Ccl-1 u leđnoj moždini doprinosi neuropatskoj boli uzrokovanoj ozljedom živaca | stanična smrt i bolest

Ccl-1 u leđnoj moždini doprinosi neuropatskoj boli uzrokovanoj ozljedom živaca | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • kemokina
  • Neuropatska bol
  • patogeneza
  • Leđna moždina

Sažetak

Poznato je da su citokini poput interleukina uključeni u razvoj neuropatske boli aktiviranjem neuroglije. Međutim, uloga hemokin (CC motiv) liganda 1 (CCL-1), dobro karakteriziranog hemokina koji se izlučuju aktivirane T stanice, u nociceptivnom prijenosu ostaje nejasna. Otkrili smo da je CCL-1 reguliran u dorzalnom rogu kralježnice nakon djelomične ligacije išijasa. Stoga smo ispitali djelovanje rekombinantnog CCL-1 na vrijednosti ponašanja u ponašanju, sinaptički prijenos, funkciju glijalnih stanica i proizvodnju citokina u dorzalnom rogu kralježnice. Ovdje pokazujemo da je CCL-1 jedan od ključnih posrednika koji sudjeluju u razvoju neuropatske boli. Ekspresija CCL-1 mRNA uglavnom je otkrivena u ipsilateralnom dorzalnom gangliju, a ekspresija specifičnog CCL-1 receptora CCR-8 je povišena u površnom dorzalnom rogu. Pojačana ekspresija CCR-8 uočena je ne samo u neuronima, već i u mikroglijama i astrocitima na ipsilateralnoj strani. Rekombinantni CCL-1 ubrizgavao je intratekalno (it) naivnim miševima induciranu alodiniju, što je spriječeno dodatnim dodavanjem antagonista N- metil-D-aspartata (NMDA) receptora, MK-801. Patch-clamp snimke s kriške leđne moždine otkrile su da primjena CCL-1 prolazno pojačava ekscitatorni sinaptički prijenos u supstanci želatinoze (lamina II). Dugoročno, ubrizgava CCL-1 induciranu fosforilaciju NMDA receptorske podjedinice, NR1 i NR2B, u leđnu moždinu. Injekcija CCL-1 također je povećala razinu mRNA markera glijalnih stanica i proinflamatornih citokina (IL-1 β , TNF- α i IL-6). Taktilna alodinija izazvana ligacijom živaca ublažena je profilaktičkim i kroničnim davanjem neutralizirajućih antitijela protiv CCL-1 i obaranjem CCR-8. Naši rezultati pokazuju da je CCL-1 jedna od ključnih molekula u patogenezi, a CCL-1 / CCR-8 signalni sustav može biti potencijalni cilj razvoja lijekova u liječenju neuropatske boli.

Glavni

Neuropatska bol (također klasificirana kao kronična ili zloćudna bol) povezana je s ozljedom živaca višestruke etiologije koja uključuje akutnu traumu, dijabetes, rak, infekciju i autoimunu patologiju. 1 Patogeneza neuropatske boli odražava složeno preuređenje leđne moždine, pri čemu se primarna uloga pripisuje promjeni sinaptičkog prijenosa i aktiviranju neuroglialnih stanica, astrocita i mikroglija. 2, 3, 4

Glutamat, glavni ekscitacijski neurotransmiter u mozgu i leđnoj moždini, pokazuje svoje postinaptičke učinke pomoću različitih skupa ionotropnih i metabotropnih receptora membrane. Glutamatni ionotropni N- metil-D -parpartatni receptori (NMDARs), posebno oni lokalizirani u dorzalnom rogu leđne moždine, kritički su uključeni u nociceptivni prijenos i sinaptičku plastičnost i dugo se smatraju metama za liječenje neuropatske boli. 5, 6 Nativni neuronski NMDAR je tetramer koji se sastoji od dvije NR1 i dvije NR2 podjedinice. 7 Poznato je da fosforilacija više mjesta u citoplazmatskim C termininima NR1 i NR2 podjedinica modulira NMDAR aktivnost i utječe na sinaptički prijenos. 8, 9, 10

Mnogo je izvještaja da ozljeda živaca pokreće reaktivne promjene u perifernom imunološkom sustavu i u neuroglijalnim stanicama u perifernom i središnjem živčanom sustavu. 4, 11, 12 U periferiji se aktivacijom Schwannovih stanica i rezidentnih makrofaga regrutuju hematogene imunološke stanice koje kasnije upadaju u ozlijeđene živce. 12, 13, 14 U dorzalnom rogu kralježnice koji prima ozlijeđene osjetilne afere, aktivacija mikroglije obično je povezana s ranim fazama uspostavljanja neuropatske boli. 2, 15, 16 citokini kao što su interleukin-1 β (IL-1 β ), faktor nekroze tumora- α (TNF- α ) i IL-6, koji potječu iz perifernog ozlijeđenog područja ili iz aktiviranih neuroglijskih stanica u kičmeni moždini, poznato je da mijenjaju sinaptički prijenos u dorzalnom rogu. 13, 14

Hemokini i njihovi receptori se široko eksprimiraju u imunološkim stanicama i živčanom sustavu. 17, 18 Nedavna istraživanja pokazala su da kemokini CC motiv ligand 2 (CCL-2) i CX3CL-1 izazivaju taktilnu alodiniju (kada neboleli neškodljivi podražaji postanu bolni) aktivacijom mikroglije leđne moždine. 17, 19 Ove reaktivne promjene posredovane citokinima i hemokinima razvijaju se paralelno s taktilnom alodinijom, a posljednji je glavni simptom neuropatske boli. 20

CCL-1 (također poznat kao hemotaktički agens 3 koji se dobije iz timusa) jedan je od dobro karakteriziranih hemokina i razvrstan je u istu CC hemokinsku skupinu kao CCL-2. CCL-1 izlučuje aktivirane T stanice, mastociti i endotelne stanice i ima važnu ulogu kao kemoatratant za neutrofile i monocite. Iako su učinci CCL-1 na imunološke stanice dobro opisani, uloge CCL-1 u središnjem živčanom sustavu, posebno u razvoju neuropatske boli, ostaju nejasne. U ovom smo izvještaju ustanovili da CCL-1 sudjeluje u razvoju taktilne alodinije nakon oštećenja perifernog živca poboljšanjem spinalnog nociceptivnog prijenosa i aktivacijom glijalnih stanica s naknadnim oslobađanjem citokina.

Rezultati

Ekspresija CCL-1 u leđnoj moždini kod neuropatskih miševa

Prvo smo ispitali razvoj alodinije u modelu djelomičnih ligacija išijas (PSNL). Miševi su pokazali značajno povećanje reakcije povlačenja na mehanički podražaj u ipsilateralnoj stražnjoj šapi (taktilna alodinija) već 7 dana nakon PSNL. Ocjena boli u ipsilateralnoj stražnjoj šapi bila je 7, 5 ± 0, 8 ( n = 8), dok je kontralateralna zadnja šapa bila 1, 9 ± 0, 6 ( n = 8) (Slika 1a). Paralelno, razina proteina CCL-1 značajno se povećala 7 dana nakon PSNL-a u ipsilateralnoj leđnoj moždini (relativna razina proteina, 0, 14 ± 0, 01; n = 4) u usporedbi s kontralateralnom leđnom moždinom (relativna razina proteina, 0, 10 ± 0, 01; n = 4) (Slika 1b). S druge strane, razine ostalih citokina, TNF- a , interferon- y i IL-1 β nisu značajno promijenjene 7 dana nakon vezivanja živaca (Slika 1b).

