Blokada kaspaze inducira rip3 posredovanu programiranu nekrozu u mikrogliji koja se aktivira na receptorima | stanična smrt i bolest

Blokada kaspaze inducira rip3 posredovanu programiranu nekrozu u mikrogliji koja se aktivira na receptorima | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • mikroglije
  • Necroptosis
  • Farmakologija
  • Cestarinski receptori

Sažetak

Mikroglije su rezidentne imunološke stanice središnjeg živčanog sustava i ključni igrači protiv patogena i ozljeda. Međutim, trajna mikroglijska aktivacija često pogoršava patološka oštećenja te je uključena u mnoge neurološke bolesti. Unatoč njihovim glavnim fiziološkim i patofiziološkim ulogama, kako se regulira preživljavanje i smrt aktiviranih mikroglija ostaje slabo razumljivo. Ovdje navodimo da mikroglija aktivirana putem Toll-like receptora (TLR-a) prolazi kroz RIP1 / RIP3 programiranu nekrozu (nekroptozu) kada je izložena inhibitoru pan kapaze zVAD-fmk. Iako zVAD-fmk i inhibitor kaspaze-8 IETD-fmk nisu imali učinka na nestimuliranu primarnu mikrogliju, oni su značajno senzibilizirali mikrogliju na TLR1 / 2, 3, 4, 7 / 8 ligande ili TNF tretman, pokrećući programiranu nekrozu koja je u potpunosti blokirana Inhibitor R1P1 kinaze nekrostatin-1. Zanimljivo je da je nekroptoza inducirana TLR ligandima i zVAD ograničena na mikroglijske stanice i nije primijećena u astrocitima, neuronima ili oligodendrocitima iako se zna da oni eksprimiraju određene TLR. Brisanje gena koji kodiraju TNF ili TNFR1 nije uspjelo spriječiti lipopolisaharidnu i poli (I: C) induciranu mikroglijsku nekroptozu, otkrivajući TNF-nezavisan programirani put nekroze u mikroglijama aktiviranim TLR3 i TLR4. Mikroglije iz miševa kojima nedostaje funkcionalni TRIF bili su u potpunosti zaštićeni od TLR3 / 4 aktivacije i zVAD-fmk-inducirane nekroze, a genetska delecija rip3 također je spriječila mikroglija nekroptozu. Aktivacija c-jun N-terminalne kinaze i stvaranje specifičnih reaktivnih vrsta kisika bili su nizvodno signalni događaji potrebni za izvršenje smrti mikroglija stanica. Uzeto zajedno, ovo istraživanje otkriva robusnu signalnu putanju nekroptoze ovisne o RIP3 u mikrogliji aktiviranom TLR-om nakon blokade kaspaze i sugerira da su TLR signalizacija i programirani putovi smrti stanice usko povezani u mikrogliji, što može doprinijeti neuropatologiji i neuroinflamation kada se disregulira.

Glavni

Mikroglije su rezidentne imunološke stanice u središnjem živčanom sustavu (CNS) i primarni branitelji koji štite CNS od patogena i ozljeda. Međutim, postojano i prekomjerno aktiviranje mikroglije može rezultirati patološkom upalom, a pokazalo se da aktivno sudjeluje u mnogim neurološkim poremećajima, uključujući akutne ozljede mozga, moždani udar, multiplu sklerozu i neurodegenerativne bolesti. 1, 2 Receptori nalik na cestarinu (TLR) glavna su obitelj receptora za prepoznavanje obrazaca koji prepoznaju visoko očuvane molekularne uzorke povezane s patogenom (PAMP) izražene na širokim mikroorganizmima i pokreću urođene imunološke odgovore. 3 Uz to, TLR otkrivaju i endogene molekularne uzorke povezane s opasnošću, te stoga imaju ključnu ulogu u infektivnim i neinfektivnim poremećajima CNS-a. 4 Microglia izražavaju repertoar TLR-a, 5 a njihovo angažiranje povezano je s oštećenjem neurona 6 i oligodendroglialnim oštećenjima, 7, 8 i pogoršanom ozljedom mozga. 9 Budući da mikroglija aktivirana TLR-om izlučuje protuupalni citotoksični medijator, razlučivost aktiviranog mikroglija mora se strogo regulirati. Odavno je prepoznato da se broj i aktivnost aktiviranih mikroglija u CNS-u smanjuje kako se patogen očisti ili uvreda nestane. Međutim, mehanizmi koji upravljaju uklanjanjem lokalno aktivirane mikroglije ostaju neuhvatljivi. Aktivacija izazvana apoptozom mikroglije jedan je od mehanizama koji smanjuje aktiviranje mikroglije. Azotni oksid, kaspaza-11, -1 i -3 i MST-1 pokazali su se da posreduju apoptozu mikroglije aktivirane interferonskim gama (IFN y ) ili IFN y plus lipopolisaharidom (LPS). 10, 11, 12 Iako je očito da se aktivirani mikroglija može podvrgnuti apoptozi ovisnoj o kaspazi, tek treba utvrditi može li aktivirana mikroglija prilagoditi druge stanične smrti. Disregulacija procesa samo-eliminacije može potencijalno pogoršati bolesti CNS-a, a trajno aktivirana mikroglija zapravo je povezana s mnogim kroničnim neuropatološkim stanjima.

Smrt nekrotičnih stanica tradicionalno se promatra kao pasivan proces uzrokovan pretjeranim stresom i kao razlog za upalu uslijed oslobađanja unutarćelijskih materijala. Nakupljajući dokazi sada su jasno pokazali da je određena vrsta nekrotične stanice programirana i da se može spriječiti. Pokazalo se da je aktiviranje domene kinaze proteina 1 (RIP1) u interakciji s receptorima i sastavljanje signalnog kompleksa koji sadrži RIP1 / RIP3 pokrenuli programiranu nekrozu u nekim stanicama, a proces se također naziva nekroptoza. 13 Nekrostatin-1 (Nec-1), mala molekula utemeljena na triptofanu koja alosterski inhibira aktivnost RIP1 kinaze, 14, 15 sprečava nekrozu izazvanu smrću receptora smrti i blokira oksidacijsku smrt oligodendroglialnih stanica. 17 Primjena nekrostatin-1 ameliorata neuralne ozljede na životinjskim modelima ishemije, 15, 18 traumatičnih ozljeda mozga, 19 i Huntington-ove bolesti. Iako je temeljni mehanizam in vivo zaštitnog učinka nekrostatina-1 još uvijek u potpunosti uspostavljen, primjena nekrostatin-1 kod miševa podvrgnutih kontroliranom kortikalnom utjecaju povezana je sa smanjenom aktivacijom mikroglija. 19

Višestruki dokazi pokazali su da kaspaza-8, inicijacijska kaspaza apoptoze izazvanog recepturom smrti i njegova adapter proteina Fasd povezana domena smrti (FADD) negativno reguliraju programiranu nekrozu ovisnu o RIP1 / RIP3 cijepanjem i inaktivacijom RIP1, 21 Suzbijanje aktivnosti kaspaze-8 inhibitorom pan-kaspaze zVAD-fmk olakšava TNF α- induciranu nekroptozu u stanicama koje eksprimiraju RIP3. Za razliku od nekroze uzrokovane smrtnim receptorima TNF-a, detalji urođene imunološke stanice uzrokovane patogenom tek su počeli izlaziti. Nekoliko studija pokazalo je da kada je aktivnost kaspaze-8 potisnuta IETD-fmk, zVAD-fmk ili virusnim inhibitorom kaspaze CrmA, ligacija TLR3 ili TLR4 rezultira programiranom nekrozom u ljudskim makrofazima 23 i mišjim peritonealnim makrofagama putem RIP3. 22, 24 Međutim, bez obzira jesu li aktivirane mikroglije, urođene imunološke stanice u CNS-u, podvrgnute programiranoj nekrozi, ostaje neodgovoreno.

