Kurkumin eliminira učinak naprednih produkata glikacije (dob) na divergentno reguliranje ekspresije gena receptora dobi prekidajući prekid leptinske signalizacije | laboratorijsko istraživanje

Kurkumin eliminira učinak naprednih produkata glikacije (dob) na divergentno reguliranje ekspresije gena receptora dobi prekidajući prekid leptinske signalizacije | laboratorijsko istraživanje

Anonim

teme

  • Stanična signalizacija
  • Fibroza jetre
  • Bezalkoholni steatohepatitis
  • terapija

Sažetak

Bezalkoholni steatohepatitis (NASH) je glavni faktor rizika za jetrenu fibrogenezu. NASH se često nalazi kod dijabetičara sa hiperglikemijom. Hiperglikemija inducira neenzimsku glikaciju proteina, dajući napredne krajnje proizvode glikacije (AGE). Učinci AGE-a uglavnom posreduju dvije kategorije citoplazmatskih membranskih receptora. Receptor za AGE (RAGE) povezan je s povećanim oksidativnim stresom i upalom, dok je AGE receptor-1 (AGE-R1) uključen u detoksikaciju i uklanjanje AGE-a. Aktivacija zvjezdanih stanica jetre (HSC) presudna je za razvoj jetrene fibroze. Nedavno smo izvijestili da AGE stimuliraju HSC aktivaciju vjerojatno inhibiranjem ekspresije gena AGE-R1 i induciranjem ekspresije gena RAGE u HSC, koji su eliminirani antioksidansom kurkuminom. Ova studija želi testirati našu hipotezu da kurkumin eliminira učinke AGE-a na divergentnu regulaciju dvaju receptora AGE-a u HSC prekidajući AGE-ove aktiviranje signala leptina, što dovodi do inhibicije HSC-aktivacije. Ovdje smo primijetili da AGE aktiviraju leptinsku signalizaciju inducirajući ekspresiju gena leptina i njegovog receptora u HSC. Kao i AGE, leptinska diferencirana genska ekspresija RAGE i AGE-R1. Kurkumin je eliminirao učinke AGE-a u HSC prekidajući leptinsku signalizaciju i aktivirajući faktor 2 transkripcije NF-E2 p45 (Nrf2), što dovodi do povišenja staničnog glutationa i slabljenja oksidativnog stresa. U zaključku, kurkumin je eliminirao učinke AGE-a na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC prekidajući AGE-ove aktiviranje signala leptina, što dovodi do inhibicije HSC aktivacije.

Glavni

Bezalkoholni steatohepatitis (NASH) glavni je faktor rizika za razvoj jetrene fibroze. 1 Glavne kliničke posljedice povezane s jetrom minimizirane su kod pacijenata s NASH-om ako se fibrogeneza može zaustaviti. 2, 3 NASH često se nalaze u pretilih i dijabetičara s hiperglikemijom. 4 Hiperglikemija inducira neenzimsku glikaciju proteina, dajući napredne krajnje produkte glikacije (AGE), 5 koji se ubrzavaju oksidativnim stresom. 6 Jetra nije samo mjesto za uklanjanje cirkulirajućih AGE-ova, već je i ciljni organ. 7 U bolesnika s NASH uočene su povišene razine AGE u serumu. 8 Učinci AGE-a posreduju dvije kategorije citoplazmatskih membranskih receptora. Receptor za AGE (RAGE) povezan je s povećanim oksidativnim stresom, rastom stanica i upalom. 9 Osovina AGE-RAGE-oksidativnog stresa uključena je u dijabetičke i kardiovaskularne komplikacije. 10 AGE receptor-1 (AGE-R1) uključen je u detoksikaciju i uklanjanje AGE-a. 11 Za razliku od dramatičnog porasta ekspresije RAGE-a kod dijabetičara s visokom razinom plazme AGE-a, 12, 13 obilje AGE-R1 značajno je smanjeno u bolesnika s dijabetesom. 14

NASH je zastupljen sa nakupljanjem masti i upalom u jetri i popraćen nenormalno povišenom razinom leptina u plazmi, tj. Hiperleptinemijom. 15, 16 Leptin, 16-kD protein koji potiče iz masnih kiselina, proizvod je gojaznih gena ( ob ) i uglavnom je odgovoran za kontrolu unosa hrane i regulaciju energetske ravnoteže. 17 Vezivanje leptina inducira aktiviranje njegovih receptora i signalnih kaskada, uključujući JAK 2 / STAT3 i PI3K. 17 Miševi s nedostatkom leptina ( ob / ob ) ne razvijaju jetrenu fibrozu tijekom steatohepatitisa ili kao odgovor na kronične toksične ozljede jetre. 18 Međutim, primjena fizioloških razina cirkulirajućeg leptina u miševima ob / ob ubrizgavanjem egzogenog leptina nastavlja fibrozu jetre uzrokovanu dijetalnim manipulacijama. 18 S druge strane, fibroza jetre izazvana tioacetamidom gotovo je u potpunosti umanjena kod Zuckerovih štakora. 19 Ova zapažanja snažno upućuju na to da bi leptin mogao imati permisivnu ulogu u razvoju jetrene fibroze.

Zvjezdane stanice jetre (HSC) primarni su izvor izvanstanične matrice (ECM) tijekom jetrene fibrogeneze. 20 Aktivacija mirnog HSC podvrgnuta je dubokim fenotipskim promjenama, uključujući pojačanu proliferaciju stanica, de novo ekspresiju aktina glatkog mišića ( α -SMA), prekomjernu proizvodnju ECM-a i iscrpljivanje staničnih lipida. 20 Ogromni dokazi pokazali su da leptin inducira HSC aktivaciju in vitro i in vivo . 21, 22, 23, 24 Iako je virusna fibroza povezana s NASH-om trenutno meta značajnog znanstvenog i kliničkog interesa u svijetu, vrlo je malo iskoraka došlo u terapijskoj intervenciji ove bolesti. 1 Istraživanje kojim se identificiraju nova, sigurna i djelotvorna antifibrotička sredstva stoga je najvažniji. 25 Najviše evoluirajuće antifibrotske terapije usmjerene su na inhibiciju aktivacije HSC-a. Trenutno nije dostupan učinkovit lijek za liječenje jetrene fibroze povezane s pretilošću i NASH. 26, 27 Antioksidant kurkumin, sastojak koji potječe od kurkume, je prehrambena komponenta koja obećava zaštitu jetre od fibrogenih uvreda. 28, 29 Mi i drugi smo pokazali da kurkumin inhibira aktivaciju HSC in vitro 30, 31, 32, 33, 34 i štiti jetru od fibrogeneze in vivo . 28, 35, 36, 37 Kurkumin suzbija gensku ekspresiju leptina i njegovog receptora i prekida signalizaciju leptina u HSC. 24

Nedavno smo izvijestili da AGE inhibira ekspresiju gena AGE-R1 i inducira ekspresiju gena RAGE u HSC i stimulira HSC aktivaciju. 38, 39 Kurkumin je eliminirao učinke AGE-a na divergentnu regulaciju ekspresije gena receptora. 38, 39 Dodatni su eksperimenti potrebni za rasvjetljavanje osnovnih mehanizama. Cilj ove studije bio je testirati našu hipotezu da kurkumin eliminira učinke AGE-a na indukciju ekspresije gena RAGE i suzbijanje ekspresije gena AGE-R1 u HSC prekidajući AGE-ove aktiviranje leptinske signalizacije, što dovodi do inhibicija aktivacije HSC. Uzgajanje mirovanja HSC-a na plastičnim pločicama uzrokuje spontanu aktivaciju, oponašajući postupak viđen in vivo , koji pruža dobar model za rasvjetljavanje osnovnih mehanizama aktivacije HSC-a i proučavanje potencijalne terapijske intervencije procesa.