Image

Povećanje CCL-1 u leđnoj moždini nakon vezivanja živaca. ( a ) Miševi su pokazali taktilnu alodiniju u ipsilateralnoj stražnjoj šapi 7 dana nakon PSNL. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( n = 8). ** P <0, 01: nasuprot prije kontralateralne ligacije (dvosmjerna analiza varijance (ANOVA), a zatim Tukey-Kramer test). ( b ) citokinske matrice na uzorcima leđne moždine 7 dana nakon vezivanja živaca. Relativne vrijednosti proteina citokina i hemokina normalizirane su na pozitivne kontrolne vrijednosti u Kit polju. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( n = 4). ** P <0, 01: nasuprot kontralateralnom (dvostrani Studentov upareni t- test). ( c ) Uspoređivanje CCL-1 mRNA između leđne moždine i DRG. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( n = 4). * P <0, 05: nasuprot leđnoj moždini (dvoredni Studentov upareni t- test). ( d ) Vremenski tijek razina CCL-1 mRNA u DRG nakon vezivanja živaca ocijenjen je kvantitativnom reverznom transkriptazom (RT) -PCR. ( e ) Vremenski tijek razine CCL-1 mRNA u leđnoj moždini nakon vezivanja živaca ocijenjen je kvantitativnim RT-PCR-om. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( d, n = 4; e, n = 6). ** P <0, 01, * P <0, 05: prema odnosu prije ligacije (jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom)

Slika pune veličine

Vremenski tijek ekspresije CCL-1 mRNA u leđnoj moždini i dorzalnom korijenskom gangliju (DRG) nakon vezivanja živaca

Prvo smo usporedili CCL-1 mRNA između leđne moždine i DRG prije vezivanja živaca. CCL-1 mRNA izražena je u DRG (12428 ± 3606, 7%; n = 4) više od leđne moždine (Slika 1c). Zatim smo ispitali ekspresiju CCL-1 mRNA u PSNL modelu. Razina CCL-1 mRNA značajno se povećala nakon 3 sata, 1 i 3 dana (194, 4 ± 19, 9%, 147, 3 ± 17, 3%, 142, 0 ± 2, 0%, respektivno; n = 4) nakon vezivanja živaca u DRG (slika 1d). U leđnoj moždini nivo CCL-1 mRNA značajno se povećao u 3 sata nakon vezivanja živaca (361, 1 ± 74, 5%; n = 6; Slika 1e).

Vremenski tijek ekspresije proteina CCR-8 u leđnoj moždini

CCR-8 je specifičan receptor za CCL-1. 22 Ligacija živaca povećala je razinu proteina CCR-8 u ipsilateralnoj dorzalnoj moždini 6 sati nakon operacije (Slike 2a i c). Relativna razina proteina CCR-8 u usporedbi s β- aktinom također je pokazala značajno povećanje 6 sati nakon vezivanja (relativna razina proteina, 0, 9 ± 0, 1; n = 9; Slika 2b). Izvršili smo ko obojenje CCR-8 s neuronskim ili glijalnim markerima 6 sati nakon vezivanja živaca u leđnoj moždini. Pojačana ekspresija CCR-8 uočena je ne samo u neuronima, već i u mikroglijama i astrocitima na ipsilateralnoj strani (slika 3). Pored toga, pokazali smo da se CCR-8 eksprimira ne samo na glutamatergičnim neuronima, već i na GABAergičkim neuronskim vlaknima u primarno kultiviranim neuronima (dopunska slika S1).

Image

Izražavanje CCR-8 u leđnoj moždini nakon vezivanja živaca. ( a i b ) Razine proteina CCR-8, selektivnog receptora za CCL-1, u leđnoj moždini u različitim vremenskim točkama nakon vezivanja živaca procijenjene su Western blottingom. C, kontralateralno; I, ipsilateralno. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( b, n = 9). ** P <0, 01: nasuprot ipsilateralnom prije vezivanja, # P <0, 05: nasuprot kontralateralnom (dvosmjerna analiza varijance, praćena Tukey-Kramerovim testovima). ( c ) Imunoziranje na CCR-8 u kontralateralnoj (Contra-) i ipsilateralnoj (Ipsi-) leđnoj moždini prije i 6 sati nakon vezivanja živaca. Šipke = 200 μ m (gornje ploče), 100 μ m (donje ploče)

Slika pune veličine

Image

Ekspresija CCR-8 u neuronima, mikroglijama i astrocitima nakon vezivanja živaca. ( a ) Imunoziranje na NeuN (crveno) i CCR-8 (zeleno) 6 sati nakon vezivanja živaca u leđnoj moždini. Trake = 10 μ m. ( b ) Imunozirajući na Iba1 (crveni) i CCR-8 (zeleni) 6 h nakon vezivanja živaca u leđnoj moždini. Trake = 10 μ m. ( c ) Imunoziranje na GFAP (crveno) i CCR-8 (zeleno) 6 h nakon vezivanja živaca u leđnoj moždini. Trake = 10 μ m

Slika pune veličine

Injekcija neutralizirajućeg antitijela protiv CCL-1 inhibira alodiniju izazvanu ligacijom živca

Da bi se ispitao profilaktički učinak blokiranja CCL-1 protiv taktilne alodinije, 10 minuta prije vezivanja živaca i 6 uzastopnih dana nakon stavljanja živca ubrizgano je neutralizirajući antitijelo protiv CCL-1 (anti-CCL-1, 2, 5, 25 i 50 ng). podvezivanja. Injekcija 50 ng anti-CCL-1 antitijela značajno je smanjila taktilnu alodiniju u 3, 5 i 7 dana nakon vezivanja živaca (rezultat boli u svakoj točki, 5, 2 ± 0, 8, 6, 0 ± 0, 8 i 6, 0 ± 0, 9; n = 15, respektivno ; Slika 4a). Inhibicija profilaktičkim davanjem anti-CCL-1 protutijela bila je ovisna o koncentraciji (Slika 4b). Da bi se ispitivali učinci post-kronične primjene, započela je svakodnevna injekcija antitijela anti-CCL-1 3 dana nakon vezivanja živaca i nastavljena 7 dana. Za razliku od profilaktičke primjene, taktilna alodinija nije blokirana jednom nakon što je izazvana ligacijom živaca (Slika 4c).

