Doprinos tip30 kemoresistenciji u karcinomu larinksa | stanična smrt i bolest

Doprinos tip30 kemoresistenciji u karcinomu larinksa | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • Rak glave i vrata

Sažetak

Skvamozno-karcinom larinksa (LSCC) jedan je od najčešćih karcinoma glave i vrata. Unatoč napretku u dijagnostici i liječenju, preživljavanje bolesnika s LSCC-om nije se poboljšalo u posljednja dva desetljeća. Čini se da je TIP30, novootkriveni supresor tumora uključen u više procesa tijekom razvoja tumora. Ovdje smo istražili uključenost TIP30 u kemoresistenciju LSCC-a in vitro i in vivo . Pokazali smo da se ekspresija TIP30 značajno smanjila u odabranim lijekovima stanicama (DSC) laringealnog karcinoma. Suzbijanje povećane sposobnosti otpornosti na TIP30 na višestruka lijeka za kemoterapiju, staničnu proliferaciju i samoobnovu u Hep2 stanicama. Uz to, opaženi su smanjeni kapacitet samoobnavljanja i kemoterapijska rezistencija u DSC-ima koji prekomjerno eksprimiraju TIP30. Nadalje, TIP30 je negativno regulirao tumorerigenezu i hemorezistenciju u LSCC stanicama subkutano transplantiranim u gole miševe. Nadalje, smanjena ekspresija TIP30 doprinijela je kemoresistenciji, samoobnavljanju i proliferaciji LSCC stanica nuklearizacijom β- katenina, adhezije ćelije i stanične stanice. Dosljedno, proporcionalne analize regresijske opasnosti Kaplan-Meier i Cox pokazale su da smanjena ekspresija TIP30 neovisno predviđa loš preživljavanje u bolesnika s LSCC-om. Uzeti zajedno, naši rezultati otkrivaju da TIP30 ima presudnu ulogu u kemoresistenciji LSCC putem signalnog puta AKT / glikogen sintaza kinaza-3 β / β- katenina i može biti obećavajući kandidat za poboljšanje LSCC kemoterapije.

Glavni

Skvamozno-karcinom larinksa (LSCC) jedan je od najčešćih karcinoma glave i vrata, a kirurgija, radioterapija i kemoterapija su glavni tretmani. Terapijski učinak je umjeren u ranoj fazi LSCC, ali slab u uznapredovalim fazama, unatoč poboljšanjima u liječenju i liječenju bolesti. 1, 2 Ponavljanje nakon operacije i rezistencija na kemoterapiju odgovorni su za lošu prognozu LSCC-a. Stoga su ključno bolje razumijevanje molekularnih mehanizama napredovanja LSCC-a i identificiranje učinkovitijih ciljeva za poboljšanje terapijske učinkovitosti ove bolesti.

Glavna prepreka u liječenju raka je razvoj otpornosti na više lijekova. Stanice koje su odabrane lijekom (DSC) uspostavljene su za daljnje istraživanje mehanizma multi-kemoresistencije. DSC-ovi, obogaćene stanice otporne na kemoterapijska sredstva, 3, 4, 5, relativno su mirne i učinkovit su model za istraživanje višestruke rezistencije, jer sprečavaju dodatne učinke tumorskih stanica osjetljivih na kemoterapiju. Svojstva DSC-a uključuju ne samo višestruki otpor 6, već i fenotip u obliku stabljike, 7 karakteriziran pojačanom inicijacijom tumora, 8, 9 metastaza 10 i recidivom. 11, 12, 13

TIP30, koji se također naziva CC3 ili HTATIP2, je supresor tumora koji je izvorno identificiran analizom diferencijalnog prikaza mRNA iz visoko metastatskog humanog varijante maloćelijskog karcinoma pluća (SCLC) nasuprot manje metastatskoj staničnoj liniji SCLC. 14 TIP30 se pozitivno izražava u mnogim normalnim ljudskim tkivima, ali smanjena je ekspresija u nekim tumorskim tkivima poput melanoma, karcinoma dojke, neuroblastoma, glioblastoma, karcinoma debelog crijeva i hepatocelularnog karcinoma (HCC). 14, 15, 16, 17 TIP30 djeluje na supresiju tumora inhibirajući rast tumora, 18 invazije 14 i angiogenezu, 17 i inducirajući apoptozu. 19 TIP30 mutanti ne samo da ukidaju potencijal supresorskog tumora već dobivaju i onkogeno djelovanje. 20 Nadalje, miševi Tip30 pokazuju veću učestalost spontanih formiranja tumora od divljih miševa 15, što ukazuje na kritičnu funkciju pokretanja tumora od strane TIP30. Prisilna ekspresija TIP30 senzitira HCC stanice na 5-flurouracil (5-FU) i značajno inhibira rast ksenografta HCC kod miševa u kombinaciji s 5-FU. Naše prethodne studije otkrile su da smanjena ekspresija TIP30 inducira epitelijsko-mezenhimski prijelaz (EMT), proces povezan sa stablom tumora, uključujući samoobnovu i kemoterapijsku rezistenciju 21 u stanicama karcinoma gušterače. 22 Uz to, sorafenib, inhibitor angiogeneze, potiče invazivnost i metastazu HCC kod miševa smanjivanjem TIP30 i induciranjem EMT. 23

Uloga TIP30 kao važnog supresijskog tumora u razvoju i napredovanju LSCC nije karakterizirana. U ovoj smo studiji opsežno istražili doprinos TIP30 otpornosti na lijekove u LSCC. Pokazali smo da se TIP30 umanjio u LSCC stanicama odabranim za lijek. Prisilna ekspresija TIP30 uvelike je poboljšala kemoterapeutsku osjetljivost LSCC stanica i produljili preživljavanje LSCC-ksenografisanih miševa. Što je još važnije, naši rezultati sugeriraju da smanjena ekspresija TIP30 povećava kemoterapijsku otpornost i sposobnost samoobnove LSCC stanica modulacijom nuklealizacije β- katenina. Nadalje smo istražili povezanost ekspresije TIP30 i kliničkopatoloških karakteristika i otkrili njegov prognostički potencijal u bolesnika s LSCC-om.

