Cornelia de lange sindrom: nipbl haploinsuctivity smanjuje kanonski wnt put u embrionima zebrefish i pacijenti fibroblasts | stanična smrt i bolest

Cornelia de lange sindrom: nipbl haploinsuctivity smanjuje kanonski wnt put u embrionima zebrefish i pacijenti fibroblasts | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Razvoj živčanog sustava
  • Genetika bolesti

Sažetak

Cornelia de Lange sindrom je teški genetski poremećaj koji karakterizira malformacije koje pogađaju više sustava, a zajedničko je obilježje teške mentalne retardacije. Smatra se da su genetičke varijante unutar četiri gena ( NIPBL (nalik Nipped-B) , SMC1A, SMC3 i HDAC8 ) odgovorne za većinu slučajeva; svi ti geni kodiraju proteine ​​koji su dio 'kohezinskog kompleksa'. Kohezini imaju dvije vremenski odvojene glavne uloge u stanicama: jedna koja kontrolira stanični ciklus, a druga koja sudjeluje u regulaciji ekspresije gena. Ova studija usredotočena je na ulogu paraloga bradavice zebrafish tijekom neuronskog razvoja, ispitivanje njegove ekspresije u središnjem živčanom sustavu i analizu posljedica gubitka funkcije bradavice . Neuralni razvoj bio je umanjen padom bradavice kod zebri . zameci - gubitak funkcije, koji su predstavljeni povećanom apoptozom u živčanim tkivima u razvoju, smanjivanjem kanonskih Wnt put gena i smanjenjem Cyclin D1 (Ccnd1). Važno je da je isti uzorak kanonične WNT staze i snižavanja vrijednosti CCND1 uočen u fiburoblastima specifičnim za pacijenta koji su bili mutirani NIPBL. Konačno, kemijska aktivacija puta u zamecima bez gubitka funkcije spasila je nepovoljni fenotip i vratila fiziološke razine smrti stanice.

Glavni

Cornelia de Lange sindrom (CdLS) je sindrom višestrukih malformacija koji obično uključuje razvojno kašnjenje, specifične crte lica, abnormalnosti u ponašanju i velike prirođene malformacije. Gotovo bilo koji organ može biti zahvaćen, ali najčešće opaženi nedostaci su oni koji utječu na neurorazvojni, gastrointestinalni i mišićno-koštani sustav. Postoji širok spektar kliničke uključenosti, s rastućim prepoznavanjem puno blažeg fenotipa nego što je prethodno bilo cijenjeno. Klinički je zajednička značajka CdLS-a mentalna retardacija koja je često povezana s proširenim ventrikulama mozga, prorjeđivanjem ili atrofijom bijele tvari, hipoplazijom moždanog debla i cerebralnom vermalnom hipoplazijom ili agenezijom. 1, 2, 3 Tijekom razvoja središnji živčani sustav (CNS) nastaje iz neuralne ploče koja se savija na prednjoj i stražnjoj (AP) osi te tvori cijev podijeljenu u tri glavne cjeline: anlagen prosencephalona (prednji mozak), mesencephalon (srednji mozak) i rombencephalon (stražnji mozak). Kaudalno će se cijev razviti u leđnoj moždini. Ti se koordinirani događaji postižu fino podešenom ravnotežom između stanične proliferacije i programirane stanične smrti. Unutar svake regije stvara se velika raznolikost vrsta neuronskih stanica, svaka s različitim identitetom u pogledu svoje morfologije, aksonske putanje, sinaptičkih specifičnosti i neurotransmitera. 4 Ovom osnovnom specifikacijom upravljaju dorsoventralni (DV) i AP gradijenti molekula. Na primjer, poznato je da komponente obitelji Wnt induciraju prednje strukture (poput prednjeg mozga), dok su koštani morfogenetski proteini odgovorni za neurogenezu u dorzalnoj neuralnoj cijevi. 5

Genetski, CdLS uzrokuju i autosomno-dominantne i X-povezane mutacije. Otprilike, 60% slučajeva nastaje zbog genetskih oštećenja jednog od četiri gena: NIPBL (Nipped-B-like) , SMC1A, SMC3 i nedavno identificiranog HDAC8 . 1, 6 NIPBL gen prvi je pronađen povezan s CdLS. SMC1A je nakon toga identificiran kao dodatni gen čiji poremećaj stvara fenotipske nalaze CdLS-a, dok je zabilježen jedan slučaj CdLS-a koji ima mutaciju u SMC3 . Nađeno je da mu se HDAC8 mutirao u bolesnika sa CdLS-om, u skladu s njegovom ulogom u kontroli statusa acetilacije SMC3 . Nedavno su pronađene mutacije u RAD21 , strukturnom proteinu u kompleksu kohezina, u djece s spektrom invaliditeta koji se preklapaju s CdLS sindromom, što predstavlja blaža kognitivna oštećenja u skladu s takozvanom koesinopatijom. 3 Svi ovi geni kodiraju proteine ​​koji su uključeni u 'kohezinski kompleks'.

