Uspoređivanje promjena u ekspresiji gena povezanih s napadom nematoda korijenskih čvorova u osjetljivim nasadima otpornim na sorte riže | znanstvena izvješća

Uspoređivanje promjena u ekspresiji gena povezanih s napadom nematoda korijenskih čvorova u osjetljivim nasadima otpornim na sorte riže | znanstvena izvješća

Anonim

teme

  • biotička
  • Fiziologija biljaka

Sažetak

Riža je jedna od glavnih vrsta osnovnih prehrambenih kultura u svijetu i izvrstan model modela za proučavanje monokotiledonih biljaka. Bolesti uzrokovane nematodama riže dobro su dokumentirane, a među njima je i nematoda korijenskog čvorova (RKN), Meloidogyne graminicola , koja uzrokuje opsežan pad prinosa. Stoga je potrebno identificirati nove izvore prirodne otpornosti na RKN u riži i detaljno istražiti interakciju riža-RKN kako bismo razumjeli osnovne mehanizme obrane biljaka i manipulaciju nematodama fiziologije domaćina. U tu svrhu je šest različitih sorti riže ispitano na infekciju i razvoj RKN-a; Otkriveno je da su Pusa 1121 i Vandana najosjetljivija i rezistentna na RKN infekciju. Da bi se istražila uloga glavnih putova obrane reguliranih hormonima u kompatibilnoj / nespojivoj interakciji riža-RKN, određeni su neki dobro identificirani marker geni koji su uključeni u put salicilat / jasmonat / etilen i pokazali su njihovu različitu ekspresiju pomoću qRT-PCR. Općenito, naša studija pokazuje znatnu odstupanje u obrascu ekspresije tih gena između kompatibilne i nespojive interakcije riža-RKN. Budući da je većina podataka o molekularnoj interakciji biljaka i nematoda generirana na dvotiledonim biljkama, trenutna studija će ojačati naše osnovno razumijevanje interakcije biljaka i nematoda u monokoti, što će pomoći u definiranju budućih strategija najboljih zdravstvenih mjera biljaka.

Uvod

Biljne parazitske nematode (PPN) pokazale su se jednim od najtežih za upravljanje i tvrdoglavim štetočinom poljoprivrednih kultura. PPN-ovi prikazuju širok izbor interakcija s njihovim domaćinima. Najnapredniji od njih su sjedilački endoparaziti koji induciraju specijaliziranu ćeliju za hranjenje u tkivu domaćina. Vjeruje se da ove prehrambene strukture služe kao jedinstveni izvor hranjivih tvari za razvoj i razmnožavanje nematoda. Identificirana je mnoštvo efektnih proteina nematoda koji uzajamno djeluju s nekoliko biljnih proteina kako bi pokrenuli i održali hranjive stanice i uzurpirali urođenu odbranu domaćina 1, 2 .

Budući da je jedna od glavnih vrsta usjeva hrane i perspektivna monokotiledonska biljka, riža ( Oryza sativa L.) privukla je znatnu pažnju nematologa koji proučavaju fiziološku i molekularnu interakciju riže i PPN-a. Korijenska nematoda (RKN), Meloidogyne graminicola nastaje kao ozbiljno usko grlo u sustavu usjeva riže i pšenice Indo-gangetskih ravnica i uzrokuje znatne gubitke u prinosu u svim pojasevima riže u jugoistočnoj Aziji. Zarazna maloljetnica drugog stupnja (J2) prodire u korijen riže iza zone vrha korijena, prolazi kroz vaskularno tkivo i inducira tipičnu stanicu za hranjenje, poznatu kao gigantska stanica (GC). Stanice koje okružuju GC hipertrofirane su da omoguće stvaranje makroskopskih žuči sličnih kukicama na korijenskom sustavu 3, 4, 5 .

Do danas je poznato da su gotovo svi ispitivani kultivari O. sativa osjetljivi na RKN infekciju, dok su nekultivirani afrički rođaci, O. glaberrima i O. longistaminata otporni na infekciju M. graminicola 3, 5, 6, 7, 8 . Kako bi se zadovoljila sve veća potražnja za hranom uslijed rasta globalne populacije, razvijaju se poboljšane sorte riže s superiornim potencijalom prinosa i tolerancijom na biotičke i abiotičke napone koristeći molekularne pristupe uzgoja. Neki od ovih kultivara uključuju: Pusa 1121 (visoki rodni basmati), Samba Mahsuri / BPT 5204 (dijabetičar i otporan na bakterijsku mrlju listova), Suraksha (otporna na žučni grozd), Vandana (otporna na sušu, korov konkurentan, umjereno otporan na plahta i eksplozija), IC 81372 (pristupanje, efikasno se koristi za genetsku transformaciju), Taipei 309 (model japoničke riže za in vitro kulturu) itd. (portal za upravljanje rižinim znanjem: www.rkmp.co.in) 9, 10 . Međutim, priroda interakcije RKN-a s tim kultivarima još nije istražena. Dakle, da bi se popunile praznine u našem razumijevanju otpornosti biljaka domaćina na PPN, reprezentativni visoko sinkroni model biljke i PPN interakcije, poput patosustava riža- M. graminicola, može se disecirati korištenjem i bihevioralnih i molekularnih studija.

Mala veličina PPN-a, kao i činjenica da su mnoge vrste obligati biotrofi i ne mogu se uzgajati u velikom broju, čine ih izuzetno teškim eksperimentalnim organizmima. Nekoliko ispitivanja koristilo je agarozu kao medij za proučavanje ponašanja nematoda. Međutim, nematode migriraju duž površine agara dvodimenzionalno, što je prilično za razliku od njihovog kretanja u tlu okoline 11 . Pojava gena Pluronic F-127 (PF-127) kao medija za proučavanje PPN ponašanja, revolucionirala je koncept interakcije biljka-nematoda na početnoj razini 12, 13, 14, 15 . Nematode suspendirane u PF-127 gelu mogu se slobodno kretati u tri dimenzije kao odgovor na stabilne kemijske gradijente koje proizlaze iz korijena domaćina. Ovaj sustav oponaša prirodno okruženje tla što vodi realnijoj procjeni interakcije domaćin-patogen. Izvrsna prozirnost gela dovodi do boljeg nadzora procesa infekcije PPN-om oko tkiva korijena domaćina pod mikroskopom. PF-127, kopolimer propilen oksida i etilen oksida, ima zanemarivu toksičnost prema nematodama ili biljnim tkivima 12, 16 . U ovoj studiji procijenili smo prikladnost alternativnog sustava bez tla (PF-127) za probir šest različitih vrsta riže, poput Pusa 1121, BPT 5204, Suraksha, Vandana, IC 81372 i Taipei 309, prepoznati odgovor otpornosti / osjetljivosti te raznolike germplazme na RKN infekciju.

