Regulacija akt signalizacije povezana sa splavom | stanična smrt i bolest

Regulacija akt signalizacije povezana sa splavom | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična signalizacija
  • Rak CNS-a
  • Mehanizam djelovanja

Sažetak

20 S -protopanaksadiol (aPPD) je metabolit ginseng saponina, za koji se navodi da je u nekim stanicama pro-apoptotičan, ali anti-apoptotičan u neuronskim stanicama reguliranjem Akt signalizacije. Zbog svoje strukture slične kolesterolu, hipotetirali smo da aPPD može regulirati Akt signalizaciju interakcijom s lipidnim splavovima. Ovdje smo usporedili Akt signalizaciju u glioblastomu U87MG i neuroblastoma Neuro-2a stanice liječene aPPD. aPPD nije promijenio aktivnost Akt u ukupnim plazma membranama svake vrste stanica, već je drastično izmijenio aktivnost Akt-a povezan sa splavom. Iznenađujuće, aktivnost Akt je smanjena na splavovima U87MG stanica, ali se povećala u N2a stanicama aPPD reguliranjem defosforilacije povezane s splavom. Dvosmjerna regulacija Akt signalizacije povezana sa splavom povećala je hemotoksičnost paklitaksela ili Vinblastina u U87MG stanicama, ali je umanjila ekscitotoksičnost N- metil-D-aspartata u stanicama N2a. Naši rezultati pokazali su da aktivnost splava povezane, ali ne ukupne membrane Akt, određuje njegove stanične funkcije. Lipidni splavovi razlikuju se u različitim tipovima stanica, što omogućava mogućnost ciljanja specifičnog za stanicu, za koje bi se aPPD mogao pokazati kao korisno sredstvo.

Glavni

20 S -protopanaksadiol (aPPD) je gastrointestinalni metabolit ginseng saponina. Potonje su glavne farmakološki aktivne komponente ginsenga. aPPD je zanimljiv spoj za koji se čini da ima suprotan učinak na neuronske stanice i stanice neurona. Prethodne studije naše skupine i drugih pokazale su da aPPD inhibira Akt aktivnost i inducira apoptozu u različitim tumorskim stanicama. 1, 2, 3 Međutim, dokazano je da aPPD štiti neuronske stanice od ekscitotoksičnosti izazvane glutamatom i N- metil-D-aspartatom (NMDA) 4 i da potakne regeneraciju neuronskih stanica aktiviranjem Akt puta. 6, 7 Mehanizam koji utječe na stanično ovisne učinke aPPD-a još nije rasvijetljen.

Plazmatska membrana (PM), kao glavno mjesto aktivacije Akt, sadrži više mikrodomena, a među njima je kao kritična platforma za staničnu signalizaciju predložen tip mikrodomena otpornih na deterdžent, poznat kao lipidni splav. 8, 9 Lipidni splavovi doprinose heterogenosti lateralne membrane i nastaju lipidno-lipidnim i specifičnim interakcijama lipida i proteina. 10 Zahvaljujući dugim i zasićenim masnim kiselinama sfingolipida i kolesterola, lipidni splavovi postoje u tekućoj fazi. Suprotno tome, ostali odjeljci PM nastaju u fazi poremećaja tekućine jer su sastavljeni od fosfolipida s kratkim i nezasićenim masnim kiselinama. 11 Vjeruje se da kolesterol služi kao razdvajanje između ugljikovodičnih lanaca sfiongolipida i funkcionira kao dinamično ljepilo koje drži splav zajedno. 12

Akt signalizacija u PM mikrodomanama tek je nedavno ispitana kao važan onkogeni put. 13, 14, 15 Vezanje faktora rasta na njihove receptorske tirozin kinaze potiče fosforilaciju fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) koja se sastoji od podjedinica P85 i P110, a koji se lokaliziraju na lipidnim splavovima. PI3K pretvara fosfatidilinozitol-4, 5-bisfosfat (PI (4, 5) P2) u fosfotidilinozitol-3, 4, 5-trisfosfat (PI (3, 4, 5) P3), dok je homolog fosfataze i tenzina izbrisan na kromosomu 10 reverzija ova reakcija. Akt translocira u PM i komunicira s PI (3, 4, 5) P3 putem njegove PH domene, a fosforilira se u dva ostatka (Thr308 i Ser473) od fosfoinozitid-ovisne kinaze (PDK) i različitih kinaza povezanih s splavom, uključujući mTORC2 i kinezu povezanu s integrinom (ILK). 16, 17 Jedna od prvih meta Akt-a za koju se pokazalo da ima izravne implikacije na regulaciju preživljavanja stanica je član proapoptotske Bcl-2-porodice i poznata je kao smrt povezana sa Bcl-2 (BAD). Vezan je za lipidne splavove u proliferacijskim stanicama, iako je povezan s mitohondrijima u apoptotskim stanicama. 12, 18 Jednom fosforilirani, fosfoserinski ostaci (Ser136 i Ser112) BAD formiraju mjesta vezanja za afinitet za 14-3-3 molekule, lokalizirajući tako fosforilirani BAD na citosol i učinkovito neutralizirajući njegovu pro-apoptotičku aktivnost. 19, 20 Nedavna istraživanja pokazala su da Akt povezan sa splavom može biti važna odrednica onkogenosti. 21, 22 Istraživanja stanica staničnog karcinoma pluća pokazuju da specifični PI3K izoformi nalaze se u lipidnim splavovima i da poremećaj membranskih splavova metil- β- ciklodekstrinom (M β CD) inhibira aktivnost Akt posredovanu PI3K. 23 Fluorescentno snimanje živih ćelija pokazalo je da se splav Akt aktivira brže i snažnije od ne-splavi Akt, vjerojatno zbog dijeljenja različitih komponenti signalnog puta, uključujući receptore, PI3K i sam Akt. 22