Kohezinski kompleks evolucijski se čuva od gljiva do ljudskih stanica, a njegova kanonska uloga je regulacija odvajanja kromatida tijekom stanične diobe. 7 Konkretno, kohezinski kompleks kontrolira sestrinsku kromatidnu koheziju tokom S faze. U somatskim ćelijama kralježnjaka identificirane su četiri jezgrene podjedinice koje tvore kompleks: SMC1 (SMC1A ili SMC1B), SMC3, SCC1 i bilo SA1 ili SA2. Povezani s jezgrovim kompleksom, drugi proteini pomažu tijekom stanične diobe, na primjer, NIPBL, koji čini se da olakšava prijenos kompleksa ili WAPL, što omogućuje složenu disocijaciju. 8

Nedavno je uočena nekanonska uloga, pri čemu kohezinski kompleks također predstavlja ključni regulator ekspresije gena. U Drosophili , pokazalo se da NIPBL ortolog (tj. Nipped-B ) sudjeluje u dugotrajnoj aktivaciji rezanja i ekspresije gena Ultrabithorax . 9 U zebrafish ( Danio rerio ), kohezini reguliraju transkripcijske faktore i hematopoezu. 10 Zanimljivo je da se čini da su kontrola staničnog ciklusa i regulacija ekspresije gena vremenski odvojeni. Na primjer, Drosophila mutanti za ortologe gena kohezinskog kompleksa pokazuju defekt u povlačenju aksona koji se fiziološki događa u post-mitotičkim neuronima, dakle u stanicama koje su izašle iz staničnog ciklusa. 11 Kod zebrafish, kohezini su izraženi i u proliferirajućim i u neproliferacijskim stanicama, 12 dok miševi koji su heterozigotni za Nipbl imaju ozbiljne nedostatke u razvoju i općenito izmijenjenu ekspresiju gena u nedostatku oštećenja staničnog ciklusa ili sestrinske kromatide. 13

Model oštećenja bradavice kod zebrica pokazuje izmijenjenu ekspresiju gena koji su uključeni u endodermalnu diferencijaciju zajedno sa spektrom oštećenja srca, crijeva i visceralnog organa koji imaju zadivljujuću sličnost onima opaženim u bolesnika sa CdLS-om. 14 U ovoj smo studiji koristili dva kombinirana pristupa, embrione zebrafish i stanice dobivene od pacijenta, kako bismo razišli molekularne mehanizme koji su u osnovi neurorazvojnih poremećaja. Prvo, opisani su učinci gubitka funkcije bradavice u razvoju CNS-a zebra, osobito na razini stražnjeg mozga. Rezultati dobiveni funkcionalnim ispitivanjima embrija zebre, potom su potvrđeni u fibroblastima bolesnika s CdLS-om s poznatom mutacijom u NIPBL.

Rezultati

Zebrafish bradavica izražena je u CNS-u

U skladu s literaturom, 12, 14 nibblb je sveprisutno izraženo tijekom rane somitogeneze u embrionima zebrefish. Izraz se progresivno smanjivao u deblu i pojavio se posebno lokalizirano u CNS-u pri 24 hpf (sati nakon oplodnje) (slika 1a). Kao što se vidi u ovom dorzalnom prikazu, ekspresija bradavice (slika 1b) otkrivena je u diencefalonu i mezencefalonu, i naglašava napredovanje otvaranja hindbranskih ventrikula. Histološki uzdužni i poprečni presjeci embrija od 24 hpf jasno su pokazali da je bradavica izražena na cijeloj dorzalno-ventralnoj (DV) i AP osi središnjeg živčanog sustava (slike 1c i d). Kolokalizacija krox20 , markerom rombomera III i V, 15 pokazala je da se ekspresija bradavice proširio kaudalno sve do rombomera V u ovoj fazi razvoja (slika 1e).

