. To povećava IOP, što na kraju rezultira uspostavom oksidativnog stresa. Taj se stres pokazuje prekomjernom ekspresijom iNOS-a, enzima koji je primarno uključen u peroksidaciju lipida mitohondrije, s posljedičnim oštećenjem stanične membrane, što se potvrđuje nakupljanjem unutarćelijskog MDA: znak lipoperoksidacije. Ub-posredovani put proteasoma je također aktiviran i to je izravno povezano s izvršenjem apoptotičke smrti što je prikazano stimulacijom ekspresije kaspaze 3. Antiapoptotska uloga karnitina prikazana je na slici 4b. Ovaj spoj ima ključnu ulogu u stabilizaciji i funkciji stanične membrane. Liječenje metilcelulozom paralelno s karnitinom smanjuje razinu svih markera stanične supsije i apoptotis. Zaključno, poboljšanjem performansi mitohondrija karnitin također poboljšava ukupni homeostatski odgovor na hipertenzivnu uvredu i ograničava apoptotičke pojave.

Materijali i metode

Održavanje životinja, indukcija hipertona i liječenje karnitinom

Muškarci za odrasle štakore Wistar korišteni su tijekom cijelog rada. Svi eksperimentalni postupci bili su u skladu s ARVO Izjavom o korištenju životinja u oftalmičkim i vidnim istraživanjima i smjernicama institucionalnog Odbora za njegu i upotrebu životinja. Opća anestezija izvedena je intraperitonealnom injekcijom nebarbituratnog anestetika u fiziološkoj otopini primijenjenoj u skladu s preporukama dobavljača (natrijeva-tiopentalna otopina (Farmotal, Pharmacia & Upjohn, USA)). Lokalna anestezija izvedena je primjenom kapi za oči od 0, 4% oksibuprokaina (Novesine, Novartis, Basel, Švicarska). Očna hipertenzija inducirana je postupkom razvijenim u našoj laboratoriji. Ukratko, životinje su ubrizgane u prednju komoru desnog oka pomoću MTC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u fiziološkoj otopini. Kontralateralno oko koristilo se kao kontrola i ubrizgavalo je samo fiziološku otopinu. IOP je praćen tonometrijom (Tonopen XL, Automatizirana oftalmika, Ellicott City, MD, SAD). Za daljnje detalje pogledajte Calandrella i sur. 8 Tretmani L-karnitinom (Sigma-Tau, Industrie Farmaceutiche Riunite, Pomezia Roma, Italija) izvedeni su otapanjem lijeka u suspenziji metilceluloze u naznačenim koncentracijama. Konačna koncentracija karnitina odnosi se na volumen, oko 300 ± 20 μl, što je procijenjeno vaganjem sadržaja svakog kontrolnog oka.

Morfološka, ​​molekularna analiza dijelova tkiva i proteina ukupnih proteina

Priprema uzoraka

Oči su uklonjene i rožnice su uklonjene u razini limbusa; staklast humor i kristalna leća odbačeni su. Tako dobiveni uzorci su fiksirani u 4% paraformaldehidu 6 sati na 4 ° C i brzo isprani u PBS-u. Uzorci su tada namočeni u 30% -tnoj otopini saharoze u trajanju od 6 do 8 sati na 4 ° C, konačno uključeni u smrzavajuću smolu (OCT, Killik, Bio-Optica, Milan, Italija) i rezani kristastatom u uzdužnim presjecima (10 µm debljine).

Analiza stanične biologije

Imunolokalizacija je izvedena na GFAP. Sekcije su dehidrirane, tretirane su s Triton X 100 (0, 1% v / v) 30 min i blokirane u 1% goveđeg serumskog albumina u isto vrijeme. Endogene peroksidaze neutralizirane su vodikovim peroksidom (0, 3% u PBS-u tijekom 20 minuta). GFAP je dokazan anti-GFAP (Sigma-Aldrich) i fluorescentnim fluorescentnim sekundarnim antitijelom (Alexa Fluor, Molekularne sonde). Fiksni presjeci obojeni su 0, 1 min hematoksilinom QS (nuklearni kromatin); nakon pranja u PBS-u, odsječki tkiva su se inkubirali 2 min u 1% eozina kako bi se obojila citoplazma; nakon ovog koraka slijedilo je optičko promatranje mikroskopa.

Fragmentacija DNA dokazana je reakcijom TUNEL ( in situ stanica za otkrivanje smrti, AP / Roche)

Biomolekularni testovi

Testovi zapadnog razmazivanja i lipoperoksidacije provedeni su na kontrolnim ekstraktima stanica mrežnice tretiranim karnitinom. Ukupni proteinski ekstrakti pripremljeni su standardnim postupcima i analizirani na PAGE koristeći sljedeća antitijela: aktivni oblik kaspaze 3, iNOS (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD) i Ub (Sigma-Aldrich). α -Tubulin korišten je kao standardna referenca (Sigma-Aldrich).

Da bismo odredili oksidativni stres na nivou membrane, koristili smo kvantitativni test zasnovan na unutarćelijskoj proizvodnji MDA mjereno komercijalnim kitom LPO-586 (Oxis Health Research Products Portland, OR, SAD). Kromofor, N -metil-2-fenilindol (NMP) reagira s MDA nakon inkubacije na 45 ° C. Pojedinačna molekula MDA reagira s NMP molekulama stvarajući stabilnu kromoforu čija se apsorbancija može spektrofotometrijski izmjeriti na 586 nm. Vrijednosti apsorpcije mogu se izravno pretvoriti u molarnu koncentraciju MDA.

Statistička analiza

Svi su pokusi ponovljeni najmanje tri puta. Statistička analiza rezultata napravljena je Studentovim t -testom ili dvosmjernom analizom varijancije koju je pratio Studentov t- test. P- vrijednosti <0, 05 smatrane su značajnim.

Glosar

RGCs

retinalne ganglijske stanice

GFAP

glialni vlaknasti kiseli protein

NOS

sinteza dušičnog oksida

NE

dušikov oksid

iNOS

inducibilni NOS

MTC

metilceluloza

Ub

ubikvitina

MDA

malondialdehid

IOP

intraokularni tlak