S obzirom na njihovu strukturu sličnu saponinu, ginsenozidi su poznati po svojoj sposobnosti da povećavaju fluidnost staničnih membrana. 11, 24 Kako struktura aPPD-a vrlo nalikuje holesterolu, pretpostavili smo da ovaj spoj može interferirati s lipidnim splavovima i mijenjati lateralno kretanje proteina koji živi u splavi. Nadalje smo spekulirali da se različite vrste stanica mogu razlikovati u rezidentnim proteinima njihovih lipidnih splavova, što može objasniti gore spomenuti kontrast u učincima aPPD-a na neurone nasuprot ne-neuronskim stanicama. Za testiranje gornje hipoteze koristili smo stanicu glioma U87MG i stanicu neuroblastoma N2a za naše istraživanje. Iako obje stanice imaju podrijetlo živčanog tkiva, one se razlikuju po tome što U87MG potječe iz glijalnih stanica, a N2a je neuronski stanični tip. 25, 26 Nakon liječenja obje vrste stanica s aPPD-om, istraživali smo Akt signalni put u lipidnim splavovima, a samim tim i njihov stanični odgovor na kemoterapijska i ekscitotoksična sredstva. Naši rezultati pokazali su da aPPD mijenja Akt aktivnost povezanu s splavom u dvije stanične linije, ali ne i u ukupnom PM. Štoviše, stanični ishodi toksičnog podražaja bili su suprotni, što ukazuje na to da farmakološki učinci ovog spoja mogu biti u potpunosti specifični za stanični tip zbog razlika u njegovom učinku na splavo povezano stanično signaliziranje različitih stanica.

Rezultati

aPPD utječe na snopove lipida drugačije od M β CD-a i ti učinci ovise o staničnoj vrsti

Da bismo pokazali razlike u učinku aPPD-a na lipidni splav u dvije stanične linije, pogledali smo promjene u koncentraciji kolesterola u raznim PM frakcijama U87MG i N2a stanica tretiranih s aPPD ili M β CD. Potonji je dobro poznati razarač lipidnog splava, koji funkcionira tako što troši membranski kolesterol. 11, 27 Da bismo ispitali je li aPPD citotoksičan za stanice, mortalitet stanica mjeren je različitim koncentracijama aPPD u različitim vremenskim točkama. Iako liječenje s 10 µM aPPD nije utjecalo na smrtnost stanica u 4 h za obje stanice 5, 20 ± 2, 45%, P = 0, 196) za U87MG i 3, 76 ± 5, 97%, P = 0, 276) za stanice N2a), smrtnost se lagano povećala, ali nije statistički značajan za 24 h (12, 64 ± 13, 57%, P = 0, 089 u U87MG stanicama i 11, 30 ± 10, 41% u N2a stanicama, P = 0, 095). Značajna stanična smrt zabilježena je 24 sata u stanicama tretiranim s 20 µM aPPD, posebno ne samo za U87MG (42, 7 ± 14, 78%, P = 0, 002), već i za N2a u manjem stupnju (23, 12 ± 5, 39, P = 0, 002). Tako je 10 μM aPPD korišteno u sljedećim eksperimentima. Stanične membrane su razdvojene 4 sata nakon tretiranja s 10 µM aPPD ultracentrifugiranjem u 12 frakcija (Slika 1b). Lipidni splavovi smješteni su uglavnom u frakciji 5, što pokazuju zapadnjački bloti flotillin-1, marker lipidnog splava (Slika 1c). Kao što se očekivalo, najveći udio kolesterola također je pronađen u frakciji 5 i neobrađenih stanica U87MG i N2a (slike 2a i b), što dodatno potvrđuje obogaćivanje lipidnih splavova u ovoj frakciji. Tretman s 10 mM M β CD-om potpuno je umanjio zamućen izgled frakcije 5 membranskih proteina obje vrste stanica (slika 2c) i značajno smanjio razinu ukupnog kolesterola u ovoj frakciji (slike 2a i b), sugerirajući potpuni poremećaj lipidni splavi obje vrste stanica ovog sredstva. Tretiranje stanica obje linije sa aPPD također je umanjilo zamućen izgled frakcije 5 (Slika 2d). Međutim, iznenađujuće je da u ovoj frakciji nije došlo do promjene razine kolesterola (slike 2a i b), što ukazuje da za razliku od M β CD-a aPPD ne uzrokuje iscrpljivanje membranskog kolesterola. Nadalje, razina proteina flotilin-1 u stanicama U87MG i N2a smanjila se u frakciji 5 nakon tretmana M β CD-om (Slika 3a). Međutim, liječenje aPPD-om smanjilo je koncentraciju flotillin-1 samo u U87MG stanicama. Umjesto toga, aPPD tretman je regulirao razinu flotillin-1 u splavovima N2a stanica na 142, 91 ± 10, 71% kontrole, kao što je prikazano na slici 3b. Uzeto zajedno, ovi podaci sugeriraju da aPPD može interferirati s lipidnim splavovima, ali ne istim mehanizmom koji se koristi u slučaju M β CD-a. Nadalje, aPPD može imati suprotan učinak na proteini flotillin-1 koji živi u splavi, ovisno o staničnoj vrsti.