U ovom istraživanju izvješćujemo da primarna mikroglija aktivirana TLR ligacijama prolazi apoptotično kao i nekrotičnu staničnu smrt. Blokada kaspaze-8 s zVAD-fmk ili IETD-fmk izrazito je senzibilizirala mikrogliju na TNF i TLR1 / 2, TLR3, TLR4 i TLR7 / 8 ligaciju. Nekroptoza mikroglije aktivirane TLR3 i TLR4 dalje je određena kako bi se posredovala TRIF, RIP3 i nizvodno c-Jun N-terminalnom kinazom (JNK) i reaktivnim vrstama kisika (ROS). Budući da nekrotična stanična smrt može izazvati sekundarne upalne reakcije, otvaranje molekularnih mehanizama koji stoje na osnovi propadanja aktivirane mikroglije može imati važne tragove za buduću terapijsku intervenciju bolesti CNS-a.

Rezultati

Različiti mikroglijski odgovori na različite veličine TLR4 aktivacije

LPS izaziva snažne imunološke reakcije u mikrogliji putem TLR4. Da bismo ispitali odnos između stupnja mikroglijske aktivacije i sudbine mikroglijskih stanica, izazvali smo primarnu mikrogliju štakora s povećanjem koncentracije LPS. Iako je aktiviranje mikroglije s vrlo niskom dozom LPS-a (0, 1 ng / ml) potaknulo preživljavanje stanica (slike 1a i b) i stvaranje TNF-a (slika 1d), veće koncentracije LPS-a (10-100 ng / ml) uzrokovale su smrt mikroglija u stanici način ovisan o dozi (slike 1a i c). Proizvodnja TNF-a aktiviranom mikroglijom ovisila je o stupnju aktivacije mikroglije i čini se da je dostigla vrhunac s 10 ng / ml LPS (slika 1d), koncentracijom koja je također izazvala značajnu fragmentaciju DNK, što je određeno povećanim brojem TUNEL + stanica (slika 1c). Ti su podaci u skladu s prethodnom studijom 25 i sugeriraju da je programirana stanična smrt svojstven, samo-eliminirajući mehanizam koji sprječava prekomjerno aktiviranje.

Image

Mikroglialni odgovori na različite doze LPS. ( a ) Mala doza LPS povećala je sposobnost mikroglije, dok su veće doze izazivale staničnu smrt. Primarne mikroglije štakora su stimulirane s povećanjem koncentracije LPS (0, 1, 10, 100 ng / ml) tijekom 20–24 h, a broj mikroglijskih stanica je izbrojan. Podaci su reprezentacija tri neovisna pokusa sa sličnim rezultatima. ( b ) Reprezentativne fazno-kontrastne slike mikroglije tretirane naznačenim koncentracijama LPS-a. Linija skale, 50 µm. ( c ) značajno povećanje TUNEL-pozitivnih mikroglija nakon stimulacije LPS-a tijekom 6 h. Podaci predstavljaju postotak TUNEL-pozitivnih stanica u ukupnim stanicama. ( d ) Povećanje proizvodnje TNF-a nakon doze ovisnog o dozi tijekom 6 h. Podaci su reprezentacija tri neovisna pokusa sa sličnim rezultatima. ( e, f ) mikroglija aktivirana LPS-om pokazala je dva različita aktivacijska modela kasaspe-8. Lokalizirana aktivacija kaspaze-8 (L-Casp-8) nije bila povezana s aktivacijom kaspaze-3 ili staničnom smrću (gornja ploča, e ), dok duboka citoplazmatska aktivacija kaspaze-8 (C-Casp-8) izazvana aktivacijom kaspaze-3, Fragmentacija DNA (pozitivna na TUNEL) i stanična smrt (donja ploča, e ). Mikroglija štakora tretirana je s 0, 1–100 ng / ml LPS kao gore, a otkrivanje in situ aktivacije kaspaze-8 u živim stanicama provedeno je kao što je opisano u odjeljku Metode. Stanice su zatim fiksirane i podvrgnute TUNEL obeležavanju ili imunološkom obojenju za odcepljenu / aktiviranu kaspazu-3 (akt. Casp-3). Rezultati su prikazani kao postotak Casp-8-pozitivnih stanica od ukupnih stanica. NS, nije značajno; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Zatim smo pitali upotrebljava li LPS prekomjerno aktivirana mikroglija klasični apoptotski put za samoisklanjanje. Aktivacija kasaze 3 izvršitelja bila je očita u mikrogliji koja je tretirana većom, ali ne niskom dozom LPS-a (slika 1e) i koja je prethodila smrti apoptotičkih stanica (dopunska slika S1). Kako je kaspaza-8 inicijacijska kaspaza potrebna za vanjske putove apoptoze, ispitivali smo aktivaciju kaspaze-8 u živim mikroglijama nakon stimulacije LPS-om FAM-LETD-fmk označenim s fluoresceinom koji označava afinitet aktiviranom kaspazom-8. 26 Uočena su dva različita uzorka aktivacije kaspaze-8 (Slika 1e): difuzna citosolna aktivacija (C-Casp-8) i lokalizirana subcelularna aktivacija kaspaze-8 (L-Casp-8). Iako je mikro-glija L-Casp-8 + negativna na TUNEL ili aktiviranu kaspazu-3, mnogi C-Casp-8 + mikroglije bili su također pozitivni na TUNEL i aktiviranu kaspazu-3, što sugerira da difuzna aktivacija kaspaze-8 u citosolu dovodi do apoptoze ( Slike 1e i f). Lokalizirana aktivacija kaspaze-8 prethodno je pronađena u T limfocitima nakon aktivacije receptora antigena i bila je povezana s staničnom proliferacijom. 26 Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da fokalno aktivirana kaspaza-8 može funkcionirati kao signalna molekula u kompleksima, dok viši stupanj aktivacije u citoplazmi pokreće program smrti apoptotske stanice.

Mikroglija aktivirana niskom dozom LPS-a postaje nekrotična kada se potisne kaspaza-8

Da bismo ispitali moguću funkciju lokalizirane aktivacije kaspaze-8 u mikrogliji aktiviranoj LPS-om, aktivirali smo primarnu mikrogliju štakora sa 0, 1 ng / ml LPS-a u prisutnosti specifičnih inhibitora kaspaze. Iako inhibitor pan-kaspaze zVAD-fmk (zVAD) nije imao utjecaja na nestimuliranu, 'miroljubivu' mikrogliju, pokrenuo je brzu i masivnu staničnu smrt u mikrogliji aktiviranom LPS-om (slike 2a-c). Nadalje, zVAD je bio sličan učinak u izazivanju smrti mikroglijskih stanica kada je dodan mikroglijama koje su bile prethodno aktivirane LPS-om i intenzivno se isprale (dodatna slika S2). Mikroglija aktivirana LPS-om bila je također osjetljiva na inhibitor kaspaze-8 IETD-fmk (IETD) (Slike 2a i b). Suprotno tome, inhibitor kaspaze-3/7 DEVD-fmk, inhibitor kaspaze-1 YVAD-fmk ili njihova kombinacija nisu uzrokovali smrt stanica (Slike 2a i b). Mikroglija je podvrgnuta nekrotičnoj staničnoj smrti kada je tretirana LPS / zVAD, što je dokazano povećanom fragmentacijom DNK (slike 2d i e) i gubitkom integriteta plazma membrane (slike 2b-c). Kako in situ otkrivanje fragmentirane DNA pomoću TUNEL-a ne mora nužno razlikovati apoptozu od nekroze, koristili smo elektronske mikroskopske analize. U skladu s našim nalazom da veća magnitude LPS / TLR4 aktivacije inducira apopazu ovisnu o kaspazi (slika 1e, dopunska slika S1), mikroglija aktivirana većom dozom LPS-a pokazuje morfološke karakteristike tipične apoptoze, uključujući smanjeni stanični volumen, kondenzaciju kromatina i netaknuta citoplazmatska membrana (slika 2f, sredina). Suprotno tome, zVAD je jako senzibilizirao mikrogliju na nisku razinu aktivacije LPS-a, što je dovelo do nekroze koja je bila karakterizirana prozirnom citoplazmom, oticanjem organele, povećanim volumenom stanice i poremećajem plazma membrane (Slika 2f). Treba spomenuti da, za razliku od primarne mikroglije aktivirane LPS-om gdje inhibitori kaspaze-8 pokreću nekrozu bez supresije TNF-a (dopunska slika S3), LPS / zVAD nije uspio uzrokovati staničnu smrt u BV-2 mikroglijskoj staničnoj liniji i samo umjereno potisnut TNF izlučivanje (dopunska slika S4). 27 Uzeto zajedno, naši rezultati pokazuju da primarna mikroglija aktivirana LPS-om ima najmanje dva različita stanična puta smrti, ovisno o stupnju njihove aktivacije i prisutnosti supresorja kaspaze.