Rezultati

Ekspresija TIP30 smanjuje se u LSCC stanicama odabranim za lijek

Goli miševi BALB / c inokulirani su sa Hep2 stanicama (LSCC stanična linija) i primali su intraperitonealnu injekciju cisplatina (2 µg / g) ili fiziološki puferirane fiziološke otopine (PBS) tjedno u trajanju od 5 tjedana (dodatna slika S1). Miševi su ubijeni 6 tjedana nakon inokulacije; stanice tumora dobivene su finim mljevenjem i digestirane su kolagenazom. Tumorske stanice iz miševa liječenih cisplatinom nazvane su DSCs.

Da bismo procijenili sposobnosti DSC-a otpornih na lijekove, prvo smo izmjerili razinu mRNA u tri transportera kaseta za ATP (ABCG2, ABCB1 i ABCC1), koji imaju presudnu ulogu u razvoju višestruke otpornosti. 24, 25 Znatno veće razine mRNA ovih transportera pronađene su u DSC-u od one u Hep2 stanicama (Slika 1a, lijevo). Zatim smo testirali njihovu otpornost na tri uobičajena kemoterapijska sredstva, to jest na cisplatin, fharmorubicin i 5-FU. DSC-ovi su bili otporniji na tri testirana kemoterapijska sredstva u usporedbi s Hep2 stanicama (slika 1a, desno).

Image

DSC pokazuju pojačanu samoobnovu, kemoresistenciju, tumorourigensku sposobnost i smanjenu TIP30 ekspresiju. ( a ) Usporedba nivoa mRNA transportera ABC (ABCG2, ABCB1 i ABCC1) i stope preživljavanja stanica između DSCs i Hep2 stanica nakon izlaganja kemoterapijskim sredstvima (cisplatinu, fharmorubicinu ili 5-fluorouracilu) u trajanju od 72 h ( n = 3). ( b ) Razine mRNA markera samoobnove (Bmi1, Oct4 i Nanog) detektirane su u naznačenim stanicama ( n = 3). Mamosfere nastale tijekom tri in vitro serijska prolaza kvantificiraju se u DSCs i Hep2 stanicama. Podaci se navode kao broj formiranih mammosfera / 1000 zasijanih stanica ± SE Barovi označavaju SE ( n = 5). Linija mjerila, 100 µm. ( c ) Alikvota od 1 × 10 4 DSC ili Hep2 stanice u jednoćelijskim suspenzijama posuta je u posude promjera 10 cm. Brojeni su klonovi koji sadrže> 50 stanica, a učinkovitost stvaranja klona (CFE) predstavljena je kao odnos broja klona i broja platirane stanice. Trake označavaju SE ( n = 3). ( d ) Alikvoti od 5 × 10 4, 1 × 10 5 ili 5 × 10 5 DSC ili Hep2 stanica ubrizgavaju se supkutano u gole miševe ( n = 6 miševa / skupina), a učestalost tumora je praćena u svakoj skupini. ( e ) Provedena je kvantitativna analiza lančane reakcije transkripcije i polimeraze kako bi se procijenila razina mRNA TIP30 u DSCs i Hep2 stanicama ( n = 3). Napravljene su reprezentativne fotografije imunohistokemijskog bojenja za ekspresiju TIP30. (Gornja: traka skale, 100 μm; donja: traka skale, 50 μm). * P <0, 05 i ** P <0, 01

Slika pune veličine

Kako DSC-ovi mogu imati svojstva nalik na stabljiku, 4 ispitali smo DSC-ovu sposobnost samoobnavljanja. Ekspresija markera samoobnove kao što su Bmi1, Oct4 i Nanog bila je značajno veća u DSC-u nego u Hep2 stanicama (Slika 1b, lijevo). Kako je CD133 marker prisutan u podskupini matičnih stanica karcinoma kod pacijenata s karcinomom larinksa, 26 smo izmjerili CD133 ekspresiju u DSCs i Hep2 stanicama analizom razvrstavanja stanica potpomognutih protokom. Postotak CD133 pozitivnih stanica bio je mnogo veći u svježe izoliranim DSC nego u Hep2 stanicama (dopunska slika S2). Generacija sfere je in vitro ispitivanje potencijala samoobnove 9 . Iako nije uočena očita razlika u formiranju primarne sfere između DSC-a i Hep2 stanica, broj sfera koje su formirali DSC-ovi bio je oko dva puta veći od broja Hep2 stanica tijekom formiranja sekundarne i tercijarne sfere (Slika 1b, desno). Testovi formiranja klona otkrili su da se DSC razmnožavaju mnogo brže nego stanice Hep2 (Slika 1c). Nadalje smo izmjerili djelotvornost stvaranja ksenografa od strane DSCs i Hep2 stanica. Kada su 5 × 10 4 ili 1 × 105 5 stanice ubrizgane u miševe BALB / c, pronađeni su tumorski čvorovi u jednom i dva miševa s ksenografijom DSC, ali nisu pronađeni tumorski čvorovi kod miševa s ksenografisanjem Hep2 (slika 1d).