Image

Analiza ekspresije bradavice. ( a - d ) ŽELJA sondom specifičnom za nipblb na 24 hpf. ( a ) Embrion cjelokupnog postavljanja koji pokazuje moduliranu ekspresiju bradavice duž AP osi. c i d označavaju položaj histoloških presjeka navedenih u c i d . ( b ) Dorzalni prikaz (sprijeda s lijeve strane) različitih područja izraza bradavica u CNS-u. ( c ) Poprečni presjek neuralne cijevi koji pokazuje da je presjek bradavice sveprisutno izražen duž DV osi. ( d ) Uzdužni presjek koji prikazuje izraženu bradavicu duž AP osi. ( e ) Usporedba izraza nipblb (plavo) i krox20 (crveno) pokazuje da se bradavica proteže straga do rombomera V na 24 hpf. di, diencefalon; m, srednji mozak; h, stražnji mozak; ot, otocystis. Linija mjerila, 100 µm

Slika pune veličine

Inhibicija funkcije Nipblb u embriju zebrafish utječe na razvoj CNS-a

Embrioni ubrizgani nipblb -morpholino (MO) počeli su pokazivati ​​oštećenja na 24 hpf, uključujući oštećenja mozga (50% ubrizganih bradavice -MO, ukupno n = 200, slike 2a i b). Konkretno, zameci bez gubitka funkcije bili su mikroftalni i mikrocefalični. Pored toga, embriji koji su ubrizgali nipblb -MO predstavljeni su kratkim, zakrivljenim repom (40% ubrizganih bradavice -MO, ukupno n = 180, slika 2b), fenotipom koji su prethodno opisali Muto i sur. 14 nakon gubitka funkcije. Učinkovitost i specifičnost nipblb -MO provjereni su eksperimentima sa zapadnom mrljom u kojima je razina proteina Nipbl smanjena za 39% u embrijima nipblb -MO na 24 hpf, u usporedbi sa etapnim kontrolnim embrionima (Slike 2c i d).

Image

MO knockdown nipblb . ( a i b ) Morfologija živih zametaka pri 24 hpf. ( a ) Embrioni ubrizgani s ctrl-MO. ( b ) Embrioni ubrizgani bradavicom -MO koji predstavljaju oštećenja mozga i zakrivljeni rep. ( c ) Nipbl je smanjen u embrija koji su ubrizgali MO za 39 ± 0, 04% u usporedbi s kontrolama (izraženo kao srednja vrijednost trostrukih denzitometrijskih analiza normaliziranih u odnosu na kontrole). ( d ) Western blot proteina ekstrahiranog iz najmanje 30 embriona po eksperimentalnoj skupini koji pokazuje smanjene razine Nipbl (316 KDa) u dvije različite serije embriona ubrizganih 24 hpf nipblb -MO u usporedbi s kontrolama u istoj fazi razvoja. Donji opseg je beta-aktin (50 KDa)

Slika pune veličine

smanjivanje regulacije bradavice utječe na opstanak stanica, ali ne i na staničnu proliferaciju

U usporedbi s kontrolama, embriji koji su ubrizgali nipblb -MO pokazali su povećanu programiranu smrt stanica u CNS-u na 24 hpf, dok je apoptoza bila manje izražena u CNS-u kontrolnih embrija (Slike 3a-d). Zanimljivo je da je TUNEL bojenje pokazalo da su apoptotičke stanice najočitije u tkivima koja eksprimiraju bradavičasti gen (usporedite sliku 1a i slike 3b-d). Prethodne studije na zebrici opisale su apoptozu ovisnu o p53 nakon obaranja kohezina smc3 i povećanja p53 regulacije u mutantima za kohezinsku podjedinicu rad21 . 16, 17 Poznato je da molekule MO mogu izazvati neželjene efekte izvan cilja, poput aktiviranja p53 proteina. Važno je da preokret smrti stanice ovisne o p53 obustavom p53 nije utjecao na staničnu smrt uzrokovanu specifičnim genskim gubitkom funkcije. 18 Da bismo potvrdili da je apoptoza u embrijima nipblb -MO ubrizgana zbog specifičnog gubitka funkcije ovog gena, a ne kao posljedice aktivacije p53, zajedno smo ubrizgali p53 -MO s nipblb -MO. U embrionima koji su ubrizgali p53 -MO + nipblb -MO, količina apoptotskih stanica bila je usporediva sa zamecima nipblb - gubitka funkcije, koji su potvrdili da je neuronska apoptoza posebno uzrokovana oborenjem nibblb-a ( n = 42) (dopunska slika S1), Ovi rezultati sugeriraju da je potrebno bradavičarstvo za preživljavanje stanica tijekom neurologije u embrijima zebrafish.