Invazija PPN-a u biljku domaćina pokreće konstitutivni i inducirani obrambeni odgovor u zaraženoj biljci što je regulirano usklađenim izražavanjem različitih biljnih signalnih putova, uključujući biljne hormone (etilen, ET; salicilna kiselina, SA i jasmonska kiselina, JA), (PR) proteini povezani s patogenezom i razni faktori transkripcije biljaka; i ishod ovih visoko koordiniranih signalnih odgovora u konačnici određuje osjetljivost / otpornost biljaka na PPN-e 17, 18, 19 . Ipak, razumijevanje uloge fitohormona u poticanju sistemske i lokalne obrane u monokotiledonima nakon infekcije PPN-om još je uvijek nedovoljno iskorišteno područje. S tim u vezi, u trenutnoj studiji, osjetljive i otporne sorte riže identificirane u PF-127 ispitivanju izazivane su inokuliranjem M. graminicola te je proučena relativna ekspresija nekoliko obrambenih gena u lokalnom i sistemskom biljnom tkivu. Naša studija daje globalni prikaz promjena u ekspresiji gena povezanih na obrani osjetljivih i otpornih sorti riže na infekciju nematodama. Značajni nalazi ove studije mogu se ekstrapolirati kako bi se razumio intimni molekularni dijalog kojim se upravlja otpornost / osjetljivost riže kao odgovor na RKN infekciju.

Rezultati

Varijatalna probir riže na infekciju nematoda u mediju PF-127

Za procjenu tolerancije šest raznolikih sorti riže na RKN infekciju u okruženju bez tla, vrhovi korijena svake sadnice riže inokulirani su s 30 J2 M. M. graminicola u Petrijevoj posudi koja sadrži sredinu PF-127 i inkubirali su 15 dana zbog kratkog životnog ciklusa RKN 3, 4 . Među različitim sortama nađeno je da je prosječni broj žuči po biljci znatno veći ( P <0, 05) u Pusa 1121, IC 81372 i Taipei 309 u usporedbi s BPT 5204, Suraksha i Vandana, a najveći broj njih je u Pusa 1121 kod 15 dpi (dana nakon inokulacije) (Sl. 1a, b). Sličan trend zabilježen je i za broj podržanih ženki, masa jaja i jaja / jajne mase, dok je najveći i najmanji broj imao Pusa 1121 i Vandana (Sl. 1b). Čak i nakon 15 dpi, uočeni su intermedijarni stadiji razvoja nematoda, poput J2s i J3 / J4, u BPT 5204, Suraksha, Vandana i IC 81372, što ukazuje na sporost razvoja M. graminicola u tim sortama (sl. 1b). Faktor množenja (MF) koji odražava opću sposobnost nematode da bude uspješan parazit značajno se razlikovao među svim sortama. Izračunata MF vrijednost M. graminicola nađena je najvećom u Pusa 1121 (41, 65), a slijede IC 81372 (9, 68) i Taipei 309 (10, 06), a najmanje u BPT 5204 (2, 98), Suraksha (1, 9) i Vandana (0, 57). Na temelju svih parametara, za daljnja ispitivanja odabrani su Pusa 1121 (osjetljiv na RKN) i Vandana (rezistentna na RKN).

Image

( a ) Biljke zaražene Nematodom iz Pusa 1121 (i), BPT 5204 (ii), Suraksha (iii), Vandana (iv), IC 81372 (v) i Taipei 309 (vi) u posudi Petrija koja sadrži medij PF-127 na 15 dpi. Uočene su kuke u svim sortama, a veći broj njih u Pusa 1121, IC 81372 i Taipei 309 u usporedbi s BPT 5204, Suraksha i Vandana. ( b ) Relativni broj galija, J2, J3 / J4, ženke, jajne mase i jaja / masa jaja M. graminicola u različitim sortama riže pri 15 dpi. Različita slova unutar bilo kojeg parametra značajno se razlikuju kod P = 0, 05 (J3: maloljetnici u trećem stupnju, J4: maloljetnici četvrte faze). Trake pogrešaka označavaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti.

Slika pune veličine

Usporedna invazija, razvoj i razmnožavanje M. graminicola u osjetljivom nasuprot rezistentnom sorti riže

Značajno više J2 ( P <0, 05) prodrlo je u korijene Pusa 1121 u usporedbi s Vandanom pri 1, 2, 3 i 4 dpi. U skladu s tim, J2 su razvijeni u stupnjevima J3 i J4 u znatno većem broju ( P <0, 05) u Pusa 1121 od Vandane pri 5 i 7 dpi. Brži razvoj i razmnožavanje zabilježeno je u Pusa 1121 u kojoj su nematode dostigle stadij mlade ženke pri 10 dpi, odrasle ženke 12 i 15 dpi i počele proizvoditi jajašca sa 15 dpi u znatno većem broju ( P <0, 05). Suprotno tome, u Vandani su primijećeni odložen prodor, razvoj i razmnožavanje (tablica 1, slika 2). Za izračunatu MF vrijednost M. graminicola utvrđeno je da je najveća u Pusa 1121, a najmanje u Vandani (Tablica 1).

Tablica pune veličine

Image

( a ) - Pusa 1121, ( b ) - Vandana. Formiranje žuči bilo je očito u 2 dpi u Pusi 1121. Pusa 1121 podržavala je veći broj nematoda s većim intenzitetom žuči tijekom razvojnog procesa u usporedbi s Vandanom. Pri 10 dpi razvijeni su J2 mladim ženkama u Pusa 1121, a J3 / J4s u Vandani, što sugerira da je razvoj nematoda kasnio u Vandani u usporedbi s Pusom 1121. Nematode su obojene kiselinom fuksina.