Image

Mikroglije aktivirane niskom dozom LPS-a podliježu brzoj nekrotičnoj staničnoj smrti nakon blokade kaspaze-8. ( a - c ) Inhibicija kaspaze-8 u mikrogliji aktiviranom LPS-om pokrenula je izražen gubitak stanične vitalnosti. Primarna mikroglija štakora stimulirana je sa ili bez LPS (0, 1 ng / ml) u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora pan kaspaze, z-VAD-fmk, specifičnog inhibitora kaspaze-8 IETD-fmk, inhibitora kaspaze-3/7 DEVD-fmk, inhibitor kaspaze-1 YVAD-fmk, ili kombinacija DEVD-fmk i YVAD-fmk (svaki od 25 μM) u trajanju od 20 do 24 sata. Stanična održivost određena je testom Alamar Blue koji mjeri metaboličku aktivnost, a potvrđena je analizom živih / mrtvih stanica pomoću propidium jodida (PI) i Calcein AM kao što je opisano. Prikazani su kontrast reprezentativnog faza i slike PI / Calcein AM bojenja mikroglija tretiranih kako je naznačeno. Podaci su reprezentativni za najmanje tri neovisna pokusa. Linija skale, 50 µm. ** P <0, 01; *** P <0, 001. ( d, e ) LPS plus zVAD-fmk izazvao smrt mikroglija stanica u miješanim glijalnim kulturama štakora koje su tretirane LPS (1 µg / ml) i zVAD-fmk 24 h. Određen je postotak TUNEL + Iba1 + microglia. ( f ) Prijenosna elektronska mikroskopija mikroglije tretirana vehiklom DMSO (lijevo), 10 ng / ml LPS-a (srednja) ili 0, 1 ng / ml LPS plus zVAD-fmk (10 µM) (desno) 6 h. Mikroglija tretirana sa nosačem i 10 ng / ml LPS imala je netaknutu citoplazmatsku membranu, dok su mnoge mikroglije tretirane LPS / zVAD pokazale prozirnu citoplazmu, mitohondrije nabreknute (umetak) i propadanje membrane. Stubovi skale, 2 µm, 0, 1 µm (umetanje)

Slika pune veličine

Programirana nekroza izazvana TLR ligandima / zVAD javlja se samo u mikrogliji, a ne u neuronima, astrocitima ili oligodendrocitima

Kako mikroglija eksprimira više TLR-ova, ispitivali smo da li zVAD također uzrokuje nekrozu mikroglije aktiviranog drugim TLR ligandima poput dvostruko natečene RNA mimične poli (I: C) (TLR3 ligand), Pam3CSK4 (TLR1 / 2) i R848 (TLR7 / 8). Zapravo su svi drugi testirani TLR ligandi inducirali mikroglijsku nekrozu (slika 3a). Suprotno tome, aktivacija mikroglije s ATP (do 1 mM) ili IL-13 (100 ng / ml) plus zVAD nije uzrokovala staničnu smrt (dopunska slika S5), što sugerira specifičnost mikroglijske nekroze za receptor smrti i aktivaciju TLR. Zanimljivo je da iako su neuroni, astrociti i oligodendrociti poznati da eksprimiraju funkcionalni TNF receptor i određene TLR, na primjer, TLR2 / TLR3 u oligodendrocitima i astrociti 28, 29, 30, 31 i TLR3 / TLR8 u neuronima, 32, 33, a nisu bili osjetljiv na TNF / zVAD ili TLR ligand / zVAD tretman (Slike 3b – d). Ovi rezultati pokazuju da TNF / zVAD ili TLR ligand / zVAD inducira nekrozu primarno u mikrogliji, ali ne i u ostalim stanicama CNS-a.

Image

TLR agonisti i TNF plus zVAD induciraju nekrotičnu staničnu smrt samo u mikrogliji, ali ne i u astrocitima, oligodendrocitima ili neuronima. ( a ) Primarna mikroglija štakora tretirana je nosačem, TLR agonistima poli (I: C) (PIC, 10 µg / ml), Pam3CSK4 (0, 1 µg / ml), R848 (1 µg / ml) ili TNF α ( 10 ng / ml) u prisutnosti ili odsutnosti zVAD-fmk (25 μM) kako je naznačeno. Stanična vitalnost određena je 20–24 sata kasnije, kako je opisano. Podaci predstavljaju prosjek ± SEM za tri neovisna pokusa. *** P <0, 0001. ( b - d ) Obogaćeni primarni astrociti, oligodendrociti i neuroni tretirani su nosačem, LPS (20 ng / ml), poli (I: C) (50 µg / ml), Pam3CSK4 (0, 5 µg / ml), R848 (5 μg / ml) ili TNF α (30 ng / ml) u prisutnosti ili odsutnosti zVAD-fmk (50 μM), a stanična vitalnost određena je 20–24 sata kasnije. Nije zabilježen gubitak vitalnosti stanica u astrocitima, oligodendrocitima ili neuronima. Podaci su reprezentativni za tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Blokada RIP1 kinaze s nekrostatinom-1 u potpunosti ukida nekrozu mikroglije

Da bismo istražili molekularni mehanizam koji stoji u osnovi TLR aktivacije i zVAD-inducirane nekroze, prvo smo testirali učinak Nec-1, koji inhibira aktivnost RIP1 kinaze 14 i RIP1 / RIP3 povezanost. 34, 35 Izlijevanje Nec-1 u potpunosti je ukinulo smrt mikroglijskih stanica uzrokovanih LPS / zVAD (slike 4a i b). Nadalje, iako su RIP1 i RIP3 bili endogeni eksprimirani u nestimuliranim mikroglijama, oni su bili značajno regulirani u mikrogliji koja je pukirana LPS i na razini transkripcije i na proteinu (Slike 4c i d). Ova pojačana ekspresija RIP1 i RIP3 u mikrogliji aktiviranim LPS-om može objasniti njihovu pojačanu osjetljivost na programiranu nekrozu. Dosljedno tome, Nec-1 je bio jednako učinkovit u zaštiti mikroglije od zVAD i drugih TLR ligand-induciranih staničnih smrti (Slika 4e).

