Kemoterapijska indukcija mitohondrijskog oksidativnog stresa aktivira gsk-3α / β i bax, što dovodi do propusnosti otvaranja pora i otvaranja tumorskih stanica | stanična smrt i bolest

Kemoterapijska indukcija mitohondrijskog oksidativnog stresa aktivira gsk-3α / β i bax, što dovodi do propusnosti otvaranja pora i otvaranja tumorskih stanica | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • kemoterapija
  • Mitohondriji

Sažetak

Preživljavanju tumorskih stanica pogoduju mitohondrijske promjene koje otežavaju indukciju smrti u različitim stresnim stanjima, poput izloženosti kemoterapeuticima. Ove promjene nisu u potpunosti karakterizirane tumorskim mitohondrijama i uključuju neravnotežu redoks ravnoteže, inhibiciju otvaranja prolazne propusnosti pora (PTP) kroz signalne putove kinaze i modulaciju članova Bcl-2 proteinske obitelji. Ovdje pokazujemo da novi kemoterapeutski, Gold (III) -ditiokarbamato kompleks AUL12, inducira oksidativni stres i smrt tumorskih stanica, što pogoduje otvaranju PTP i aktivira pro-apoptotički protein Bax iz Bcl-2 obitelji. AUL12 inhibira respiratorni kompleks I i uzrokuje brzi porast razine mitohondrijalnog superoksida, što dovodi do aktiviranja mitohondrijalne frakcije GSK-3 α / β i do slijedeće fosforilacije mitohondrijskog kapelonskog ciklofilina D, što olakšava otvaranje PTP-a. Pored toga, nakon tretmana AUL12, Bax stupa u interakciju s aktivnim GSK-3 α / β i translocira se na mitohondrije, gdje doprinosi indukciji PTP i smrti tumorskih stanica. Ovi nalazi pružaju dokaze da ciljanje redoks ravnoteže koju mitohondriji održavaju u tumorskim stanicama omogućuje pogoditi ključne mehanizme koji štite novotvorine od toksičnosti mnogih antiumorskih strategija i identificiraju AUL12 kao obećavajući kemoterapijski spoj.

Glavni

Neoplazme stječu sposobnost brzog i dereguliranog rasta pod snažnim selektivnim pritiskom stresnih uvjeta, jer prihvaćaju fleksibilne molekularne strategije za prevladavanje mnoštva apoptotičkih signala i okolinskih ograničenja s kojima se susreću. 1, 2 Ovaj visok stupanj biološke plastičnosti čini stanice raka neuhvatljivom metom za većinu terapija i zahtijeva definiranje specifičnih bioloških osobina zloćudnih stanica koje bi se mogle upotrijebiti za prilagođene farmakološke pristupe.

U mitohondrijama se događa nekoliko biokemijskih promjena koje presudno pridonose neoplastičnoj transformaciji. U većini slučajeva, upravo u mitohondrijama posvećenost smrti postiže točku bez povratka. Otvaranje prelazne pore mitohondrijske propusnosti (PTP), velikog kanala smještenog u unutarnjoj mitohondrijskoj membrani, rezultira depolarizacijom mitohondrija, oticanjem, otpuštanjem Ca 2+, rupturom vanjske membrane i isporukom proteina koji pokreću fazu apoptoze izvršitelja. 3 Oslobađanje ovih efektorskih proteina iz mitohondrija može se dogoditi i nakon umetanja / oligomerizacije u vanjsku mitohondrijsku membranu pro-apoptotičkih članova proteina porodice Bcl-2, kao što su Bax ili Bak. 4 Mitohondrije tumorskih stanica podliježu promjenama koje pridonose stvaranju čvrstih anti-apoptotičkih obrana. Razine ekspresije Bcl-2 proteina iz obitelji su izmijenjene ili ih cilja niz bezbrojnih post-translacijskih modifikacija pokretanih onkogenim signalnim putovima, 4, 5 s porastom anti-apoptotičkih ili smanjenjem pro-apoptotičkih funkcija. Smanjena osjetljivost mitohondrijskog PTP-a na različite stresne podražaje također je primijećena u neoplastičnim stanicama, 3, 6, a mi i drugi smo nedavno otkrili da je PTP otvaranje pojačano fosforilacijom ovisnog o GSK-3 α / β- fosforilaciji kapelonskog ciklofilina D (CyP -D), dobro poznati regulator PTP-a, te da je taj put inhibiran u stanicama raka. 7, 8, 9

Tijekom progresije ka zloćudnom stanju, neoplastična akumulacija prekomjerno povećava opskrbu kisikom i hranjivim tvarima koje pružaju okolne krvne žile. 10 Kako bi se izbjegao štetni učinak ovih hipoksičnih stanja, stanice u unutrašnjosti tumorske mase pojačavaju iskorištavanje glukoze (Warburg učinak; 11, 12, 13 ), uz istodobno smanjenje disanja mitohondrija. 14 Ova inhibicija kompleksa respiratornog lanca (RC) može povećati proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), 15 i iznad određenog praga, oksidativni stres može oštetiti različite stanične strukture i naposljetku ubrzati staničnu smrt aktivirajući otvaranje PTP kroz loše definirane mehanizme. 16 Stanice raka su stoga prisiljene istodobno inducirati anti-oksidansnu obranu radi postavljanja nove homeostatske redoks ravnoteže, 17, 18, 19, a daljnje povećanje razine ROS-a moglo bi nadjačati njihove preostale anti-oksidansne sposobnosti. Suprotno tome, isti stupanj oksidativnog stresa lakše bi mogao upravljati ne-transformiranim stanicama. Prema tome, ciljanje redoks ravnoteže predstavlja obećavajuću strategiju u razvoju novih i selektivnih antikancerogenih strategija, na temelju lijekova koji eliminiraju neoplastične stanice povećanjem mitohondrijskog ROS-a do razine koja može otključati desenzibilizaciju PTP-a.