Image

Izolacija i identifikacija lipidnih splavova. ( a ) Kemijska struktura 20 S- propatopanaksadiola (aPPD). ( b ) Membranski pripravci nakon centrifugiranja za izoliranje lipidnih splavova kako je opisano u Materijalima i postupcima. Lipidni splavovi uglavnom su u frakciji 5 izgledali kao neproziran pojas. ( c ) Proteini u svakoj frakciji prikazanoj u ( b ) su analizirani sa SDS-PAGE i izbrisani flotillin-1 antitijelom. Kao proteinski rezidualni protein lifta, flotilin-1 bio je uglavnom prisutan u frakciji 5 (ponekad i u 6). Svi su rezultati reprezentativni za najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Image

aPPD ne troši kolesterol u membrani. ( a ) Koncentracije kolesterola u PM i svakoj frakciji U87MG stanica izmjerene su s kompletom za testiranje kolesterola Amplex Red. ( b ) Koncentracije kolesterola u PM i svakoj frakciji N2a stanica. Najviša razina kolesterola otkrivena je u frakciji 5 u obje stanične linije. ( c i d ) Uzorci stanične membrane od 10 mM M β CD- ili 10 μ M aPPD-tretiranih U87MG i N2a stanica prikupljeni centrifugiranjem. Iako su i M β CD i aPPD uzrokovali nestanak neprozirnog pojasa, samo M β CD, a ne aPPD je osiromašio kolesterol ( a i b ). * P <0, 05, ** P <0, 001 u usporedbi s kontrolom, t -test ( n = 3 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

Image

Razine flotilina-1 u lipidnim splavovima i stanica U87MG i N2a tretirane s M β CD ( a ) ili aPPD ( b ). * P <0, 05, ** P <0, 001 u usporedbi s kontrolom, t -test ( n = 3 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

aPPD mijenja Akt fosforilaciju povezanu s splavom bez promjene ukupne Akt razine membrane

Tada smo pitali da li je aPPD promijenio razinu Akt i njegov status fosforilacije u staničnoj membrani dvije vrste stanica. Zapadne mrlje ukupnog Akt i njegova dva fosforilacijska ostatka, Thr308 i Ser473, izvedene su s ukupnim membranskim proteinima U87MG i N2a stanica tretiranih s aPPD. Slike 4a i b pokazuju da nije bilo značajnih promjena u Akt ili njegovom stanju fosforilacije u PM svake vrste stanica tretiranih aPPD-om.

Image

Učinak aPPD na aktivnost Akt u staničnoj membrani. aPPD nije imao utjecaja na koncentraciju Akt niti na njegovo stanje fosforilacije niti u stanicama U87MG niti N2a ( a i b ). aPPD regulira Akt fosforilaciju u lipidnim splavovima U87MG i N2a stanica na suprotan način ( c i d ). * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom, t -test ( n = 3 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

Zanimljivo je da su Akt i njegovo stanje fosforilacije bili potpuno različiti u lipidnim splavovima izoliranim iz dvije različite vrste stanica tretiranih aPPD-om. Kao što je prikazano na slikama 4c i d, iako aPPD nije značajno promijenio ukupnu razinu Akt u lipidnim splavovima dviju vrsta stanica, fosforilacija u Thr308 i Ser473 značajno je smanjena u stanicama U87MG, ali povećana u N2a, što ukazuje da aPPD može inhibirati raft-povezana aktivnost Akt u U87MG stanicama, ali stimuliraju tu aktivnost u N2a stanici.