Slika pune veličine

Oticanje korijena koje su posljedica žuči, inicijalno formirani na korijenskom vrhu Pusa 1121, bili su vidljivi pri 2 dpi. Nakon toga, zaraženo korijenje zaustavilo je svoj rast i nastali su žuči na bočnim korijenima zbog progresije oštećenja nematoda. U Vandani je zabilježen porast broja lateralnih korijena od 10 i 15 dpi u odnosu na Pusa 1121, što ukazuje na stvaranje strukturne barijere u korijenu kako bi se spriječila naknadna invazija nematoda (Sl. 2).

Urođeni obrambeni odgovor u korijenskim i otrovnim tkivima riže na RKN infekciju

Da bi se dobio uvid u različiti odgovor osjetljivih i otpornih kultivara riže na RKN infekciju, istraživana je ekspresija gena koji su uključeni u biljni urođeni imunitet u zaraženom tkivu korijena i sistemskog pucanja pri 2 i 6 dpi koristeći kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qRT -PCR).

OsMAPK5a , OsMAPK6 i OsMAPK20 kodiraju proteine ​​kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) koje su uključene u kaskade fosforilacije u molekularnom uzorku (PTI) izazvanom patogenom (PTIP) i imunološkom imunitetu (ETI) tijekom ranog odgovora na patogene. Uz to, ti proteini igraju važnu ulogu u prenošenju biljnih signala koji se odnose na biotičke napone 20, 21, 22 . Rano nakon infekcije (2 dpi), razina mRNA OsMAPK5a , OsMAPK6 i OsMAPK20 bila je znatno regulirana, nakon čega je uslijedila silazna regulacija na 6 dpi u zaraženim korijenima u odnosu na tkiva pucanja Pusa 1121 (sl. 3a). S druge strane, iako su razine OsMAPK6 i OsMAPK20 bile prekomjerno izražene u zaraženom korijenu Vandane , transkripcija OsMAPK5a bila je prigušena i pri 2 i 6 dpi. Iznenađujuće, MAPK geni su ili regulirani ili su vraćeni na bazalnu razinu ekspresije kod zaraženih izdanaka Vandane u usporedbi s neinficiranom kontrolom (Sl. 3a).

Image

( a ) odgovor vezan uz MAPK, ( b ) odgovor povezan sa SA, ( c ) odgovor povezan sa JA, ( d ) odgovor povezan sa ET i ( e ) opći odbrambeni odgovor. Ekspresija gena mjerena je qRT-PCR u biljkama zaraženim M. graminicola pri 2 i 6 dpi. Razine genske ekspresije su normalizirane pomoću dva unutarnja referentna gena, Os18srRNA i Os-aktin . Podaci su prikazani kao log 2 - transformirane vrijednosti nabora mijenjaju razinu zaraženih korijena i pucaju u odnosu na kontrolno tkivo (tj. Korijen i izdanak nezaraženih biljaka). Šipke predstavljaju srednju razinu ekspresije i SE iz dvije biološke i tri tehničke kopije, a svaka sadrži bazen od deset biljaka. Zvezdice pokazuju značajan diferencijalni izraz ( P <0, 05) u usporedbi s neinficiranim biljkama.

Slika pune veličine

Općenito, čini se da iako je MAPK-ov obrambeni mehanizam aktiviran rano pri 2 dpi, nematode su bile u mogućnosti da suzbiju to 6 dpi u osjetljivim biljkama. Suprotno tome, beznačajna ekspresija OsMAPK5a i OsMAPK20 je dokumentirana u korijenu Vandane inficiranom RKN-om, sugerirajući dvosmislenu ulogu MAPK gena u induciranoj sistemskoj obrani riže protiv RKN-a. Uz to, odbrambeni signal posredovan MAPK-om nije translociran u tkiva pucanja čak ni nakon 6 dpi u Vandani, čime je biljkama onemogućeno da upozoravaju svoje sistemsko tkivo na RKN prisutnost.

Odgovori ovisni o SA u korijenima i otrovnim tkivima riže na RKN infekciju

OsPAL1 , OsICS1 (ključni enzimi u biosintetskom putu salicilata 23 ), OsEDS1 , OsPAD4 (modulira SA-uzvodnu signalizaciju 24, 25 ) i OsNPR1 (interakcija s faktorima transkripcije TGA i ključni posrednik sistemski stečene otpornosti ili SAR 26, 27 ) koristi se kao marker gena za proučavanje odgovora povezanih sa SA.

Lokalna endogena razina OsPAL1 i OsICS1 lagano je inducirana pri 2 dpi, praćena slabom redukcijom od 6 dpi u korijenu Pusa 1121 kao odgovor na RKN infekciju. Suprotno, uočeno je u tkivima izbojka Pusa 1121. Suprotno tome, razine mRNA OsPAL1 i OsICS1 bile su značajno i dosljedno povišene u zaraženom korijenu Vandane i pri 2 i 6 dpi. Međutim, u izbojcima Vandane transkripti OsPAL1 i OsICS1 bili su snažno izraženi tek pri 6 dpi (Sl. 3b). Razine mRNA u stalnom stanju OsEDS1 i OsPAD4 bile su ili vraćene u neinficiranu razinu tkiva ili su značajno potisnute na 6 dpi prije nego što je značajno poraslo za 2 dpi u korijenima Pusa 1121 zaraženih RKN-om. Sličan odgovor primijećen je u tkivima izbojka od Pusa 1121. Vremenska ekspresija OsEDS1 i OsPAD4 , iako blago regulirana, nije značajno izmijenjena u korijenu Vandane, inficiranom M. graminicola, u usporedbi s odgovarajućim mokutnim tkivom. Zanimljivo je da su razina OsEDS1 i OsPAD4 u tkivima izbojka znatno regulirana na 6 dpi (Sl. 3b). Izražaj OsNPR1 nije bio različito izražen ili smanjen u korijenima Pusa 1121 za razliku od dosljedne i značajne regulacije u Vandani u obje vremenske točke. Iako se obrazac ekspresije OsNPR1 nije značajno razlikovao u tkivima izdanaka niti jednog kultivara (Sl. 3b).