REZULTATI

AGEs ekspresija gena leptina i receptora leptina u ovisnosti AGE-a u aktiviranom HSC in vitro

Nedavno smo izvijestili da AGE stimuliraju HSC aktivaciju, vjerojatno inhibiranjem ekspresije gena AGE-R1 i induciranjem ekspresije gena RAGE u HSC. 38, 39 Pored toga, aktiviranje HSC izazvane ekspresije gena leptina i aktiviranje njegove signalizacije, što je zauzvrat ubrzalo aktivaciju HSC. 21, 24, 44, 45 Stoga smo pretpostavili da učinci AGE-a na divergentnu regulaciju ekspresije dvaju recepcijskih gena u HSC mogu biti posredovani induciranjem ekspresije gena leptina i aktiviranjem njegovih putova transdukcije signala, što dovodi do aktiviranje HSC. Da bismo testirali pretpostavku, započeli smo procjenom učinka AGE-a na ekspresiju gena leptina i njegovog receptora Ob-Rb. Serijski izgladnjeli HSC tretirani su AGE-om u naznačenim dozama (0–200 µg / ml) u mediju koji je oštetio serum tijekom 24 sata. Naknadna kultura u serumom iscrpljenim medijima isključila je miješanje zbog faktora u FBS-u. Ukupna RNA ili cijeli stanični ekstrakti pripremljeni su za PCR ili Western blotting analize u stvarnom vremenu. Kao što je prikazano na slici 1a, AGE-ovi ovise o dozi mRNA razine leptina i Ob-Rb u pasiranom HSC-u. Daljnji eksperimenti IP i western blot analizom otkrili su da AGE povećavaju obilje leptina i Ob-R u stanicama. Rezultati su kolektivno pokazali da AGEs in vitro eksprimira gensku ekspresiju leptina i njegovog receptora Ob-R u dozi.

Image

AGEs ekspresija gena leptina i njegovog receptora Ob-R ovisno o dozi u in vitro aktiviranom HSC- u . HSC-om izgladnjele serumom liječene su AGE-ima kako je naznačeno. Pripremljeno je ukupno RNA ili cijelih staničnih ekstrakata. ( a ) PCR analize u realnom vremenu na leptin i Ob-Rb mRNA. Vrijednosti su izražene kao promjene nabora mRNA (znači ± sd) ( n = 3). * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (odgovarajući prvi stupac). ( b ) Western blot analize u imunološkom taloženom leptinu i Ob-R. Teško lanac koji nije specifično prepoznat, korišten je kao invarijska kontrola za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Gep ekspresija RAGE i AGE-R1 ovisna ovisno o dozi i diferencijalno reguliranom leptinu u aktiviranom HSC in vitro

Da bi se utvrdila uloga leptina u regulaciji ekspresije gena RAGE i AGE-R1 u HSC-u, stanice izgladnjele u serumu su tretirane leptinom u različitim dozama (0–150 ng / ml) u mediju sa oštećenim serumom tijekom 24 sata. Pripremljeno je ukupno RNA ili cijelih staničnih ekstrakata. Kao što je prikazano na slici 2a, u usporedbi s netretiranom kontrolom (odgovarajući prvi stupac), leptin ovisi o dozi i različito je mijenjao nivo mRNA RAGE i AGE-R1 u HSC povećanjem razine mRNA RAGE i smanjenjem sadržaja mRNA u AGE- R1 (odgovarajući drugi do šesti stupac). Dodatna analiza zapadne blotkture osigurala je promatranje i pokazala da leptin povećava brojnost proteina RAGE i smanjuje sadržaj AGE-R1 u HSC-u na način ovisan o dozi (Slika 2b). Uzeto zajedno, ovi podaci pokazali su da leptin ovisi o dozi i različito regulirana ekspresija gena RAGE i AGE-Rl u aktiviranom HSC in vitro .

Image

Gep ekspresija RAGE i AGE-R1 ovisno o dozi leptina i in vitro aktivirana HSC. Serijski izgladnjeli HSC tretirani su leptinom (100 ng / ml) kako je naznačeno. Pripremljeno je ukupno RNA ili cijelih staničnih ekstrakata. ( a ) PCR analize u realnom vremenu RAGE i AGE-R1 mRNA. Vrijednosti su izražene kao promjene nabora mRNA (znači ± sd) ( n = 3). * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (odgovarajući prvi stupac). ( b ) Western blot analizama RAGE i AGE-R1. P- Aktin je korišten kao invarijska kontrola za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Leptin sa nedostatkom leptina bio je neodgovarajući na starosne skupine staničnog rasta i u regulaciji ekspresije gena RAGE i AGE-R1, koje je egzogeni leptin ovisio o dozi.

Nedavno smo pokazali da AGE-ovi ovise o dozi aktiviranja HSC-a potičući rast stanica i ekspresiju profibrogenih gena. 38 Pretpostavili smo da leptin može posredovati stimulirajuće učinke AGE-a. Da bi se ispitala pretpostavka, HSC su izolirani od divljih vrsta miševa ili od miševa koji su imali nedostatak leptina. Nakon gladovanja u serumu u medijima koji su oštećeni u serumu tijekom 24 sata, oba genotipa pasiranog mišjeg HSC-a bili su prethodno obrađeni s AGE-om u naznačenim koncentracijama (0–100 µg / ml) 1 sat sa ili bez dodatka egzogenog rekombinantnog leptina u naznačenim koncentracijama dodatnih 24 h. Stanični rast određen je upotrebom MTS testova. Kao što je prikazano na slici 3a, AGE nisu pokazale utjecaj na rast stanica u ob / ob HSC (prvi do četvrti stupac). U velikom kontrastu, u prisutnosti egzogenog leptina (20 ng / ml), AGE uzrokuju povećanje doze u povećanju rasta ob / ob HSC (peti do osmi stupac). Daljnji eksperimenti na slici 3b pokazali su da su AGE uzrokovale porast staničnog rasta HSC-a od divljih miševa (prvi do četvrti bijeli stup), ali ne i HSC od ob / ob miševa (prvi do četvrti od crni stupovi). No, egzogeni leptin olakšao je stimulativnu ulogu AGE-a na 100 µg / ml i uzrokovao povećanje ovisno o dozi u oba genotipa HSC-a (peti do osmi stupac). Unatoč tome, stimulacijski učinak leptina na rast stanica u ob / ob HSC bio je značajno slabiji (crni stupovi), u usporedbi s divljim tipom HSC (bijeli stupovi). Uzeto zajedno, rezultati su pokazali da je leptin potreban faktor i da ima presudnu ulogu u procesu staničnog rasta HSC uzrokovanog AGE-om in vitro .