aPPD regulira aktivnost Akt u splavovima lipidima mijenjajući razine fosfataza povezanih sa splavom

Da bismo odredili kako aPPD selektivno aktivira aktivnost Akt-a povezanu sa splavom u stanicama N2a, ali inhibira je u stanicama U87MG, izmjerili smo nivoe PI3K, PDK i ILK u lipidnim splavovima, koji su poznati kao kinaze uzvodno koje reguliraju fosforilaciju Akt. 17 Kao što je prikazano na slici 5a, primijetili smo da nema značajnih promjena u PI3K, uključujući aktivnost koja uključuje regulatornu podjedinicu P85 i katalitičku podjedinicu P110 α , nakon aPPD tretmana bilo U87MG ili N2a stanica. Nadalje smo istražili da li su splavi PDK1 i ILK, koji fosforiliraju Thr308 i Ser473 iz Akt, utjecali na tretman aPPD. Slika 5b pokazuje da se količina PDK1 nije značajno promijenila u svakoj vrsti stanice tretirane aPPD-om. Međutim, količina ILK1 u lipidnim splavima N2a stanica značajno se povećala, dok se smanjila u U87MG. Konačno, izmjerili smo razine dvije glavne fosfataze, ponavljajuću fosfatazu 1 i 2, bogatu leucinom, fosfatazom (PHLPP1 i 2) koje su odgovorne za Akt dephosforilaciju. 28, 29, 30, 31, 32, 33 Naši rezultati (slika 5c) pokazali su da je liječenje aPPD-om uzrokovalo značajne promjene i u PHLPP1 i PHLPP2 u lipidnim splavovima. Nevjerojatno, razina PHLPP1 i PHLPP2 u splavovima porasla je za 56, 31 ± 5, 12 i 82, 97 ± 5, 02%, u U87MG stanicama, ali se smanjila za 30, 38 ± 3, 94 i 30, 22 ± 8, 31% u N2a stanicama.

Image

Učinci aPPD na Akt regulatore u lipidnim splavovima. ( a ) Nije bilo značajnih promjena u razinama P85 i P110 α PI3K nakon liječenja aPPD-om bilo u U87MG stanicama, bilo u N2a stanicama. ( b ) Količina PDK1 nije se značajno promijenila u stanicama tretiranim aPPD-om svake stanične linije. Međutim, količina ILK1 u lipidnim splavovima značajno se povećala u stanicama N2a i smanjila u stanicama U87MG. ( c ) Razine PHLPP1 i PHLPP2 u splavovima značajno su porasle u stanicama U87MG, ali su se smanjile u stanicama N2a. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom, t -test ( n = 4 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

Dvosmjerna regulacija Akt funkcija gliomskih stanica nasuprot neuronskim stanicama

Da bismo ispitali da li su kontrastni učinci aPPD na Akt povezan sa splavom u dvije vrste stanica u korelaciji s razlikom u njihovim farmakološkim odgovorima, izmjerili smo vitalnost stanica pod toksičnom inzultom sa ili bez aPPD-a. U87MG stanice su tretirane s različitim koncentracijama paklitaksela (TAXOL) (Bristol-Myers Squibb, Toronto, ON, Kanada) ili ćelije Vinblastina i N2a tretirane su s NMDA. Obje stanice su tretirane sa 10 μM aPPD. Izuzetno pojačana toksičnost je bila vidljiva u stanicama U87MG koje su tretirane aPPD i TAXOL ili Vinblastin (Slike 6a i b). Suprotno tome, aPPD je snažno štitio N2a stanice od NMDA-inducirane ekscitotoksičnosti (Slika 6c).

Image

aPPD je pojačao citotoksični učinak kemoterapijskih sredstava u stanicama glioma i oslabio citotoksični učinak u neuronskim stanicama tretiranim NMDA-om. ( a i b ) U87MG stanice su inkubirane sa ili bez 10 µM aPPD u prisutnosti različitih koncentracija paklitaksola (TAXOL) ili Vinblastina. ( c ) aPPD značajno smanjuje neuroekscitotoksičnost izazvanu NMDA u stanicama N2a. * P <0, 05, ** P <0, 001 u usporedbi s kontrolom, t -test ( n = 3 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