U tu svrhu se pretpostavlja da je EDS1- i PAD4- posredovana SA-uzvodna signalizacija, koja je pokrenula induciranu odbranu od RKN-a u ranoj fazi infekcije, negativno regulirana u kasnijoj fazi infekcije u osjetljivim biljkama. S druge strane, rezistentni kultivar, poput Vandane, pokazao je znatnu regulaciju biosinteze SA i osjetljivih gena (koji su posredovani NPR1) u zaraženom korijenu tijekom rane i kasne infekcije RKN-om. Međutim, isto to ne može se dokumentirati u zaraženim korijenima Vandane za signalizacijske gene (EDS1- i PAD4) geni. U Vandani je biosinteza i signalizacija SA inhibirana tijekom rane faze interakcije biljka-nematoda neposredno prije nego što su biljke uspjele slati upozoravajuće signale sistemskim tkivima pri 6 dpi. Stoga, uzimajući u obzir ambivalentnu ekspresiju gena povezanih sa SA u otpornim i osjetljivim kultivarima, može se nagađati da je uloga SA u induciranju sistemske obrane riže kod RKN infekcije manje izravna od one u drugim obrambenim regulatornim fitohormonima.

Reakcije ovisne o JA u korijenju i otrovnim tkivima riže na RKN infekciju

OsAOS2 (ključni enzim u biosintezi JA 28 ), OsJMT1 (pretvara JA u hlapljivi MeJA 29 ) i OsJAMYB (JA-inducibilni Myb transkripcijski faktor 30 ) korišteni su kao marker geni za ispitivanje JA vezanih odgovora.

Rano nakon infekcije, u korijenima i Vandane i Pusa 1121, zabilježeno je značajno pojačano kopiranje transkripta OsAOS2 , koje se u Vandani i dalje regulira, ali je pokazalo značajnu represiju u Pusa 1121 pri 6 dpi. Potvrđujući ovo zapažanje, OsJMT1 i OsJAMYB su različito izraženi u korijenima Pusa 1121 i Vandana u obrascu sličnom OsAOS2, osim činjenice da je OsJMT1 bio slabo reguliran u Vandani pri 6 dpi (sl. 3c). Identičan odgovor OsAOS2 zabilježen je u tkivima izdanaka različitih kultivara riže. Istodobno, u izbojcima Pusa 1121 nije otkrivena gotovo nikakva transkripcijska promjena ili negativna regulacija OsJMT1 i OsJAMYB u usporedbi s konstitutivnom ekspresijom tih gena u Vandani (sl. 3c). Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da za razliku od Pusa 1121, JA igra glavnu ulogu tijekom ranog i kasnog obrambenog odgovora Vandane na RKN infekciju.

Odgovori ET-a u korijenju i otrovnim tkivima riže na RKN infekciju

OsACS1 , OsACO7 (dva glavna katalitička enzima koji su uključeni u biosintezu ET-a iz metionina 31 ), OsEIN2 (centralni pretvarač signala u ET-signalnom putu 32 ) i OsERF1 (ET-inducibilni gen 33 ) korišteni su kao markerski geni za demonstraciju ET- povezani odgovori.

Unatoč neregulisanoj koncentraciji mRNA od 2 dpi, OsACS1 i OsACO7 su oslabljeni u zaraženom korijenu Pusa 1121 pri 6 dpi. Gotovo osnovna ekspresija ili silazna regulacija OsEIN2 i OsERF1 dokumentirana je u zaraženom korijenu Pusa 1121, pri 2 i 6 dpi. Suprotno tome, zabilježena je snažna indukcija OsACS1 u korijenima Vandane i pri 2 i 6 dpi. Međutim, transkripti OsACO7 , OsEIN2 i OsERF1 nisu značajno inducirani na 6 dpi prije nego što su bili visoko eksprimirani na 2 dpi u Vandani (Sl. 3d). Geni biosinteze i signalni geni bili su ili regulirani ili se nisu različito eksprimirali u pucanju osjetljive biljke u obje vremenske točke. Suprotno tome, iako je u nekoliko slučajeva primijećena manja regulacija, sistemske razine mRNA OsACS1 , OsACO7 , OsEIN2 i OsERF1 bile su dosljedno regulirane u izbojcima Vandane i pri 2 i 6 dpi (slika 3d). Kolektivno, dosljedna prekomjerna ekspresija gena koji reagiraju na ET tijekom cijelog tijeka infekcije nematodama kod rezistentnih biljaka sugerira pozitivnu povezanost između ET-inducibilne ekspresije gena u riži i ukupne obrane M. graminicola .

Opći odgovori obrane u tkivima riže i pucanja riže na RKN infekciju

Da bi se dodatno razjasnio molekularni strojevi koji podupiru opći obrambeni odgovor riže pokrenut nakon infekcije nematoda, procijenjena je diferencijalna ekspresija tri PR gena ( OsPR1a , OsPR1b , OsPR10 ) 34 . Uz to, procijenjena je i ekspresija OsWRKY13 i OsWRKY45 , koji djeluje kao pozitivni transkripcijski regulator obrambenih gena 22, 35, 36 .

Snažna regulacija OsPR10 i OsPR1a u svim sortama pri 2 i 6 dpi potvrđuje obrambene sposobnosti PR gena u korijenu riže kao odgovor na napad RKN-a. Međutim, najjača regulacija OsPR1a i OsPR1b zabilježena je u Vandani pri 2 dpi. Suprotno tome, ekspresija OsPRlb bila je značajno smanjena i kod 2 i 6 dpi u zaraženom korijenu Pusa 1121 (Sl. 3e). Povećano i postojano obilježje transkripcije OsPR1a , OsPR1b i OsPR10 zabilježeno je na mladicama otpornog kultivara od 2 i 6 dpi. Dok su bili u izbojcima Pusa 1121, transkripti OsPR1a , OsPR1b i OsPR10 bili su ili nepromijenjeni ili su prigušeni pri 6 dpi prije nego što su bili značajno izraženi na 2 dpi (Sl. 3e). Unatoč tome što je korijen-inducibilan, sistemska razina mRNA OsWRKY13 se nije značajno promijenila nakon RKN infekcije u izbojcima Vandane ni u jednom trenutku. Kombinirajući podatke o ekspresiji korijena i izdanaka , transkripti OsWRKY45 bili su značajno regulirani na 6 dpi u Vandani, za razliku od neznačajnog izraza ili smanjenja regulacije u Pusa 1121 u bilo kojem trenutku (Sl. 3e). U skladu s ovim nalazima, čini se da OsWRKY13 ima neznatan pozitivan učinak u aktiviranju sistemske obrane riže kao odgovora na napad RKN-a.