Image

Inhibicija alodijanije ligacije, neutraliziranjem antitijela protiv CCL-1. ( a i c ) Učinci CCL-1 neutralizirajućih antitijela (anti-CCL-1) na alodiniju induciranu živčanom ligacijom. CCL-1 neutralizirajući antitijelo (anti-CCL-1) ili nosač (kontrolni serum) najprije se ubrizgava 10 min prije vezivanja živaca ( a ) ili 3 dana nakon vezivanja živaca ( c ), a zatim svakodnevno davanje (prikazano strelicama). Rezultati su mjereni upotrebom von Freyjeve niti (vehikl, n = 17; svaka koncentracija anti-CCL-1, n = 15). 0 = prije vezivanja. ( b ) Inhibicija inhibicije alodijanije protutijelama anti-CCL-1 provedena 7 dana nakon vezivanja živaca metodom profilaktičke i kronične primjene. Svaki podatak predstavlja srednju vrijednost ± SE * P <0, 05: prema vozilu (dvosmjerna analiza varijancije, praćena Tukey-Kramerovim testom)

Slika pune veličine

Injekcija alodinije izazvane CCL-1, koju je oslabio NMDAR inhibitor

Dalje smo ispitali učinak intratekalne (it) injekcije CCL-1 na nociceptivno ponašanje. Učinak CCL-1 ovisio je o dozi i vremenu; 25 ng CCL-1 značajno je povećalo rezultat boli nakon 10, 20, 30, 40 i 80 min (rezultat boli u svakoj točki, 8.6 ± 1.2, 11.3 ± 1, 11.4 ± 1.7, 11.6 ± 0.9, 9.2 ± 1.4 i 7.4 ± 0, 9, respektivno; n = 8; Slika 5a). Ocjena bola 20 min nakon ubrizgavanja različite koncentracije CCL-1 prikazana je na slici 5b. NMDAR su kritični u patogenezi alodinije. 5, 6 U našem modelu je alodinija izazvana ubrizgavanjem CCL-1 (25 ng) ovisna o dozi ko-injekcijom MK-801, NMDAR antagonista ovisnog o nekompetitičnoj upotrebi, u koncentraciji od 125 ° C. 250 i 500 pM (slika 5c). MK-801 je pokazao inhibiciju alodnije ovisne o dozi inducirane CCL-1 nakon 10, 20, 30, 40 i 50 min nakon injekcije (rezultat boli u svakoj točki, 3.0 ± 0.7, 4.6 ± 0.7, 6.4 ± 1.0, 4.3 ± 0.8, 4.0 ± 0.7; n = 8; Slika 5c). IC50 za MK-801 učinke bio je 354 pM ( n = 8) kada je određen 20 minuta nakon ubrizgavanja CCL-1 (Slika 5d), što sugerira ulogu NMDA posredovanog prijenosa u alodiniji.

Image

Indukcija alodinije CCL-1 i prigušivanje CCL-1-inducirane alodije od NMDA antagonista i učinak CCL-1 na ekscitacijski sinaptički prijenos u površnom dorzalnom rogu kralježnice. ( a ) Intrahekalna (it) injekcija CCL-1 u alojiniju induciranu naivnim miševima (nosač, n = 12; svaka koncentracija CCL-1, n = 8). ( b ) Ovisnost koncentracije CCL-1-inducirane alodnije 20 min nakon ubrizgavanja CCL-1. ( c ) Ko-injekcija MK-801 blokiranog alodinija induciranog CCL-1 (25 ng, it) (nosač, n = 12; svaka koncentracija MK-801, n = 8). ( d ) Inhibicija alodine ovisna o koncentraciji MK-801 50 min nakon injekcije. Koncentracija MK-801 za 50% inhibicije (IC50) bila je 354 pmol. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ** P <0, 01, * P <0, 05 u odnosu na nosivost; ## P <0, 01, # P <0, 05: nasuprot CCL-1 (25 ng) (dvosmjerna analiza varijance, praćena Tukey-Kramerovim testovima). ( e ) Reprezentativni ekscitacijski učinak CCL-1 (50 ng / ml) na sEPSC evocirane u supstanci želatinoznih neurona s potencijalom zadržavanja od -70 mV (lijevi tragovi). CCL-1 pokrenuo je niz sEPSC-ova. Ekscitacijsko djelovanje CCL-1 otkriveno je u oko 40% testiranih neurona (vidjeti odjeljak s rezultatima). Grafikoni u desno prikazuju radnje CCL-1 na frekvenciji i amplitudi sEPSC ( n = 9)

Slika pune veličine

CCL-1 povećava otpuštanje glutamata u površnom dorzalnom rogu leđne moždine

Ispitali smo djelovanje CCL-1 na ekscitatorni sinaptički prijenos u površnom dorzalnom rogu kralježnice, u supstanci želatinoza (lamina II), pomoću cijeloćeličnih zakrpa-steznih zapisa s mišjih kriški moždine. Kad su stanicu držali na -70 mV, neuroni supstancije želatinoze pokazali su spontane ekscitacijske postinaptičke struje (sEPSC) prosječne frekvencije od 7, 1 ± 1, 0 Hz i amplitude 11, 4 ± 0, 9 pA ( n = 9). U četiri od devet ispitivanih stanica, primjena CCL-1 (50 ng / ml) u kupelji tijekom 60–90 s pojačala je ekscitacijski sinaptički prijenos kao što je prikazano na slici 5e; ova akcija trajala je više od 3–5 min. U stanicama osjetljivim na CCL-1, frekvencija i amplituda sEPSC u prisutnosti CCL-1 bili su 174 ± 11%, odnosno 110 ± 6.3% kontrola (Slika 5e). U prisutnosti TTX (1 µM ), takav ekscitacijski učinak CCL-1 detektiran je i u dvije od šest ispitivanih stanica (podaci nisu prikazani).

NMDAR fosforilacija nakon injekcije CCL-1 u leđnu moždinu

Ispitali smo da li CCL-1 uzrokuje fosforilaciju NR1 i NR2B podjedinice NMDAR-a u leđnoj moždini koristeći Western blot (slike 6a i b). Razina fosforilacije CCL-1 utjecala je na podjedinicu NR1 u Ser896 (p-NR1) u leđnoj moždini u 3 h, 1 i 3 dana nakon injekcije CCL-1 (25 ng, it) (relativne razine proteina, 2, 7 ± 0, 75, 4, 5 ± 1, 16, 3, 5 ± 0, 88, respektivno; n = 3; Slika 6c). Nakon imunoblotiranja, membrana se odstrani i ponovno ukloni anti-NR1 antitijelom (slika 6a). Međutim, CCL-1 nije imao utjecaja na povećanje razine proteina NR1 (Slika 6d). Razina proteina p-NR1 / NR1 povećana je u 1, 3 h, 1 i 3 dana nakon injekcije CCL-1 (25 ng, it) (relativne razine proteina, 5, 5 ± 0, 69, 5, 5 ± 1, 32, 9, 8 ± 1, 84, 7, 3 ± 1, 46; n = 3; Slika 6e). CCL-1 inducirana fosforilacija NR2B podjedinice u Tyr1472 (p-NR2B) u leđnoj moždini 1 i 3 sata nakon ubrizgavanja CCL-1 (25 ng, it) (relativne razine proteina, 2, 4 ± 0, 24, 4, 7 ± 0, 18, respektivno ; n = 3; Slika 6f). Nakon imunoblotiranja membrana se odstrani i reprobira anti-NR2B antitijelo (slika 6b). CCL-1 povećao je razinu proteina NR2B 1, 3 i 7 dana nakon injekcije CCL-1 (25 ng, to je relativna razina proteina, 2, 9 ± 0, 33, 2, 9 ± 0, 35, 3, 2 ± 0, 65, n = 3; Slika 6 g). Razina proteina p-NR2B / NR2B povećana je 1 i 3 sata nakon ubrizgavanja CCL-1 (25 ng, to je, relativna razina proteina, 0, 90 ± 0, 34, 0, 97 ± 0, 34, n = 3; Slika 6h).