U ovom konceptualnom okviru istražili smo molekularne mehanizme djelovanja derivata spojeva iz porodice zlata (III) -ditiokarbamato, nazvanih AUL12 ((AuIIIBr2 (ESDT)), ESDT: etilsarkozinditiokarbamata, čiji je dizajn usmjeren na identificiranje meta-ditiokarbamato derivati ​​koji nalikuju cisplatinu, ali obdareni su većim antikancerogenim djelovanjem, poboljšanom selektivnošću i bioraspoloživošću i nižim nuspojavama. 20 Sredstva zlata (III) -ditiokarbamato imaju izvanrednu razinu citotoksičnosti in vitro prema većini humanih staničnih linija humanog tumora. 21 AUL12 je izabran među ovu klasu molekula zbog svog efikasnog anti-neoplastičnog djelovanja, oba in vitro , jer ubija stanice karcinoma povećanjem razine intracelularnog ROS-a, 22 i in vivo prema nekoliko ksenografta raka, uključujući neke dobivene rakom prostate rezistentnim na cisplatin stanice, 23, 24 i zbog njegove izuzetno niske nefrotoksičnosti i akutne toksičnosti. 24

Ovdje smo okarakterizirali mehanizam djelovanja AUL12, otkrivši da on inhibira RC kompleks I, podižući razinu ROS-a i aktivirajući GSK-3 α / β . Aktivni GSK-3 α / β potiče smrt tumorskih stanica, istovremeno olakšavajući PTP otvaranje i uzrokujući Bax-ovu preraspodjelu u mitohondrije. Naši podaci pokazuju da se platforma za preživljavanje koja funkcionalno povezuje RC komplekse, redoks ravnoteže, signalizacija kinaze i izvršioci smrti mitohondrija mogu biti ciljani u neoplastične stanice kako bi dobili njihovo selektivno čišćenje.

Rezultati

AUL12 izaziva smrt stanice ovisne o dozi

Da bismo razumjeli mehanizam citotoksičnosti AUL12, prvo smo karakterizirali njegove učinke na održivost u: (a) modelu visoko agresivnih stanica raka, ljudskim stanicama osteoosarkoma SAOS-2, okarakteriziranim gubitkom aktivnosti p53; (b) humane epitelijske stanice prostate RWPE-1, koje su immortalizirane, ali nemaju bilo kakav tumorigenski potencijal, i (c) stanice RWPE-2, koje su izražene tumorigenskom ekspresijom K-Ras u stanicama RWPE-1. 25, 26 Tretman AUL12 rezultirao je brzim (3 h) porastom razine mitohondrijalnog superoksida u stanicama SAOS-2 (dopunska slika. 1a), što je paralelno s masivnom mitohondrijskom depolarizacijom i indukcijom stanične smrti. isti opseg doze i vremena lijeka (slika 1a, b). U RWPE stanicama, K-Ras transformacija značajno je poboljšala staničnu smrt induciranu AUL12 (usporedite dodatne slike 2a i 2b). Prethodno tretiranje stanica anti-oksidansom N -acetil-L-cisteinom (NAC) spriječilo je depolarizaciju mitohondrija (slika 1a) i staničnu smrt (slika 1b i dodatna slika 2a i 2b), pokazujući ROS-ovisnost toksičnosti AUL12. Suprotno tome, referentni lijek cisplatin nije uspio inducirati staničnu smrt nakon 3-satne inkubacije (dopunska slika 3a), dok je aktivirao NAC-osjetljivu staničnu smrt nakon 24 sata (dopunska slika 3b). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da dva spoja na bazi metala oštećuju stanice pomoću različitih mehanizama i da AUL12 potiče brzu staničnu smrt povećanjem razine mitohondrija ROS.

Image

AUL12 inducira mitohondrijsku depolarizaciju i staničnu smrt proizvodnjom mitohondrijalnog superoksida. ( a ) Citofluorimetrijska analiza (Forward Scatter, FSC nasuprot Tetrametilrhodamin metil esteru, TMRM) koja pokazuje depolarizaciju mitohondrija u ljudskim stanicama SAOS-2 osteosarkoma izloženih AUL12. Na lijevoj strani je prikazan jedan reprezentativni eksperiment, u kojem su vitalne stanice (V, TMRM pozitivne) ograničene gornjim kvadrantom, a stanice koje pokazuju depolarizirane mitohondrije (Dp) ograničene su donjim kvadrantom. ( b ) Indukcija smrti na SAOS-2 stanicama izloženim AUL12 prikazana je kao citofluorimetrijska analiza propidijum jodida (PI) nasuprot bojenju u Dodatku V-FITC. S lijeve strane je prijavljen jedan reprezentativni eksperiment. Stabilne ćelije (V, dvostruko negativne za PI i Aneksin V-FITC) ograničene su donjim lijevim kvadrantima; rane apoptotičke stanice (Single pozitivne u Aneksinu V-FITC) nalaze se u donjem desnom kvadrantu; kasne apoptotske i / ili nekrotične stanice (PI i Aneksin V-FITC dvostruko pozitivne) nalaze se u gornjem desnom kvadrantu; nekrotične stanice (PI pojedinačne pozitivne) nalaze se u gornjem desnom kvadrantu. D (mrtva) označava zbroj svih apoptotičkih i nekrotičnih stanica. I u ( a ) i ( b ), kvantifikacija podataka nalazi se u grafikonima s desne strane; vrijednosti su prosjek ± SD najmanje pet pokusa. Na cijeloj slici brojevi u grafikonima su postotci; AUL12 se inkubira 3 sata; N- acetil cistein (NAC, 1 mM) prethodno je inkubiran 1 sat prije AUL12 tretmana