Na kraju, upitali smo mogu li se gornje razlike u farmakološkim učincima aPPD-a pripisati njegovim različitim učincima na Akt-put u lipidnim splavovima dviju staničnih linija pod toksičnim uvredama. Usporedili smo razine Akt-a povezane sa splavom i fosforilirani Akt, kao i BAD. Potonji je cilj Akt nizvodno, a BAD fosforilacija važan je anti-apoptotički mehanizam Akt signalizacije. Ni TAXOL ni Vinblastin značajno nisu promijenili Akt aktivnost u lipidnim splavovima U87MG stanica (Slike 7a i c). Uz to, oba kemoterapijska sredstva značajno su smanjila ukupnu razinu BAD u lipidnim splavovima U87MG stanica, ali nisu utjecala na njihovo stanje fosforilacije (slike 7b i d). S druge strane, NMDA je značajno smanjila fosforilaciju Akt u lipidnim splavovima N2a stanica, te je posljedično smanjena i fosforilacija BAD-a koji je povezan sa splavom (slike 7e i f). Kao što se očekivalo, aPPD je drastično potisnuo Akt fosforilaciju u lipidnim splavovima u U87MG stanicama tretiranim TAXOL ili Vinblastinom. Razine BAD fosforilacije također su značajno smanjene (Slike 7a-d). Suprotno tome, aPPD je obnovio status fosforilacije Akt i BAD u lipidnim splavovima N2DA tretiranih N2a stanica (slike 7e i f). Prema tome, ovi rezultati potvrđuju da aPPD djeluje suprotno farmakološkim učincima na ove različite stanične tipove i da se ovaj specifičan za stanični tip dvosmjerni fenomen može pripisati razlikama u aktivnostima aPPD-a u Akt signalizaciji povezanoj s splavom, specifičnom za stanicu.

Image

Akt signalizacije u lipidnim splavovima U87MG i N2a stanica liječenih kemoterapeuticima i NMDA sa i bez aPPD. Ukupna Akt i Akt fosforilacija u lipidnim splavovima inhibirana je aPPD u U87MG stanicama tretiranim TAXOL ili Vinblastinom ( a i c ). Fosforilacija BAD u lipidnim splavovima također je smanjena aPPD ( b i d ). aPPD je obnovio fosforilaciju Akt i BAD u lipidnim splavovima N2a stanica liječenih NMDA ( e i f ). * P <0, 05, ** P <0, 001 u usporedbi s kontrolom, t -test ( n = 3 neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

aPPD inhibira migraciju gliomskih stanica

Poznato je da Akt signalni put povezan sa splavom regulira invaziju i pokretljivost stanica. 34 Dakle, in vitro ispitivanje ogrebotina 35 provedeno je za mjerenje stope migracije 24 h u stanicama U87MG i N2a liječenih aPPD. Slika 8 pokazuje da liječenje aPPD značajno inhibira staničnu migraciju u U87MG stanicama (53, 2 ± 20, 1% kontrole, P = 0, 0002), ali ima mnogo manji učinak na N2a stanice (82, 4 ± 20, 8%, P = 0, 166).

Image

Učinci aPPD na staničnu migraciju U87MG i N2a stanica. ( a ) Migracija stanica u posudama za kulturu. Rubovi (isprekidane linije) uzgojenih U87MG stanica 0 i 24 sata nakon ogrebotine prikazani su kao linija ozljede, odnosno linija migracije. Područje migracije izračunato je kao regije između linija ozljede i migracije. ( b ) Kvantifikacija brzine migracije ćelije. Brzina migracije U87MG stanica učinkovito je smanjena liječenjem aPPD-a u U87MG, ali ne i N2a stanicama. Podaci su bili prosjeci dva ponovljena pokusa s četverostrukom za svaki put, * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom

Slika pune veličine

Rasprava

Gornji rezultati jasno pokazuju da je (1) aPPD vrlo učinkovit u ometanju proteinskog sastava lipidnih splavova ne mijenjajući razinu kolesterola; (2) učinci aPPD-a na proteine ​​koji žive u splavi su jako ovisni o staničnoj vrsti; (3) aPPD suzbija aktivnost Akt staze u lipidnim splavovima gliomskih stanica, ali povećava je u stanicama neurona bez utjecaja na Akt aktivnost u ukupnom PM obje vrste stanica; (4) aktivnost Akt povezane sa splavom regulirana je aPPD mijenjanjem razina fosfataza u splavu; (5) razlika u utjecaju aPPD-a na aktivnost Akt-puta povezanog sa splavom rezultira inhibicijom stanične migracije i pojačanom citotoksičnošću s TAXOL-om ili Vinblastinom u U87MG stanicama, ali oslabljenom ekscitotoksičnošću s NMDA u stanicama N2a; Naše istraživanje pokazuje da je konačni metabolit protopanaksadiol ginsenozida, aPPD, visoko učinkovit poremećaj splava. Za razliku od M β CD-a, aPPD mijenja sadržaj rezidualnih proteina u lipidnim splavovima bez promjene razine kolesterola. Rh2, pokazalo se da glikozilirani oblik protopanaksadiola utječe na bočno kretanje Fasa između splava i ne-raft mikrodomana stanične membrane. 11 Kako je aPPD strukturno sličniji kolesterolu, ne bi bilo iznenađujuće ako djeluje kao jači rastavljač splava kroz interkalizaciju u lipidni splav i uzrokuje promjene u mikro okruženju membrane, što zauzvrat rezultira izmjenom proteina sastav lipidnih splavova. Ostaje da se utvrdi da li aPPD mijenja proteinske rezidualne proteine ​​uzrokujući opću promjenu fluidnosti membrane, slično ostalim derivatima kolesterola 36, ili da li spoj izravno komunicira sa specifičnim proteinima u lipidnim splavovima kako bi modulirao njihovu aktivnost. Vrijedno je napomenuti da iako aPPD ne mijenja razinu kolesterola u lipidnim splavovima, uzrokovao je nestanak neprozirnosti frakcije lipidnog splava, kao i M β CD (slika 2). Kako neprozirnost može ukazivati ​​na prisutnost specifičnog oblika kompleksa koji sadrži netopive proteine ​​i lipide, njegov nestanak izazvan aPPD-om jasno upućuje na to da spoj može promijeniti fizičko stanje proteina u lipidnim splavovima.