Image

Apoptoza je povećana u CNS-u zametaka koji gube funkciju. ( a i b ) Apoptotičke stanice obilježene TUNEL-om snažno su povećane u ( b ) zamecima koji su ubrizgali bradavicu -MO na 24 hpf u usporedbi s kontrolnim embrionima ( a ) u istoj fazi razvoja. ( c i d ) Poprečni presjeci pokazali su prevladavajuću staničnu smrt u neuralnoj cijevi ( d, strelica) embrija koji ubrizgava -MO u usporedbi s kontrolama ( c ). nt, neuralna cijev. Linija mjerila, 100 µm

Slika pune veličine

Da bi se utvrdilo da li gubitak funkcije bradavice također mijenja brzinu proliferacije, embriji su obojeni antitijelom za proliferativni stanični nuklearni antigen. Kao što se očekivalo iz ranije objavljenih studija o gubitku funkcije kohezina, 10, 19, otkrili smo da ulazak u S fazu nije ugrožen, jer broj embriona koji su ubrizgali proliferativne nuklearne antigene u nipblb -MO embrionu na 24 hpf nije bio značajno povećao u usporedbi s kontrolama (dopunska slika S2).

gubitak funkcije nipblb mijenja izraz Wnt izražavanja puta signalizacije

Zahvaljujući ekspresiji nibblb-a širom CNS-a, dodatno smo istražili je li promjena CNS-a AP promijenjena u embrionima sa gubitkom funkcije na 24 hpf. Ekspresija AP markera identiteta, kao što su hoxb2a , 20 pax2a, 21 i krox20 , 15, nije promijenjena u embrionima koji su ubrizgali nipblb -MO (dopunska slika S3), što sugerira da je CNS ispravno uzorkovan. Međutim, otkrili smo da je ekspresija wnt1 22 ozbiljno izmijenjena u stražnji mozak embrija koji se ubrizgava -MO sa 24 hpf (80%, ukupno analiziranih embrija n = 120; Slike 4a i b). Bilo je moguće opažati nipblb fenotipove obrušavanja s različitim stupnjevima fuzije signala wnt1 u stražnjem mozgu između romba II i leđne moždine: najoštriji fenotip uključio je potpunu fuziju wnt1 signala stražnjeg mozga (20%, ukupno n = 120), intermedijarni fenotip izrazio je više točaka fuzije wnt1 duž osi AP stražnjeg mozga (40%, ukupno n = 120), a najmanje teški fenotip predstavljen kao pojedinačna točka fuzije wnt1 ili kao nepotpuno otvaranje komore (20%, ukupno n = 120, slike 4a i b).

Image

Wnt1 ekspresija je posebno pogrešno regulirana u stražnji mozak embrija koji se ubrizgavaju -MO. ( a i b ) wnt1 ekspresija u kontrolama i embrijima nipblb -MO-ubrizgavanjem pri 24 hpf. Izmijenjena wnt1 ekspresija u stražnjem mozgu ( b ) nipblb -MO-ubrizganih zametaka pri 24 hpf u usporedbi s ( a ) kontrolama u istoj fazi razvoja. Zvezdice označavaju više točaka fuzije wnt1 duž AP stražnjeg mozga ( b ) nipblb -MO ubrizganih embrija. ( c i d ) ekspresija axin2 pokazuje usporedive nedostatke uzorka kod zametaka koji su ubrizgali bradavicu ( MO) u usporedbi s kontrolama ( c ). Linija mjerila, 100 µm

Slika pune veličine

Da bismo istražili jesu li promatrani nedostaci specifični za pogrešno reguliranje ekspresije wnt1 nakon gubitka funkcije bradavice ili su uzrokovani morfološkim oštećenjima u stvaranju stražnjeg mozga , analizirali smo izraz atoh1 , markera dorzalnih progenista zadnjeg mozga i otvaranja ventrikula. 23 ekspresija atoh1 nije izmijenjena u embrijima nipblb -MO ubrizganom na 24 hpf (90%, ukupno n = 50; Dodatne slike S4A i B), što pokazuje da anatomsko oblikovanje mozga u razvoju ne utječe gubitkom funkcije bradavice .

Budući da oštećenja uzoraka neuronske cijevi mogu poremetiti diferencijaciju neurona, ispitali smo dopaminergičnu populaciju (tirozin-hidroksilaza-pozitivni neuroni) na 24 hpf nakon gubitka funkcije bradavice . Dobro je poznato da se formiranje mesencefalnih dopaminergičnih neurona usmjerava ne samo difuznim signalima iz notokorda, podne ploče i isthmičkih organizatora kao što su Shh i Fgf, već i Wnt1 i drugim vanjskim faktorima. 24 U embrionima koji gube funkciju, otkrili smo da neurodiferencijacija ove populacije nije negativno utjecala (dopunske slike S4C i D).