Ekspresija gena koji su povezani s ligninom i kalozom u korijenu riže tijekom ranog napada RKN-a

Taloženje lignina i kaloze u korijenu biljke pojačava otpornost biljke prema invazivnim patogenima, uključujući PPNs 37, 38, dajući mehaničku čvrstoću biljnim zidovima sekundarnih stanica. Kao što je otkriveno biološkim ispitivanjem infekcije (Tablica 1, Sl. 2) u ovom istraživanju, M. graminicola J2s mogli su upasti u korijene Vandane u manjem broju u usporedbi s Pusa 1121, tijekom rane faze infekcije. Ovo se otkriće može pripisati mogućoj ulozi gena povezanih ligninom i kalozom u bazalnoj obrani riže protiv nematoda. Ovom nagađanjem, ekspresijski obrazac dva gena biosinteze lignina ( OsC4H , OsCAD6 ) 39, tri gena kaloza sintaze ( OsGSL1 , OsGSL3 , OsGSL5 ) 40 i jedan hidrolizalni gen kaloze ( OsGNS5 ) 40 u korijenu Pusa 1121 i inficiran RKN-om Vandana je istraživana qRT-PCR. Uz to, uzeti su u obzir i podaci o ekspresiji OsPAL1 (kao esencijalnog enzima u fenilpropanoidnom putu koji katalizira deaminaciju fenilalanina u transcinamsku kiselinu, prekursor u biosintetskom putu lignina) 41 .

Kod 2 dpi, OsC4H i OsPAL1 su značajno regulirani u korijenu Vandane zaraženom RKN-om u usporedbi s neinokuliranim vrhovima korijena. Suprotno tome, došlo je do blage, ali beznačajne inhibicije OsC4H i manjeg uguranja OsPAL1 u korijenu Pusa 1121, tretiranom RKN-om (Sl. 3b i 4). Međutim, ekspresija OsCAD6 nije odgovorila značajno na RKN infekciju pri 2 dpi (slika 4). Invazija nematoda u osjetljivim i rezistentnim kultivarima stvorila je prekomjernu ekspresiju OsGSL1 , OsGSL3 i OsGSL5 pri 2 dpi, iako su geni kaloza sintaze izraženi u relativno većoj količini u korijenima otpornih biljaka. U skladu s ovim rezultatima, kvantitativno najveći izraz OsGNS5 zabilježen je u korijenu osjetljivih biljaka RKN-om u usporedbi s rezistentnim biljkama na 2 dpi (Slika 4). Ovi nalazi podržavaju ideju da geni koji sudjeluju u taloženju lignina i kaloze mogu igrati glavnu ulogu u inhibiranju prodora nematoda i, uslijed toga, odgađani razvoj i razmnožavanje PPN dolazi kod otpornog kultivara.

Image

Ekspresija gena mjerena je qRT-PCR u biljkama zaraženim M. graminicola pri 2 dpi. Razine genske ekspresije su normalizirane pomoću dva unutarnja referentna gena, Os18srRNA i Os-aktin . Podaci su prikazani kao log 2 -preoblikovane vrijednosti nabora promjene nivoa zaraženog tkiva u usporedbi s kontrolnim tkivom (vrhovi korijena nezaraženih biljaka). Šipke predstavljaju srednju razinu ekspresije i SE iz dvije biološke i tri tehničke kopije, a svaka sadrži bazen od deset biljaka. Zvezdice pokazuju značajan diferencijalni izraz ( P <0, 05) u usporedbi s neinficiranim biljkama.

Slika pune veličine

Rasprava

Jednostavna, nova metoda za in vitro inokulaciju korijena biljke infektivnim J2 pogodnija je za kontinuirana ispitivanja razvoja nematoda u usporedbi s radno intenzivnim eksperimentima sa loncima. U skladu s ovom pretpostavkom, ovdje pokazujemo da je PF-127 vjerovatno odgovarajuća matrica za praćenje napredovanja razvoja nematoda unutar korijena biljaka u dužem vremenskom razdoblju u neakenskom okruženju, sprečavajući komplikacije povezane s dugotrajnim postupkom sterilizacije nematoda za eksperimente ploče sa agarima. Čak i nakon uspješne sterilizacije, nematode mogu biti zarobljene u vodenim filmovima formiranim na agar ploči 13 . S druge strane, ne kruta, ujednačena tekstura i prozirna priroda PF-127 nedvosmisleno omogućuje nematodama da se slobodno kreću u trodimenzionalnim matricama. Ranije je istraživan cjelokupni razvoj nematode krumpirovih cista, Globodera pallida u solanskim biljkama ( Solanum tuberosum i S. sisymbriifolium ) koristeći sredinu PF-127 42 . Podaci dobiveni iz ove studije mogu se upotrijebiti za probir rezistentnih ili transgenih sorti usjeva na infekciju nematoda, umnožavanje, razvoj i razmnožavanje. Uz to, različiti stadiji parazita nematoda mogu se izolirati iz biljnih tkiva s većom lakoćom za genomske, proteomske ili transkriptomske analize.

Na temelju rezultata probirnog biološkog ispitivanja, pronađeno je da je Pusa 1121 najosjetljivija, a Vandana najotpornija na infekciju M. graminicola pri 15 dpi. Nakon toga su ove sorte podvrgnute istraživanjima razvoja nematoda radi dubljeg razumijevanja napredovanja bolesti nematoda u osjetljivim i otpornim kultivarima u stvarnom vremenu. Rezultati sugeriraju da je M. graminicola prodirala, razvijala se i razmnožavala se brže kao i u većem broju u Pusa 1121 u usporedbi s Vandanom. Prije toga se pokazalo da je Vandana umjereno otporna na terensku populaciju M. graminicola u uvjetima kulture lonca 43 . Ipak, faktori koji određuju mehanizam otpornosti riže na ovisnost o genotipu kao odgovor na RKN infekciju još uvijek nisu utvrđeni.