Image

Blokada aktivnosti RIP1 kinaze ukida mikroglijsku nekrozu uzrokovanu TLR-aktivacijom. ( a ) Blokada aktivnosti RIP1 kinaze s nekrostatinom-1 (Nec-1) u potpunosti je spriječila nekrozu uzrokovanu LPS / zVAD. Primarna mikroglija štakora tretirana je kao što je naznačeno s LPS (0, 1 ng / ml), zVAD (25 μM) ili Nec-1 (20 μM ), a preživljavanje stanica ocijenjeno je brojenjem stanica. *** P <0, 001. ( b ) Reprezentativne slike PI / Calcein AM (gornja ploča) i fazni kontrast (donja ploča) mikroglije tretirane kao gore, pokazuju da je smrt mikroglija stanica izazvana LPS / zVAD ukinuta s Nec-1. Podaci predstavljaju najmanje tri neovisna pokusa. Šipke skale, 50 µm. ( c ) LPS je značajno regulirao ekspresiju RIP1 i RIP3 u mikroglijama što je određeno zapadnom blot analizom. Mikroglije štakora se preko noći aktiviralo malom dozom LPS-a, intenzivno se ispere i izloži 3 sata zVAD ili zVAD / Nec-1. Stanični lizati su zatim pripremljeni i podvrgnuti Western blot analizi. Prikazana je reprezentativna zapadna mrlja s kraćim vremenom izlaganja. Kvantifikacija relativne ekspresije RIP1 i RIP3 provedena je denzitometrijskom analizom western blota od 3 do 7 neovisnih pokusa. * P <0, 05; dvoredni student t test. ( d ) RT-PCR analiza mikroglije tretirane kao gore, pokazuje da LPS transkripcijski povećava ekspresiju RIP1 i RIP3. Actin i Iba1 korišteni su kao unutarnja kontrola, a TNF kao pokazatelj aktivacije mikroglija. RT, reverzna transkriptaza. Eksperimenti su ponovljeni tri puta sa sličnim rezultatima. ( e ) Nec-1 učinkovito ukinuta mikroglialna nekroza izazvana drugim TLR ligandima. Microglia je tretirana kako je naznačeno sa zVAD, Nec-1 i različitim TLR agonistima: TLR1 / 2 agonist Pam3CSK4 (0, 1 μg / ml), TLR3 agonist poli (I: C) (PIC, 10 µg / ml), ili TLR7 / 8 agonista R848 (1 μg / ml). Preživljavanje stanica određeno je brojenjem stanica. Podaci predstavljaju prosjek ± SEM dva neovisna pokusa. *** P <0, 001

Slika pune veličine

Mikroglialna nekroptoza izazvana aktivacijom TLR3 i TLR4 neovisna je o TNF / TNFR1, ali ovisi o TRIF i RIP3

S obzirom na naše otkriće da je TNF / zVAD sposoban potaknuti programiranu nekrozu u primarnoj mikrogliji (slika 3a) i činjenicu da se TNF proizvodi aktiviranom mikroglijom, dodatno smo istražili moguću uključenost autokrine TNF signalizacije u mikroglijsku nekrozu induciranu LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD. Prvo smo potvrdili da je nekroza uzrokovana LPS / zVAD doista posredovana putem LL receptora TLR4, jer je nekroptoza izazvana LPS, ali ne poli (I: C), potpuno ukinuta u mikrogliji s mutiranom tlr4 (slika 5a). Zatim smo pripremili miješane glijalne kulture iz mozgova miša tnf + / + i tnf - / - i ispitali preživljavanje mikroglija nakon stimulacije preko noći s LPS / zVAD. Iako tnf - / - mikroglije nisu bile sposobne proizvesti TNF, 36 bile su podjednako osjetljive kao divlji tip na staničnu smrt uzrokovanu LPS / zVAD (slika 5b), što sugerira da autokrinska proizvodnja TNF nije potrebna za nekrozu izazvanu LPS / zVAD. U skladu s tim, gubitak mikroglije uzrokovan LPS / zVAD također je bio neovisan o TNF receptoru TNFR1 (Slika 5b). Slično tome, poli (I: C) / zVAD uzrokovao je značajnu razinu toksičnosti i za mikrogliju divljeg tipa i za tnf (Dopunska slika S6). Zajedno, ovi rezultati pokazuju postojanje alternativnih putova koji iniciraju nekrozu osim puta TNF / TNFR1 u mikrogliji koja se aktivira TLR4 i TLR3.

Image

Smrt mikroglija stanica uzrokovana LPS / zVAD neovisna je o TNF / TNFR1, ali ovisi o TRIF i RIP3. ( a ) LPS / zVAD-inducirani mikrobni smrt mikrobnih stanica bio je potreban za LL / zVAD-inducirani receptor, ali ne i za poli (I: C) / zVAD. Mješovite glijalne kulture iz pojedinačne sekcije tlr4 divljeg tipa (WT) ( n = 2–5) i nokautom (KO) ( n = 3) mladunaca legla su tretirane nosačem, LPS (1 µ g / ml), LPS / zVAD (50 μM ), poli (I: C) (50 μg / ml) ili poli (I: C) / zVAD u trajanju od 20–24 h. Preživljavanje mikroglije utvrđeno je brojenjem Iba1 + stanica. *** P <0, 001; NS, nije značajno. ( b ) TNF i TNFRl bili su neophodni za mikroglijsku nekrozu izazvanu LPS / zVAD. Mješovite glijalne kulture pripremljene od WT i tnf -, tnfrl-oštećenih miševa tretirane su nosačem, LPS ili LPS / zVAD kako je naznačeno 20–24 h. Preživljavanje mikroglija utvrđeno je brojenjem Iba1 + stanica. Osjetljivost mikroglije na LPS / zVAD bila je ista u miješanim glijskim kulturama WT, tnf- i tnfrl -KO. Podaci predstavljaju tri do četiri neovisna pokusa. *** P <0, 001; NS, nije značajno. ( c ) TRIF je bio važan za LPS / zVAD- i poli (I: C) / zVAD-induciranu mikroglijsku nekrozu. Miješane kulture glija iz WT-a i triput miševi tretirane su s LPS / zVAD ili poli (I: C) / zVAD kao što je naznačeno, a preživljavanje mikroglija ocijenjeno je kao gore. Podaci predstavljaju prosjek ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. Ligi / zVAD- i poli (I: C) / zVAD-inducirana smrt mikroglija stanica potpuno su poništene u kulturama s trostrukim mutantima. Umetnite, Western blot analizu TRIF proteinske ekspresije u trif- WT i mutantnim mikroglijama. *** P <0, 001. ( d ), TRIF posredovana proizvodnja poli (I: C) inducirane TNF mikroglijama. Mješoviti glia iz divljih vrsta i triput miševi stimulirani su nosačima, LPS i poli (I: C) kao što je specificirano. Izlučivanje TNF-a određeno je ELISA supernatantima kulture iz svakog naznačenog stanja. Podaci predstavljaju dva neovisna pokusa sa sličnim rezultatima. ( e ) RIP3 posredovana LPS / zVAD- i poli (I: C) / zVAD inducirana programirana nekroza u mikroglijama. Mješovite glijalne kulture izvedene iz rip3 + / +, rip3 +/− i rip3 - / - littermati su izazvane sa LPS, poly (I: C) i zVAD tokom 24 sata, a preživljavanje mikroglija utvrđeno je brojenjem Iba1 + stanica. Podaci predstavljaju prosjek ± SEM za tri neovisna pokusa. *** P <0, 001