Važno je da su usporedive promjene u raspodjeli gena primijećene u wnt1 također primijećene u uzorku ekspresije axin2 , 25 ključnoj nizvodnoj komponenti puta, koja se obično koristi kao očitavanje kaskade (slike 4c i d).

Ekspresijsko profiliranje WNT / beta-kateninskih putnih gena u bolesnika s fibroblastima i embrionima ubrizganim nibblb-MO

U embrionima zebrefish, gubitak funkcije bradavice rezultirao je izmjenama puta Wnt / beta-katenina, modelirajući molekularne defekte koji su bili u osnovi bolesnika s CdLS-mutiranim NIPBL-om. Stoga smo pokušali analizirati profil ekspresije ovog signalnog puta kod fibroblasta pacijenata, uspoređujući ga s onim stanica dobivenih iz zdravih kontrola dobi, etnika i spola. Vjeruje se da fibroblasti predstavljaju valjani model za nedostatak kohezina kod ljudi 6 kao što su u ispitivanjima ekspresije gena primijećeni konzistentni izmijenjeni profili u primarnim kulturama fibroblasta i limfoblastoidnih staničnih linija. 6

Bilo je moguće isključiti uključenost nekanonskog puta, jer su i DVL1 i DVL2 26 usporedivi u bolesnika i u kontrolnoj skupini (dopunske slike S5A i B). Analiza ekspresije izravnih ciljeva kanonskog puta, kao što je Cyclins, kvantitativnim PCR (q-PCR) pokazala je trend smanjenja Cyclin D1 ( CCND1) kod bolesnika koji su mutirani NIPBL u usporedbi sa zdravim kontrolama (Slika 5a). Kako je poznato da Ciklini mogu nadoknaditi nedostatak drugih izoformi u sisavaca, 27 također smo analizirali Cyclin D2 ( CCND2) i otkrili da je on značajno reguliran ( P <0, 01) (Dodatna slika S5C). Dosljedno, opaženo je prosječno smanjenje razine CCND1 od gotovo 50% u uzorcima bolesnika u usporedbi sa zdravim kontrolama (Slika 5c, Dopunska slika 5D). Nađeno je i da je Ccnd1 značajno smanjen u embrijima koji su ubrizgali bradavicu pomoću q-PCR-a (slika 5b), Western blot analizom sa smanjenjem ekspresije Ccnd1 za 42% (Slika 5d) i hibridizacijom in situ hibridizacije (WISH ) analize (slike 5e i f). Potonje je pokazalo da je ekspresija ccnd1 izmijenjena u embrionima koji su ubrizgali nipblb -MO pri 24 hpf u usporedbi s kontrolama (40%, ukupno n = 30).

Image

Kanonski Wnt put reguliran je u životinjskim i ljudskim modelima CdLS-a. ( a i b ) Analiza u stvarnom vremenu na čovjeku ( CCND1) i zebri ( ccnd1 ) kod ( a ) fibroblasta specifičnih za pacijente i u ( b ) embrija ubrizganih bradavicama ( MO) koji pokazuju trend smanjenja transkripata u oba modela (zvjezdice u b predstavljaju P <0, 01). ( c i d ; g i h ) Western blot analize. Kvantifikacija relativne ekspresije proteina nakon normalizacije beta-aktina. Kvantifikacija je izvršena na tri (zebrafish) ili dva (ljudska) neovisna eksperimenta, a podaci su izraženi kao promjena puta u odnosu na relativne kontrole sa standardnim pogreškama. ( c i d ). Smanjenje CCND1 potvrđeno je na razini proteina u CdLS-ovim pacijentima izvedenim stanicama ( c ) i u zamecima-dO-ubrizganim embrijima ( d ). ( e i f ) ŽELJNA analiza koja pokazuje smanjene nivoe ekspresije ccnd1 u zamecima koji su ubrizgali mioblbl -MO ( f ) u usporedbi s kontrolnim embrionima ( e ) u istoj fazi razvoja. ( g i h ) Razine ABC su smanjene u oba CdLS modela, to jest čovjeku ( g ) i zebrici ( h ), u usporedbi sa specifičnim kontrolama. Zvezdica u h predstavlja P <0, 05. ( e i f ) Dorzalni pogled, lijevo s prednje strane

Slika pune veličine

Pored toga, pronašli smo prosječno smanjenje za 18% aktivnog oblika beta-katenina (ABC) 28 u bolesnika u usporedbi s kontrolama nakon normalizacije (slika 5 g, dopunska slika 5D). Isti je obrazac zabilježen kod embrija koji su ubrizgali bradavicu i MO sa statistički značajnim smanjenjem razine ABC-a od 80% (Slika 5h).