TIP30 je smanjen u nekoliko humanih tumora, 15, 17, 18, 22 i prekomjerna ekspresija TIP30 može povećati osjetljivost HCC stanica na kemoterapeutske lijekove poput 5-FU. 18 Sorafenib može regulirati ekspresiju TIP30 da inhibira metastazu tumora kroz Jun-aktiviranu kinazu i pretvornik signala i aktivator signala transkripcije 3. 23 Izmjerili smo TIP30 ekspresiju u DSC-u. Izolirali smo ukupnu RNA u svježim tumorskim tkivima od miševa koji su bili hep2-ksenografisani liječeni cisplatinom ili PBS-om, kao što je prikazano na Dodatnoj slici S1. Ekspresija TIP30 bila je značajno niža u DSC-u nego u Hep2 stanicama (Slika 1e, lijevo). Smanjena ekspresija TIP30 u DSC je dodatno potvrđena imunohistokemijskim bojenjem (Slika 1e, desno).

Skupno, ovi podaci pokazuju da se TIP30 ekspresija smanjila u DSC i da smanjena TIP30 ekspresija može biti uključena u kemoresistenciju LSCC stanica.

TIP30 in vitro negativno regulira svojstva poput stabljike i hemorezistenciju DSC-a

TIP30 ekspresija se postupno povećavala nakon uzgajanja DSC-a pod različitim uvjetima, što ukazuje da smanjena TIP30 ekspresija može biti važna za DSC-ove za održavanje nediferenciranog statusa (slika 2a). Kako bi se provjerilo je li TIP30 ekspresija važna za potencijal samoobnavljanja u DSC-u, Tip30 gen je ili uveden u DSCs ili utišan RNA interferencijom u Hep2 stanicama. Faktori transkripcije povezani sa samo-obnovom kao što su Bim1, Oct4 i Nanog značajno su porasli kada je TIP30 utihnuo u stanicama Hep2 i smanjili se kada je TIP30 uveden u DSC (Slika 2b i Dopunska slika S3A). Analiza formiranja sfere otkrila je da utišavanje TIP30 dovodi do pojačanog stvaranja sfere u Hep2 ćelijama, dok je uvođenjem TIP30 inhibirano stvaranje sfere u DSC (slika 2c i dodatna slika S3B). Stanična proliferacija značajno je povećana u Hep2 ćelijama koje su ušutkane TIP30 i smanjena je u DIP-ima prekomjerno eksprimiranim TIP30 (dopunska slika S4). Nadalje, zabilježeno je zaustavljanje staničnog ciklusa faze G0 / G1 u DSC lentivirusu (LV) Tip30 . Suprotno tome, potvrđeno je da se indeks proliferacije (postotak stanica u S i G2 fazi) značajno povećao nakon šutnje TIP30 u Hep2 stanicama (dopunska slika S5).

Image

TIP30 se postupno povećava u DSC adhezivnim rastom i negativno je uključen u regulaciju samoobnove i kemoterapijsku rezistenciju u stanicama karcinoma larinksa. ( a ) Western blot je proveden radi procjene razine proteina TIP30 u Hep2 stanicama i DSC-u u različitim vremenskim točkama pod adekvatnim uvjetima. ( b ) Hep2 stanice su bile zaražene kratkim sh Tip30 , a DSC su zaražene LV Tip30 tokom 5 dana. Usporedba nivoa mRNA markera samoobnove (Bmi1, Oct4 i Nanog) među Hep2-sh Tip30 , DSCs -LV Tip30 i kontrolnim stanicama ( n = 3). ( c ) Mammosfere koje su nastale tijekom četiri in vitro serijska prolaza kvantificirane su u naznačenim stanicama. Podaci se navode kao broj formiranih mammosfera / 1000 zasijanih stanica ± SE Barovi označavaju SE ( n = 5). ( d ) Razine mRNA transportera ABC (ABCG2, ABCB1 i ABCC1) detektirane su u naznačenim stanicama ( n = 3). ( e ) Lijevo: krivulje preživljavanja opisanih stanica tretirane s 30 µM cisplatinom; desno: krivulje preživljavanja doza-odgovor u stanicama opisanim u ( b ) nastale su nakon izloženosti različitim koncentracijama cisplatina u trajanju od 72 h. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz tri neovisna pokusa. ( f ) Provedena je analiza sortiranja stanica potpomognuta protokom kako bi se odredila ekspresija CD133 u različitim vremenskim točkama u DSCs-sh Tip30 i kontrolirale stanice u adherentnoj kulturi. Otkrivene su i odgovarajuće razine mRNA TIP30. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz tri neovisna pokusa. ( g ) Analiza imunofluorescencije citokeratina 19 u svježe izoliranim DSC nasuprot Hep2 stanicama (lijevo) i u DSC-sh Tip30 nasuprot DSC-sh Non pod diferencirajućim uvjetima (desno). DAPI je korišten za bojenje jezgara. Linija skale, 50 μm. * P <0, 05 i ** P <0, 01

Slika pune veličine

Da bismo dodatno istražili učinak TIP30 na kemoresistenciju u LSCC stanicama, izmjerili smo razinu mRNA ABCG2, ABCB1 i ABCC1. Šutnja TIP30 značajno je poboljšala ekspresiju ABCG2, ABCB1 i ABCC1 u Hep2 stanicama, dok je uvođenje TIP30 u DSC smanjilo ekspresiju tih gena (slika 2d i dodatna slika S3A). Štoviše, prigušivanje TIP30 u Hep2 stanicama povećalo je otpornost na kemoterapeutske lijekove poput cisplatina. Kad su DSC zaraženi LV Tip30 , njihova se kemoterapijska osjetljivost značajno povećala (Slika 2e).