Najupečatljiviji nalaz ovog istraživanja je da aPPD regulira Akt put gliomskih stanica i stanica neurona povezanih sa splavom na suprotan način. aPPD snižava regulaciju Akt fosforilacije u stanicama U87MG, ali uvećava fosforilaciju u stanicama N2a. Rezultati su pokazali da ovo dvosmjerno reguliranje aktivnosti Akt-a povezanog s splavom od strane aPPD-a nije posljedica promjena u aktivnosti PI3K ili PDK1 na splavovima (Slika 5). Potonji je odgovoran za fosforilaciju u Thr308, za koju se smatra da je ključna za Akt aktivaciju. 37 Kako je aPPD promijenio status foksforilacije Akt bez promjene u PI3K ili PDK1, vjerojatnije je da je aktivnost Akt bila regulirana promjenama fosfataza povezanih sa splavom. Doista, promjena u tipičnim staničnim promjenama u splavo-povezanim PHLPP-ima uočena je u stanicama tretiranim aPPD-om. Obje su fosfataze poznate po svojoj ulozi u smanjenju ukupne razine fosforilacije hidrofobnog motiva Akt i preživljavanja stanica. 28 Nema očiglednog objašnjenja kontrastnih učinaka aPPD-a na dvije stanične linije u odnosu na Akt signalizaciju u njihovim lipidnim splavovima. Zabilježeno je da je PHLPP1 možda povezan s Akt2 i Akt3, dok bi PHLPP2 mogao biti s Akt1 i Akt3. 33 Ostaje istražiti da li diferencijalna raspodjela Akt izoforma i njihovih PHLPP-a ima bilo kakvu ulogu u njihovim funkcijama u lipidnim splavovima različitih tipova stanica. Alternativno, također je moguće da se stanice mogu razlikovati u odgovarajućim strukturama lipidnih splavova poput onih koje odražavaju sastav rezidualnih proteina, te da se te razlike mogu razjasniti proteomskom analizom lipidnog splava. 38

Gornja dvosmjerna regulacija Akt signalizacije povezane s splavom, aPPD, je u velikoj mjeri u skladu s kontrastnom farmakološkom aktivnošću ovog spoja u U87MG stanicama i stanicama N2a kada je ko-stimulirana toksičnim uvredom (Slika 6). Zanimljivo je da su u U87MG stanicama i TAXOL i Vinblastin značajno smanjili ukupnu količinu BAD-a koji je povezan sa splavom, fosforilirajući cilj Akt, bez promjene količine fosforiliranog BAD u lipidnim splavovima. Kako nije bilo značajne razlike u aktivnosti Akt na splavovima liječenih stanica, čini se da su kemoterapeutski agensi povećali omjer fosforiliranog BAD i nefosforiliranog BAD u lipidnim splavovima uklanjanjem potonjeg iz ovih struktura. Zanimljivo je da je u N2a stanicama NMDA inhibirala fosforilaciju Akt-a i BAD-a povezanih sa splavom bez promjene ukupnih količina ovih proteina u lipidnim splavovima. Konačno, aPPD pojačava hemotoksičnost u U87MG stanicama i štiti N2a stanice od ekscitotoksičnosti izazvane NMDA-om. Ti su dvosmjerni učinci bili u skladu s promjenama primijećenim u aktivnosti Akt kao i u njegovom nizvodnom ciljnom BAD-u u lipidnim splavovima dviju vrsta stanica, koje mogu izravno biti u korelaciji s pro-apoptotičkim ili anti-apoptotičkim efektom ovisnim o stanici od aPPD. Još je važnije, činjenica da farmakološke funkcije aPPD-a koreliraju s aktivnošću Akt-a povezanom sa splavom, ali ne i da je u ukupnom PM-u još više naglašen pojam da samo Akt povezan sa splavom određuje funkcije njegove signalizacije.