Slika pune veličine

Poznato je da aktiviranje TLR3 i TLR4 pokreće niz signalnih kaskada kroz različite adaptere. Kako je TRIF uobičajena molekula adaptera za signalizaciju TLR3 i TLR4, ispitivana je uloga TRIF u mikroglijskoj nekroptozi. Dok su LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD uzrokovali značajan gubitak divljeg tipa mikroglije, trostruke mutacije su potpuno zaštićene, pokazujući kritičnu ulogu za TRIF u smrti mikroglijalnih ćelija aktiviranih TLR3 / TLR4 (Slika 5c). Da bi se potvrdilo da je TRIF doista specifično posredovao signalnim događajima nakon TLR3 ligacije, analizirana je sekrecija TNF-a u supernatantima kulture. Kao što se očekivalo, proizvodnja TNF-induciranog poli (I: C) je ukinuta u trifimtantnim mikroglijama, dok je proizvodnja TNF-a izazvana LPS-om samo prolazno blokirana (Slika 5d). To je u skladu s konceptom da TLR4 regrutuje molekule adaptera MyD88 i TRIF, dok je TRIF jedina molekula adaptera za TLR3. 3 Jedna od potencijalnih mehanističkih veza između aktivacije TLR3 / TLR4 i nekroptoze je ta da TRIF fizički djeluje na RIP1 i RIP3 putem motiva homogenog proteina homologne interakcije (RHIM). 24, 37 U prilog ovoj ideji, nedostatak rip3- a u potpunosti je spriječio mikrogliju da nastane LPS / zVAD-, kao i poli (I: C) / zVAD-inducirana nekroza (Slika 5e), i nije imao utjecaja na proizvodnju TNF-a izazvanog LPS-om (nije prikazano). Zanimljivo je da je rip3 +/− heterozigota mikroglija pokazivala oko 50% osjetljivosti prema LPS / zVAD ili poli (I: C) / zVAD u usporedbi s rip3 + / + microglia (Slika 5e). Stoga, osim što je aktivacija RIP3 ključna regulatorna točka nekroptoze, naši podaci također pokazuju da je razina ekspresije proteina RIP3 važna za učinkovitu indukciju nekroptoze.

Aktivacija JNK i proizvodnja reaktivnih kisikovih vrsta orkestriraju smrt mikroglijskih stanica

Prethodno smo pokazali da okidači arahidonske kiseline programiraju nekrozu u oligodendrogliji putem RIP1 i nizvodno c-jun N-terminalne kinaze (JNK). 17 Da bismo utvrdili je li potrebna JNK aktivacija za mikroglijsku nekroptozu uzrokovanu LPS / zVAD, ispitali smo učinak JNK specifičnog inhibitora SP600125 na preživljavanje mikroglija. Izlijevanje pomoću SP600125 značajno je, ali ne i u potpunosti, spriječilo smrt stanice uzrokovanu LPS / zVAD (slika 6a), dok blokada p38 kinaze ili ERK1 / 2 nije imala zaštitni učinak (dopunska slika S7). U skladu s ulogom JNK-a u mikroglijskoj nekrozi, robusna JNK aktivacija uočena je 3 sata nakon tretmana LPS / zVAD i značajno je inhibirana SP600125, a u potpunosti Nec-1 (Slika 6b), što ukazuje da se JNK aktiviranje događa nizvodno od RIP1.

Image

Za programiranu nekrozu mikroglije potrebne su reaktivne kisikove vrste (ROS) i fosforilacija JNK. ( a ) Ublažavanje smrti mikroglija stanica uzrokovanih LPS / zVAD pomoću SP600125 (10 µM) i BHA (150 µM ). Čista mikroglija štakora tretirana je kako je naznačeno, a preživljavanje stanica određeno je prebrojavanjem Calcein AM + / PI - stanica 20-24 h kasnije. Vitamini K1 (1 µM ) i K2 (1 µM, menakinon-4) imali su umjeren učinak, ali nisu statistički značajni. AA861 (10 μM) nije imao zaštitni učinak. Podaci predstavljaju prosjek ± SEM od tri do pet neovisnih pokusa. *** P <0, 001; NS, nije značajno u usporedbi sa stanicama koje su tretirane LPS / zVAD. ( b ) Povećana fosforilacija JNK u mikrogliji tretiranoj LPS / zVAD i potpuna inhibicija Nec-1. Mikroglije štakora prethodno je tretirano sa vehiklom, Nec-1 (20 µM ), BHA (150 µM ) ili SP600125 (10 µM ) 1 sat nakon čega je slijedila stimulacija sa ili bez LPS (0, 1 ng / ml) i zVAD (10 μM ) 3 h. Zatim su pripremljeni mikroglialni lizati i podvrgnuti se Western blot analizama kako je opisano. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM denzitometrijske analize triju neovisnih pokusa. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; dvoredni Studentov t test

Slika pune veličine

Predloženo je da proizvodnja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), peroksidacija lipida i curenje lizosoma predstavljaju ključne korake za provođenje nekroze u određenim staničnim linijama. 13 Kako su mikroglije aktivirane LPS-om sposobne stvarati reaktivne vrste kisika / dušika, 8 mi smo zaključili da ROS-sredstvo za uklanjanje butila u hidroksianizolu (BHA) može spriječiti nekrozu uzrokovanu LPS / zVAD-om. Zapravo, mikroglialna nekroza uzrokovana LPS / zVAD gotovo je potpuno ublažena BHA (slika 6a). Suprotno tome i na naše iznenađenje, nismo primijetili nikakvu zaštitu inhibitorom 12-lipoksigenaze AA861, i samo manju, ali ne i statistički značajnu zaštitu vitaminom K1 i K2 (slika 6a), reagensima koji su svi bili vrlo učinkoviti u ublažavanju glutationa izazvanog iscrpljivanjem oksidativna ozljeda u oligodendrocitima i neuronima 38 kao i nekroptoza izazvana arahidonskom kiselinom u oligodendrocitima. 39 Osim toga, drugi klasični antioksidanti kao što su hidrofilni Trolox i lipofilni vitamin E ( α- tokoferol) nisu pružili značajnu zaštitu (dopunska slika S8), niti smo primijetili značajnu zaštitu inhibitorom sintaze dušičnog oksida L-NMMA, superoksid dismutazom mimičnim MnTMPyP, Inhibitor NADPH oksidaze difenileiodonij, katalizator razgradnje peroksnitrit FeTMPyP ili glutation-peroksidaza oponaša Ebselen (dopunska slika S7).

Da bi se dalje utvrdila uloga ROS-a u mikroglijskoj nekrozi, procijenjena je intracelularna produkcija ROS-a. Za razliku od prethodnih studija, nismo otkrili značajni fluorescentni signal u mikrogliji tretiranoj LPS / zVAD primjenom H2 DCF-DA, široko korištenog općeg staničnog oksidativnog stresa / ROS indikatora, 40 vjerovatno zbog slabog stanja aktivacije mikroglije. Međutim, otkriven je značajan porast fluorescentnog signala iz pokazatelja superoksida hidroetidina (HE) 41 u mikrogliji koja je tretirana LPS / zVAD tijekom 3 sata u usporedbi s onima tretiranim samo LPS-om (slika 7a). U skladu s njihovim učincima na preživljavanje, Nec-1 i BHA učinkovito su poništili HE signal izazvan LPS / zVAD dok vitamin E i K2 nisu (Slika 7a). JNK inhibitor SP600125, iako značajno i djelomično potisnuo smrt stanica uzrokovanih LPS / zVAD, imao je samo ograničen učinak na povećani HE signal uzrokovan LPS / zVAD, sugerirajući da je JNK aktivacija na razini ili niže od proizvodnje ROS. To se slaže s opažanjem da je BHA spriječila proizvodnju ROS-a i značajno i djelomično blokirala aktiviranje JNK izazvanog LPS / zVAD (Slika 6b). Daljnja analiza fluorescentne mikroskopije na razini pojedinačnih stanica otkrila je da proizvodnja superoksida izazvanog LPS / zVAD provodi permeabilizaciju plazma membrane i staničnu smrt (slike 7b-e). Ovi rezultati zajedno podržavaju ideju da je višak superoksida ili srodnih vrsta glavni izvor ROS-a u mikroglijama tretiranim LPS / zVAD. Ukratko, naši podaci pokazuju da je mikroglijska nekroptoza izazvana TLR4 orkestrirana nizom događaja posredovanih TRIF, RIP1 / RIP3 signalizacijom, JNK aktivacijom i specifičnom proizvodnjom ROS-a.