Slika pune veličine

AUL12 inhibira RC kompleks I i izaziva proizvodnju ROS-a

Mitohondrijski RC kompleksi I, II i III su među glavnim izvorima unutarćelijskog ROS-a 15, a njihovo ciljanje AUL12 moglo bi spriječiti brzinu potrošnje kisika (OCR) i povećati razinu ROS-a u stanicama tumora. Primijetili smo da 15-minutno pred-liječenje AUL12 inhibira na način ovisan o dozi, i spajeno disanje i ukupni mitohondrijski OCR, sve do potpune ukidanja bilo koje mitohondrijske potrošnje kisika (slika 2a, desna i lijeva ploča).

Image

AUL12 inhibira OCR i RC kompleks I. ( a ) S desne strane, reprezentativni tragovi OCR mjerenja provedenih na monoplastima živih SAOS-2 stanica tretiranih s AUL12. Izvršene su naknadne dodatke inhibitora ATP sintaze oligomicina, odvajača FCCP, rotenona inhibitora RC kompleksa I i antimikina A inhibitora RC kompleksa III. AUL12 kod prijavljenih koncentracija prethodno je inkubiran 15 minuta prije početka eksperimenata. Stupni dijagrami s desne strane prikazuju spajanje disanja mitohondrija, izračunato oduzimanjem nevezanog OCR mitohondrija od bazalnog OCR-a (nakon i prije dodavanja oligomicina), nakon što je umanjio ne-mitohondrijsku komponentu OCR-a (rosenon / neosjetljiv na OCR-a na rotenon frakcija). Enzimska aktivnost RC kompleksa II-III ( b ) ili RC kompleksa I ( c ) procijenjena je na mitohondrijima izoliranim iz SAOS-2 stanica u prisutnosti ili odsutnosti različitih koncentracija dodanih AUL12 5 min prije početka eksperimenta. U ( d ), aktivnost RC kompleksa I analizirana je na permeabilizirane SAOS-2 stanice prethodno obrađene ili ne tijekom 90 minuta s 40 µM AUL12. Svi podaci aktivnosti RC kompleksa normalizirani su na aktivnost citratne sintaze i imaju srednje vrijednosti ± SD ( n = 6). Statistička značajnost mjerena je Studentovim t testom i prikazana je zvjezdicama (** P <0, 005)

Slika pune veličine

Kako bismo raskomadali učinak AUL12 na disanje, direktno smo testirali maksimalnu aktivnost RC kompleksa pod uvjetima kada su kompleksi dostupni u mitohondrijama ili permeabiliziranim stanicama i izloženi višku supstrata. AUL12 je imao skroman inhibitorni učinak na RC kompleks II / III (slika 2b), dok je u potpunosti ukinuo aktivnost RC kompleksa I u mitohondrijama i permeabiliziranim stanicama (slike 2c i d). Nedostatak aditivnog učinka na porast razine ROS mitohondrija između složene I inhibitore rotenona i AUL12 (dopunska slika 1b) nadalje ukazuje da AUL12 povećava ROS ciljajući kompleks I.

AUL12 senzibilizira prijelaznu propusnost pora za otvaranje

Postizira se da ROS povećava unutarćelijsku Ca 2+, što bi zauzvrat povećalo stvaranje ROS-a, u krugu za usmjeravanje koji na kraju dovodi do otvaranja PTP-a i smrti stanice. 16, 27, 28 U modelima ćelija raka otvaranje PTP-a otežava konstitutivna inhibicija GSK- α / β , koja djeluje kao čvrst mehanizam preživljavanja. 8

Da bismo istražili utječe li AUL12 na pore, upotrijebili smo ispitivanje zadržavanja kapaciteta Ca2 + za cijelu ćeliju (CRC), kojim se procjenjuje modulacija otvaranja PTP-a procjenom količine Ca 2+ koju su preuzeli mitohondriji digigonina- permealizirane stanice. 29 3-satni tretman AUL12 izazvao je smanjenje doze ovisnog o dozi, tj. Indukciju otvaranja PTP, kako na stanicama (slike 3a i b) tako i na izoliranim mitohondrijama jetre (slike 3c i d). Ovu indukciju u potpunosti je spriječio antioksidans NAC (Slike 3e i f), dok je dodavanje permealiziranim stanicama ciklosporina A (CsA), inhibitora regulatora pora CyP-D, značajno povećalo potrebnu količinu Ca2 + za otvaranje PTP-a (slike 3a i b).