U ovom istraživanju pokazujemo da samo fosforilacija Akt-a povezanog sa splavom određuje aktivnost i smjer Akt signalizacije, jer aPPD nema utjecaja na Akt fosforilaciju u ukupnom PM-u dviju tipova stanica. Ovo naglašava važnost fokusiranja na mikrodomenske membranske umjesto na globalnu staničnu membranu kada se proučavaju funkcije signalnih proteina. Naši rezultati su prvi koji jasno pokazuju da stanice mogu biti različito ciljane prema razlikama u strukturi mikrodomenskih membranskih membrana, a aPPD je ovdje korišten kao prvo sredstvo koje je primijenjeno u tu svrhu.

Materijali i metode

materijali

aPPD pružio je Šangajski inovativni istraživački centar tradicionalne kineske medicine (Šangaj, Kina). Spoj je bio 97, 9% čist, mjereno HPLC analizom. Antitijela na fosfor-Akt (Ser 473 ), fosfor-Akt (Thr 308 ), Akt (pan), PI3 kinaza p85, PI3 kinaza p110 α , ILK1, fosfor-PDK1 (Ser 241 ), BAD, fosfor-BAD (Ser 112 ) i fosfor-BAD (Ser 136 ) kupljeni su od Cell Signaling Technology, Inc. (Mississauga, Ontario, Kanada). Flotillin-1 antitijelo je kupljeno od Abcam, Inc. (Cambridge, MA, USA). PHLPP1 i PHLPP2 protutijela kupljena su od Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX, USA). HRP-konjugirani anti-zečji i anti-mišji IgG kupljeni su od Perkin-Elmer Life Sciences (Boston, MA, SAD). Kokteli s inhibitorima proteaze dobiveni su od Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Njemačka). Modificirani komplet za ispitivanje istosmjernih proteina i membrane iz nitroceluloze kupljeni su od tvrtke BIO-RAD (Hercules, CA). M β CD, Vinblastin, NMDA, mediji (Dulbeccov modificirani medij Eagle, DMEM), tiazolil plavi tetrazolijev bromid (MTT) i druge kemikalije kupljeni su od Sigme (St. Louis, MO, USA). Paclitaxel je kupljen u ljekarni Agencije za borbu protiv raka British Columbia (Vancouver, BC, Kanada). U87MG stanice i N2a stanice kupljene su od American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Fiziološka otopina puferirana fosfatima (PBS), dodaci staničnoj kulturi (fetalni goveđi serum (FBS) i antibiotici dobiveni su od GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, SAD).

Stanične kulture i tretmani

Humane U87MG i N2a stanice uzgajane su u DMEM-u uz dodatak 10% FBS-a, 100 U / ml penicilina i 100 µg / ml streptomicina na 37 ° C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2 i hranjene su svaka 2-3 dana. Osnovna otopina 50 mM aPPD je pripremljena u 100% etanolu i razrijeđena do pravilnih koncentracija u DMEM neposredno prije svakog pokusa. Stanice za liječenje lijekom prethodno su tretirane DMEM-om 4 sata na 37 ° C, nakon čega je slijedilo dodavanje 10 mM M β CD-a ili 10 µM aPPD tijekom 1 sata.

Izolacija splavi lipida

Stanice u pet posuda od 100 mm pomiješane su s 3 ml pufera za lizu po posudi (150 mM NaCl, 20 mM Na2 HPO 4, 2 mM NaH2P04, 20% (v / v) glicerola, 2 mM natrijevog ortovananadata sa inhibitori proteaze, pH 7, 4) i homogenizirani 30 puta s uskim Dounceovim homogenizatorom (Sigma). Uzorci su dodatno prekinuti povremenim soniranjem (šest 30-s impulsa s vremenskim intervalom od 1 min) i zatim centrifugirano pri 10 K okr / min (Beckman-Coulter Optima L-90K ultracentrifuga s SW55Ti rotorom, Mississauga, ON, Kanada) 11 min na 4 ° C za odvajanje staničnih krhotina i nuklearnih materijala. Supernatant je zatim centrifugiran na 32, 5 K okr / min (SW55Ti rotor) 90 min na 4 ° C kako bi se granulirao PM. PM se suspendira i solubilizira u 2 ml solubilizacijskog pufera koji sadrži 0, 5% v / v Triton X-100 u Meso puferiranom fiziološkom otopinom (MBS: 25 mM Mes, pH 6, 5 / 0, 15 M NaCl), inhibitorima proteaze i 2 mM natrijevim ortovananadaom za 15 min na ledu. Zatim se 2 ml solubiliziranog PM dalje razrijedi jednakim volumenom 80% saharoze u MBS i stavi na dno 13 ml epruvete za ultracentrifugu s 4 ml 30% saharoze / MBS. Konačno, kao gornji sloj gradijenta dodano je 4 ml 5% otopine saharoze / MBS. Gradijent je centrifugiran 16 ° C u minuti (SW41Ti rotor) 16 h pri 4 ° C radi izolacije lipidnog splava i odjeljaka koji nisu splavi. Gradijent je zatim frakcioniran u 12 frakcija. 39