Image

NMDAR fosforilacija nakon injekcije CCL-1 u leđnu moždinu. ( a ) Razine fosforilacije NR1 podjedinice u Ser896 (p-NR1) u leđnoj moždini u različitim vremenskim točkama nakon ubrizgavanja CCL-1 (25 ng, to) su ocijenjene zapadnom blontom. Membrana je uklonjena i ponovno ispitivana anti-NR1 antitijelima. ( b ) Razine fosforilacije NR2B podjedinice u Tyr1472 (p-NR2B) u leđnoj moždini u različitim vremenskim točkama nakon ubrizgavanja CCL-1 (25 ng, to) ocijenjene su Western blottingom. Membrana je uklonjena i ponovno ispitivana anti-NR2B antitijelima. ( c ) Grafikon sažima razinu proteina p-NR1. ( d ) Grafikon sažima razinu proteina NR1. ( e ) Usporedba razina p-NR1 normaliziranih na NR1. ( f ) Grafikon sažima razinu proteina p-NR2B. ( g ) Grafikon sažima razinu proteina NR2B. ( h ) Usporedba razina p-NR2B normaliziranih na NR2B. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( n = 3). ** P <0, 01, * P <0, 05: nasuprot kontroli (nastavak) (jednosmjerna analiza varijance, praćena Bonferronijevim testom)

Slika pune veličine

Učinci ubrizgavanja CCL-1 na glijalne stanice i citokine u leđnoj moždini

Aktivacija glijalnih stanica doprinosi razvoju i održavanju taktilne alodinije. 11, 13 Ispitali smo mikrogliju i astrocite u leđnoj moždini nakon injekcije CCL-1 (25 ng, it). Razine Iba1 mRNA značajno su porasle u leđnoj moždini u 1, 3 sata i 1 dan nakon injekcije CCL-1 (25 ng, to; 179, 8 ± 12, 0, 168, 4 ± 20, 0, 149, 5 ± 20, 0%, respektivno; n = 4; Slika 7a ). A pokazali smo da CCL-1 (25 ng, to) inducira porast i morfološku promjenu Iba1-pozitivne mikroglije 1 dan nakon injekcije (dopunska slika S3). Razine CD11b mRNA također su značajno porasle u leđnoj moždini 1 dan nakon injekcije CCL-1 (25 ng, to; 249, 5 ± 51, 2%; n = 4; Slika 7b). Objavljeno je da je P2X 4 R na mikrogliji važan za razvoj neuropatske boli. 2, 3 Ispitali smo ekspresiju P2X4R mRNA nakon injekcije CCL-1 (25 ng, it). Međutim, p2X4R mRNA se nije promijenila nakon injekcije CCL-1 (Slika 7c). Razina mRNA proteina glialne fibrilarne kiseline (GFAP) značajno se povećala u leđnoj moždini u 1, 3 sata i 1 dan nakon injekcije CCL-1 (25 ng, to; 199, 1 ± 19, 0, 163, 5 ± 16, 6, 169, 7 ± 20, 8%, respektivno; n = 4; Slika 7d). Osim toga, primijetili smo da CCL-1 (25 ng, to) izaziva morfološku promjenu i broj GFAP-pozitivnih astrocita 1 dan nakon injekcije (dopunska slika S3). Nadalje, ispitali smo aktivaciju mikroglije i astrocita nakon injekcije CCL-1 (25 ng, it) koristeći fosfor-p38 MAPK antitijelo (p-p38). CCL-1 inducira fosforilaciju p38 MAPK na mikrogliji i astrocitima (dopunska slika S2). Citokini i faktori rasta važni su posrednici interakcije neuronal-glial. 12, 23 Ispitali smo citokin (IL-1 β , TNF- α , IL-6) i moždani neutrofični faktor (BDNF) u leđnoj moždini nakon injekcije CCL-1 (25 ng, it). Iako razina proteina IL-1 β , TNF- a i IL-6 nisu promijenjene nakon 7 dana vezivanja živaca (Slika 1b), IL-1 β mRNA značajno se povećala u leđnoj moždini u 1 i 3 sata nakon injekcije CCL -1 (25 ng, to; 688, 0 ± 150, 8, 609, 2 ± 148, 1%, respektivno; n = 4; Slika 7e), kao i TNF- a mRNA za 30 min, 1 i 3 h (25 ng, to; 368, 1 ± 150, 1, 485, 8 ± 94, 4, 408, 1 ± 97, 4%, n = 4; Slika 7f), i IL-6 mRNA u 1 i 3 h (25 ng, to; 248, 7 ± 40, 8, 318, 0 ± 68, 8%, respektivno; n = 4; Slika 7 g) nakon injekcije CCL-1. S druge strane, BDNF mRNA se nije promijenila nakon injekcije CCL-1 (Slika 7h).

Image

CCL-1 povećava ekspresiju glijalnih stanica i citokina u leđnoj moždini. Ekspresija mRNA od ( a ) Iba1, ( b ) CD11b, ( c ) P2X4R, ( d ) GFAP, ( e ) IL-1 β , ( f ) TNF- α , ( g ) IL-6 i ( h) ) BDNF nakon injekcije CCL-1 (25 ng, to) je ocijenjen pomoću RT-PCR. Svaka vrijednost normalizirana je na razinu kontrole (nastavak). Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( n = 4). ** P <0, 01, * P <0, 05: nasuprot kontroli (jednosmjerna analiza varijance, praćena Bonferronijevim testom)

Slika pune veličine

Učinci liječenja siRNA CCR-8 na alodiniju

Dalje smo ispitali učinke smanjivanja regulacije CCR-8 na taktilnu alodiniju. Napravili smo CCR-8 knockdown model koristeći transfekciju siRNA protiv CCR-8. Potvrdili smo da je razina proteina CCR-8 smanjena u leđnoj moždini 5 dana nakon ubrizgavanja CCR-8 siRNA (Slika 8a). Obrušeni miševi CCR-8 podvrgnuti su PSNL 5 dana nakon injekcije CCR-8 siRNA. Ispitali smo učinak CCR-8 otpora na alodiniju i koordinirano gibanje primjenom von Frey-ovog filamentnog testa i rotirajućeg testa. Smanjena regulacija CCR-8 smanjila je taktilnu alodiniju izazvanu PSNL tijekom 2 tjedna ( n = 5; Slika 8c). Suprotno tome, smanjivanje regulacije CCR-8 nije utjecalo na koordinirano kretanje ( n = 5; Slika 8d).