Image

AUL12 senzibilizira otvaranje PTP-a na način ovisan o ROS-u. ( a ) PTP otvaranje SAOS-2 stanica tretiranih s AUL12 mjeri se cijelom staničnom analizom CRC. Izvještava se o fluorescenciji kalcijevog zelenog-5N u ćelijama koje propuštaju cifronin kao proizvoljne jedinice na osi y . Kako sonda ne prožima mitohondrije, unos Ca 2+ u organele nakon svakog pulsa (5 µM Ca 2+ ) prikazuje se brzim padom fluorescentnog šiljaka. Očekuje se da će se inhibitori pore i induktori povećati ili smanjiti, odnosno, doći će do broja uboda prije tranzicije propusnosti, odnosno naglog i izraženog porasta fluorescencije. AUL12 je dodan stanicama u naznačenim koncentracijama 3 sata prije permealizacije digitainom. Gdje je naznačeno, dodan je ciklosporin A (CsA) 5 min prije početka ispitivanja. Stupni grafikoni u ( b ) izvještavaju o ukupnom unosu Ca 2+ prije otvaranja PTP-a (rezultati su srednja ± SD; n = 6). ( c, e ) Reprezentativni CRC eksperimenti izvedeni na izoliranim mitohondrijama jetre liječenih različitim koncentracijama AUL12 ( c ) i / ili s N -acetil-cisteinom (NAC, 1 mM; ( e )). Stupni grafikoni u ( d, f ) izvještavaju o ukupnom unosu Ca 2+ prije otvaranja PTP-a (rezultati su srednja ± SD; n = 6). Statistička značajnost mjerena je Studentovim t testom i prikazana je zvjezdicama (** P <0, 005)

Slika pune veličine

Aktivacija GSK-3 α / β posreduje biološke učinke AUL12

Ovi podaci pokazuju da AUL12 može brzo inducirati inhibiciju RC kompleksa I i oksidativni stres, otključavajući mitohondrijski PTP tumorskih stanica na ROS-ovisan način. U stanicama tumora, stanje koje značajno inducira PTP je aktivacija GSK-3 α / β . 6 Otkrili smo da povećane doze AUL12 izazivaju izrazito i NAC osjetljivo povećanje GSK-3 α / β aktivnosti 30 (slika 4a). Nadalje, stanična predinkubacija s GSK-3 a / p inhibitorom indirubin-3'-oksimom prije tretmana AUL12 obustavila je i senzibilizaciju za PTP (Slika 4b) i zaštitila stanice od apoptoze (Slika 4c). Prema tome, AUL12 aktivira GSK-3 α / β na način ovisan o ROS-u, a GSK-3 α / β aktivacija zauzvrat inducira PTP otvaranje. Inhibicija GSK-3 α / β aktiviranjem signalizacije preživljavanja kinaze pogoduje regrutovanju izoforme II hekokinaze (HK II) na mitohondrijsku površinu tumorskih stanica, 31, 32 gdje smanjuje osjetljivost PTP na podražaje stresa. 29 Međutim, otkrili smo da razina HK II koja je vezana za mitohondrije nije promijenjena tretmanom AUL12 (podaci nisu prikazani). Drugi mogući mehanizam regulacije pora pomoću GSK-3 α / β bila je fosforilacija PTP regulatora CyP-D mitohondrijskom frakcijom kinaze, poboljšavajući tako otvaranje PTP. Prema tome, otkrili smo da AUL12 aktivira mitohondrijalni GSK-3 α / β (slika 4d) i inducira CyP-D fosforilaciju (slika 4e).

Image

AUL12 inducira smrt stanica putem ROS-ovisne aktivacije GSK-3 α / β . ( a ) Zapadna imunobloting analiza koja pokazuje fosforilaciju ostatka aktivatora Y (279/216) GSK-3 α / β u ukupnim SAOS-2 staničnim lizatima. Tamo gdje je naznačeno, stanice su tretirane s AUL12 (2 h) i prethodno inkubirane s NAC (1 mM, 1 h) ili s indirubinom GSK-3 α / β inhibitor (IND, 2 µM, 3 h) prije izlaganja AUL12. ( b ) CRC eksperimenti na cijelim stanicama koje su tretirane ili nisu s AUL12 (40 µM, 2 h) pokazuju da pred tretman indirubinom (IND) spašava otvaranje PTP-a izazvano kemoterapijom. Unos mitohondrija Ca 2+ u različitim uvjetima uspoređuje se s onim izmjerenim u nestimuliranim stanicama. U početku je djelotvornost indirubina za inaktivaciju GSK-3 α / β prikazana kao deposforilacija Y (279/216) ostatka. ( c ) Indukcija smrti na SAOS-2 stanicama izloženim različitim koncentracijama AUL12 sa ili bez pretinkubacije s IND analizira se citofluorimetrijom dvostrukim obojenjem propidijum-jodidom / Aneksinom V-FITC, kao na slici 1B. Stabilne stanice prijavljene na grafikonu negativne su za oba fluorofora. ( d ) Zapadna imunoblontska analiza fosfo-Y (279/216) ostatka GSK-3 α / β u mitohondrijskim i citoplazmatskim frakcijama SAOS-2 stanica izloženih AUL12 sa ili bez pretinkubacije s IND. ( e ) Imunoprecipitaciju ostataka antifosfo-serina / treonina iz mitohondrija stanica SAOS-2 izloženih gladovanju u serumu (24 sata) ili AUL12 praćena je zapadnom imunoblotskom analizom ciklofilina D. Na slici su prikazani prosječni grafikoni. ± SD vrijednosti ( n = 3). Statistička značajnost mjerena je Studentovim t testom i prikazana je zvjezdicama (** P <0, 005). Inhibitor IND (2 µM) je predinkubiran tokom 3 sata

Slika pune veličine

GSK-3 α / β također aktivira staničnu smrt kroz mitohondrijske sklopove alternativne otvaranju PTP-a, kao što je mitohondrijska translokacija pro-apoptotičkog člana porodice Bcl-2 Bax, 33 što dovodi do prožimanja vanjske mitohondrijske membrane. Eksperimenti sa su-imunoprecipitacijom otkrili su da Bax i aktivni Tyr-fosforilirani GSK-3 α / β djeluju u stanicama liječenim AUL12, a ta interakcija je ukinuta staničnom predobradom bilo s indirubin-3'-oksimom ili s antioksidansom NAC (Slika 5a i b). Nadalje, primijetili smo da AUL12 inducira Bax-ovu translokaciju u mitohondrije, a taj proces inhibira GSK-3 a / β inhibitor indirubin-3'-oksim (slika 5c). Primjetno, stanična predobrada selektivnim peptidom koji inhibira Bax (BIP) može djelomično inhibirati otvaranje pora inducirano AUL12 (slika 5d) i zaštititi tumorske stanice od letalnosti AUL12 (slika 5e). Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazuju da povećana razina unutarćelijskog ROS-a izazvana AUL12 aktivira GSK-3 α / β , što zauzvrat aktivira staničnu smrt propadanjem mitohondrijalne membrane posredovanim otvaranjem PTP- a i Baxsovim rekrutacijom na mitohondrijima, što može doprinijeti porastu pora indukcija.