CD133 je LSCC marker stanične površine, a stanice CD133 + povećale su potencijal za samoobnovu i tumourigenesis. 26 Svježe izolirani DSC sadržavali su oko 51, 23% CD133 + stanica (dopunska slika S2). Međutim, nakon 3 tjedna kulture u mediju za diferencijaciju, popraćeno pojačanom TIP30 ekspresijom, većina CD133 + DSC diferencirana je u CD133 - (Slika 2f). Smanjena regulacija TIP30 u DSC povećavala je postotak preostalih CD133 + stanica pod razlikovnim uvjetima (Slika 2f). Citokin 19 (CK19) je marker matičnih stanica karcinoma u karcinomu glave i vrata i značajno se povećava u stanicama populacije u odnosu na onu u stanicama koje nisu sporedne populacije. 27 Stoga smo izmjerili ekspresiju CK19 u svježe izoliranim DSC i Hep2 stanicama imunofluorescentnim bojenjem. Rezultati su pokazali da je ekspresija CK19 bila značajno veća u DSC-u nego u Hep2 stanicama. Smanjenje regulacije TIP30 u DSC-u umanjilo je uklanjanje CK19 pod diferencirajućim uvjetima (Slika 2g). Zbog toga će za održavanje svojstava nalik na stabljiku u DSC-ovima biti potrebna niska TIP30 ekspresija.

Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da smanjena ekspresija TIP30 sudjeluje u regulaciji svojstava sličnih stabljici i hemorezistenciji u LSCC.

TIP30 in vivo negativno regulira tumourigenezu i hemorezistenciju LSCC stanica

Ispitali smo tumorourigenost LSCC stanica in vivo kako bismo dalje utvrdili učinak TIP30 na svojstva staničnih stanica. Hep2 stanice osiromašene od TIP30 pokazale su pojačane in vivo sposobnosti stvaranja tumora, dok je uvođenje TIP30 u DSC značajno oslabilo njihovu tumoričnost prema testiranju serijskog razrjeđivanja golih miševa (Slika 3a). Nadalje, prigušivanje TIP30 značajno je pospješilo rast Hep2 stanica in vivo , dok je prisilna ekspresija TIP30 značajno smanjila rast DSC-a (Slika 3b). Ovi podaci sugeriraju da TIP30 negativno utječe na tumorerigenezu u LSCC. Isti su rezultati dobiveni u Hep2 stanicama zaraženim drugim skupom R30 (shRNA) LN (kratka slika S3C i D) tip30.

Image

TIP30 in vivo djeluje inhibirajući na tumourigenezu i hemoresistenciju. ( a ) Alikvoti 5 × 10 4, 1 × 10 5 ili 2 × 10 5 Hep2-sh Tip30 , DSC-LV Tip30 ili kontrolne stanice ubrizgavaju se supkutano u gole miševe ( n = 6 miševa / skupina) i učestalost tumora je praćena u svakoj grupi. ( b ) Veličina tumora praćena je jednom u 2 tjedna s kalibarima 2 tjedna nakon ortofopske transplantacije ksenografta 1 × 106 spomenutih stanica u golih miševa ( n = 6 miševa / skupina), a pripremljene su krivulje volumena tumora (* P < 0, 05). ( c ) Stope preživljavanja golih miševa ( n = 6 miševa / skupina) s 5 × 10 6 Hep2-sh Non , Hep2-sh Tip30 , supkutano implantiranim DSCs -LV Non ili DSCs-LV Tip30 , u kombinaciji s intraperitonealnom injekcijom cisplatina (2 µg / g) ili natrijevog klorida dva puta tjedno

Slika pune veličine

LSCC stanice su implantirane supkutano u gole miševe u kombinaciji s liječenjem cisplatinom ili natrijevim kloridom kao kontrolom za ispitivanje učinka TIP30 na kemoterapiju in vivo . Šutnja TIP30 značajno je smanjila preživljavanje miševa s ksenografijom Hep2 ( P = 0, 023) i kemoterapeutski učinak cisplatina ( P = 0, 006) (Slika 3c, lijevo). Suprotno tome, uvođenje TIP30 u DSC stanice značajno je povećalo preživljavanje miševa koji su bili ksenografisani DSC ( P = 0, 021) i kemoterapeutski učinak cisplatina ( P = 0, 007) (Slika 3c, desno).

Ovi rezultati jasno sugeriraju da je TIP30 ekspresija važna za liječenje LSSC kemoterapijskim lijekovima.

AKT / GSK-3 β / β- kateninska signalizacija potrebna je za TIP30 da regulira samoobnovu, kemoresistenciju i proliferaciju LSCC stanica