Image

Leptin s nedostatkom leptina bio je neodgovarajući na AGE u staničnoj fazi i u regulaciji ekspresije gena RAGE i AGE-R1, koji su egzogenim leptinom ovisili o dozi. HSC su izolirani od divljeg tipa miševa ili iz ob ( ob / ob ) miševa s nedostatkom leptina. Nakon gladovanja u serumu u medijima koji su oštećeni u serumu tijekom 24 sata, pasirani miša HSC prethodno su tretirani s AGE u naznačenim koncentracijama u trajanju od 1 sata sa ili bez dodatka egzogenog rekombinantnog leptina u naznačenim koncentracijama tijekom dodatnih 24 sata. ( a, b ) Stanični rast određen je kolorimetrijskim MTS testovima. Rezultati su izraženi kao promjene nabora u gustoći stanica. Vrijednosti su izražene kao vrijednosti ± sd ( n = 3). * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (peti stupac). ( c ) Western blot analizama RAGE i AGE-R1. P- Aktin je korišten kao invarijska kontrola za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Da bismo istražili osnovne mehanizme, pretpostavili smo da leptin kritički posreduje učinak AGE-a na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC. Da bi se ispitala pretpostavka, HSC su liječeni AGE-om u naznačenim koncentracijama (0–100 µg / ml) sa ili bez egzogenog leptina (20 ng / ml) tijekom 24 sata. Pripremljeni su cjeloviti stanični ekstrakti. Kao što je prikazano na slici 3c zapadnim blotting analizama, AGE nisu imale očit utjecaj na obilje RAGE ili AGE-R1 u ob / ob HSC (prva do četvrta jažica). Međutim, u prisutnosti egzogenog leptina na 20 ng / ml, AGE su značajno smanjili razinu AGE-R1 i povećali broj RAGE na način ovisan o dozi u ob / ob HSC (peti do osmi jažice), što sugerira nužnost leptina u procesu. Važno je napomenuti da za razliku od RAGE štakora, miš RAGE uvijek pokazuje dvije trake koje su otkrile antitijela korištena u ovom izvještaju. Zabilježeno je da RAGE ima varijantne proizvode za spajanje kod sisavaca. 46 Uzeto zajedno, ovi rezultati pokazuju da je leptin potreban AGE-ima za poticanje rasta stanica i posredovao utjecaju AGE-a na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC.

Inhibicija aktivacije JAK 2 / STAT3 ili PI3K / AKT proširila je utjecaje AGE-a ili Leptina na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC

Prethodna ispitivanja pokazala su da su JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT glavni posrednici u kaskadama transdukcije signala aktiviranim leptinom. 47, 48 Da bismo istražili ulogu signalnih putova leptina u utjecaju AGE-a na divergentnu regulaciju ekspresije gena RAGE i AGE-R1, HSC iz gladi u serumu prethodno je tretiran s AG490 (20 µM), specifičnim JAK 2 inhibitorom, ili LY294002 (20 µM ), selektivni inhibitor PI3K / AKT, 1 sat prije dodavanja leptina (100 ng / ml) ili AGE (100 µg / ml) tijekom 24 sata. Ukupna RNA ili cijeli stanični ekstrakti pripremljeni su za PCR ili Western blotting analize u stvarnom vremenu. Kao što je prikazano na slikama 4a i b, u usporedbi s netretiranom kontrolom (odgovarajući prvi stupac ili jažicu), leptin kao i AGE, kao što se očekivalo, povisili su razinu RAGE transkripta i proteina i smanjili sadržaj AGE-R1 mRNA i proteina (odgovarajući drugi ili četvrti stupac ili bunar). Bilo je primjetno da su različiti učinci leptina ili AGE-a uklonjeni od strane JAK 2 inhibitora AG490 (odgovarajući treći ili peti stupac ili jažica). Slično tome, inhibicija PI3K / AKT od strane LY294002 (LY) također je uklonila učinke leptina ili AGE-a na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 (slike 4c i d).

Image

Inhibicija aktiviranja JAK 2 / STAT3 ili PI3K / AKT ukinula je utjecaje AGE-a ili leptina na divergentnu regulaciju ekspresije gena RAGE i AGE-R1 u HSC. Serijski izgladnjeli HSC prethodno su obrađeni sa AG490 (20 µM), specifičnim JAK 2 inhibitorom, ili LY294002 (20 µM ), selektivnim inhibitorom PI3K / AKT, 1 sat prije dodavanja leptina (100 ng / ml) ili AGE (100 µg / ml) tijekom 24 sata. Ukupni RNA ili cijeli stanični ekstrakti pripremljeni su za PCR u stvarnom vremenu ili Western blotting analize RAGE ili AGE-Rl. ( a, b ) Stanice su obrađene sa AG490 i analizirane PCR ( a ) u stvarnom vremenu ili analizom Western blottinga ( b ); ( c, d ) Stanice su obrađene sa LY294002 (LY) i analizirane PCR ( c ) u stvarnom vremenu ili analizom Western blottinga ( d ). Vrijednosti u ( a, c ) su izražene kao promjene nabora mRNA (znači ± sd) ( n = 3). * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (odgovarajući prvi stupac); P <0, 05 u odnosu na stanice liječene samo leptinom (odgovarajući drugi stupac); § P <0, 05 u odnosu na stanice tretirane samo s AGE (odgovarajući peti stupac). P -Aktin je korišten kao invarijska kontrola u analizama zapadnog blotiranja za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa. ( e ). Analiza aktivnosti luciferaze HSC ko-transficirana s bijesom ili starom -r1 promotorom luciferaze reporter plazmidom pRAGE-luc ili pAGE-R1-luc i cDNA ekspresivnim plazmidom pdn-STAT3 ili pwt-STAT3, nakon čega slijedi tretman sa ili bez AGE ( 100 μg / ml) kroz 24 sata. Plazmidi pdn-STAT3 i pwt-STAT3 kodiraju dominantno negativni STAT3 i divlji STAT3. Aktivnosti luciferaze izražene su kao relativne jedinice nakon normalizacije s aktivnostima β- galaktozidaze (znači ± sd, n = 6). * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (odgovarajući prvi stupac); P <0, 05 u odnosu na stanice transficirane samo s pRAGE-luc ili pAGE-R1-luc, bez pdn-STAT3 ili pwt-STAT3 (odgovarajući drugi stupac).