Image

AUL12 inducira interakciju između fosforiliranog GSK-3 α / β i Bax, koji translocira na mitohondrije i doprinosi PTP indukciji i staničnoj smrti. ( a ) S lijeve strane, GSK-3 α / β imunoprecipitacija u SAOS ćelijama tretirane ili ne u trajanju od 2 sata s 40 µM AUL12; tamo gdje je naznačeno, stanice su prethodno inkubirane s IND (2 µM, 3 h) ili NAC (1 mM, 1 h). Zapadni imunoblot je ispitivan s Baxom, dok se β- katenin koristi kao pozitivna kontrola ko-imunoprecipitacije s GSK-3 α / β u izgladnjelim stanicama (STV); NC, negativna kontrola. S desne strane p (Y216) GSK-3 α / β imunoprecipitacija u SAOS stanicama koje su tretirane ili ne 2 sata s 40 µM AUL12. Zapadni imunoblot je ispitivan s GSK-3 α / β i Baxom. Na obje ploče IgG se koristi kao kontrola opterećenja. ( b ) Bax imunoprecipitacija u SAOS stanicama tretiranim ili ne 2 sata s 40 µM AUL12; tamo gdje je naznačeno, stanice su prethodno inkubirane s IND, kao u ( a ). Zapadni imunoblot ispitivan je s GSK-3 α / β s Baxom i s IgG kao kontrolom opterećenja; NC, negativna kontrola. ( c ) zapadni imunoblot na citosolne i mitohondrijske frakcije SAOS-2 stanica tretirane ili ne u trajanju od 2 h s 40 µM AUL12; tamo gdje je naznačeno, stanice su prethodno inkubirane s IND, kao u ( a ). Da bi se provjerila čistoća frakcije, mrlja je također ispitana s p- kateninom kao citosolnim markerom i s TOM20 kao mitohondrijskim markerom. ( d ) CRC eksperimenti na cijelim stanicama tretiranim prijavljenim koncentracijama AUL12 (sa ili bez 1 h preinkubacije peptidom koji inhibira Bax (BIP, 60 µM). Unos mitohondrija Ca 2+ u različitim uvjetima uspoređuje se s izmjerenim u nestimuliranim stanicama. ( e ) Indukcija smrti na SAOS-2 stanicama izloženim različitim koncentracijama AUL12 sa ili bez pretinkubacije s BIP (60 µM) analizira se citofluorimetrijom dvostrukim obojenjem propidijum-jodidom / Prilogom V-FITC, kao na slici 1b. Stabilne ćelije prijavljene na grafikonu negativne su za oba fluorofora. Na cijeloj slici bar-grafovi pokazuju prosječne vrijednosti ± SD vrijednosti ( n = 3). Statistička značajnost mjerena je Studentovim t testom i označena je zvjezdicama ( * P <0, 01, ** P <0, 005)

Slika pune veličine

Rasprava

U ovom smo radu opisali biokemijske mehanizme koji održavaju antikancerogeno djelovanje AUL12, nove kemoterapije obitelji Gold (III) -ditiokarbamato. Otkrili smo da AUL12 snažno inhibira aktivnost RC kompleksa I i uzrokuje brzo povećanje razine ROS, što zauzvrat dovodi do otvaranja mitohondrijskog PTP-a i apoptoze stanica raka. Uloga koju oksidanti imaju u neoplastičnoj transformaciji složena je i nije u potpunosti shvaćena. ROS može doprinijeti poticanju proliferacije, invazije i metastaze i inhibiranju apoptoze. 34 Potičući genomsku nestabilnost, ROS ubrzava brzinu mutacija i dovodi do daljnjih neoplastičnih promjena, poput disfunkcija u energetskom metabolizmu, istjecanjem elektrona tijekom procesa oksidativne fosforilacije i slijedeće generacije superoksida i kasnije hidrogen peroksida. 18, 35, 36 Aktivacija nekoliko onkogena, kao što su Ras, Bcr-Abl i c-Myc ili gubitak funkcionalnog p53, povećavaju produkciju ROS pojačavanjem glikolize i inhibiranjem oksidativne fosforilacije. 37, 38, 39 Ove promjene su pretpostavljene da bi stanice tumora bile podložne daljnjem oksidativnom stresu. U skladu s tim, otkrili smo da ljudske stanice osteoosarkoma SAOS-2, kojima nedostaje funkcionalni p53, 40, podvrgavaju se masovnoj apoptozi nakon 3 sata liječenja AUL12.