Repertoar gena vjerojatno je uključen u reakcije na stres i odbranu, transdukciju signala i regulaciju fitohormona u biljnim tkivima kao odgovor na infekciju nematoda 44, 45, 46, 47, 48 . U skladu s tim izvješćima, geni inducirani u tim kategorijama u ovoj su istrazi različito izraženi. Međutim, uspoređujući odgovor osjetljivih i otpornih sorti na infekciju RKN-om, nastale su mnoge odstupanja zbog učinaka nematoda (biologija nematoda varira u zavisnosti od otpornih i osjetljivih domaćina), sistemskih učinaka signalizacije hormona ili specifične tkivne razlike u ekspresiji odabranih gena. Kao općeniti trend, uočene su neke značajne razlike i sličnosti, o kojima se govori u sljedećim stavcima.

MAPK kaskade su evolucijski sačuvani, unutarćelijski signalni moduli koji igraju odlučujuću ulogu u odgovorima domaćina na višestruka biotska naprezanja aktiviranjem PTI, ETI i PR gena indukcije 20, 22 . Uzimajući u obzir suvišnost eksperimentalnih izvještaja u interakciji novih biljaka dikota kao što su Arabidopsis i duhan s bolestima koje uzrokuju patogene 20, 49, naše razumijevanje uloge kaskada MAPK u izazivanju urođene obrane monokotileda u odgovoru na PPN prilično je ograničeno. U skladu s ovim gledištem, ispitali smo da li je prekomjerna ekspresija ili supresija MAPK gena u riži važna odrednica u prenošenju otpornosti ili osjetljivosti na M. graminicola . Rana prolazna aktivacija OsMAPK5a , OsMAPK6 i OsMAPK20, nakon čega slijedi njihovo suzbijanje u osjetljivim biljkama u kasnijoj fazi, može se odnositi na kapitulaciju do stresa koji je posljedica razvoja bolesti korijenskog čvora. U rezistentnim biljkama transkripcija OsMAPK5a bila je ili nepromijenjena ili smanjena, što je u skladu s činjenicom da OsMAPK5 negativno modulira ekspresiju PR gena u riži 20, 29 . Obustava OsMAPK5 u riži dovela je do pojačane otpornosti na gljivične i bakterijske patogene 20 . U sistemskim izbojcima Vandane , OsMAPK6 i OsMAPK20 su očito bili regulirani, što je primjer dvosmislene uloge MAPK kaskada u pružanju RKN otpornosti Vandani.

Nizvodno od PTI i ETI aktivacije, koordinirani izraz SA / JA / ET posredovanja signalizacije čini biljku da učinkovito prilagodi svoju lokalnu i sistemsku odbranu od patogena 19, 50 . Pored toga, SAR odgovor nastaje u zaraženim tkivima koji je karakteriziran lokalnom i sistemskom povećanjem endogeno sintetiziranog SA i ekspresijom PR proteina 25 . U biljkama dikata, put SA ima glavnu ulogu u izbacivanju obrane od biotrofa koji se isključivo hrane i razmnožavaju živim stanicama domaćina, za razliku od uključivanja JA / ET staza u obranu od nekrotrofa koji ubijaju stanice domaćina tijekom infekcije 51 . Međutim, uloga fitohormona u poticanju sistemske i lokalne obrane u monokotiledonima tek treba dalje dešifrirati. Naši podaci pokazuju da je proizvodnja SA putem OsPAL1 i OsICS1 značajno regulirana u lokalnim (2 i 6 dpi) i sistemskim (6 dpi) tkivima Vandane u usporedbi s neznačajnom izmjenom u Pusa 1121, što sugerira značajnu ulogu biosintetskog puta SA u zaštiti otporne biljke tijekom invazije nematoda.

Kao ključni posrednici antagonističkih unakrsnih razgovora između SA i JA putanje, EDS1 i PAD4 uključeni su u proizvodnju SA i signalizacija za bazalnu otpornost na biotrofe i hemi-biotrofe 19 . Naši rezultati pokazuju da RKN može aktivno suzbiti razine OsEDS1 i OsPAD4 u korijenu osjetljivog kultivara u kasnijoj fazi infekcije u usporedbi s beznačajnom indukcijom tih gena u otpornom kultivaru. Smatra se da je signalizacija nizvodne SA putem OsNPR1 presudna za obranu od rižinog bakterijskog udara i gljivičnih eksplozija 26, 27 . U našem istraživanju, lokalne endogene razine OsNPR1 konstitutivno su izražene u otpornim sortama za razliku od represije kod osjetljive. Međutim, suprotstavljeni podaci o ekspresiji OsEDS1 , OsPAD4 i OsNPR1 u tkivima mladice otpornih biljaka ukazuju na to da je možda transdukcija SA signalnih i odgovornih gena oslabljena u sistemskim tkivima riže tijekom rane nespojive interakcije s RKN-om. Unatoč činjenici da su biosinteza i signalizacija SA pozitivno povezani sa SAR-om u ostalim biljkama 52, točna uloga SA u induciranju SAR-a u riži i dalje ostaje neizdrživa 5, 44, 46, 47 . U svjetlu rezultata ove studije, pretpostavljamo da signalni i odgovorni geni SA mogu igrati zanemarivu ulogu u urođenom imunitetu riže protiv RKN-a.

Nekoliko istraživača u riži je predložilo najveću važnost JA u poticanju SAR-a, a ne SA-a, 53, 54, 55 . Nevjerojatno, naši pokusi otkrili su konzistentnu lokalnu i sistemsku indukciju biosinteze JA i osjetljivih gena i u ranom i u kasnom stadiju RKN infekcije u Vandani u usporedbi s varijabilnim odgovorom tih gena u Pusa 1121. Poznato je da put ET modulira snažne aktivacija gena biosinteze JA i signalnih gena da se inducira sistemska obrana u riži protiv M. graminicola 44 . Zbog tog straha, procjena obrane izazvane ET-om bila je kompatibilna i nekompatibilna interakcija riže i M. graminicola . Uglavnom, značajno povećana transkripcijska akumulacija biosinteze ET-a, signalnih i odgovornih gena otkrivena je u lokalnim i sistemskim tkivima rezistentnih kultivara u usporedbi s supresijom tih gena izazvanih RKN-om u osjetljivim biljkama. Uzeti zajedno, naši podaci pojačavaju spoznaju da put JA, pretpostavljeno moduliran od strane ET, može učinkovito pridonijeti reakciji otpornosti riže na invaziju RKN-a.