Image

Povišena proizvodnja superoksidnih anionskih orkestra mikroglobno propada i nastavlja se permeabilizacijom plazma membrane. ( a ) Povećana proizvodnja superoksidnih aniona mikroglijom aktiviranom LPS / zVAD i potpuno suzbijanje Nec-1 i BHA. Mikroglije su prethodno tretirane 1 sat prije Nec-1 (20 µM), BHA (150 µM ), vitamina E (10 µM ), vitamina K2 (10 µM ) ili SP600125 (10 µM ). stimulacija s niskom koncentracijom LPS (0, 1 ng / ml) ili LPS (0, 1 ng / ml) / zVAD (25 μM) tijekom 3 sata. Reaktivne vrste kisika su zatim procijenjene pomoću pokazatelja hidroetidina superoksidnog aniona (HE, 1 μM ) i protočne citometrije kako je opisano. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± tri nezavisna pokusa. ** P <0, 01; NS, nije značajno. ( b ) Reprezentativne slike fluorescencije i kontrastne faze mikroglija stimulirane s LPS / zVAD u trajanju od 3 sata i inkubirane 20 minuta s HE (1 µM) i Sytoxom (10 nM), pokazujući povećani oksidirani HE signal koji prethodi smrti mikroglija stanica (strelice) ). Bisbenzimid je korišten za vizualizaciju svih jezgara. Linija skale, 50 µm. ( c, d ) Reprezentativne stanice mikroglije u ( b ) pri većem povećanju, koje pokazuju povišeni oksidirani HE signal u subpopulaciji mikroglije (strelica u c, glava strelice u d ) koja prethodi permeabilizaciji plazma membrane u stanici koja umire (strelica u c ). Strelica nepomičnosti u ( d ) označava stanicu mikroglije s minimalno oksidiranim HE signalom. ( e ) Analiza vremenskog odmaka mikroglije opterećene HE i Sytoxom i tretirane LPS / zVAD otkriva da oksidirani HE signal prethodi staničnoj smrti. Ispravno , grafički prikaz srednjeg intenziteta HE i Sytox signala reprezentativne ćelije tijekom vremena. Šipke skale, 15 µm

Slika pune veličine

Rasprava

Programirana stanična smrt je temeljni stanični proces s kritičnim funkcijama u razvoju, homeostazi i imunitetu. Kaspaza ovisna apoptoza i nedavno identificirana programirana nekroza, koja se također naziva nekroptoza, dva su programirana puta smrti stanice za koje je dokazano da imaju glavnu ulogu u perifernom imunološkom sustavu, poput uklanjanja reaktivnih T stanica i urođene kontrole virusnih infekcija. 42, 43, 44 Microglia su imunološke stanice u CNS-u i reguliraju i urođene i adaptivne imunološke odgovore; međutim, do danas, prema našim saznanjima, malo je dostupnih podataka o programu nekroptoze u mikroglijama. U ovom istraživanju pokazali smo rad dvaju međusobno povezanih programiranih staničnih putova smrti u primarnoj mikrogliji aktiviranoj TLR-om: (1) apoptoza ovisna o kaspazi kod prekomjerno aktivirane mikroglije i (2) nekroptoza posredovana RIP3, koja je razotkrivena blokadom kaspaze. Agonisti TLR receptora, kao i TNF, mogli su pokrenuti primarnu nekrozu mikroglije kad je kaspaza-8 suzbijena zVAD-fmk ili IETD-fmk, pojave koje nisu primijećene u ostalim stanicama CNS-a, uključujući primarne neurone, astrocite i oligodendrocite. Specifični inhibitor RIP1 kinaze, nekrostatin-1, bio je vrlo učinkovit u spašavanju mikroglije protiv nekroptoze. Nadalje smo otkrili da je nekroza inducirana vezanjem mikroglijskog TLR4 ili TLR3 s LPS i poli (I: C), odnosno zVAD je bila neovisna o autokrinoj signalizaciji TNF / TNFR1 i transducirana je putem molekula adaptera TRIF, kao LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD nije uspio uzrokovati mikroglijsku nekroptozu u trifimtantnim stanicama. TRIF, RIP1 i RIP3 poznati su adaptivni proteini koji sadrže RHIM motive koji mogu međusobno komunicirati putem RHIM, 37, 45 i aktiviranje TLR3 i TLR4 u prisutnosti zVAD inducira stvaranje TRIF / RIP3 kompleksa. 24 U skladu s tim, genetska ablacija rip3 potpuno je poništila nekroptozu mikroglije, pokazujući apsolutni zahtjev za signalizacijom RIP3 u pokretanju nekrotične smrti aktivirane mikroglije. Konačno, čini se da aktiviranje JNK-a i stvaranje specifičnog ROS-a provode program smrti stanica i rezultiraju raspadom aktivirane mikroglije.

Mikroglije djeluju kao prva linija obrane u CNS-u i mogu se aktivirati putem TLR-a u različitim situacijama, ne samo mikrobnim PAMP-ima, već i molekulama koje potiču od domaćina oslobođenih iz oštećenih stanica. Međutim, regulacija homeostaze aktivirane mikroglije ostaje slabo razumljiva. Prekomjerna aktivacija mikroglije s LPS bila je povezana s povećanom smrti apoptotičkih stanica. Intrigantno, iako mala doza LPS-a aktivirala mikrogliju bez izazivanja stanične smrti, blokada kaspaze-8 pokrenula je snažan program nekroze ovisan o RIP1. Jedna je mogućnost da kaspaza-8 inaktivira RIP1 proteolitičkim cijepanjem21, a njegova supresija povećava stabilnost RIP1, senzibilizirajući stanice prema nekrozi posredovanoj RIP1. U stvari, pokazalo se da kaspaza-8 posjeduje procjepljujuće aktivnosti jer je potrebna za aktivaciju T-limfocita, 46, 47 diferencijaciju monocita 48, 49 kao i suzbijanje nekroptoze izazvane TNF-om. 13, 21 Caspase-8 i -3/7 nedavno su također uključeni u mikroglijsku aktivaciju, jer je njihova blokada IETD-fmk i DEVD-fmk potisnula LPS-induciranu uregulaciju iNOS-a i određenih citokina u BV-2 mikrogliji bez izazivanja stanične smrti, 27 Također smo otkrili da inhibitori kaspaze nisu uzrokovali smrt BV-2 i samo su umjereno supresirali proizvodnju TNF-a uzrokovanu LPS-om. Suprotno tome, blokada kaspaze nije spriječila izlučivanje TNF-a izazvanog lučenjem TNF-a u primarnim mikroglijama štakora, već je izrazito senzibilizirala stanice na izazivanje LPS-a. Važno je napomenuti da su primarne mikroglije štakora ranjivije od mišje mikroglije na stimulaciju TLR3 / 4 i blokadu kaspaze. Kako kaspaza-8 može komunicirati i oblikovati signalne komplekse sa, na primjer, cFLIP, FADD, RIP1 / 3 i TRIF u različitim kontekstima, 50 je potrebno daljnje istraživanje da se razgraniči točna funkcija kaspaze-8 u regulaciji mikroglijske aktivacije, preživljavanja i stanična smrt koristeći genetske pristupe. Drugi zanimljiv nalaz ove studije je da preko noći stimulacija mikroglije s LPS-om rezultira pojačanom RIP1 / RIP3 ekspresijom koja predisponira stanice za indukciju nekroptoze. Mehanizam koji počiva na reguliranju RIP-a izazvan LPS-om tek treba definirati.