Međutim, međusobno djelovanje pro-neoplastične transdukcije signala i redox regulacije može biti složeno, kao u slučaju onkogena K-Ras: niska razina K-Ras ekspresije potiče ROS detoksikacijski program potreban za inicijaciju tumora, proliferaciju i preživljavanje, 19. ali izrazito povećanje njegove aktivnosti pojačava mitohondrijski ROS, koji potiče staničnu proliferaciju i rast neovisan o sidrištu, 41 i lijekovi poput lanperisona ili erastina induciraju oslobađanje mitohondrija od ROS-a, oksidacijsku staničnu smrt i suzbijanje rasta tumora u onkogeni model koji luči onkogeni K- Ras mutacije. 42, 43 U skladu s osjetljivošću na K-Ras na oksidativni stres, AUL12 je učinkovitiji u induciranju apoptoze u epitelnim stanicama prostate transformiranih iz K-Ras-RWPE-2 u odnosu na ne-transformirane roditeljske RWPE-1 stanice, iako su ove više osjetljiv na razne apoptogene podražaje. 8 Uz to, AUL12 in vivo inhibira ksenografski rast stanica tumora prostate, uzrokujući minimalnu sistemsku toksičnost. 23

Međutim, iznad određenog praga, oksidativni stres može izazvati produljeno otvaranje mitohondrijskog PTP-a, nepovratno čineći stanice do smrti. Povećanje razine ROS-a može potaknuti povratnu petlju koja uključuje progresivni porast Ca 2+, daljnje povećanje ROS-a i produljene PTP otvore 16, 27, 28, ali molekularni mehanizmi koji promoviraju taj proces i njihovu moguću deregulaciju u karcinomu ostaju slabo definirani, Većina ROS-a stvorenih u netaknutim mitohondrijama doprinosi RC kompleksom I, 44 a NADH: hinon-oksidoreduktaza obdarena izuzetno složenom strukturom. 45 Fino reguliranje aktivnosti Složenog I događa se tijekom tumorigeneze. Na primjer, K-Ras-transformirani fibroblasti smanjuju sadržaj i aktivnost složenih I u usporedbi s kontrolnim kolegom. 46 Analogni rotenon kinona povećava proizvodnju superoksida iz supstrata vezanih uz NAD + i ometa stvaranje stabiliziranog ubisemikinona u matričnom dijelu kompleksa. 34 Kao što primjećujemo da ROS induciran AUL12 nije dodatno povećan rotenonom, sumnjamo da dva lijeka djeluju na isti biokemijski proces unutar kompleksa I. Osobito, oksidativni stres ovisno o rotenonu izaziva autofagičnu smrt u stanicama raka. 47

ROS regrutira i podešava aktivnost signalnih molekula na izrazito razdijeljen način unutar stanice. 48 ROS-osjetljivi proteini reguliraju različite stanične funkcije koje su relevantne za nastanak i razvoj tumora. 35 Primjećujemo da oksidativni stres izazvan AUL12 uzrokuje fosforilaciju Tyr (279/216) ostatka na GSK-3 α / β , što aktivira enzim i pogoduje njegovoj subcelularnoj preraspodjeli. 49 Uočena je ROS-ovisna aktivacija GSK-3 α / β u nekoliko ćelijskih modela, uključujući kardiomiocite kroz trajnu aktivaciju ERK 50 ili mTOR 51, mezangijalne stanice, gdje ROS-GSK-3 α / β signalni put inducira autofagiju, 52 ili neuronske stanice, u kojima oksidativni stres izaziva izrazitu aktivaciju GSK-3β, koja antagonizira signale preživljavanja. 53 GSK-3 α / β može pogodovati otvaranju PTP-a promoviranjem odvajanja HK II od mitohondrija, 29, 31, 32 ili fosforiliranjem kapepana i PTP regulatora CyP-D, 7, 8, 9 i u neoplazmi, nekoliko onkogenih signala se konvergira na mitohondrijalnom GSK-3 α / β za održavanje PTP zaključano. 6 Ovdje utvrđujemo da ROS-ovisna GSK-3 α / β aktivacija ne mijenja ravnotežu vezanja HK II s mitohondrijama, već fosforilira CyP-D, funkcionalno spajajući AUL12 ovisnu GSK-3 α / β aktivaciju s PTP indukcijom.

Paralelno s tim, primijetili smo da ROS povišen AUL12 inducira interakciju između GSK-3 α / β i pro-apoptotičnog Bcl-2 obiteljskog proteina Bax, s dramatičnom preseljenjem Baxa na mitohondrije. Ovaj je rezultat u skladu s prethodnim opažanjima, pokazujući da GSK-3 α / β može aktivirati Bax bilo izravno, fosforilacijom na Ser-163 ili pospješujući njegovu p53-induciranu ekspresiju. 33 Mitohondrijski Bax inducira staničnu smrt, što potiče permeabilizaciju vanjske membrane i posljedično oslobađanje apoptogenih čimbenika. 54 Međutim, predložene su i funkcionalne veze između regulacije Bax-a i PTP-a, jer je pokazano da Bax blokira naponski ovisni K + kanal nazvan K V 1.3 u unutarnjoj mitohondrijskoj membrani, što dovodi do brze proizvodnje ROS-a i otvaranja PTP-a. 55 Prema tome, opažamo da inhibicija Baxa selektivnim peptidom djelomično spašava otvaranje PTP-a i staničnu smrt izazvanu AUL12.

Mehanizmi pomoću kojih AUL12 cilja neuravnoteženu homeostatsku redoks ravnotežu malignih stanica omogućuje propuštanje svjetla u mitohondrijski stroj koji orkestrira preživljavanje neoplazme. Funkcionalna veza koju primjećujemo kod složene I, poboljšane proizvodnje ROS-a, aktiviranje GSK-3 α / β i Bax-a i otključavanje PTP-a nudi višestruke, obećavajuće terapijske ciljeve. Toksičnost izvedena iz liječenja, neosjetljivost stanica na lijekove i nedostatak terapijske selektivnosti i dalje su glavni problemi u razvoju strategija koje vode do izliječenja raka. S obzirom na sposobnost selektivnog ubijanja stanica karcinoma in vivo i in vitro bez sistemske toksičnosti, AUL12 može predstavljati vodeći spoj u razvoju kemoterapeutika koji ciljaju jedinstvene neoplastične promjene stanične redoks ravnoteže.