Spašavanje fenotipa nedostatka bradavice kemijskom indukcijom kanonskog Wnt puta

Kako su naši podaci sugerirali da je štetni fenotip uzrokovan obaranjem bradavice u embrionima zebre i kod pacijenata fibroblasta posredovao slabljenjem kanonskog Wnt puta s naknadnim smanjenjem ekspresije Ccnd1, pokušali smo spasiti fenotip u nipblb -loss -of - funkcioniranje embrija kemijskom indukcijom Wnt staze tretmanom litijevim kloridom (LiCl). 29 Koncentracija upotrijebljena u tri niza pokusa nije uspjela proizvesti vidljive efekte u kontrolnim embrionima (najmanje 30 po pokusu), ali je uspjela upečatljivo poništiti defekte inducirane injekcijom nipblb- MO (minimalno 30 po pokusu). Konkretno, cefalične su strukture pokazale obnovljenu morfologiju, a obrazac raspodjele wnt1 sličan je onom kontrolnih embrija (slike 6a-c). Razine apoptoze određene TUNEL-om bojanja smanjene su nakon tretmana LiCl u embrijima koji su ubrizgali bradavicu MO na razine usporedive s nivoima kontrolnih embrija (Slike 6d-f). Analiza Western blot-a kod zametaka ubrizganih bradavicom MO-om tretiranih s LiCl pokazala je da je kanonski Wnt put induciran, jer su razine ABC-a porasle za četverostruko u usporedbi s kontrolama i više od 10 puta u usporedbi s embrionima ubrizganim nipblb -MO (Slike 6g– i). Obje su razlike bile statistički značajne. Značajno je da je razina Ccnd1 proteina nakon liječenja LiCl inducirana više od 3, 7 puta u usporedbi s embrijima ubrizganim mravljinom i MO i 2, 4 puta se povećao u usporedbi s kontrolama. (Slike 6h – j).

Image

Molekularno-morfološka oštećenja u modelu zelišta ribe CdLS mogu se spasiti tretmanom LiCl. ( a - c ) Dorzalni prikaz (sprijeda s lijeve strane) ravnog montiranog embrija koji pokazuje izmijenjenu ekspresiju wnt1 u embrijima bradavice -MO-a ( b ) s višestrukim točkama fuzije (zvjezdice) u usporedbi s kontrolama ( a ) i vraćenim ekspresija wnt1 do normalnog patteringa u embrijima nipblb -MO koji su tretirani s LiCl ( c ). ( d i f ) Bočni prikaz cijelih embrija obojenih testom TUNEL pokazuje da liječenje LiCl ( f ) spašava morfološke cefaličke oštećenja i smanjuje razinu abnormalne apoptoze ( e ) obnavljajući fiziološke razine usporedive s kontrolnim embrionima ( d ). ( g - j ) Western blot analize pokazuju da su razine proteina ABC ( g - i ) i Ccnd1 ( h - j ) snažno povećane u embrijima tretiranim nipblb -MO-om, iniciranim LiCl, u usporedbi s embrionima koji su ubrizgali nipblb -MO. Kvantifikacija Western blot-a provedena je na tri (zebrafish) neovisna eksperimenta, a podaci su izraženi kao promjena nabora u embrija koji su ubrizgali bradavicu i MO-ubrizganih liCl -embriona tretiranih preko MO sa standardnim pogreškama. Zvezdice u g predstavljaju * P <0, 05 ili ** P <0, 01

Slika pune veličine

Rasprava

U ovoj su studiji korištene dvije različite strategije modeliranja za analizu abnormalnosti na kojima leže CdLS, usredotočujući se na NIPBL, koji je najčešće mutirani gen u bolesnika zahvaćenih bolešću. 1, 30 Razvojna studija in vivo na embrionima zebrice početno je korištena za identificiranje genskih putova koji mogu doprinijeti fenotipu, nakon čega je uslijedila validacijska studija u kojoj su naknadno testirane fibroblasti primarnih kultura CdLS bolesnika.