Pokazalo se da je proizvodnja ROS-a potrebna za nekroptozu kod nekih tipova stanica, ali kod drugih. 35, 50, 51 Zanimljivo je napomenuti da je samo lipofilni antioksidans BHA sprečavao nekroptozu posredovanu TLR3 / 4 i bio je zapravo antioksidans korišten u većini prethodnih studija o nekroptozi. Ostali lipofilni antioksidanti, poput α- tokoferola, mimika antioksidativnih enzima i inhibitora lipoksigenaze, iako učinkoviti u sprječavanju nekroptoze izazvane arahidonskom kiselinom u oligodendrocitima, 17 nisu učinkovito blokirali mikroglijsku nekrozu posredovanu TLR-om. Zhang i sur. 22 su također primijetili da samo BHA sprečava nekrozu uzrokovanu TNF-om u N stanicama. U skladu s našim nalazima, ustanovljeno je da povišena razina proizvodnje superoksida u mikrogliji tretiranoj LPS / zVAD prethodi staničnoj smrti i potpuno su je ukinuli Nec-1 i BHA. Iako ne možemo isključiti mogućnost da BHA može imati druge učinke osim sprečavanja proizvodnje superoksida, u cjelini naši podaci snažno sugeriraju da je za nekroptozu uzrokovanu TLR-aktivacijom u mikrogliji potreban specifični ROS na određenim subcelularnim lokacijama.

Microglia su specificirani makrofagi u CNS-u. Nedavna istraživanja pokazala su da mikroglije imaju izrazito embrionalno podrijetlo od monocita koji potiču iz koštane srži, koloniziraju CNS tijekom ranog embrionalnog razvoja i pokazuju jedinstvene osobine poput razmnožavanja koje ih razlikuje od makrofaga. 52 Međutim, naša identifikacija puta nekroptoze izazvane TLR / zVAD, slična onoj kod makrofaga, 24, 35 u mikroglijama postavlja pitanje može li zaštita od nekrotične smrti mikroglija stanicama biti korisna u CNS-u s obzirom na to da nekrotična smrt stanica često rezultira upala. S druge strane, moguće je da je nekroptoza rezervna strategija urođenih imunoloških stanica protiv patogena kako bi stimulirali imunološki sustav kada apoptozu blokiraju, na primjer, virusi. 13, 34 Patološka mikroglijska stanična smrt ili degeneracija doista su primijećeni na mišjim modelima amiotrofične lateralne skleroze, 53 multiple skleroze 54 i neurodegenerativnih bolesti. 55 Međutim, okidač i posljedice smrti mikroglijskih stanica ostaju u velikoj mjeri neistraženi i zahtijeva daljnje istraživanje.

Ukratko, naši podaci otkrili su da mikroglija aktivirana putem TLR-a može biti podvrgnuta apoptozi radi samo-uklanjanja ili RIP3-posredovanoj programiranoj nekrozi kada je osjetljiva na zVAD ili pod određenim uvjetima. Stoga se čini da mikroglialna TLR aktivacija ne samo pokreće imunološke reakcije CNS-a protiv patogena i oštećenja tkiva, već se može iskoristiti i za reguliranje sudbine stanica aktiviranih mikroglija. Zaista, tijekom postupka pregleda našeg rukopisa, nedavno istraživanje pokazalo je da zVAD inducira nekrozu mikroglije aktiviranog LPS-om u miješanim kulturama neurona / glija, tako što posredno štiti neurone od toksičnosti LPS. 56 Budući da mikroglija ima kritičnu fiziološku i patološku ulogu u mnogim neurološkim poremećajima, detaljno razumijevanje mehanizma koji regulira preživljavanje i smrt aktiviranih mikroglija može pružiti nove strategije za ciljanje neurodegeneracije i neuroinflamation.

Materijali i metode

Životinje i reagensi

Wild-type B6.129SF2/J and C57BL/6J mice, TNF α (wild-type control B6.129SF2/J, # 003008) and TNFR1 (wild-type control C57BL/6J, #003242) knockout (KO) mice, and TRIF (Ticam1, background C57BL/6J, #005037) mutant mice were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Rip3-deficient mice were generous gift from Dr. Xiaodong Wang (National Institute of Biological Sciences, China) and Dr. Astar Winoto (University of California, Berkeley). BV-2 microglial cells were kindly provided by Dr. Monica Carson (University of California, Riverside). DMEM, HBSS, propidium iodide, Calcein AM, Alamar blue, and hydroethidine were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Antibody against Iba1 was from Wako chemicals (Richmond, VA, USA). Recombinant TNF, zVAD-fmk, IETD-fmk, DEVD-fmk, YVAD-fmk, and antibody against RIP1 were obtained from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Rabbit anti-RIP3 and TRIF antibodies were from IMGENEX (San Diego, CA, USA). JNK, pJNK and active caspase-3 antibodies were obtained from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Pam3CSK4 and R848 were obtained from InvivoGen (San Diego, CA, USA). JNK inhibitor II (SP600125) was from Merck (Darmstadt, Germany). MnTMPyP, 0FeTMPyP, L-NMMA and Ebselen were obtained from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, UA). HRP-conjugated secondary antibodies were obtained from Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). Unless specified otherwise, all other reagents were from Sigma (St. Louis, MO, USA).

Primary glial cell cultures

Primary microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and mixed glial cultures were prepared from forebrains of 1- to 2-day-old Sprague–Dawley rat pups as described previously. 8, 36 Briefly, dissociated cells were plated onto poly- D -lysine (PDL)-coated T75 flasks or 96 well culture plates and were fed every other day with D10S (DMEM with 10% FBS) for 7–10 days. Microglia were isolated by shaking mixed glia-containing flasks for 1 h at 200 rpm The purity of microglia at this stage was consistently >95%. For highly purified microglia monocultures (>99%), the cells were plated onto regular petri dishes for 1 h, detached from the plates with ice cold EBSS, and plated at final density of 3 × 10 4 cells per well in 96-well plates. Following 1-h pre-shaking, the flasks were shaken overnight at 200 rpm to separate OL precursors (preOLs) from the astrocyte layer. The cell suspension was then plated onto uncoated Petri dishes for 1 h to remove residual contaminating microglia, and the resulting preOLs were plated into poly- L -ornithine-coated culture plates and maintained in a serum-free basal defined medium (0.1% bovine serum albumin, 50 μ g/ml human apo-transferrin, 50 μ g/ml insulin, 30 nM sodium selenite, 10 nM D -biotin and 10 nM hydrocortisone in DMEM) supplemented with PDGF 10 ng/ml and bFGF 10 ng/ml for 5–9 days at 37 °C in a humid atmosphere of 5% CO2 and 95% air. Astrocytes (>95%) were purified from the remaining astrocyte layer in the flask after being exposed to a specific microglia toxin L -leucine methyl ester (1 mM) for 1 h and were subcultured one to two times. Mouse mixed glial cultures were prepared with similar methods as described above from B6.129SF2/J, C57BL/6J, TRIF mutant, TNF KO, TNFR1 KO, and rip3 KO mice and were seeded in PDL-coated 96-well plates. Mixed glial cultures at DIV6-7 were used in this study.