Materijali i metode

Kemikalije i reagensi

FITC-konjugirani Annexin-V bio je iz Rochea (Indianapolis, IN, SAD); Kalcijev zeleni-5N i metilni ester tetrametil-rodamin (TMRM) bili su iz molekularnih sondi (Eugene, OR, SAD); PD 98059 i Indirubin-3-monoksim bili su iz Calbiochema (San Diego, Kalifornija, SAD); sve druge kemikalije (oligomicin, antimikcin, rotenon, N -acetil-L-cistein (NAC)) bile su iz Sigme (St. Louis, MO, SAD). Miševo monoklonsko protu-aktinsko antitijelo (ulaz) bilo je iz Sigme; mišje monoklonsko anti-GSK-3a / β, zečje poliklonalno anti-BAX i anti-TOM20 antitijelo bilo je iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), monoklonsko anti-CyP-D antitijelo je iz Calbiochem; zečja antifosfo-Y (279/216) protutijela na GSK-3 α / β bila su iz stanične signalizacije (Beverly, MA, SAD); Sekundarna antitijela konjugirana na FITC bila su iz Sigme. N- acetil-L-cistein (NAC) dodan je 1 sat prije pokretanja indukcije apoptoze putem AUL12, dok je IND dodan 3 sata prije.

Analiza protočne citometrije indukcije apoptoze

Zabilježene su snimke protočne citometrije apoptotskih promjena, kako je opisano. 56, 57 Ukratko, nakon indukcije apoptoze, stanice se ponovo suspendiraju u 135 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2 i inkubiraju 15 minuta na 37 ° C u FITC-konjugiranom Aneksinu-V, TMRM (20 nM) i propidijumu jodid (PI, 1 µ g ml −1 ), za otkrivanje mitohondrijske depolarizacije (smanjeno obojenje TMRM), izloženosti fosfatidilserinu na staničnoj površini (povećana FITC-konjugirana boja na prilogu A-V) i gubitka integriteta plazma membrane (propusnost i bojenje PI), Uzorci su analizirani na protočnom citometru FACS Canto II (Becton Dickinson, San Diego, CA, SAD). Prikupljanje i analiza podataka provedena je korištenjem FACSDiva softvera (Becton Dickinson). Svaki je eksperiment ponovljen najmanje četiri puta, a dosljednost podataka omogućila je prikazivanje jednog reprezentativnog eksperimenta za svako stanje.

Stanična liza, frakcionacija i zapadnjačka imunoblotska analiza

Ukupni stanični ekstrakti pripremljeni su na 4 ° C u 140 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 5 mM EDTA, 10% glicerola i 1% Triton X-100 u prisutnosti fosfataze i inhibitora proteaze (Sigma). Za odvajanje mitohondrija od citosolne frakcije, stanice su stavljene u izolacijski pufer (250 mM saharoze, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EGTA-Tris, pH 7.4) i homogenizirane na 4 ° C. Mitohondrije su zatim izolirane diferencijalnom centrifugiranjem (tri puta, prvo pri 700 × g i dva puta pri 9000 × g , sve na 4 ° C, 10 min) u izolacijskom puferu mitohondrija.

Za imunoprecipitacije, 2000–3000 μg proteina po reakciji inkubirano je s antitijelima konjugiranim na protein A- ili zrnce proteina G-Sepharose (Sigma) na 4 ° C preko noći. Negativne kontrole izvedene su inkubacijom lizata na konjugiranim zrncima u odsustvu primarnih antitijela. Zatim su uzorci razdvojeni u redukcijskim uvjetima na SDS-poliakrilamidnim gelovima i preneseni na Hybond-C Extra membrane (Amersham, Little Chalfont, Velika Britanija). Primarna antitijela su se inkubirala 16 sati na 4 ° C, a sekundarna antitijela vezana uz hren dodana su tijekom 1 sata. Zapadni imunobloti provedeni su u standardnim uvjetima, a proteini su vizualizirani pojačanom kemiluminiscencijom (Millipore, Billerica, MA, USA).

Izolacija mitohondrija miša

Mitohondrije su izolirane iz jetre divljeg tipa, BALBc miševa, postupnim uzastopnim centrifugiranjem, kako je opisano. 58 Svi postupci provedeni su na 4 ° C.