Slika pune veličine

Da bi se uklonili potencijalni lažni učinci od kemijskih inhibitora korištenih u eksperimentima, provedeni su dodatni eksperimenti. HSC su kofeficirani regenerativnim plazmidom luciferaraznog regeneratora rage ili age r1 pRAGE-luc ili pAGE-R1-luc 38, 39 i plazmidom ekspresije cDNA pdn-STAT3 ili pwt-STAT3. 43 Plazmidi pdn-STAT3 i pwt-STAT3 kodiraju dn STAT3 i divlji STAT3. 43 Ukupno 4, 0 µg smjese DNA dodano je u svaku jažicu stanica u pločicama s kulturom od 6 jažica, uključujući 2 μg pRAGE-luc ili pAGE-Rl-luc, 0, 5 μg pSV-β-gal i 1, 5 μg pdn-STAT3 ili pwt-STAT3 u različitim dozama plus prazan vektor pcDNA. Potonji je korišten da se osigura jednaka količina ukupne DNK u ispitivanjima transfekcije. Nakon oporavka, stanice su gladirane u serumu 4 sata prije tretmana sa ili bez AGE-a (100 μg / ml) u mediju koji je oštetio serum tijekom dodatnih 24 sata. Kao što je prikazano na slici 4e analizama aktivnosti luciferaze, prisilna ekspresija dn STAT3 ovisno o dozi je smanjila učinke AGE-a na divergentno reguliranje promotorne aktivnosti gena RAGE i AGE-R1 u HSC (drugi do šesti stupac, u usporedbi s odgovarajućim prvim kolona). Suprotno tome, prisilna ekspresija divljeg tipa STAT3 lagano, ali ne i značajno, pojačala je učinke AGE-a na divergentnu regulaciju promotorne aktivnosti gena RAGE i AGE-R1 (sedmi stupac, u usporedbi s odgovarajućom drugom kolonom). Prisilna ekspresija dn STAT3 ili divljeg tipa STAT3, bez AGE, nije imala očigledan utjecaj na promotorsku aktivnost dvaju gena u stanicama (osmi ili deveti stupac, u usporedbi s odgovarajućim prvim stupcem). Ovi rezultati zajedno pokazuju da aktivacija JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT ima vitalnu ulogu u učincima AGE-a ili leptina na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC.

AGE-i aktivirani JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT u HSC-u, što dovodi do divergentne regulacije RAGE i AGE-R1, koju je prekinuo kurkumin

Nedavno smo izvijestili da antioksidans kurkumin eliminira učinak AGE-a na poticanje aktivacije HSC inducirajući ekspresiju gena AGE-R1 i inhibirajući ekspresiju gena RAGE u HSC. 38, 39 Temeljni mehanizmi tek trebaju biti definirani. Pretpostavili smo da su AGE aktivirali leptinsku signalizaciju i aktiviranje JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT u HSC, što je dovelo do divergentne regulacije RAGE i AGE-R1, a da je kurkumin eliminirao ove učinke AGE prekidajući aktiviranje JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT. Za početak ispitivanja pretpostavke, pasirani HSC tretirani su s JAK 2 inhibitorom AG490 u različitim dozama (0–20 μM) tijekom 24 sata. Cjeloviti stanični ekstrakti su pripremljeni za Western blotting analize. Kao što je prikazano na slici 5a, inhibicija JAK 2 AG490 smanjila je brojnost RAGE, u međuvremenu povećala sadržaj AGE-Rl na način ovisan o dozi. Rezultati su potvrdili i istaknuli vitalnu ulogu aktivacije JAK 2 / STAT3, PI3K / AKT u divergentnoj regulaciji ekspresije gena RAGE i AGE-R1 u HSC. Za testiranje naše pretpostavke, HSC izgladnjeli serumom prethodno su tretirani kurkuminom u različitim koncentracijama (0–30 µM ) 1 sat prije tretmana sa ili bez AGE-a (100 µg / ml) dodatnih 30 minuta. Pilot eksperimenti pokazali su da su AGE brzo aktivirali svoju signalizaciju u HSC i dostigli svoj vrhunac u roku od 20–30 min (neobjavljena zapažanja). Cjeloviti stanični ekstrakti su pripremljeni za Western blotting analize. Kao što je prikazano na slikama 5b-d, u usporedbi s neobrađenom kontrolom (odgovarajuće prve jažice), AGE su povisile razine fosforilacije JAK 2 (slika 5b), STAT3 (slika 5c) i PI3K (slika 5d) (odgovarajuća sekunda jažice), koje je uklonjeno kurkuminom na način ovisan o dozi (odgovarajuće treće do šeste jažice). Ovi rezultati podržavaju našu pretpostavku i pokazuju da kurkumin ukida ulogu AGE-a u aktiviranju JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT, što bi moglo dovesti do uklanjanja učinka AGE-a na divergentnu regulaciju RAGE i AGE-R1 u HSC,

Image

AGE-i aktivirali JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT u HSC-u, što vjerojatno dovodi do divergentne regulacije RAGE i AGE-R1, koju je prekinuo kurkumin. ( a ) Western blot analizom RAGE i AGE-Rl u pasiranom HSC tretiranom s AG490 u naznačenim koncentracijama tijekom 24 sata. P- Aktin je korišten kao invarijska kontrola za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa. ( b - d ). Serijski izgladnjeli HSC prethodno su tretirani kurkuminom (Cur) u naznačenim koncentracijama (0–30 μM ) 1 sat prije tretmana sa ili bez AGE (100 μg / ml) dodatnih 30 min. Cjelokupni ekstrakti pripravljeni su za zapadnu blot-analizu fosforiliranog JAK2 (p-JAK2) ( b ), fosforiliranog STAT3 (p-STAT3) ( c ), i fosforiliranog PI3K (p-PI3K) ( d ). Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa. Odgovarajuće ukupne proteine ​​korištene su kao unutarnja invariantna kontrola za jednako opterećenje.

Slika pune veličine

Kurkumin je eliminirao utjecaje leptina na diferencijalno regulirajuću ekspresiju gena RAGE i AGE-R1

Da bi se istražila uloga kurkumina u prekidu AGE-aktiviranog leptinskog signala i eliminaciji AGE-uzrokovane divergentne regulacije RAGE i AGE-R1, HSC su transfektirani s bijesnim ili age-r1 promotorom luciferaze reporter plazmidom PRAGE-luc ili PAGE-Rl-luc. Svaki plazmid sadržavao je fragment gena promotora RAGE ili AGE-Rl subkloniranog u reporter plazmidu luciferaze. 38, 39 Nakon oporavka preko noći, stanice su gladirane 4 sata u serumu i naknadno su tretirane kurkuminom (0–30 µM ) 1 sat prije tretmana sa ili bez leptina (100 ng / ml) u mediju iscrpljenom serumom tijekom dodatnih 24 sata h. Provedena su ispitivanja aktivnosti luciferaze. Kao što je prikazano na slici 6a, u usporedbi s netretiranom kontrolom (odgovarajući prvi stupac), leptin je značajno povećao aktivnost luciferaze u stanicama koje su transficirane pRAGE-luc (drugi crni stupac) i smanjio aktivnost luciferaze u stanicama koje su bile transficirane s pAGE-R1- luc (drugi bijeli stupac). Ovisno o dozi kurkumina uklanjaju se različiti učinci leptina (odgovarajući treći do šesti stup). Za daljnje istraživanje opažanja, HSC izgladnjele u serumu slično je prethodno liječen kurkuminom (0–30 μM ) 1 sat prije tretmana sa ili bez leptina (100 ng / ml) u mediju koji oštećuje serum tijekom dodatnih 24 sata. Pripremljeno je ukupno RNA ili cijelih staničnih ekstrakata. Rezultati PCR-a u stvarnom vremenu (slika 6b) i zapadnja blotiranja (slika 6c) potkrijepili su gornje promatranje na razinama transkripta i proteina. Ovi rezultati pokazuju da kurkumin eliminira utjecaj leptina na različito regulirajuću ekspresiju gena RAGE i AGE-R1 u HSC. Ukratko, rezultati na slikama 4, 5, 6 kolektivno su podržali naše pretpostavke i otkrili da su aktiviranje leptinske signalizacije i signalni put JAK 2 / STAT3, PI3K / AKT imali kritičnu ulogu u AGE uzrokovanoj divergentnom regulacijom RAGE i AGE -R1 u HSC-u. Kurkumin inhibira aktivaciju JAK 2 / STAT3 i PI3K / AKT i eliminira učinke AGE-a ili leptina na divergentnu regulaciju ekspresije gena u HSC.