Gubitak TIP30 poboljšava aktivnost receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), što dovodi do aktivacije AKT i izvanćelijski regulirane kinaze (ERK) 1/2 u ljudskom pluću adenokarcinoma i tumora dojke. 28, 29 AKT / glikogen sintaza kinaza-3 β (GSK-3 β ) / p- katenin signalizacija ima važnu ulogu u razvoju više tkiva reguliranjem samoobnavljanja, proliferacije, diferencijacije i kretanja stanica. 30, 31 Ovdje smo otkrili da silazno reguliranje AKT aktiviranog TIP30 uzrokuje naknadnu fosforilaciju GSK-3 β Ser9 (neaktivni oblik GSK-3 β ) i manje fosforilaciju β- katenina Thr41 / Ser45 (prepoznato po proteasomu za razgradnju) u Hep2 stanicama, Suprotno tome, pretjerano eksprimiranje TIP30 uvelike je oslabilo aktivaciju AKT, smanjilo fosforilaciju GSK-3 β Ser9 i poboljšalo fosforilaciju β- katenina Thr41 / Ser45 u DSC-u (Slika 4a). Prema tome, smanjivanje vrijednosti TIP30 moglo bi poboljšati stabilnost p- katenina, a prekomjerna ekspresija TIP30 mogla bi promovirati razgradnju p- katenina. Zapravo, pad sile TIP30 povećao je ukupnu ekspresiju β- katenina u Hep2 stanicama, dok je prisilna ekspresija TIP30 u DSC rezultirala smanjenjem ukupne ekspresije β- katenina (Dodatna slika S6). Dosljedno, zabilježeno je nuklearno nakupljanje β- katenina u Hep2 ćelijama koje su ušutkane TIP30, dok je prisilna ekspresija TIP30 rezultirala citoplazmatskom raspodjelom p- katenina u DSC-ima (slika 4b). Nadalje, uočena je značajna negativna povezanost između ekspresije TIP30 i p-AKT razine ( r = 0, 452, P <0, 001) ili raspodjele β- katenina ( r = 0, 454, P <0, 001) u tkivima LSCC ugrađenih parafinom imunohistohemijskom analizom (Dopunska Slika S7 i dopunska tablica S1).

Image

Put AKT / GSK-3β / p- katenina potreban je za inhibiciju samo-obnove izazvane TIP30, hemorezistenciju i proliferaciju. ( a ) Western blot je proveden za procjenu fosforilirane i ukupne ekspresije AKT, GSK-3 p i p- katenina u Hep2-sh Tip30 , DSC-LV Tip30 i kontrolnim stanicama. ( b ) Analiza imunofluorescencije β- katenina za stanice opisane u ( a ). DAPI je korišten za bojenje jezgara. Linija skale, 25 µm. ( c ) Klonovi koji su se formirali i sfere nastale u Hep2-sh Non ili Hep2-sh Tip30 stanicama koje su transficirane siRNA ciljajući β- katenin (si- CTNNB1-554 ili si- CTNNB1-689 ) ili šifrirana siRNA (si- NC ). Stope smrtnosti stanica testirane su u Hep2-sh Non , Hep2-sh Tip30 i Hep2-sh Tip30 transficirani sa si- CTNNB1-554 , si- CTNNB1-689 ili si- NC , u kombinaciji s liječenjem cisplatinom (30 μM ) za 24 ili 48 h, respektivno. Trake označavaju SE ( n = 5). ( d ) Klonovi koji su nastali i sfere koje su nastale u DSCs-LV Non ili DSCs-LV Tip30, transficirani s pcDNA3 ili pc CTNNB1 . Stope smrtnosti stanica testirane su u DSCs-LV Non , DSCs-LV Tip30 i DSCs -LV Tip30 transfektirani pcDNA3 ili pc CTNNB1 , u kombinaciji s liječenjem cisplatinom (30 µM ) tijekom 24, odnosno 48 h. Trake označavaju SE ( n = 5). * P <0, 05 i ** P <0, 01

Slika pune veličine

Inhibiranje P- katenin signalizacije s malim interferirajućom RNA (siRNA) značajno inhibira pojačanu sposobnost TIP30 izazvanu za formiranje sfere, proliferaciju i rezistenciju na cisplatin (Slika 4c). Suprotno tome, prekomjerni eksprimirajući β- katenin umanjio je TIP30-inducirani inhibitorni učinak na stvaranje sfere, proliferaciju i rezistenciju na cisplatin u DSC-u (slika 4d). Zbog toga je za TIP30 potrebna signalizacija AKT / GSK-3 β / β- katenina da bi se regulirala samoobnova, hemorezistencija i proliferacija LSCC stanica.

Smanjena ekspresija TIP30 povezana je s lošom prognozom u bolesnika s karcinomom larinksa

Ekspresija TIP30 ispitana je u 105 karcinoma grkljana i susjednim ne-tumorskim tkivima koristeći anti-humano TIP30 antitijelo. Otkriveno je TIP30 imunološko bojenje u staničnoj citoplazmi. Udio negativne ekspresije TIP30 bio je veći u tumorskim tkivima nego u netumorskim tkivima (Slika 5). Minimalno TIP30 bojenje tumorskih stanica pronađeno je u 46 slučajeva (43, 8%), dok je minimalno TIP30 bojenje u ne-tumorskim stanicama otkriveno u 27 slučajeva (25, 7%; P = 0, 006). Da bismo dodatno potvrdili rezultate imunološkog testiranja, ispitali smo TIP30 ekspresiju u osam svježe izoliranih karcinoma grkljana i ne-tumorskih tkiva Western blot analizom. Kao što je prikazano na Dodatnoj slici S8, ekspresija TIP30 u susjednim ne-tumorskim tkivima bila je značajno veća od one u tumorskom tkivu.

Image

Reprezentativno TIP30 imunohistokemijsko bojenje u tkivima humanog karcinoma grkljana i susjednim nekarcinomskim tkivima. Negativna TIP30 ekspresija u tumorskim tkivima ( a, b, e i f ). Pozitivna ekspresija TIP30 u tumorskim tkivima ( c, d, g i h ). Negativna TIP30 ekspresija u susjednim ne-karcinomnim tkivima ( i, j, m i n ). Pozitivna ekspresija TIP30 u susjednim ne-karcinomnim tkivima ( k, l, o i p ). ( a - d i i - l ) Linija skale, 100 μ m; ( e - h i m - p ) ljestvica skale, 50 μm

Slika pune veličine

Na temelju rezultata ekspresije TIP30 u tumorskim stanicama, 105 bolesnika podijeljeno je u visokoekspresirajuću ( n = 59) i niskoekspresirajuću skupinu ( n = 46), te su analizirane korelacije između TIP30 ekspresije i kliničkopatoloških karakteristika. TIP30 je bio obrnuto povezan sa T stadijumom ( P < 0, 001). Međutim, ostale kliničke karakteristike, uključujući dob, spol, metastaze na limfnim čvorovima, klinički stadij, mjesto tumora i histološku diferencijaciju, nisu bile značajno povezane s ekspresijom TIP30 (tablica 1).