Prvo, procijenjena je ekspresija bradavice u CNS-u embrija zebre u 24 hpf, vrijeme kada je proces neuralumacije gotovo dovršen. To ublažava postojeći jaz u podacima u literaturi, jer je prethodno prijavljen obrazac izraza zečjeg bradavica u različitim razvojnim fazama. 12, 14 Rezultati su pokazali dinamički obrazac ekspresije reguliran prostorno-vremenski, sa specifičnom lokalizacijom na razini cefaličnih neuronskih tkiva. Zabilježeno je da druga paraliza bradavice zebrafis ima sličan obrazac izražavanja i funkcionira u visceralnim organima u razvoju. 14

Korištenjem MO tehnologije stvoren je model haploinsuficijencije u zamecima zebrafish. Ovaj model oponaša genetsku haploinsuficijenciju bolesnika sa CdLS-om koji imaju mutaciju u NIPBL-u. Embriji sa gubitkom funkcije pokazali su ozbiljne promjene morfologije glave, s različitim stupnjevima mikrocefalije, mikroftalmije i nepotpunim razvojem tih cefaličnih struktura.

Ovaj nepovoljni fenotip u korelaciji je s povećanom apoptozom u područjima u kojima je bradavica izrazito izražena, što sugerira da kohezini imaju važnu funkcionalnu ulogu u staničnom preživljavanju specifičnih tkiva tijekom razvoja kralježnjaka. U našem sustavu činilo se da količina širenja ne utječe. Zanimljivo je da je ekspresija raspodjele brojnih markera razvoja AP izgledala usporedivo s kontrolnim embrionima. Rasprostranjenost wnt1 , s druge strane, kod sisavaca bila je značajno oslabljena na razini stražnjeg mozga, izgledom bradavica , duguljastih oblina i mozak. Isključili smo da su promjene u ekspresiji wnt1 uzrokovane nepravilnostima u anatomiji razvojnih struktura kao atoh1 , koja ekspresija pokriva cijeli dorzalni i bočni aspekt cerebralnog anlaža, a pravilno je distribuirana u embrionima ubrizganim nipblb -MO. 31, 32 Međutim, lokalizacija wnt1 nije uspjela biti ograničena na lateralna tkiva u tim zamecima. Ovo je u skladu s prethodnim podacima koji ukazuju na prisustvo anterio-posteriornog uzorka u odsutnosti Wnt signala. 33, 34, 35

Otkriveno je da je kanonski Wnt put izmijenjen u embrijima koji su ubrizgali bradavicu i MO i u fibroblastima bolesnika. U oba slučaja ABC je bio reguliran. Ccnd1, poznati izravni cilj puta, posljedično je reguliran u oba modela. Primjetno, nenormalni cefalični fenotip primijećen u embrijima koji su ubrizgali bradavicu MO jako podsjeća na onaj koji je primijećen nakon propadanja Ccnd1.

Korištenjem LiCl kao dobro poznatog kemijskog aktivatora Wnt staze, 34, 36 koji negativno regulira inhibiciju beta katenina GSK3 β , 37 bilo je moguće spasiti štetni fenotip u zamecima koji ubrizgavaju nipblb -MO na svim razinama: anatomski cefalik strukture su izgledale morfološki normalno, programirane razine smrtnosti stanica vraćene su na fiziološke razine vidljive u kontroli, a razina proteina Ccnd1 povećana. Zanimljivo je da se pojavljivanje wnt1 uzorka spasio u zametima zebrafish bradavice -MO ubrizganim tretmanom LiCl, sugerirajući da je u našem modelu primarni štetni događaj na nivou kompleksa Gsk3 β -Beta-katenina i da kemijska kompenzacija izaziva negativnu povratnu informaciju na wnt1 kontroli ekspresije. U stvari, prijavljena je negativna povratna sprega uregulacijom Axin2 u modelu raka. 38

Naš CdLS model zebrefish sugerira ulogu za kanoničnu perturbaciju Wnt puta kod abnormalnosti CNS-a. U mišjem modelu autozomske recesivne mikrocefalije, promjene mozga uzrokovane su smanjenjem nivoa ekspresije Wntl- reguliranih gena, a prekomjerna ekspresija beta-katenina u neuronskim stanicama mogla bi spasiti oštećenja. 39 Nekoliko životinjskih modela s izmjenama ekspresije gena povezanih s Wnt pokazuje djelomično preklapanje fenotipa: otkriveno je da je poznati mutant ( mbl ) mutant, koji razvija redukciju telencefalona, ​​optičkih vezikula i abnormalno uzorkovanje AP, spontani akksin1 mutantni. 34, 35 Otada je nekoliko miša (na primjer, Hesx1 , Six3 i Tcf3 ), 40, 41, 42 i mutanti zebrafish 43, 44 opisano sa usporedivim fenotipom kod AP uzorka CNS-a tijekom embrionalnog razvoja. U ljudi je nađeno da su HESX1 i SIX3 uzročnici hipopituitarizma i septooptičke displazije, 45, 46, poremećaja u razvoju karakteriziranog teškim oštećenjima mozga i oka. Godine 1996. u prikazu slučaja opisana je obdukcija 5-godišnje bolesnice s CdLS-om koja je otkrila hipoplaziju optičkog sustava, hipotalamičkih jezgara, corpus callosum i cerebellar vermis. Štoviše, septum pellucidum, fornix i prednji proboj su bili rudimentarni. Ovaj slučaj pokazao je karakteristike septooptičke displazije u kombinaciji s kommisusnom displazijom i hipoplazijom cerebelarne vermija. 47