Image

Kurkumin je eliminirao učinke leptina na različito regulirajuću ekspresiju gena RAGE i AGE-R1. Serijski izgladnjeli HSC tretirani su sa ili bez leptina (100 ng / ml) u prisutnosti kurkumina (Cur) u naznačenim koncentracijama u DMEM-urušenom serumu tijekom 24 sata. * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (odgovarajući prvi stupac); P <0, 05 u odnosu na stanice liječene samo leptinom (odgovarajući drugi stupac). ( a ) Analiza aktivnosti luciferaze stanica koje su prolazno transficirane plazmidom pRAGE-luc ili pAGE-R1-luc. Aktivnosti luciferaze izražene su kao relativne jedinice nakon normalizacije s aktivnostima β- galaktozidaze (znači ± sd, n ≥6). Uložak je označavao plazmide reportera luciferaze u upotrebi i primjenu leptina sa ili bez Cur-a na sustav; ( b ) PCR analize u stvarnom vremenu RAGE i AGE-R1 mRNA. Vrijednosti su izražene kao promjene nabora mRNA (znači ± sd) ( n = 3); ( c ) Western blot analizama RAGE i AGE-R1. P- Aktin je korišten kao invarijska kontrola za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Kao i Leptin, AGE inhibiraju aktivaciju Nrf2 u HSC, kojeg je ukinuo kurkumin

Ranije smo izvijestili da je oksidativni stres uzrokovan leptinom u HSC-u, koji je kurkumin ovisno o dozi. 24 Međutim, temeljni mehanizmi i dalje su u velikoj mjeri nedostižni. Aktivacija faktora transkripcije Nrf2 započinje fosforilacijom Nrf2, što dovodi do njegove translokacije u jezgru gdje se veže na elemente koji reagiraju na antioksidante / elektrofile (ARE) u promotoru ciljnih gena. 49, 50 Pretpostavili smo da AGE uzrokovana aktiviranjem leptinske signalizacije stimulira oksidativni stres, a da je kurkumin oslabio stimulativni učinak inducirajući aktivaciju Nrf2, što dovodi do uklanjanja učinka AGE-a na divergentnu regulaciju ekspresije gena RAGE i AGE-Rl. Da bismo testirali postulaciju, prvo smo trebali utvrditi mogu li AGE ili leptin inhibirati aktivaciju Nrf2 u HSC i može li kurkumin ukloniti inhibitorni učinak. Serijski izgladnjeli HSC prethodno su obrađeni kurkuminom (20 µM ) 1 sat prije dodavanja leptina (100 ng / ml) ili AGE (100 µg / ml) tijekom 24 sata. Imunofluorescentna mrlja korištena je za određivanje lokacije Nrf2 u stanicama. Kao što je prikazano na slici 7a, Nrf2 je bio ravnomjerno raspoređen i u citoplazmi i u jezgrama u netretiranom kontrolnom HSC-u. Kao i leptin, i liječenje AGE-om rezultiralo je nakupljanjem Nrf2 u citoplazmi HSC-a, što ukazuje na inhibiciju aktivacije Nrf2. Bilo je zanimljivo promatrati kako prethodna obrada kurkuminom uklanja utjecaj leptina ili AGE-a i inducira translokaciju Nrf2 u jezgre. Ova opažanja sugeriraju da poput leptina, AGE inhibira aktivaciju Nrf2 u HSC, što je eliminirano kurkuminom.

Image

AGE, poput leptina, inhibiraju aktivaciju Nrf2 u HSC, što je ukinuo kurkumin. ( a ) HSC izgladnjelog u serumu prethodno je obrađen kurkuminom (Cur) (20 μM ) 1 sat prije dodavanja leptina (100 ng / ml) ili AGE (100 μg / ml) tijekom 24 sata. Kontrolne stanice nisu primile tretman. Stanice su fiksirane sa 4% paraformaldehida za slijedeću imunostain Nrf2. Korištena je uljna leća (× 100). Prikazi imunološkog bojenja bili su predstavnici najmanje tri neovisna pokusa. ( b ) HSC je bio prolazno transfektiran plazmidom p8xARE-luc. Nakon oporavka, stanice su tretirane sa ili bez AGE-a (100 µg / ml) u prisutnosti kurkumina u naznačenim koncentracijama u DMEM-urušenom u serumu tijekom 24 sata. Provedena su ispitivanja aktivnosti luciferaze. Aktivnosti luciferaze izražene su kao relativne jedinice nakon normalizacije s aktivnostima β- galaktozidaze (znači ± sd, n ≥6). * P <0, 05 u odnosu na neobrađene kontrolne stanice (odgovarajući prvi stupac). P <0, 05 u odnosu na stanice tretirane samo s AGE (drugi stupac). Ulomak je označavao plazmid p8xARE-luc u upotrebi i primjenu AGE-a plus kurkumina (Cur) u sustav.

Slika pune veličine

Da bi se dodatno procijenio utjecaj AGE-a ili leptina sa ili bez kurkumina na aktivaciju Nrf2 u HSC-u, HSC su transfektirani s Nrf2 transaktivnom luciferaznom reporter plazmidom p8XARE-luc, koji je sadržavao osam primjeraka ARE subkloniranih u reporter plazmida luciferaze. 41 Nakon oporavka preko noći, stanice su gladirane u serumu 4 sata, a potom prethodno obrađene kurkuminom u različitim dozama (0–30 μM ) 1 sat prije dodavanja AGE (100 μg / ml), ili leptina (100 ng / ml ), dodatnih 24 h. Kao što je prikazano na slici 7b i u Dodatku 1, ispitivanjima aktivnosti luciferaze, AGE, poput leptina, značajno su smanjile aktivnosti luciferaze u stanicama (odgovarajući drugi stupac). Međutim, prethodna obrada kurkuminom ovisno o dozi ukinula je inhibitorni učinak AGE-a (ili leptina) i povećala aktivnosti luciferaze (odgovarajući treći do peti stupac). Rezultati liječenja leptinom prikazani su u Dodatku 1. Uzeto zajedno, ovi rezultati pokazuju da poput leptina, AGE inhibiraju aktivaciju Nrf2 u HSC, koji je ukinuta kurkuminom.