Image

Intrahekalna siRNA protiv liječenja CCR-8 inhibira ligaciju živca uzrokovanu alodinijom. ( a ) Razina proteina CCR-8 u leđnoj moždini nakon transfekcije CCR-8 siRNA. ( b ) Raspored izrade modela miševa i analize ponašanja. ( c ) CCR-8 siRNA inhibira vezanje živa uzrokovano alodijom. ( d ) Nije došlo do promjene koordiniranog gibanja nakon tretmana siRNA. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SE ( n = 5). ** P <0, 01 nasuprot kontralateralnom; ## P <0, 01, # P <0, 05: nasuprot kodrirajućoj siRNA (dvosmjerna analiza varijance, praćena Tukey-Kramerovim testovima)

Slika pune veličine

Rasprava

Ova studija po prvi put pokazuje da se ekspresija CCL-1 u leđnoj moždini i DRG na razini mRNA i proteina povećava nakon ligacije živaca, a taktilna alodinija izazvana ligacijom živca ublažena je liječenjem neutralizirajućim antitijelom protiv CCL-1 i u miševima srušenim CCR-8. Nadalje pokazujemo da CCL-1 ima ekscitacijsko djelovanje na glutamatergički sinaptički prijenos i fosforilaciju NMDAR podjedinica, NR1 i NR2B, u dorzalnom rogu kralježnice i pojačava ekspresiju markera aktivacije glijalnih stanica (Iba1, CD11b i GFAP) i citokina (IL -1 β , TNF- a i IL-6). Naši rezultati stoga pokazuju da CCL-1 može biti jedan od ključnih posrednika kronične taktilne alodinije koja djeluje akutnom modulacijom nociceptivnog sinaptičkog prijenosa, fosforilacijom NR1 i NR2B, glialnom aktivacijom i povećanjem citokina u leđnoj moždini.

U ovom istraživanju pokazali smo da CCL-1-specifični receptor, CCR-8, se eksprimira ne samo u neuronima, već i u glijalnim stanicama 6 sati nakon vezivanja živaca na ipsilateralnoj strani (vidi sliku 3). Predložili smo da porast ukupnog proteina CCR-8 nakon vezivanja živaca u leđnoj moždini povećanjem ekspresije CCR-8 na glijalnim stanicama. CCL-1 mRNA pokazala je samo prolazno povećanje leđne moždine (vidi sliku 1e) i 3 sata, 1 i 3 dana nakon vezivanja živaca u DRG (vidjeti sliku 1d). To ukazuje da se CCL-1 može uglavnom proizvoditi u DRG-u nakon vezivanja živaca. U slučaju CCL-21 i CCL-2, proizvedeni su u DRG nakon vezivanja živaca i prevezeni su do neuronskih terminala u dorzalnom rogu. 24, 25 CCL-2 otpušten je iz sinaptičkih vezikula neurona u leđnoj moždini. 26 Slično, pretpostavljamo da se CCL-1, koji se stvara u DRG neuronima nakon vezivanja živaca, nakon toga transportira do leđne moždine i zatim se oslobađa. CCL-1 mRNA u leđnoj moždini u 3 sata nakon vezivanja živaca također se proizvodi u glialnim stanicama, iako samo prolazno; to ipak zahtijeva daljnju istragu.

Imune stanice i glijalne stanice stupaju u interakciju s neuronima kako bi promijenili osjetljivost na bol i posredovali prelazak iz akutne u kroničnu bol. 11, 14, 19 Općenito se vjeruje da su mikroglije uključene u razvoj, a astrociti u održavanju neuropatske boli. 27, 28, 29 Citokini su važni glasnici za komunikaciju između neurona i glija. 11, 13, 30 Ubrizgavanje CCL-1 u leđnu moždinu povećalo je razinu mRNA mikroglija (CD11b ili Iba1) i astroglialnih (GFAP) markera, kao i citokina (IL-1 β , TNF- α i IL- 6) (vidi sliku 7). Također smo primijetili dvostruko bojenje GFAP-a ili CD11b s p-P38 nakon ubrizgavanja CCL-1, što sugerira da su mikroglija i astrociti bili u reaktivnom stanju (vidi Dodatnu sliku S2). Dobro je karakterizirana aktivacija mikroglije u dorzalnom rogu kralježnice nakon ozljede perifernog živca. 2, 31 Mehanizmi mikroglijske aktivacije izazvane ozljedama živaca složeni su i uključuju nekoliko signalnih sustava. 32 Čini se da purinergička signalizacija posredovana putem receptora P2X 4, P2X 7 i P2Y 12 doprinosi početnoj aktivaciji mikroglije nakon akutne ozljede živaca. 2, 3, 16, 31, 33, 34 Međutim, nismo uspjeli identificirati promjene u mRNA receptora P2X 4 u leđnoj moždini nakon injekcije CCL-1. Ovo upućuje na to da aktiviranje mikroglije posredovano CCL-1 ne uključuje reguliranje P2X 4 receptora, već uključuje različite signalne kaskade. Nekoliko izvještaja prethodno je pokazalo da citokini i hemokini aktiviraju mikrogliju i astrocite, potičući izlučivanje protuupalnih faktora (npr. IL-1 β , TNF- α , BDNF, IL-6, IL-17, CCL-2). 2, 12, 27 Nekoliko proupalnih citokina i hemokina uključeno je u promijenjenu nociceptivnu obradu. 12 TNF- α povećava sinaptičku učinkovitost povećanjem površinske ekspresije AMPA receptora. 35 IL-1 β modulira prijenos osjetilnog neurona povećanim oslobađanjem nociceptivne neuropeptidne tvari P i peptida povezanim s kalcitonin genima. 36, 37, 38 IL- 1P je također inducirao fosforilaciju NRl. Za 39 IL-6 prijavljeno je da sudjeluje u razvoju neuropatske boli. 40 Za razliku od toga, postoje izvješća da IL-6 ima neuroprotektivni učinak na središnji živčani sustav. 41 IL-1 P i TNF- a inducirali su ekspresiju IL-6 u kultiviranim neuronima i astrocitima. 42 Prema ovim izvješćima, možda bi bilo razumno da se vršna ekspresija IL-6 u leđnoj moždini dogodila kasnije u usporedbi s ekspresijom TNF- a i IL-1 β nakon injekcije CCL-1 (vidi sliku 7g). Ovi rezultati pokazuju da CCL-1 sudjeluje u razvoju alodnije glialnom aktivacijom i ekspresijom citokina. Međutim, i druge signalne molekule mogu biti uključene u patogenezu neuropatske boli. Učinci CCL-1 na glijalnu funkciju u budućnosti trebaju se detaljnije istražiti.