Western blotting

Koncentracija proteina izmjerena je korištenjem modificiranog testa proteina DC. Jednaki volumen frakcije (10 μl / traka) iz svakog uzorka razdvojen je na poliakrilamidnom gelu. Za imunobloting proteini su preneseni na nitrocelulozne membrane pomoću mokrog prijenosnog sustava (BIO-RAD). Membrane su blokirane s 5% nemasnog mlijeka (BIO-RAD) 1 sat na sobnoj temperaturi i ispitivane s primarnim antitijelima na 4 ° C preko noći. Membrane su potom isprane tri puta s Tris-puferiranom fiziološkom otopinom s 0, 05% Tween 20 (TBST) i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi s HRP-konjugiranim anti zečjim ili kozjim IgG (1: 5000). Signali su detektirani pomoću poboljšane hemiluminiscencije (Perkin-Elmer Life Sciences), a intenziteti pojasa kvantificirani su korištenjem Image J softvera (NIH, Bethesda, MD, USA).

Mjerenje kolesterola

Pedeset mikrolitara svake frakcije analizirano je s Amplex Red testom kolesterola (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) u skladu s protokolom proizvođača.

MTT test

Da bi se održila stanica, stanice su posijane u pločice s 96 jažica, gustoće 2, 5 × 10 4 / jažici, 1 dan prije pokusa. Kulture su zatim inkubirane sa DMEM koji sadrži TAXOL, Vinblastin ili NMDA, sa ili bez aPPD (10 µM) tijekom 24 sata na 37 ° C. Na kraju svake vremenske točke, kulturni medij je uklonjen i dodano je 50 μl MTT (0, 5 mg / ml u mediju bez seruma) u svaku jažicu. Nakon inkubacije na 37 ° C tokom 4 sata, destilirano je 100 μl pufera za lizu (50 V / v N, N -dimetilformamid (Sigma), 20% SDS (BIO-RAD) i 0, 4% (v / v) ledene octene kiseline doda se voda (pH 4, 8) i ploče se inkubiraju preko noći u vlažnoj atmosferi (37 ° C sa 5% C02). Optička gustoća svake jažice određena je s čitačem mikroploča (BIO-TEK, Winooski, VT, USA) na 595 nm.

Test stanične migracije

U87MG ili N2a stanice uzgajane su u posudama sa kulturom sa šest jažica do 70-90% sutoka, nakon čega je praćena grebanjem s 1 ml steriliziranih vrhova pipete. Nakon ispiranja s prethodno zagrijanim PBS-om, stanice su kultivirane u DMEM bez seruma 24 sata. Slike su snimljene u 0 i 24 sata nakon ogrebotine pomoću mikroskopa Zeiss Axiovert 200 (Zeiss, Toronto, ON, Kanada) sa × 5 (za U87MG stanice) ili × 10 (za stanice N2a). Slike istih mjesta snimljene u 0 i 24 sata prekrivene su i prilagođene programima Photoshop CS4 (Adobe, Ottawa, ON, Kanada). Rub kultiviranih stanica bio je obilježen povezivanjem staničnih tijela najudaljenijih, ali neprekidno povezanih stanica iz neškodovanih regija. Rub na 0 i 24 h definiran je kao linija ozljede i linija migracije. Područje između ozljede i migracijske linije smatralo se migracijskim područjem i bilo je podložno kvantifikaciji. 40 Područja migracije na slikama izmjerena su pomoću ImageJ.

Statistička analiza

Podaci su dobiveni iz najmanje dva neovisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden najmanje u tri primjerka. Podaci su izraženi kao sredstvo ± SE i analizirani za statističku značajnost dvosmjernim Studentovim t- testom. Razlike s P- vrijednostima <0, 05 smatrane su statistički značajnim i na slikama su označene zvjezdicom ( * ).

Glosar

aPPD

20S-protopanaxadiol

LOŠE

Promotor smrti povezan s Bcl-2

M β CD

metil- P- ciklodekstrin

NMDA

N- metil-D -aspartat

PHLPP

PH domena bogata leucinom ponavlja fosfatazu

PM

membrana plazme

TAXOL®

paklitaksela