Prisilna ekspresija Nrf2 ili dn-Nrf2, cDNA pokazala je suprotne utjecaje na regulaciju promotorskih aktivnosti gena RAGE i AGE-R1 u HSC

Da bismo dodatno testirali našu gore navedenu postulaciju i razjasnili ulogu Nrf2 u AGE-uzrokovanoj divergentnoj regulaciji genske ekspresije RAGE i AGE-R1, pasirani HSC ko-transficirani su plazmidom pRAGE-luc, ili pAGE-R1-luc, plus plazmid ekspresije cDNA pNrf2 ili pdn-Nrf2. Plazmidi pNrf2, odnosno pdn-Nrf2, sadržavali su cjelokupnu duljinu divljeg tipa Nrf2 cDNA, ili dn Nrf2 cDNA, subkloniranu u plazmidu ekspresije cDNA. 42 Nakon oporavka preko noći, stanice su gladirane 4 sata u serumu i naknadno su tretirane sa ili bez AGE-a (100 μg / ml), ili kurkumina (20 µM ) dodatnih 24 sata. Analiza aktivnosti luciferaze provedena je u stanicama. Kao što je prikazano na slici 8a, AGE, kao što se očekivalo, značajno su aktivirali promotor bijesa pokazan povećanjem aktivnosti luciferaze u stanicama s pRAGE-luc i inhibirali promotor age-r1 prikazan smanjenjem aktivnosti luciferaze u stanicama s pAGE-R1-luc (odgovarajući drugi stupovi). Bilo je zanimljivo promatrati kako prisilna ekspresija doze Nrf2 cDNA ovisi o učinku AGE-a na divergentno reguliranje promotorne aktivnosti gena RAGE i AGE-R1 (odgovarajući treći do sedmi stupac).

Image

Prisilna ekspresija Nrf2 ili dn-Nrf2, cDNA pokazala je suprotan utjecaj na regulaciju promotorskih aktivnosti gena RAGE i AGE-R1 u HSC. Pasivne stanice kofeficirane su plazmidom izvještaja luciferaze pRAGE-luc ( a ) ili pAGE-R1-luc ( b ), i plazmidom ekspresije cDNA, pNrf2 ( a ), ili pdn-Nrf2 cDNA ( b ), u različitim dozama plus prazan vektor pcDNA. Potonji je korišten za osiguranje jednake količine cjelokupne DNA u tijeku transfekcije. Nakon oporavka, stanice su gladirane u serumu 4 sata i tretirane sa ili bez AGE-a (100 µg / ml) ( a ), ili kurkumina (Cur) (20 µM ) ( b ), u DMEM-urušenom DMEM tijekom 24 sata. Aktivnosti luciferaze analizirane su i izražene kao relativne jedinice nakon normalizacije s aktivnostima β- galaktozidaze (znači ± sd, n = 6). * P <0, 05 u odnosu na neobrađene kontrolne stanice (odgovarajući prvi stupac). P <0, 05 u odnosu na stanice tretirane s AGEs ( a ), ili samo kurkuminom (odgovarajući drugi stupac) ( b ). Inseti su označavali ko-transfekciju HSC-a s reporter plazmidom luciferaze plus plazmidom s ekspresijom cDNA.

Slika pune veličine

S druge strane, na slici 8b, za razliku od AGE-ova, kurkumin, kao što se očekivalo, značajno je smanjio aktivnost luciferaze u stanicama s pRAGE-luc i povećao aktivnost luciferaze u stanicama s pAGE-R1-luc (odgovarajući drugi stupovi). Prisilna ekspresija dn-Nrf2 cDNA, koja je sprečavala aktiviranje Nrf2, ovisno o dozi smanjila je diferencijalne učinke kurkumina na promotorsku aktivnost gena RAGE i AGE-R1 (odgovarajući treći do sedmi stupac). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da prisilna ekspresija Nrf2 ili dn-Nrf2 cDNA pokazuje suprotne učinke i različito regulira promotorsku aktivnost RAGE i AGE-R1 gena u HSC. Ukratko, rezultati na slikama 7 i 8 zajedno pokazuju da aktivacija Nrf2 ima različit utjecaj na promotorsku aktivnost gena RAGE i AGE-R1. AGE, kao i leptin inhibiraju aktivaciju Nrf2 i ARE, što dovodi do divergentne regulacije promocijske aktivnosti RAGE i AGE-R1 gena u HSC, koji su eliminirani kurkuminom.

AGE-i su smanjili brojnost GCL-a i njegove aktivnosti u HSC-u, što je dovelo do smanjenja sadržaja staničnog GSH-a, a koje je eliminirao kurkumin

GCL je ključni enzim koji ograničava brzinu u sintezi de novo GSH-a, glavnog neproteinskog tiola. 51 GSH reagira s reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) ili djeluje kao kofaktor antioksidacijskih enzima, što dovodi do slabljenja oksidacijskog stresa. Tijekom tog procesa, GSH se pretvara u oksidirani oblik (GSSG). Omjer GSH / GSSG smatra se osjetljivim pokazateljem oksidacijskog stresa. 52, 53 Veći omjer GSH / GSSH ukazuje na nižu razinu oksidacijskog stresa. Enzim GCL je heterodimer s velikom katalitičkom podjedinicom (GCLc, ∼ 73 kDa) i malom modifikacijskom podjedinicom (GCLm, ∼ 30 kDa), koji su kodirani različitim genima i disocirani u reducirajućim uvjetima. 54, 55 ARE se nalaze u genskim promotorima obje GCL podjedinice. 56, 57 Aktivacija Nrf2 ima kritičnu ulogu u regulaciji ekspresije gena GCL podjedinica. 58

Budući da su naši raniji rezultati sugerirali da AGE inhibira aktivaciju Nrf2 u HSC-u, stoga je bilo vjerovatno istražiti utjecaj AGE-a na ekspresiju GCL-a i njegovu aktivnost, te dalje odrediti razinu GSH-a i omjer GSH / GSSG-a u HSC-u. Pasirani HSC su tretirani s AGE-om u naznačenim koncentracijama tijekom 24 sata. Cjelokupni ekstrakti su pripremljeni za analizu zapadnog blotiranja GCL podjedinica i za analizu GCL aktivnosti. Kao što je prikazano na slikama 9a i b, AGE-ovi ovisni o dozi smanjuju obilje GCLc i GCLm, kao i aktivnost GCL-a u HSC-u. Da bi dodatno istražili utjecaj AGE-a na oksidativni stres u HSC-u i razjasnili ulogu kurkumina u uklanjanju učinka AGE-a i pri slabljenju oksidativnog stresa uzrokovanog AGE-om, HSC su tretirani sa ili bez AGE-a (100 µg / ml) u prisutnost kurkumina u naznačenim dozama tijekom 24 h. Kao što je prikazano na slikama 9c i d, u usporedbi s netretiranom kontrolom (odgovarajući prvi stupac), AGE su značajno povećale stanični oksidativni stres pokazan smanjenjem razine staničnog GSH (slika 9c i omjer GSH / GSSG u HSC (slika 9d) (odgovarajući drugi stupac). Doza kurkumina ovisila je o inhibicijskom učinku AGE-a. Ovi rezultati zajedno pokazuju da AGE-ovi povisuju oksidativni stres smanjenjem obilja GCL podjedinica i njegove enzimske aktivnosti u HSC-u. Potonji je oslabljen kurkuminom.