Pokazali smo da je alodijanija inducirana ubrizgavanjem CCL-1 blokirana istim ubrizgavanjem NMDAR antagonista. Pretpostavili smo da CCL-1 povećava otpuštanje glutamata iz presinaptičkog terminala ili pogođenih postinaptičkih NMDAR-a. Potvrdili smo da CCL-1 utječe na oboje, povećavajući prolazno oslobađanje glutamata i postepeno izazivajući fosforilaciju NR1 i NR2B. Što se tiče presinaptičkog učinka, pokazali smo da CCL-1 povećava otpuštanje glutamata samo u nekim, ali ne i u svim neuronima (vidi sliku 5e). Slično tome, dvostruko imunoizovanje anti-CCR-8 i anti-NeuN pokazalo je da je ekspresija CCR-8 prisutna samo u sub-populaciji neurona (vidi sliku 3), čiji razlog zahtijeva daljnje istraživanje. Što se tiče postsinaptičkog učinka, već se navodi da je aktiviranje NMDAR-a važno za pokretanje dugotrajnih promjena u sinapsama i da je uključeno u trajnu bol jačanjem glutamatergičkog senzornog prijenosa. 5 Iako nismo izravno provjerili je li postsinaptička NMDA struja pojačana CCL-1 ili ne, primijetili smo da se i fosforilacija NMDAR-a i porast broja NMDAR-a odvijaju kao odgovor na CCL-1. Poznato je da fosforilacija NMDAR modulira aktivnost NMDAR i olakšava prijenos nociceptivnih ulaza u modelima upalne i neuropatske boli. 39 Djelomičnim vezivanjem išijasnog živca značajno je povećana fosforilirana proporcija NR1 i NR2B podjedinica u dorzalnom rogu. 43, 44 Fosforilacija NR1 podjedinice povezana je s povećanjem sinaptičke učinkovitosti i razvojem središnje osjetljivosti 7 dana nakon ozljede živaca. 45 S druge strane, selektivni antagonist NR2B ublažio je neuropatsku bol. 46 Fosforilacija tirozina NR2B, ali ne i NR2A, povezana je s razvojem uporne boli. 47 U našim eksperimentima, CCL-1 je inducirao fosforilaciju NR1 i NR2B, iako s različitim vremenskim tokom: Fosforilacija NR2B bila je prolazna, dok je fosforilacija NR1 nastavljena 3 dana. U našim bihevioralnim eksperimentima s ocjenom boli, ubrizgavanje CCL-1 induciranog alodinija prolazno, kao fosforilacija NR2B. Budući da postoji izvješće da je NR2B posebno važan za percepciju boli, 5 pretpostavljamo da bi fosforilacija NR2B bila važnija od fosforilacije NR1, zajedno s povećanjem regulacije NR2B. Što se tiče fosforilacije NR1, izvještava se da IL- 1P inducira fosforilaciju NRl. 45, 48 Kako se IL-1 β mRNA povećala u leđnoj moždini nakon ubrizgavanja CCL-1 nakon 1 i 3 h (slika 7e), pretpostavljamo da bi se NR1 fosforilirao ne samo CCL-1, već i IL-1 β .

Zaključno, naša studija daje dokaze da se CCL-1 proizvodi uglavnom u DRG-u nakon vezivanja živaca, a pretpostavlja se da se transportira do leđne moždine, gdje povećava oslobađanje glutamata zajedno s lokalnim nereguliranim CCL-1, a zatim aktivira glijalne stanice i oslobađanje citokina., CCL-1 je također inducirao fosforilaciju NMDAR podjedinica, NR1 i NR2B. Tretman neutralizirajućim antitijelom protiv CCL-1 i CCR-8 siRNA blokirao je taktilnu alodiniju izazvanu ligacijom živca. Stoga je CCL-1 jedna od ključnih molekula u patogenezi alodinije, a CCL-1 / CCR-8 signalni sustav može biti potencijalni cilj razvoja lijekova u liječenju neuropatske boli.

Materijali i metode

životinje

Korišteni su muški miševi DDY (20–30 g, Kyudo Co. Ltd., Tosu, Saga, Japan). Miševi su smješteni na 23 ± 2 ° C s 12 h svjetlošću: 12 h tamnim ciklusom (svijetli od 0700 do 1900 sati) i njima je omogućen besplatan pristup komercijalnoj hrani i vodi iz slavine. Eksperimentalni postupci temeljili su se na smjernicama Odbora za njegu i uporabu životinja Sveučilišta Kyushu, Sveučilišta Fukuoka i Nacionalnog instituta za fiziološke znanosti.

lijekovi

Rekombinantni mišji CCL-1 i neutralizirajući antitijelo CCL-1 kupljeni su u R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). MK801 je kupljen od Sigme Aldrich (St. Louis, MO, SAD).

PSNL

Miševi su anestezirani intraperitonealnom (ip) injekcijom pentobarbitala (65 mg / kg). PSNL je dobiven vezanjem uske ligature s najlonskim navojem br. 8 oko 1 / 3–1 / 2 promjera išijasnog živca smještenog na lijevoj strani (ipsilateralne strane) po Seltzer-ovoj metodi. 49 S desne strane (kontralateralna strana) živac je bio izložen bez vezivanja.

Analiza ponašanja

Behavioural analysis was performed to assess the development of tactile allodynia in mice. Tactile allodynia was measured using a von Frey filament (North Coast Medical, Gilroy, CA, USA). Mice were placed in glass cages with a wire mesh bottom and allowed to habituate for at least 1 h. A von Frey filament with bending forces of 0.16 g (innocuous stimulation) was pressed perpendicularly against the plantar skin of a hind-paw. The paw withdrawal responses to the mechanical stimulus were evaluated by scoring as follows: 0, no response; 1, lifting the hind-paw within 3 s; 2, lifting the hind-paw over 3 s; and 3, immediate flinching or licking of the hind-paw. The stimulation of the same intensity was applied seven times to each hind-paw at several seconds intervals and the total served as the pain-related score (score) in the SNL model. The behavioural data were analyzed using Origin (Microcal software Inc., Sunnyvale, MA, USA) software to determine the IC 50 values.

We performed a rota-rod (KN-75 Rota-rod, Natume, Japan) test to measure motor balance and coordination. Mice were pre-trained on rota-rod apparatus for 3 days and then tested on the accelerating rod in which the speed of the spindle was 10 rpm Latency until fall was automatically recorded. To eliminate stress and fatigue, mice were given a maximum cutoff latency of 120 s.

Intrathecal injection

Intrathecal (it) injection was performed using a 25- μ l Hamilton syringe with a 28-gauge needle (Muranaka Medical Instruments co. LTD., Osaka, Japan), as described previously. 50, 51 The needle was inserted into the intervertebral space of a conscious mouse between the lumbar 5 (L5) and 6 (L6) regions of the spinal cord. A reflexive flick of the tail was considered to be an indicator of the accuracy of each injection. A volume of 5 μ l was used for the it injections.