Dokazani pokazatelji ukazuju da faktori transkripcije WRKY konstitutivno reguliraju ekspresiju gena koji se odnose na obranu, a njihova različita ekspresija se može pripisati otpornoj ili osjetljivoj reakciji biljaka na nematode 19 . Osim beznačajne ekspresije u tkivima izbojka, OsWRKY13 i OsWRKY45 bili su prekomjerno izraženi u ranom i kasnom korijenu Vandane zaraženom RKN-om. Međutim, kod osjetljivih korijena i izdanaka , OsWRKY13 i OsWRKY45 rano su regulirani, ali kasnije smanjeni.

S obzirom na konačnu važnost PR gena za dobivanje SAR-a, naši rezultati pokazuju da su OsPR1a i OsPR10 bili dosljedno regulirani u korijenima i osjetljivih i otpornih kultivara tijekom rane i kasne RKN infekcije. Suprotno tome, transkripcija OsPRlb bila je značajno oslabljena u osjetljivom korijenu u obje vremenske točke. Što se tiče tkiva izdanaka, za razliku od rezistentnih kultivara, ekspresija svih PR gena bila je ili snižena ili vraćena na bazalnu razinu u osjetljivom kultivaru u kasnijoj fazi infekcije. Prema ranijim izvješćima, nekoliko PR gena suzbijeno je u tkivima sistemske izdanake Arabidopsis i rajčice tijekom kompatibilne interakcije s RKN 56, 57 . Isto tako, najočitija razlika u nakupljanju PR gena između kompatibilne i nespojive interakcije rajčice i M. incognita zabilježena je u tkivima mladice 58 .

Akumulacija lignina i kaloze jača biljnu staničnu stijenku da ograniči dostupnost enzima koji razgrađuju staničnu stijenku izlučuju PPN tijekom prodora i migracije u korijenu biljaka 59 . U prilog ovom stajalištu, tijekom rane interakcije riže i M. graminicola , u trenutnoj studiji zabilježena je razmjerno veća indukcija gena biosinteze lignina i kaloze u korijenu otpornih kultivara od osjetljivih. Paralelno s tim, gensko-razgradni gen kvantitativno je uvelike induciran u osjetljivom kultivaru u usporedbi s rezistentnim. Stoga bazalna obrana biljke posredovana ligninom i kalozom može spriječiti prodiranje i odgoditi razvoj RKN-a u korijenu otpornih sorti.

S obzirom na neadekvatno predstavljenu perspektivu uloge biljnog urođenog imuniteta u nespojivoj interakciji biljka-PPN, naša studija pokazuje trend usklađenog različitog izražavanja akumulatora gena povezanih u obrani u kompatibilnoj u odnosu na nekompatibilnu interakciju riža-RKN, što se može prevesti u razjasniti molekularnu logiku u određivanju faktora koji reguliraju otpornost / osjetljivost biljaka na nematode. Naši podaci pokazuju da se u ranoj fazi infekcije aktivira bazalna obrana domaćina i u osjetljivim i rezistentnim biljkama, dok se naizgled potiskuje u kasnijoj fazi infekcije kod osjetljivih biljaka. Naime, geni uključeni u biosintezu SA (ali ne i SA signaliziranje), JA i ET put i PR geni pozitivno utječu na otpornost riže na infekciju nematoda. S druge strane, tijekom kompatibilne interakcije RKN interferira s homeostazom hormona biljaka radi suzbijanja sistemske obrambene signalizacije, a posljedično, progresija bolesti nematoda nastaje uslijed uspostavljanja i održavanja funkcionalnog mjesta hranjenja u osjetljivim biljkama. Kao što je prikazano podacima o ekspresiji pucanja, prijenos obrambenog gena sintetiziranog korijenom s zaraženih rezistentnih korijena na izbojke uglavnom u kasnijoj fazi infekcije, ukazuje na uspješnu indukciju SAR-a u otpornim kultivarima. Ako se zajedno razmatraju, naši rezultati podržavaju model (Sl. 5) u kojem uspješna indukcija lokalnih i sistemskih obrambenih gena dovodi do nespojive interakcije riža- M. graminicola .

Image

Formiranje strukturne barijere do prodora nematoda pripisuje se taloženju lignina i kaloze u stanicama biljnih stanica, dok se sustavna obrana posredovana hormonima pokreće nakon prepoznavanja efektora i PAMP-a koji izlučuju nematodu biljnim transmembranskim receptorima i R-proteinima. Geni koji su uključeni u različite putove označeni su u zagradama. Crte koje završavaju strelicama označavaju aktiviranje. Linije koje završavaju okomitom kratkom linijom označavaju potiskivanje ili antagonističku interakciju.

Slika pune veličine

Daljnja je istraga potrebna kako bi se dobio uvid u ulogu efektora nematoda u suzbijanju ili izražavanju urođene obrane riže u kompatibilnoj i nekompatibilnoj interakciji. Smatra se da je horizmatna mutaza izlučena stilom glicina Heterodera kao mogući faktor virulencije za infekciju cista nematodama soje 60 . Efektor H. schachtii , 10A06, djeluje sa Arabidopsis spermidin sintazom kako bi suzbio gene koji odgovaraju na biljke 61 . Kalreticulin s nematodom korijena, čvor Mi-CRT ključni je učinak u suzbijanju obrane od Arabidopsis 62 . Uz to, kontinuirana istraga o unakrsnim razgovorima različitih signalnih molekula otkrit će još jednu dimenziju obrambenih putova izazvanih hormonima.

metode

Uzgoj nematoda

Čista kultura indijskog izolata M. graminicola Golden & Birchfield održavana je na riži ( O. sativa L. cv. Pusa 1121) u staklenici. Masa jaja je sakupljana iz korijena zaraženog bilja pomoću steriliziranih pinceta i držana je za izlijevanje u dvoslojnom papirnom tkivu poduprtom na izliveno sito žičane gaze u Petrijevoj posudi koja sadrži destiliranu vodu. Svježe izbušeni J2 korišteni su za sve eksperimente.