Image

AGE-i su smanjili obilje GCL-a i njegovu aktivnost u HSC-u, što je dovelo do smanjenja sadržaja staničnog GSH-a koji je eliminiran kurkuminom. ( a, b ) Pasirani HSC tretirani su s AGE-om u naznačenim koncentracijama tijekom 24 sata. Ekstrakti iz cijelih stanica pripremljeni su za analizu zapadnog blotiranja GCL podjedinica ( a ), ili za analizu GCL aktivnosti ( b ). P -Aktin je korišten u zapadnim blot analizama kao invariantna kontrola za jednako opterećenje. Predstavnici su predstavljeni iz tri neovisna pokusa. GCL aktivnosti su prikazane kao nmol / μ g proteina (srednja ± sd, n = 3). * P <0, 05 u odnosu na neobrađene kontrolne stanice (prvi stupac). ( c, d ) HSC su tretirani sa ili bez AGE (100 μg / ml) u prisutnosti kurkumina (Cur) u naznačenim dozama tijekom 24 sata. Stanični ekstrakti su pripremljeni za ispitivanja. * P <0, 05 u odnosu na neobrađenu kontrolu (prvi stupac); P <0, 05 u odnosu na stanice tretirane samo s AGE (drugi stupac). ( c ) Određivanje sadržaja staničnog GSH. Sadržaji GSH prikazani su kao nmol / μg proteina (prosjek ± sd, n = 3). ( d ) Određivanje omjera GSH u GSSG (srednja ± sd, n = 3).

Slika pune veličine

Inhibicija aktivnosti GCL-a ukinula je ulogu NAC-a i kurkumina i oponašala efekte AGE-a na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC

Daljnji eksperimenti bili su potrebni da bi se utvrdilo ima li GSH kritičnu ulogu u AGE-uzrokovanoj divergentnoj regulaciji RAGE i AGE-R1 u HSC. HSC sa izgladnjelim serumom podijeljeni su u dvije skupine. U jednoj skupini, stanice su stimulirane s AGEs (100 µg / ml), ili AGEs kurkuminom (Cur) (20 µM ), ili NAC (5 mM), u mediju koji oštećuje serum, tijekom 24 sata. Kontrolne stanice nisu primile tretman. U drugoj skupini, stanice su prethodno obrađene sa BSO (0, 25 mM) 1 sat prije dodavanja AGE (100 µg / ml), ili AGEs kurkumina (20 µM ), ili NAC (5 mM), u serumu. besplatni mediji dodatnih 24 h. Ukupna RNA ili cijeli stanični ekstrakti pripremljeni su za PCR ili zapadnu blot analizu u stvarnom vremenu. Kao što je prikazano na slici 10, u usporedbi s neobrađenom kontrolom (odgovarajući prvi stupac ili jažicu), AGE, kao što se očekivalo, značajno su inducirali gensku ekspresiju RAGE i smanjili ekspresiju gena AGE-R1 (odgovarajući drugi stupovi i jažice). Oponašajući kurkumin (odgovarajući treći stupac i jažice), NAC je očito eliminirao učinak AGE-a na divergentnu regulaciju ekspresije dvaju gena (odgovarajući četvrti stupac i jažica). Bilo je zanimljivo primijetiti da iscrpljivanje staničnog GSH inhibitorom GCL BSO ukida uloge kurkumina i NAC u uklanjanju učinaka AGE (odgovarajući šesti i sedmi stupac i jažice). Uzeto zajedno, ovi rezultati pokazuju da inhibicija aktivnosti GCL i iscrpljivanje staničnog GSH od strane BSO ukida ulogu NAC i kurkumina i oponaša efekte AGE-a na divergentnu regulaciju genske ekspresije RAGE i AGE-R1 u HSC, sugerirajući kritičnu ulogu GSH-a u tom procesu.

Image

The inhibition of the activity of GCL by BSO abolished the role of NAC and curcumin, and mimicked the effects of AGEs on the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1 in HSC. Serum-starved HSC were divided into two groups. In one group, cells were stimulated with AGEs (100 μ g/ml), or AGEs plus curcumin (Cur) (20 μ M), or NAC (5 mM), in serum-depleted media for 24 h. Control cells received no treatment. In the other group, cells were pretreated with BSO (0.25 mM) for 1 h before the addition of AGEs (100 μ g/ml), or AGEs plus curcumin (20 μ M), or NAC (5 mM), in serum-free media for additional 24 h. Total RNA or whole-cell extracts were prepared. ( a ) Real-time PCR analyses of RAGE and AGE-R1 mRNA. Values were expressed as mRNA fold changes (means±sd) ( n =3). * P <0.05 vs the untreated control (the corresponding first column); P <0.05 vs cells treated with AGEs only (the corresponding second column); § P <0.05 vs cells treated with AGEs plus curcumin, or NAC (the corresponding third or fourth column, respectively). ( b ) Western blotting analyses of RAGE and AGE-R1. β -Actin was used as an invariant control for equal loading. Representatives were presented from three independent experiments.

Slika pune veličine

RASPRAVA

We recently reported that AGEs stimulated HSC activation likely by inducing gene expression of RAGE and suppressing gene expression of AGE-R1, which were abrogated by curcumin. 38, 39 However, the underlying mechanisms remained to be defined. In this report, we demonstrated that AGEs induced gene expression of leptin, activated its signaling and elevated cellular oxidative stress in HSC, leading to the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1. Curcumin eliminated the effects of AGEs by interrupting leptin signaling, activating Nrf2, and elevating the level of cellular GSH.

AGEs are non-enzymatic adducts of proteins, lipids, and nucleic acids which form in a time-dependent manner in a pro-oxidant environment. 5 A great deal of AGEs is formed endogenously due to hyperglycemia, hyperlipidemia, and oxidative stress in diabetic patients. 59 AGEs are accumulated in tissues and circulation during liver fibrogenesis. 59 In addition, high-fat diets are another major resource of blood AGEs. 59 It bears indication that AGEs used in this report were generated in vitro system. It remains unknown to what extent these AGEs could represent 'native' AGEs created in vivo system. Although AGEs generated in vivo could be detected in AGEs formed in vitro , the extent of AGE modifications formed in vitro might be unlikely as high as those generated in vivo . 60

There is an inverse correlation between the dietary AGE content and the ratio of AGE-R1 to RAGE, leading to the increase in oxidative stress, organ damage and the short of life span. 61 AGEs interact with cells through specific receptors. 62 Among them, AGE-R1 is a scavenger receptor. 11 RAGE downregulates cellular defense mechanisms. Studies have implicated that AGEs act as causal factors in the vascular complications of diabetes, 61 and that RAGE contributes, at least in part, to the development of diabetic complications. 5 The role of AGEs and RAGE has being implied in the development of NASH-associated hepatic fibrosis. 63 On the other hand, AGE-R1 acts as a negative regulator of the inflammatory response to AGEs. 11 Blockade of AGE–RAGE signaling attenuates acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. 64 It has been suggested that inhibition of AGE formation, blockade of the AGE–RAGE interaction, and suppression of RAGE expression or its downstream pathways may be novel therapeutic strategies for the treatment of AGE-caused complications. 65 Our results revealed that curcumin showed a novel mechanism to diminish the deleterious effects of AGEs and protect HSC from activation by suppressing gene expression of RAGE and inducing gene expression of AGE-R1.