Poznato je da smanjena razina signala Wnt1 rezultira snižavanjem regulacije Ccndl što dovodi do apoptoze u nekoliko životinjskih modela. 48, 49, 50 Važno je napomenuti da kod sisavaca postoji djelomična nadoknada reguliranjem Ccnd2, 27 kao što je to opaženo u našem staničnom sustavu. Također je poznato da prekomjerna ekspresija GSK3 β inducira pojačanu apoptozu in vivo ometajući proliferaciju i sazrijevanje, što rezultira gubitkom nezrelih neurona. 51 Smanjenje nivoa Wnt liganda ili uklanjanje beta-katenina iz kanonične komponente puta dovodi do manje neuroepitelne / radijalne matične stanice glija i do brze diferencijacije neurona u mišjim zamecima. 52

Nadalje, pokazano je da kod mišjih modela poremećaja sličnih autizmu, najvidljiviji fenotip predstavlja porast programirane stanične smrti u moždanu u razvoju. 53, 54 U bolesnika s CdLS-om poznate su promjene u razvoju cerebelarnih struktura na anatomskim razinama, ali robusnije analize s magnetskom rezonancom mogle bi pomoći u otkrivanju veze između značajki autizma, napadaja i promijenjenog razvoja CNS-a kod ovih bolesnika.

Povećana apoptoza u našem in vivo sustavu dovela nas je do hipoteze da bi, barem do neke mjere, mentalna zaostalost i ponašanje nalik autizmu tipično povezano s bolesnicima sa CdLS-om moglo imati svoje korijene u ovoj abnormalnosti. Prijavljena obdukcija 47 pokazala je smanjenje broja Purkinje stanica u moždanu, a naši podaci mogli bi implicirati neravnotežu kontrole stanične smrti tijekom razvoja kao uzročne.

Nekoliko dokaznih materijala sugerira moguće reguliranje Wnt putanje kohezionima u nepodijeljujućim ćelijama na različitim modelima. U kožnim fibroblastima koji eksprimiraju mutirani oblik HDAC8, WNT5A , WNT2 , WISP2 i FZD8 regulirano je u usporedbi sa stanicama divljeg tipa. 6 U Drosophili, SMC3 čini se važnim za kontrolu ekspresije Flamingo / Starry night (Fmi / Stan) ortologa kralježnjaka Celsr , za koji se zna da pretvara Wnt signalnu kaskadu u nekanonski put za kontrolu polariteta stanica. 55 Zanimljivo je primijetiti da je ova regulacija možda dvosmjerna, kao što je slučaj kod kolorektalnog karcinoma, čini se da poznata regulacija beta-katenina kontrolira ekspresiju SMC3 . 56

Zaključno, ovaj je rad prvi put pokazao, prema našim saznanjima, regulaciju Wnt-kanonskog puta od strane kohezina tijekom razvoja u zečjim embrionima i u fibroblastima pacijenata sa CdLS-om. Ovo sugerira potencijalni temeljni mehanizam za razvojne abnormalnosti koje su primijećene u CNS-u bolesnika sa CdLS-om.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske tablice

  2. 2.

    Dopunske slikovne legende

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

  5. 5.

    Dopunska slika S5

Glosar

CdLS

Cornelia de Lange sindrom

Ccnd1

Ciklin D1

Ccnd2

Ciklin D2

CNS

središnji živčani sustav

AP

anterior-posterior

DV

dorzoventralno

ŽELJA

hibridizacija na cijelom mjestu

RPMI

Serum Roswell Park Memorial Institute

q-PCR

kvantitativni RT – PCR

TBST

tris-puferirana fiziološka otopina / pufer Tween 20

abeceda

aktivni oblik beta-katenina

FMI / Stan

Flamingo / Zvjezdana

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)