Tablica pune veličine

Potencijalne povezanosti između imunološke boje TIP30 i ukupnog preživljavanja (OS) i preživljavanja bez recidiva (RFS) retrospektivno su procijenjene u ovih bolesnika. Analiza Kaplana-Meiera pokazala je da su OS ( P = 0, 022) i RFS ( P = 0, 002) značajno bolji među pacijentima koji imaju visoku TIP30 bojenje u usporedbi s onima s niskim TIP30 obojenjem (Slika 6). Univarijantna analiza pokazala je da spol, dob, T stadij i klinička faza nemaju prognostički značaj za RFS i OS. Međutim, mjesto tumora, histološka diferencijacija i ekspresija TIP30 bili su prediktori za RFS i OS, dok je metastaza u limfnim čvorovima imala samo prognostički značaj za RFS (Dodatna tablica S2). U multivarijantnoj analizi otkrili smo da su metastaza na limfnim čvorovima, histološka diferencijacija i ekspresija TIP30 neovisni prognostički čimbenici za RFS. Histološka diferencijacija i TIP30 ekspresija su također imali neovisnu prognostičku vrijednost za OS (Dodatna tablica S3).

Image

Niska ekspresija TIP30 predviđa lošu prognozu kod pacijenata s karcinomom larinksa. Krivulje preživljavanja Kaplana-Meiera koje pokazuju ukupnu stopu preživljavanja (bez liječenja) i rekurentnu bolest (105) između 105 bolesnika s karcinomom larinksa između TIP30-visoke u odnosu na TIP30-nisko-eksprimirajuću skupinu (test rang-loga)

Slika pune veličine

Zaključujemo da smanjena ekspresija TIP30 može biti prognostički pokazatelj lošeg preživljavanja bolesnika s karcinomom larinksa. Ovi rezultati potvrdili su da je TIP30 neovisna varijabla, i što je važno, sugeriraju da TIP30 negativno predstavlja značajan faktor rizika za opstanak pacijenta.

Rasprava

Unatoč LSCC strategijama liječenja koje su razvijene u posljednja dva desetljeća, 32, 33, 34 zadovoljavajuća terapijska ishoda i stope preživljavanja bolesnika s LSCC nisu se značajno poboljšale. Otpornost na lijekove i ponovna pojava malignih bolesti odgovorni su za neizvjesne terapijske učinke.

Stanice tumora otporne na lijekove mogu se dobiti in vivo ili in vitro davanjem kemoterapijskih lijekova za ubijanje proliferacijskih stanica. 36, 37, 38 Ovi DSC imaju svojstva matičnih stanica, sa sposobnošću samoobnavljanja, i mogu se koristiti za daljnja istraživanja otpornosti na lijekove. 36, 37, 38 Da bismo bolje razumjeli mehanizme kemoresistencije u LSCC stanicama, stvorili smo DSCs, visoko malignu staničnu liniju larinksa, tretiranjem Hep2 stanica cisplatinom in vivo.

Naši rezultati pokazali su da su DSC-ovi pokazali svojstva slična stabljikama raka, uključujući pojačano formiranje sfere, kemoresistenciju, tumourigenesis i CD133 + populaciju. DSC-ovi su imali oko 20 puta više tumurogene sposobnosti od matičnih stanica i mnogo veću ekspresiju markera samoobnove (Bmi1, Oct4 i Nanog). Štoviše, otkrili smo da je Tip30 , novi gen za suzbijanje tumora, teško eksprimiran na razini mRNA i proteina u svježe izoliranim DSC, što ukazuje na to da TIP30 može imati važnu ulogu u otpornosti na lijekove i samoobnavljanju u bolesnika s LSCC.

Prethodna izvješća sugeriraju da TIP30 ima važnu ulogu u mnogim zloćudnim bolestima, uključujući rak jetre, rak pluća, karcinom gušterače i karcinom dojke. 22, 39, 40, 41, 42 Gubitak TIP30 uzrokuje spontani razvoj karcinoma jetre, pluća i mlijeka. 15, 28, 43 Prethodno smo izvijestili da TIP30 može izvršiti svoj antitumorski učinak stabilizacijom p53 mRNA i promicanjem apoptoze. 41 Ektopična ekspresija TIP30 u HCC stanicama pojačava p53 ekspresiju i smanjuje ekspresiju Bcl-2 / Bcl-xL čime je TIP30 povećao osjetljivost citotoksičnog lijeka 5-FU i produlio preživljavanje golih miševa koji nose potkožno utvrđene HCC tumore. 18 U ovom istraživanju otkrili smo da iscrpljivanje TIP30 negativno regulira otpornost LSCC na kemoterapeutske lijekove. Razine mRNA ABC poltransportera, za koje se vjeruje da su važni regulatori otpornosti na lijekove, značajno su se smanjile u stanicama prekomjerno eksprimiranim TIP30 i povećale u stanicama koje utišaju TIP30. Srušenje TIP30 učinilo je Hep2 stanice otpornijima na cisplatin, dok je prisilna ekspresija TIP30 učinila DSC stanice osjetljivim na cisplatin. Najvažnije, prekomjerno eksprimiranje TIP30 u kombinaciji s liječenjem cisplatinom značajno je povećalo preživljavanje LSCC-ksenografisanih miševa, dok je pad TIP30 značajno oslabio terapeutske učinke cisplatina kod miševa s ksenografijom LSCC.