Cell treatment and survival determination

Microglia monocultures were washed two times with D1S (DMEM containing 1% FBS) and treated in triplicate with vehicle, LPS, Pam3CSK4, R848, poly(I:C), or TNF α in the presence or absence of zVAD-fmk or IETD-fmk as specified. For mixed glial cultures, cells were treated in serum-free basal defined medium. 30 As microglia in mixed glial cultures were not as sensitive as in isolated pure cultures to LPS/zVAD-induced necroptosis, higher concentrations of LPS and poly(I:C) were used. Microglial survival was determined by counting Iba1 + cells with normal nuclei in mixed glia cultures or Calcein AM + /propidium iodide (PI) cells in pure microglia cultures. Total number of cells was revealed by staining all nuclei with Hoechst 33342. Five to ten random consecutive fields were counted in each well under 100 × or 200 × magnification, with a total of >1000 cells counted in the control condition. In some cases, cell viability in monocultures was determined by measuring cell metabolic activity using Alamar Blue, a tetrazolium dye that is reduced by living cells to a colored product as previously described. 38 57

For experiments involving RNA and protein isolation, primary microglia were seeded into six-well plates at a density of 1.5–2 × 10 6 cells/well in D10S. After attachment, the cells were washed twice with D1S, and pre-treated with LPS (0.1 ng/ml) for 12–16 h. At the end of LPS treatment, microglia were washed twice with D1S and incubated with Nec-1, butylated hydroxyanisole (BHA), SP600125, or corresponding vehicle for 1 h before the induction of necrosis with zVAD-fmk addition. Microglia were then collected with ice-cold PBS at 1 h (RNA extraction) and 3 h (protein preparation) post zVAD-fmk treatment. Vehicles used were PBS for LPS, DMSO for zVAD-fmk, Nec-1, and SP600125, and ethanol for BHA, and these were used at the same final concentration volume (<0.1%) as the corresponding reagent.

In situ caspase-8 activity assay

To detect caspase-8 activity in situ in living microglia, a caspase-8 detection kit containing a specific and fluorescent FAM-LETD-fmk that covalently labels active caspase-8 was used according to the manufacturer's instruction (Image-iTs LIVE Green Caspase-8 Detection Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After live labeling of active caspase-8, microglia were fixed and subjected to immunocytochemistry as specified in the Figure 1 legend. Images were captured using a fluorescence microscope equipped with an Olympus DP70 digital camera. On the basis of the intracellular location of active caspase-8, the percentage of microglia with cytoplasmic diffuse caspase-8 signal (C-casp-8) and localized active caspase-8 (L-casp-8) was counted and analyzed across treatment conditions.

Detection of intracellular ROS

Intracellular ROS production was evaluated by flow cytometry using the superoxide indicator hydroethidine (HE) 41, 58, 59 and visualized by fluorescence microscopy. Briefly, freshly isolated primary rat microglia were treated in suspension as specified in Figure 7 legend. At the end of the treatment, cells were incubated with 1μM HE and 10 nM Sytox green nucleic acid stain for 20 min at 37 °C, centrifuged at 100 × g , resuspended in 100 μ l of PBS containing 2% FBS and analyzed immediately using a flow cytometer equipped with 488 nm laser for excitation (Accuri C6, BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Data were collected using FL1 for Sytox green nucleic acid stain (530±15 nm) or FL2 channel for HE (585±20 nm). A minimum of 10 000 cells were analyzed per condition. For time lapse microscopy, microglia seeded in slide chambers were loaded with 1 μ M HE and 10 nM Sytox for 20 min, washed and subjected to LPS (0.1 ng/ml)/ zVAD-fmk (25 μ M) stimulation. Images were manually acquired from the same chamber field at specified time points. To minimize photobleaching, cells were imaged with <0.5 s of exposure time for each filter. Fluorescence intensity of representative cells was analyzed with Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Reverse transcription -PCR

Transcriptional expression levels of RIP1, RIP3, Iba1, TNF α , and β-actin in microglia upon stimulation with LPS and zVAD-fmk were examined as described previously. 57 Using Tri reagent, total RNA was extracted according to the manufacturer's instructions. Residual DNA was digested by incubating RNA samples with DNase I for 15 min at room temperature followed by DNase inactivation at 65 °C for 10 min according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). The samples were reverse transcribed to cDNA using the reverse transcription system kit (Promega, Madison, WI, USA) as described previously. 57 Primers specific for β -actin were used as a loading control. All products were amplified by PCR using 50 ng of cDNA and the following specific primers: RIP1, forward 5′-GCACCAGCTGTCAGGGCCAG-3′, reverse 5′-GCCCAGCTTTCGGGCACAGT-3′; RIP3, forward 5′-ACCTTGGCTGGCACTCCCCA-3′, reverse 5′-CCCCTGCCGAACTGTGCTGG-3′; TNF α , forward 5′-GCCCACGTCGTAGCAAAC-3′, reverse 5′-GCAGCCTTGTCCCTTGAA-3′; Iba1, forward 5′-CTTTTGGACTGCTGAAAGCC-3′, reverse 5′-GTTTCTCCAGCATTCGCTTC-3′; and β -actin, forward 5′-AGACTTCGAGCAGGAGATGG-3′, reverse 5′-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3′. After the PCR reaction, products were electrophoresed on 2% agarose gels and visualized under UV light using a Bio-Rad Chemidoc XRS gel documentation system and Quantity-one software.

TNF α ELISA

TNF α levels in culture supernatants were determined using a commercially available ELISA kit according to the manufacturer's instruction (eBioScience). Absorption at 450 nm was determined with a microplate reader (Fluostar Optima, BMG Labtech, Cary, NC, USA). The detection limits of the TNF ELISA were 8 pg/ml for mouse TNF α and 16 pg/ml for rat TNF α .

Transmission electron microscopy

After a quick wash with PBS, microglia were fixed in 1% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde (Electron Microscopy 225 Sciences, Hatflield, PA, USA) in 0.1 M, pH 7.4 phosphate buffer overnight at 4 °C. Following three washes with 8% sucrose in 0.1 M phosphate buffer, the cells were washed again in 0.1 M sodium cacodylate buffer and stained with 1% osmium tetroxide and 0.5% potassium ferrocyanide in 0.5% sucrose for 1.5 h. The cells were then dehydrated in ascending alcohol series and embedded in epoxy resin. Ultrathin sections of microglia were examined using an FEI Morgagni 268 transmission electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV. Digital images were acquired with a MegaViewIII camera operated with iTEM software (Olympus Soft Imaging Systems, Germany).

Immunostaining, TUNEL and immunofluorescence microscopy

After the treatment, microglia were fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 10 min. Cells were rinsed three times with TBS, and blocked with TBS-T (0.1% Triton X-100) containing 5% goat serum for 1 h at room temperature. Primary antibody against Iba1 (1 : 2000) was used for detecting microglia. Antibody against cleaved, active casaspe-3 (1 : 1000) was used to evaluate caspase-3 activation. After overnight incubation at 4 °C, secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594 (1 : 1000; Invitrogen) were used. Nuclei were stained with Hoechst 33342. To label fragmented DNA, TUNEL was performed using an in situ cell death detection kit (Roche, Indianapolis, IN, USA). All images were captured with an inverted fluorescence microscope equipped with an Olympus DP70 digital camera (model IX71; Olympus, Tokyo, Japan).

Statistička analiza

All cell culture treatments were performed in at least triplicate samples. GraphPad prism software (San Diego, CA, USA) was used for data analyses. Data were expressed as mean±SEM and analyzed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test unless stated otherwise. Differences were considered to be statistically significant when P <0.05.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

CNS

središnji živčani sustav

HE

hydroethidine

JNK

c-jun N-terminal kinase

LPS

lipopolisaharid

Nec-1

necrostatin-1

RHIM

receptor-interacting protein homotypic interaction motif

POČIVAO U MIRU

receptor-interacting protein

ROS

reaktivne vrste kisika

TLR

Cestarinski receptor

TNF

tumor necrosis factor α

TNFR1

TNF receptor 1

TRIF

TIR-domain containing adapter-inducing interferon- β

TUNEL

terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)