Imunohistokemijske analize

Mice were anesthetized by pentobarbital sodium (50 mg/kg, ip) and perfused transcardially with saline followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS; 80 mM Na 2 HPO 4, 20 mM KH 2 PO 4, 150 mM NaCl, pH 7.4). The L4–L6 segment of the lumbar spinal cord was removed, postfixed in the same fixative and placed in 20% sucrose solution for 24 h at 4 °C. Transverse L4–L6 spinal cord section (20 μ m) were sliced by a HM 550 cryostat (Micro-edge Instruments Co., Tokyo, Japan) and incubated for 1 h at room temperature in 5% donkey serum (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA). Then, the sections were incubated with the following: NeuN (1 : 200, Millipore, Bilerica, MA, USA), CCR-8 (1 : 500, Enzo, New York, NY, USA), Iba1 (ionized calcium-binding adapter molecule-1, 1 : 2000, Wako, Osaka, Japan), CD11b (1 : 500, Serotec, Oxford, UK), GFAP (1 : 800, Millipore) or p-p38 (phosphor-p38 MAPK, 1 : 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) for 24 h at 4 °C. The sections were incubated for 4 h at room temperature in the secondary antibody (IgG-conjugated Alexa Fluor 488 or 594, 1 : 1000, Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Sections were mounted on coverslips with permafluor aqueous mounting medium (Thermo Scientific, Yokohama, Japan). The sections were analyzed using a fluorescence microscope (BZ9000, Keyence, Japan) and a confocal laser scanning microscope (LSM510META, Carl Zeiss, Hallbergmoos, Germany). In confocal imaging, we used a series of Z-stack images (images taken at multiple focal points of an objective lens through the z -axis) for 3D analysis of each slice.

Cytokine array

Mouse cytokine array kit was purchased from R & D Systems and was assessed as described previously. 52 The L4–L6 segment of the lumbar spinal cord was isolated and homogenized in the lysis buffer (10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.4) containing protease inhibitor cocktail (Sigma) and centrifuged at 15 000 rpm for 20 min at 4 °C. Each reaction was performed according to the protocol of the manufacturer using 20 μ g of protein collected from the sample. The protein sample was incubated with a blot array precoated with 40 cytokine/chemokine antibodies overnight at 4 °C. These blots were visualized using Lumi GLO Reserve Chemiluminescent Substrate Kit (Cell Signaling Technology) and quantified by a luminoimage analyzer (Fluor Chem Imaging System, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA).

Real-time reverse transcription (RT) PCR

The L4–L6 segment of the lumbar spinal cord and DRG were subjected to total RNA extraction according to the protocol of the manufacture and purified with QIAamp RNA Blood Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA). The amount of total RNA concentration was measured using Smart Spec 3000 (Bio-Rad, Tokyo, Japan). Total RNA (175 ng) was converted to cDNA by reverse transcription, using random 9 mer (Takara, Otsu, Japan) and RNA PCR kit (Takara). The primers were as follows: CCL-1 primers (forward: 5′-TTCCCCTGAAGTTTATCCAGTGTT-3′, reverse: 5′-TGAACCCACGTTTTGTTAGTTGAG-3′); β -actin primers (forward: 5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAGGAG-3′, reverse: 5′-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′); TNF- α primers (forward: 5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3′, reverse: 5′-TGGGCTACAGGCTTGTCACT-3′); IL-1 β primers (forward: 5′-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3′, reverse: 5′-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3′); IL-6 primers (forward: 5′-ACACTCCTTAGTCCTCGGCCA-3′, reverse: 5′-CACGATTTCCCAGAGAACATGTG-3′); BDNF primers (forward: 5′-TGCAGGGGCATAGACAAAAGG-3′, reverse: 5′-CTTATGAATCGCCAGCCAATTCTC-3′); Iba1 primers (forward: 5′-CCTGATTGGAGGTGGATGTCAC-3′, reverse: 5′-GGCTCACGACTGTTTCTTTTTTCC-3′); CD11b primers (forward: 5′-AATGATGCTTACCTGGGTTATGCT-3′, reverse: 5′-TGATACCGAGGTGCTCCTAAAAC-3′); GFAP primers (forward: 5′-CCAGCTTCGAGCCAAGGA-3′, reverse: 5′-GAAGCTCCGCCTGGTAGACA-3′); and P2X 4 R primers (forward: 5′-TGGCCGACTATGTGGTCCCA-3′, reverse: 5′-GGTTCACGGTGACGATCATG-3′). All primers were purchased from Sigma Aldrich Japan (Tokyo, Japan). PCR amplification was undertaken for Sybr qPCR Mix (Takara) in Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). Each reaction volume consisted of 10 μ l Sybr qPCR Mix, 0.4 μ l 50 × ROX reference dye, 0.4 μ l mix of forward and reverse primers (0.2 μ M each) and 7.8 μ l RNAase free water containing cDNA (17.5 ng). PCR was done by 15 s denaturation at 95 °C and annealing/extending at 60 °C for 40 cycles. Each mRNA expression level was normalized by β -actin. The mRNA expression was calculated relative to β -actin using the ΔΔC T algorithm.

Western blotting

Expression protein level of CCR-8 in lumbar spinal cord was examined by western blotting relative to β -actin. The L4–L6 segments of the lumbar spinal cord were isolated and homogenized in a lysis buffer containing protease inhibitor (Sigma); subsequently 20 mg of proteins were loaded for each lane and separated by SDS-PAGE gel (7.5%), and transferred to PVDF membrane (Bio-Rad). The membrane was blocked with 5% low-fat dried milk (anti-CKR8/CCR-8), 5% BSA (anti-p-NR2B, anti-NR2B) or 3% BSA (anti-p-NR1, anti-NR1) and incubated with the following for 1 h at room temperature: Rabbit monoclonal anti-CKR8/CCR-8 (1 : 500, Epitomics, Burlingame, CA, USA), anti-phospho-NR1 (Ser896; 1 : 1000, Millipore), anti-NR1 (1 : 1000, Millipore), anti-phospho-NMDAR2B (Y1472; 1 : 1000, R&D Systems), anti-NMDAR2B (D15B3) (1 : 1000, Cell Signaling Technology), and anti- β -actin (1 : 1000, Sigma). The membrane was washed and incubated with specific secondary antibodies (Amersham ECL anti-rabbit IgG and anti-mouse IgG, horseradish peroxidase-linked species-specific whole antibody, 1 : 5000, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). The blots were detected by use of ECL western blotting detection system (GE Healthcare) and LAS-4000 imaging system (Fujifilm, Tokyo, Japan). Bands were quantified using the software Multi Gauge (Fujifilm).