Prethodne studije su pokazale da TIP30 može biti uključen u regulaciju svojstava matičnih stanica ili prekursorskih stanica. Brisanje Tip30 dovodi do ekspanzije bronhoalveolarnih matičnih / potomničkih stanica u Tip30 -knockout BALB / c miševima 40, dok prekomjerno eksprimiranje TIP30 u staničnoj liniji prekursora oligodendrocita štakora inhibira njegovu diferencijaciju. 44 Ovdje smo otkrili da je prisilna ekspresija TIP30 oslabila svojstva DSC-a nalik stabljikom inhibiranjem AKT / GSK-3P / P- katenin signalizacije. Prethodno izvješće sugerira da gubitak TIP30 poboljšava aktivnost EGFR-a, što dovodi do neregulisanog p-AKT i pERK1 / 2 u adenokarcinomu pluća i raka mliječne žlijezde. 28, 29 p-AKT fosforilati GSK3 β za regulaciju aktivacije β- katenina. 45, 46 β- katenin je višenamjenski protein s središnjom ulogom u raznim bolestima, uključujući rak, a nenormalna aktivacija signala p- katenina povezana je s otpornošću na lijekove. Uz to, nuklearna lokalizacija p- katenina karakteristična je za staničnu populaciju stabljika u karcinomima koji mogu pokrenuti stvaranje tumora. 47 Naši podaci otkrili su da je prigušena ekspresija TIP30 praćena AKT i GSK-3 β fosforilacijom oslabila razinu fosforiliranog P- katenina i dovela do nuklearne akumulacije β- katenina. Inhibiranje P- katenina značajno je inhibiralo pojačane sposobnosti TIP30 izazvane pojačanjem sfere, proliferacije i hemoresistencije. Suprotno tome, štetni učinci upreguliranog β- katenina također su potvrđeni. Stoga je aktiviranje TIP30 uzrokovano nedostatkom puta AKT / GSK-3 β / β- katenina kritično za kemoresistenciju, samoobnovu i proliferaciju LSCC stanica.

Pored toga, prvi put smo procijenili ekspresiju TIP30 u kliničkim uzorcima bolesnika s karcinomom larinksa i susjednim tkivima. Niska ekspresija TIP30 pronađena je u karcinomu larinksa i značajno je povezana s T stadijom. Važnost proteina TIP30 u razvoju karcinoma grkljana naglasio je njegovu nisku razinu ekspresije u karcinomu larinksa. Predlažemo da smanjena ekspresija TIP30 može biti prognostički pokazatelj lošeg preživljavanja bolesnika s karcinomom larinksa zbog većih recidiva i smrtnosti.

Zaključno, otkrili smo da TIP30 regulira potencijal za kemoresistenciju i samoobnovu u LSCC stanicama. Ovi učinci TIP30 bili su povezani sa regulacijom puta AKT / GSK-3 β / β- katenina. Štoviše, naši podaci otkrivaju da se TIP30 smanjio u tumorskim tkivima LSCC-a i bio je povezan s napredovanjem i prognozom. Uzeto zajedno, ovi rezultati sugeriraju da TIP30 može biti koristan kandidat za poboljšanje kemoterapijskih rezultata i poslužiti kao marker za prognozu u bolesnika s LSCC-om.

Materijali i metode

Stanična kultura i LV

Stanice Hep2 dobivene su od Instituta za biološke znanosti (Šangaj, Narodna Republika Kina). Stanice su uzgajane 1640-DMEM (Dulbeccova modifikovana Eagle-ova sredina) sa 10% fetalnim goveđim serumom na 37 ° C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2 u zraku. Kao što je ranije izvješteno , zaraženo je LV koji kodira shRNA ciljajući Tip30 . 48 Dvolančani oligo DNK za sh Tip30 -2 bili su: gornji lanac, 5′-CCGGCCTCTAAAGGAGCTGATAAATCTCGAGATTATCAGCTCCTTTAGAGGTTTTTTg-3 ′ i donji lan, 5′-CCGGGCAGAATAAATCCGTCTTTTATTCTTTATCATTCATTCtTtCattgtgtgtgata

Plazmidi, siRNA i transfekcija

pcCTNNB1 je kupljen od Addgene (Cambridge, MA, SAD). SiRNA specifična za CTNNB1 i kontrolnu siRNA kupljena je od šangajske GenePharma (Šangaj, Narodna Republika Kina). Stanice su transficirane pomoću DharmaFect (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SAD) prema uputama proizvođača. Za svaku transfekciju korišteno je 2 M siRNA dupleksa. Sekvence su bile sljedeće: za CTNNB1 -554, smisao –5 '-GCUGCUAUGUUCCCUGAGATT-3' i antisense - 5 '-UCUCAGGGAACAUAGCAGCTT-3'; za CTNNB1 -689, smisao - 5′-GCAGUUGUAAACUUGAUUATT-3 'i antisense - 5′-UAAUCAAGUUUACAACUGCTT-3'.

Učinkovitost LV infekcije i malih interferiranja i transfekcija plazmidom prikazana je na Dodatnoj slici S9.