Klijanje sjemena

Sjeme različitih kultivara riže, tj. Pusa 1121, BPT 5204, Suraksha, Vandana, IC 81372 i Taipei 309 (ljubazno osigurane od strane Odjela za genetiku i Odjela za biljnu fiziologiju, ICAR-Indijskog instituta za poljoprivrednu istraživanja u New Delhiju), natapalo se preko noći u destiliranoj vodi i površinski sterilizirano sa 70% -tnim etanolom u trajanju od 30 s, a zatim tri puta ispiranje u sterilnoj vodi. Sterilizirano sjeme je stavljeno u vlažni filtrirani papir unutar Petrijeve posude i inkubirano u komori za rast na 28 ° C. Sadnice stare 3-4 dana korištene su za slijedeće eksperimente.

Pregled sorti za infekciju nematoda u Pluronic gel medijumu

Pluronik F-127 (PF-127) (Sigma-Aldrich) gel je pripravljen kako je ranije opisano 12, 14, 15 . Svaka od gore navedenih sorti riže provjerena je na zaraznost RKN-om u standardnim Petrijevim posudama (110 × 25 mm, HIMEDIA). Dvadeset pet ml 23% PF-127 izliveno je u svako Petrijevo zdjelo koje sadrži sedam, jednoliko raspodijeljenih sadnica identične sorte na 15 ° C. Approximately 30 J2s of M. graminicola were inoculated at the root tip of each seedling using a pipette tip followed by setting of gel at the room temperature. The covered Petri plates were placed in a humid tray and incubated at 28 °C with 16:8 h light:dark photoperiod in a growth chamber. Three plates for each variety were included in each experiment and each experiment was repeated at least twice.

At 15 dpi, plantlets were harvested from the gel by simply placing the Petri dishes briefly over an ice bath. Due to the slight decrease in temperature, gel was liquefied and allowed the plantlets to be easily extracted sans any damage to the root system. Roots were stained with acid fuchsin 63 and the number and stage of the invaded nematodes were observed after dissecting the stained galls under the microscope. To determine the reproductive potential of M. graminicola in different varieties, nematode multiplication factor [(number of eggmasses × number of eggs per egg mass) ÷ nematode inoculum level] was calculated. Photographs were taken in a Zeiss Axiocam MRm microscope.

Nematode development assays in Pluronic gel medium

Based on the outcome of varietal screening assay, two of the rice varieties, such as Pusa 1121 and Vandana were used to study the comparative development of M. graminicola in PF-127 medium. Root tip of the germinated seedlings was infected with the RKN and Petri plates were incubated as described above. Three plates for each variety were included in each experiment and each experiment was repeated at least twice. The plantlets were removed from the medium daily starting from the 1 dpi up to 15 dpi. Roots were stained and dissected under the microscope to identify the different developmental stages of RKN. Photographs were taken in a Zeiss Axiocam MRm microscope.

Expression analysis of rice defence genes in response to RKN infection

Root tip of the rice cultivars – Pusa 1121 and Vandana – were inoculated with the J2s of M. graminicola in PF-127 medium as documented above. At 2 and 6 dpi, plantlets were harvested from the medium, excised root tips and shoots were immediately and separately frozen in liquid nitrogen and stored at –80 °C until use.

Total RNA was isolated from the root tip and shoot of infected and non-infected rice seedlings using NucleoSpin total RNA Kit (Macherey-Nagel, Germany), with addition of an on-column DNase I digestion. Extracted RNA was assessed for quality and quantity using Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Scientific). Approximately 500 ng of the purified RNA was reverse transcribed to cDNA using cDNA synthesis Kit (Superscript VILO, Invitrogen). Further, cDNA was used for amplification of few candidate defence genes of rice, such as MAPK5a, MAPK6, MAPK20 (plant innate immunity), PAL1 , ICS1 (SA biosynthesis), EDS1 , PAD4 (SA signalling), AOS2 (JA biosynthesis) , JMT1 (MeJA biosynthesis), JAMYB (JA response), ACO7 , ACS1 (ET biosynthesis), EIN2 (ET signalling), ERF1 (ET response), NPR1 , WRKY13 , WRKY45 (transcription factors), PR1a , PR1b , PR10 (SAR marker genes), and C4H , CAD6 , GSL1 , GSL3 , GSL5 , GNS5 (induced structural defence). Primer details are given in the Supplementary Table S1.

To analyse the transcript abundance of above-mentioned genes, qRT-PCR was carried out in a realplex 2 thermal cycler (Eppendorf) using SYBR Green Supermix Kit (Eurogentec). Reaction mixture for each sample contained a final volume of 10 μl, comprising of 5 μl of SYBR Green PCR Master mix (Eurogentec), 750 nM of each primer and 1.5 ng of cDNA. The cycling conditions were as follows: a hot start of 95 °C for 5 min, followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min. The specificity of amplification was determined by an additional melt curve programme (95 °C for 15 s, 60 °C for 15 s, followed by a slow ramp from 60 °C to 95 °C). Two constitutively expressed genes, Os18SrRNA and Os-actin , were used for normalization of qRT-PCR data (Supplementary Table S1). At least two biological and three technical replicates were used for each of the samples. In order to determine the relative gene expression in different rice cultivars, mean Ct values were obtained and fold change values were calculated using 2 −ΔΔCT method 64 . The non-infected rice was treated as the control. The results are expressed as the log2-transformed fold change values.

Statistička analiza

Data of the bioassay experiments were subjected to one way Analysis of variance. Results are reported as significant or non-significant based on Duncan's multiple comparison test with significance level at P < 0.05 using SAS software (version 9.3). Regarding qRT-PCR data, significant differential expression between infected plants and control tissue was determined by student's t -test at P < 0.05.

dodatne informacije

How to cite this article : Kumari, C. et al. Comparing the defence-related gene expression changes upon root-knot nematode attack in susceptible versus resistant cultivars of rice. Sci. Rep. 6, 22846; doi: 10.1038/srep22846 (2016).

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.