Mjerenje kapaciteta zadržavanja mitohondrija Ca 2+

CRC analiza korištena je za procjenu otvaranja PTP nakon vlakova Ca2 + impulsa 29, 58 i izmjereno fluorimetrično na 25 ° C u prisutnosti Ca2 + indikatora, Kalcij Green-5N (1 μM ; λ exc: 505 nM; λ nM: 535 nM; Molekularne sonde). Izvodili smo CRC eksperimente na izoliranim mitohondrijama ili na cijelim stanicama smještenim u izotoničnom puferu (130 mM KCl, 1 mM Pi-Tris (Pi: anorganski fosfat), 10 mM Tris / MOPS, 10 μM EGTA / Tris, 5 mM glutamat / 2, 5 mM malata, 10 µM citokroma c , pH 7, 4). CRC za čitave stanice proveden je nakon permeabilizacije plazma membrane neionskim deterdžentom digitoninom, koji je visoko selektivan za membrane obogaćene holesterolom i ne oštećuje mitohondrijske membrane. Stanice su isprane dva puta u puferu sastavljenom od 130 mM KCl, 1 mM Pi-Tris, 10 mM Tris / MOPS, 1 mM EGTA / Tris, pH 7, 4, a zatim permeabilizirani sa 150 μM digitona (15 min, 4 ° C) u isti pufer s modificiranim EGTA / Tris, (1 mM, pH 7, 4). Digitonin je tada ispran spinovima dva puta u puferu za pranje s 0, 1 mM EGTA / Tris, a broj stanica pažljivo je procijenjen prije početka svakog eksperimenta. Zatim su stavljene mitohondrije (0, 5 mg ml -1 ) ili permeabilizirane stanice (7 × 106 stanica po pokusu) u prisutnost pokazatelja Ca 2+, Kalcij-Zeleni-5N, koji ne prožima mitohondrije, i izložene Ca 2+ bodova (10 µM, odnosno 5 µM , respektivno). Fluorescentne kapi korištene su za procjenu unosa mitohondrija Ca 2+ . Otkrivanje PTP-a otkriveno je kao porast fluorescencije.

Određivanje aktivnosti mitohondrijskog respiratornog kompleksa

Za mjerenje enzimske aktivnosti RC kompleksa, mitohondrije jetre mišića homogenizirane su električnim loncem (Sigma) u puferu sastavljenom od 250 mM saharoze, 10 mM Tris-HCl, 0, 1 mM EGTA-Tris, pH 7, 4, Percoll 10%, proteaza i izolirane inhibitore fosfataze i mitohondrije, kako je gore opisano, s različitim centrifugiranjima. Aktivnosti mitohondrijskog respiratornog kompleksa I i II / III određene su spektrofotometrijski, kako je opisano. 59 Ukratko, za složene I mišje mitohondrije jetre (40 μg ml -1 ) stavljeni su u testni medij sastavljen od Tris 10 mM pH 8, goveđeg serumskog albumina 3 mg ml -1, alameticina 5 μM, natrijevog azida 5 mM, antimikin 1 µM, CoQ 6, 5 µM i promjena apsorpcije (340 nM, 37 ° C) sa ili bez AUL12 (10 min inkubacije) zabilježeni su 1 min. Potom je dodan NADH (0, 1 mM), a aktivnost NADH oksidoreduktaze mjerena je 5 min prije dodavanja rotenona (20 μM ) nakon čega je mjerena aktivnost dodatnih 3 minute. Aktivnost složene I je aktivnost na NADH oksidoreduktazu osjetljivu na rotenon.

Za određivanje složenih aktivnosti II / III, mitohondrije jetre mišića (40 μg ml -1 ) stavljene su u medijum sastavljen od KH 2 PO 4 25mM, albumina goveđeg seruma 1 mg ml -1, natrij azida 5 mM, sukcinata 10 mM, alameticin 5 μM, ATP 0, 1 mM sa ili bez AUL12 (10-minutna inkubacija). Zatim je dodan citokrom c 50 μM i smanjenje apsorpcije (550 nM, 37 ° C) zabilježeno je 10 min. Konačno, podaci su ispravljeni za aktivnost citratne sintaze: mitohndrija jetre mišića (40 μg ml -1 ) smještena je u medij sastavljen od Tris / HCl 100mM, pH = 8, DTNB 0, 1 mM, acetil CoA 0, 3mM i oksaloacetat 0, 5 mM. Potom je zabilježeno povećanje apsorpcije (412 nM, 37 ° C) tijekom 10 min.

Pokusi potrošnje kisika (OCR)

Brzina potrošnje kisika određena je u realnom vremenu pomoću XF24 vanćelijskog analizatora fluksa (Seahorse Biosciences), koji omogućava mjerenje OCR promjena nakon čak četiri uzastopna dodavanja spojeva. Stanice (5 × 10 4 po jažici) su posađene dan prije eksperimenta u DMEM / 10% serumskom mediju; eksperimenti su izvedeni na spojnim jednoslojevima. Prije započinjanja mjerenja, stanice su stavljene u tekući medij DMEM (dopunjen sa 25 mM glukoze, 2 mM glutamina, 1 mM natrijevog piruvata i bez seruma) i prethodno inkubirane 1 sat na 37 ° C u atmosferskom CO2. OCR vrijednosti su tada normalizirane za sadržaj proteina u svakom uzorku. Provedena je točna titracija s odvajačem FCCP, kako bi se iskoristila koncentracija FCCP (20 nM) koja maksimalno povećava OCR.

Statistička analiza

Podatke su prikupili istražitelji zaslijepljeni eksperimentalnim postavkama i statistički su analizirali parametrijskim Studentovim t- testom. Na svim grafovima prikazana je srednja vrijednost ± SD (standardno odstupanje srednje vrijednosti). P- vrijednosti 0.01 smatrane su statistički značajnim. Statistička analiza izvršena je sa Statgraphics Centurion XVI, verzija 16.1.12 (StatPoint Technologies, Inc. Warrenton, VA, SAD)

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

AUL12

([AuIIIBr2 (ESDT)]

ESDT

ethylsarcosinedithiocarbamate)

BIP

Peptid koji inhibira Bax

CRC

Kapacitet zadržavanja Ca 2+

CsA

ciklosporin A

CYP-D

ciklofilin D

HK II

heksokinazni izoform II

IND

indirubin-3'-oksim

NAC

N- acetil-L-cistein

OCR

stopa potrošnje kisika

OXPHOS

oksidativne fosforilacije

PTP

propusnost prijelaznih pora

RC

respiratorni lanac

ROS

reaktivne vrste kisika

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)