Preparation of spinal cord acute slices

The methods used for obtaining spinal cord slice preparations are identical to those described elsewhere. 53, 54 Mice were anesthetized with urethane (1.2–1.5 g/kg, ip), and a thoracolumbar laminectomy was performed. The lumbosacral segments of the spinal cord (L1–S1) were placed in an ice-cold Krebs solution equilibrated with 95% O 2 /5% CO 2 . The Krebs solution contained (in mM) 117 NaCl, 3.6 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3 and 11 glucose. Immediately after removal of the spinal cord, the mice were exsanguinated under the urethane anesthesia. The pia-arachnoid membrane was removed after cutting all of the ventral and dorsal roots. The spinal cord was mounted on a vibratome and a 500- μ m thick transverse or sagittal slices were cut. The slice was placed on a nylon mesh in the recording chamber with a volume of 0.5 ml and was completely submerged and perfused with Krebs solution saturated with 95% O 2 and 5% CO 2 at 36±1 °C at a flow rate of 10–15 ml/min.

Whole-cell patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons

The substantia gelatinosa was easily discernible with transmitted illumination as a relatively translucent band across the dorsal horn in the transverse or parasagittal slice preparations. Blind whole-cell voltage-clamp recordings were made from SG neurons, as previously described. 53, 54 The patch pipettes were filled with potassium gluconate solution, a solution containing (in mM); 135 K-gluconate, 5 KCl, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 5 EGTA, 5 HEPES, and 5 ATP-Mg (pH 7.2). The tip resistance of the patch pipettes was 6–12 MΩ. Series resistance was assessed from current in response to a 5-mV hyperpolarizing step. Series resistance was monitored during the recording session and data were rejected if its value changed by >15%. Ion currents were monitored with a patch-clamp amplifier (Axopatch 700A, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). The data were digitized with an analog-to-digital converter (Digidata 1321A, Molecular Devices), stored on a personal computer using a data acquisition program (Clampex version 10, Molecular Devices) and analyzed using a software package Clampfit version 10 (Molecular Devices). Recordings were made in a voltage-clamp mode at holding potential of −70 mV to isolate EPSCs. Drugs were dissolved in the Krebs solution and applied by superfusion.

Transfection of CCR-8 siRNA by electroporation

siRNA against CCR-8 were obtained from Bonac Corporation (Kurume, Japan) (GenBank accession number: NM_007720, mCcr8#1 sense 5′-GCAAGAAACUGAGGAGCAU-3′, anti-sense 5′-AUGCUCCUCAGUUUCUUGC-3′, mCcr8#2 sense 5′-GAGCAGUCUUUGAGGUGGA-3′, anti-sense 5′-UCCACCUCAAAGACUGCUC-3′, and mCcr8#3 sense 5′-GAGAGAAGUUUAAGAAACA-3′, anti-sense 5′-UGUUUCUUAAACUUCUCUC-3′). Mice were anesthetized by pentobarbital sodium (50 mg/kg, ip). Mixed siRNA (0.2 μ g/ μ l, 10 μ l) was injected it using a 25- μ l Hamilton syringe with a 28-gauge needle (Muranaka Medical Instruments co. LTD.). 55, 56 Scrambled siRNA (sense 5′-UACUAUUCGACACGCGAAG-3′, anti-sense 5′-CUUCGCGUGUCGAAUAGUA-3′; Bonac Corporation) was used as a negative control. A volume of 5 μ l was used for the it injections at each points. Electric pulses (poring pulse: 75 V, 5 ms of length with 50-ms interval, transfer pulse: 20 V, 50 ms of length with 50-ms interval) were delivered using NEPA21 (Nepa Gene, Ichikawa, Japan). 57, 58 Knock-down effects were evaluated by western blotting.

Stanična kultura

Cortex neurons were obtained from embryonic days 14–16 ddY mice as described previously. 59 Briefly, neurons were cultured at 37 °C in a 10% CO 2 incubator for 5–7 days with neurobasal medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) containing 2% B27 supplement (GIBCO) and 0.5 mM L-glutamine (GIBCO).

Immunocytochemical analysis

Primary cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 min at room temperature and permeabilized with 0.1% TritonX-100 in PBS for 5 min, followed by treating with blocking solution (Block Ace; Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan) for 30 min at room temperature. Cells were incubated with primary antibodies: CCR-8 (1 : 200, Epitomics), MAP2 (1 : 1000, Sigma, St. Louis, MO, USA), VGLUT1 (1 : 1000, Synaptic Systems, Göttingen, Germany) or VGAT (1 : 500, Synaptic Systems) overnight at 4 °C. The cells were washed in PBS and then incubated for 3 h at room temperature with secondary antibody (IgG-conjugated Alexa Fluor 488 or 568 or 633, 1 : 1000, Molecular Probes). The cells were washed in PBS and treated with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 300 nM, Molecular Probes) for 10 min and then washed with PBS. Slides were cover-slipped with permafluor aqueous mounting medium. The sections were analyzed using a confocal laser scanning microscope (LSM510META, Carl Zeiss).

Statistička analiza

All data are presented as mean±SEM The statistical analyses of the results were evaluated by using two-tailed Student's paired or unpaired t -test, one-way ANOVA followed by Student–Newman–Keuls test, one-way ANOVA followed by Bonferroni's test or two-way ANOVA followed by Tukey–Kramer test. P <0, 05 se smatra statistički značajnim.

primki

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM_007720

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

AMPA

alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid

AMV

avian myeloblastosis virus

ANOVA

analysis of variance

ATP

adenosine triphospjate

BDNF

moždani neurotrofni faktor

CCL-1

chemokine (CC motif) ligand 1

CCL-2

chemokine (CC motif) ligand 2

CCL-21

chemokine (CC motif) ligand 21

CCR-8

chemokine (CC motif) receptor 8

CX3CL-1

chemokine (CX3C motif) ligand 1

DAPI

4', 6'-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride

DMEM

Dulbecco's modified eagle medium

DRG

dorsal root ganglion

EDTA

etilen glikol tetra octena kiselina

FBS

fetalni goveđi serum

GABA

γ-amino butyric acid

GFAP

glial fibrillary acid protein

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

Iba-1

ionized calcium-binding adapter molecule 1

IC 50

half maximal inhibitory kinase

IFN-γ

interferon γ

IL-17

interleukin-17

IL-1β

interleukin 1β

IL-6

interleukin-6

to

intrathecal injection

IP

intraperitoneal injection

L5

lumbar 5

MAPK

proteinska kinaza koja se aktivira mitogenom

MAP2

microtubule-associated protein 2

mEPSC

miniature excitatory postsynaptic current

mRNA

messenger ribo nucleic acid

NeuN

neuron specific nuclear protein

NMDA

N-methyl-D-aspartate

NR1

NMDA receptor 1

NR2B

NMDA receptor 2B

PBS

phosphate buffered saline

pNR1

phosphorylated NR1

pNR2B

phosphorylated NR2B

PSNL

partial sciatic nerve ligation

PVDF

polyvinylidene difluoride

RT-PCR

reverse transcription polymerase chain reaction

SE

standard error

SG neuron

substantia gelatinosa neuron

siRNK

small interfering ribo nucleic acid

sEPSC

spontaneous excitatory postsynaptic current

TCA-3

thymus-derived chemotactic agent 3

TNF-α

tumour necrosis factor-α

??X

tetrodotoxin

VGAT

vesicular GABA transporter

VGLUT1

vesicular glutamate transport protein 1

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)