Our results suggested that the activation of key intermediators JAK 2 /STAT3 and PI3K induced by leptin or AGEs had a critical role in the AGE-caused divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1 (Figure 4). However, the rapid activation of JAK 2 /STAT3 and PI3K within 30 min by AGEs in Figures 5b–d was unlikely induced by leptin produced by HSC. It has been reported that binding AGEs to RAGE induces sustained post-receptor signaling, including activation of p21 ras, MAP kinases, and the NF- κ B pathway. 5 Whether AGE-R1 could transduce signals from AGEs remains elusive. It is plausible to assume that the interaction of AGEs and RAGE could rapidly activate JAK 2 /STAT3 and PI3K, which initiates an instant action for the induction of gene expression of leptin and its receptor, and the subsequent activation of leptin signaling, ultimately leading to the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1. This assumption is supported by our observation. The knockdown of RAGE by RAGE shRNA diminished the stimulant effect of AGEs on the activation of HSC in vitro , suggesting a critical role for the induction of rage expression in the process. 39 Additional experiments using RAGE shRNA are necessary to further test the assumption, which are being conducted in our laboratory.

The leptin receptor Ob-R is a member of the class I cytokine receptor family. Alternative splicing of Ob-R gene results in at least six transcripts designated Ob-Ra through Ob-Rf. 66 Among them, Ob-Rb contains the longest intracellular domain, which is crucial for leptin signaling. Ob-Ra, Ob-Rc, and Ob-Rd contain only short cytoplasmic domains. Ob-Rd is only found in mice, while Ob-Rf only exists in rats. In human, expression of Ob-Ra, Ob-Rb, and Ob-Rc mRNA has been reported. 67 We have shown that curcumin dose-dependently reduces the steady-state levels of mRNA of leptin and different isoforms of Ob-Rs, including Ob-Ra, Ob-Rb, and Ob-Re, in rat HSC in vitro . 24 Similar results were also observed in mice (data not published). Ob-Rb was the target in this report (Figure 1a) by using primers that only hybridized with the region of DNA encoding the intracellular domain. However, we could not exclude the possibility in our report that different receptor isoforms may have different roles in the biology of leptin.

Although underlying mechanisms remain incompletely understood, accumulating evidence has indicated that oxidative stress has critical roles in the activation of HSC. 20, 68 Oxidative stress is a deleterious imbalance between the production and removal of free radicals, including ROS. They are generated from aerobic cells by inflammation and aerobic metabolism. 52, 53 Reducing oxidative stress in mammalian cells is through several antioxidant systems, including enzymes and non-enzymatic molecules. Among them, GSH is the main non-protein thiol. The GSH/GSSG ratio is regarded as a sensitive indicator of oxidant stress. 52, 53 The interaction between AGEs and RAGE generates oxidative stress and subsequently evokes vascular inflammation, thereby having a central role in diabetic complications. 69 In this study, we demonstrated that, similar to curcumin, the elevation of the level of cellular GSH by NAC eliminated the effect of AGEs on the divergent regulation of RAGE and AGE-R1. These results also highlighted the critical role of elevated oxidative stress in the AGE-caused divergent regulation of the expression of RAGE and AGE-R1 genes, which, in turn, further induced oxidative stress in a manner of positive feedback and accelerated the activation of HSC.

We previously demonstrated that curcumin dose-dependently increased the activity of GCL in passaged HSC by inducing gene expression of both subunits of GCL. 34 However, the underlying mechanisms were elusive. In this report, we observed that curcumin stimulated the nuclear translocation of Nrf2 and elevated its transcriptional activity in HSC (Figure 7). The transcription factor Nrf2 normally forms a complex with the cytoskeleton-associated protein Keap1 in cytoplasm. 49, 70 Keap1 and Nrf2 constitute a crucial cellular sensor for oxidative stress. 49, 70 ARE is often found in the promoter of many genes and confers a general transcriptional sensitivity to oxidative stress. 50 Nrf2 is essential for the ARE-mediated induction of gene expression of antioxidative stress proteins/enzymes. Our results in this report suggested that in responding to AGEs, the inactivation of Nrf2 resulted in the suppression of gene expression of GCL subunits in HSC. The underlying mechanisms are under investigation. Studies have shown that leptin activates several downstream molecules involved in key pathways related to cell survival such as JAK 2, STAT3, PI3K, MAP kinases, AMP-activated protein kinase (AMPK), CDK5, and GSK3β. 71 Binding AGEs to RAGE induces sustained post-receptor signaling, including activation of p21 ras, MAP kinases, and the NF- κ B pathway. 5 Our preliminary data suggested that AMPK might be a key regulator in the regulation of Nrf2 activation (data not presented here). Our observations are consistent with prior reports. Phosphorylation of AMPK induces the activation of AMPK, 72 and in turn, promotes the phosphorylation of Nrf2, which triggers the translocation of Nrf2 from the cytoplasm into the nucleus, leading to its binding to ARE and the induction of expression of target genes. 50 After computer-aided analyses, no consensus ARE was found in the promoters of rodent RAGE or AGE-R1 genes (data not shown here). It suggested that Nrf2 might be indirectly involved in the divergent regulation of the expression of RAGE and AGE-R1. Although beyond the scope of the current project, additional experiments are ongoing in our laboratory.

On the basis of our observations, a simplified model is proposed to explain the mechanism of AGEs in the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1 in HSC, which is eliminated by curcumin (Figure 11). The interaction of AGEs with RAGE induces gene expressions of leptin and its receptor. The activation of leptin signaling suppresses the activity of Nrf2 and gene expression of GCL and its activity, leading to the reduction in cellular GSH and the elevation of oxidative stress. The latter facilitates the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1. The elevated abundance of RAGE shows a positive feedback mechanism and, in turn, enhances the interaction with AGEs and the subsequent events, collectively leading to the activation of HSC. Curcumin interrupts leptin signaling and blocks the occurrences of the subsequent events, resulting in the elimination of the effects of AGEs and the inhibition of HSC activation. It bears emphasis that this model does not exclude any other mechanisms involved in the effects of AGEs. In addition, we should not simply conclude that the protective roles of curcumin solely result from these mechanisms studied in this report. No single unequivocal mechanism accounts for all of versatile roles of curcumin against HSC activation. Our results provide novel mechanisms by which curcumin eliminates the effects of AGEs on the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1 in HSC in vitro . Additional experiments are necessary to explore its role in protection of the liver from hepatic fibrogenesis facilitated by hyperglycemia-associated AGEs in vivo .

Image

A simplified model of the mechanism of AGEs in the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1 in HSC, which is eliminated by curcumin. The interaction of AGEs with RAGE induces gene expressions of leptin and its receptor, leading to the activation of leptin signaling, including JAK 2 and PI3K. The latter suppresses the activity of Nrf2 and gene expression of GCL and its activity, leading to the reduction in cellular GSH and the elevation of oxidative stress. The latter facilitates the divergent regulation of gene expression of RAGE and AGE-R1. The elevated abundance of RAGE shows a positive feedback mechanism and, in turn, enhances its interaction with AGEs and the subsequent events, collectively leading to the activation of HSC. Curcumin interrupts leptin signaling and blocks the occurrences of the subsequent events, resulting in the elimination of the effects of AGEs and the inhibition of HSC activation. '↑' or '↓' indicates the effects of AGEs. ' ⊢ ' represents the inhibitory role of curcumin in the process.

Slika pune veličine

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska slikovna legenda

    Dodatne informacije pridružuju se radu na web mjestu Laboratorijska istraga (//www.laboratoryinvestigation.org)