Kultura stanične sfere

Stanice se resuspendiraju u mediju bez DMEM-F12 bez seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) uz dodatak 4 μg / ml inzulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 20 ng / ml EGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 20 ng/ml basic fibroblast growth factor (Peprotech), B27 (1 : 50 Invitrogen) and 0.4% bovine serum albumin (BSA). The cells were plated onto ultralow attachment plates (Corning, New York, NY, USA). A 200- μ l aliquot of 0.8% BSA-F12 medium containing EGF and insulin was added every 3 days. The number of spheroids was measured under a microscope 14 days after seeding. The spheres were collected by centrifugation for serial passage, dissociated into single cells with trypsin and cultured under the conditions described above.

Cell viability and chemoresistance assay

Cells were detached, counted and seeded on 96-well plates at 5000 cells per well. The chemotherapeutic agent obtained from Changhai Hospital was added to the medium at a particular concentration 24 h later. The medium was removed, and the plates were washed with PBS two times after the designated time point. Cell viability was determined with an MTS assay reagent (CellTiter 96 AQueous one Solution Cell Proliferation Assay; Promega, Madison, WI, USA) according to the manufacturer's protocol.

Clone formation

A single-cell suspension of 10 000 cells was plated in a 10-cm-diameter dish and cultured in 1640-DMEM for 10 days. After most of the cell clones had expanded to >50 cells, they were washed two times with PBS and dyed with crystal violet for 15 min at room temperature. After washing out the dye, clones containing >50 cells were counted. Clone formation efficiency (CFE) was the ratio of the clone number to the plated cell number.

Tumour xenograft mouse model

Six-week-old male BALB/c nude mice were purchased from the Shanghai Experimental Animal Centre of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, People's Republic of China) and were maintained under specific pathogen-free conditions. The animal care and experimental protocols were conducted in accordance with the guidelines of the Shanghai Medical Experimental Animal Care Commission. Aliquots of cells were injected subcutaneously into each mouse for limiting dilution tumour formation. The animals were killed at the indicated time intervals when tumour nodules were identified on the body surface of the mice. If no tumours were found, the mouse was monitored until the second or third time point. An aliquot of 1 × 10 6 cells was injected subcutaneously into the mice to evaluate tumour-forming ability, and the mice were monitored once every 2 weeks for palpable tumours. Tumour size was measured with callipers, and tumour volume was calculated according to the following formula: larger diameter × (smaller diameter) 2 /2.

Patients, immunohistochemistry and scoring

In total, 105 laryngeal carcinoma samples with adjacent non-tumour tissues were obtained from patients who had undergone surgery between 2004 and 2009 at Changhai Hospital (Shanghai, People's Republic of China). Tumour stage was determined according to the NCCN clinical practice guidelines of the oncology – head and neck cancer guidelines. All paraffin-embedded tissue specimens were diagnosed and reconfirmed by two experienced pathologists. Complete follow-up data were available for all patients, and the clinicopathologic characteristics of the patients are summarised in Supplementary Table S4. Patient follow-up was completed in May 2012. Recurrences were confirmed based on typical imaging appearance on computed tomography scans and/or magnetic resonance imaging.

Rabbit anti-human TIP30 (1 : 6000, generated in our lab as reported previously 39 ), rabbit anti-human p-AKT (1 : 50; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and rabbit anti-human β -catenin (1 : 300; Cell Signaling Technology) were used to detect TIP30, p-AKT and β -catenin expression. The immunohistochemistry protocols have been described elsewhere. 39 One set of samples was incubated with non-immune rabbit IgG (1 : 150; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) instead of primary antibody as an antibody control. The staining evaluation was performed independently by two experienced pathologists. Immunostaining intensity was semiquantitatively estimated according to signal intensity and distribution. Briefly, the mean percentage of positive tumour cells was determined in at least five areas at × 400 magnification and assigned to one of the following five categories: 0, 75%. Immunostaining intensity was scored as follows: 1, weak; 2, moderate and 3, intense. The predominant pattern of the tumours that showed heterogeneous staining was considered for scoring. The percentage of positive tumour cells and staining intensity were multiplied to produce a weighted score for each case. Tissues with an immunohistochemical score ≤4 were considered low expressing, and those >4 were considered high expressing. Carcinoma cells staining positively for membranous β -catenin were classified as normally expressing, whereas positive staining of the cytoplasm or the nuclei was considered abnormal β -catenin expression. The use of all human samples and the experimental procedures for this study were reviewed and approved by the university and hospital ethics committees.

Statistička analiza

Statistical analyses were carried out using SPSS 16.0 for Windows software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P -values for dichotomous variables were based on Pearson's χ 2 -test. Continuous variables were analysed with Student's t -test. Spearman's rank correlation test was used to analyse bivariate correlations. The Kaplan–Meier method was used to determine survival probability, and differences were assessed by the log-rank test. OS was defined as the interval between surgery and death or between surgery and the last observation point. Data of surviving patients were censored at the last follow-up. RFS was defined as the interval between the date of surgery and the date of diagnosis of any type of relapse. Univariate and multivariate analyses were based on the Cox proportional hazards regression model. All statistical tests were two-sided, and P <0.05 was considered significant.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

  5. 5.

    Dopunska slika S5

  6. 6.

    Dopunska slika S6

  7. 7.

    Dopunska slika S7

  8. 8.

    Dopunska slika S8

  9. 9.

    Dopunska slika S9

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunski materijali i metode

Glosar

abeceda

ATP-binding cassette half-transporter

CFE

clone formation efficiency

CK19

cytokine 19

DSC

drug-selected cell

GSK-3 β

glycogen synthase kinase-3 β

LSCC

laryngeal squamous cell carcinoma

OS

overall survival

RFS

recurrence-free survival

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)