Različiti doprinosi oksidanta amonijaka i nitritnih oksidanta nitrifikaciji u četiri neobrađena tla | časopis isme

Različiti doprinosi oksidanta amonijaka i nitritnih oksidanta nitrifikaciji u četiri neobrađena tla | časopis isme

Anonim

teme

  • Mikrobiologija tla

Sažetak

Polja sa rižom odlikuju se redovitim poplavama i gnojidbom dušikom, ali funkcionalna važnost aerobnih oksidatora amonijaka i nitritnih oksidansa pod jedinstvenim poljoprivrednim upravljanjem se slabo razumije. U ovom istraživanju izvještavamo o različitom doprinosu arheje oksidirajućeg amonijakom (AOA), bakterija (AOB) i bakterija koje oksidiraju nitrite (NOB) nitrifikaciji u četiri neobrađena tla iz različitih geografskih područja (Zi-Yang (ZY), Jiang- Du (JD), Lei-Zhou (LZ) i Jia-Xing (JX)) koji su reprezentativni za rižine ekosustave u Kini. U mikrokosmovima sa izmjenom ureje nitrifikacijska aktivnost uvelike se razlikovala s 11, 9, 9, 46, 3, 03 i 1, 43 µg NO3 -N g -1 suhe težine tla dnevno u tlima ZY, JD, LZ i JX tijekom razdoblje inkubacije od 56 dana. Kvantitativni PCR gena amoA u stvarnom vremenu i pirosekvenciranje gena 16S rRNA pokazali su značajno povećanje populacije AOA do različitih ekstenzija, što sugerira da je njihov relativni doprinos aktivnosti oksidacije amonijaka smanjen sa ZY na JD na LZ. Suprotan trend primijećen je za AOB, a tlo JX stimuliralo je samo AOB populacije. DNK sondiranje stabilnog izotopa nadalje pokazalo je da je aktivna AOA brojčano nadmašila svoje bakterijske palete za 37, 0-, 10, 5- i 1, 91 puta u 13 C-DNK tla iz ZY, JD i LZ tla, dok je AOB, ali ne AOA bio označen u JX tlu tijekom aktivne nitrifikacije. NOB su označeni u mnogo većoj mjeri od AOA i AOB, a dodavanje acetilena u potpunosti je ukinulo asimilaciju 13 CO 2 nitrifikacijskom populacijom. Filogenetska analiza sugerirala je da je arhealna oksidacija amonijakom uglavnom katalizirana AOA-om povezana s fosmidom 29i4 unutar linije tla 1.1b u zemljištu. AOB iz Nitrosospira 3 sličnog AOB izveo je većinu bakterijske oksidacije amonijakom na tlima ZY, LZ i JX, dok je većina 13 C-AOB u tlu JD bila povezana s lozom Nitrosomona communis . 13 C-NOB je u velikoj mjeri dominirao Nitrospira nego Nitrobacter . Primijećena je značajna korelacija između aktivnog omjera AOA / AOB i sposobnosti oksidacije tla, što podrazumijeva veću prednost AOA nad AOB u mikroaerofilnim uvjetima. Ovi rezultati sugeriraju važnu ulogu fiziokemijskih svojstava tla u određivanju aktivnosti oksidansa amonijaka i nitritnih oksidansa.

Uvod

Nitrifikacija je biološka oksidacija amonijaka nitratom putem nitrita središnja je komponenta globalnog dušičnog ciklusa (Galloway i sur., 2008). Unos sintetičkih dušičnih gnojiva u Kini čini više od 37% globalne potrošnje dušika s ∼ 1, 2 milijuna tona u 2012. godini, što je uglavnom bilo u obliku amonijaka (Organizacija Ujedinjenih naroda za hranu i poljoprivredu (FAO), 2014.). Ova amonijeva gnojiva moraju se oksidirati najmanje jednom prije nego što se vrate kao N 2 u atmosferu. Otpadi u poljoprivredi često su sadržavali pretjerano veliku količinu hranjivih nitrata nastalih oksidacijom amonijakom i rezultirali ozbiljnim onečišćenjem okoliša, poput onečišćenja podzemnih voda (Sebilo i sur., 2013). Također je široko prihvaćeno da je poljoprivredni ekosustav važan izvor stakleničkih plinova N2O (Yan i sur., 2003), nusproizvoda tijekom mikrobne oksidacije amonijakom (Klotz i Stein, 2008; Santoro i sur., 2011; Stieglmeier i sur., 2014). Nitrifikacija je tako dobila pozornost širom svijeta u proteklim desetljećima (Koops i sur., 2006).

Aerobna oksidacija amonijaka provodi se filogenetski različitim skupinama arheja oksidacijskih amonijakom (AOA) i bakterijama (AOB) u prvom koraku nitrifikacije koji ograničava brzinu (Könneke i sur., 2005). Mikrobna ekologija AOA i AOB često zahtijeva analizu biomarker gena amoA koji kodira aktivni položaj polipeptida amonijak monooksigenaza (Rotthauwe i sur., 1997; Francis i sur., 2005; Dam i sur., 2014), iako su temeljni mehanizmi enzimske oksidacije amonijaka nije do kraja razjašnjeno (Hyman i Arp, 1992; Liew i sur., 2014). Oksidanti za nitrit imaju ogroman ekološki značaj kao glavni izvor nitrata koji podržava primarnu biološku proizvodnju na Zemlji (Gruber i Galloway, 2008); Uz to, ovi oksidanti imaju značaj za okoliš za pročišćavanje otpadnih voda (Lücker i sur., 2010). Ekofiziološka studija bakterija koje oksidiraju nitrit (NOB) dugo je otežana nedostatkom specifičnih testova za procjenu vrlo raznolikih NOB zajednica u složenom okruženju (Freitag i sur., 2006; Sorokin i sur., 2012). Pojavom tehnika prodiranja s visokom propusnošću, NOB su nedavno dobili sve veću pažnju (Bock i Wagner, 2006; Xia i sur., 2011; Sorokin i sur., 2012).

Nitrificirajuće populacije koriste vrlo ograničen raspon supstrata, ali suživot AOA, AOB i NOB populacija dokazan je u širokom rasponu okruženja. To podrazumijeva da su ovi mikrobni cehovi mogli razviti vrlo različite stilove života radi korištenja resursa. Na primjer, postoje značajne razlike u aktivnosti oksidacije amonijaka AOB unutar rodova Nitrosospira i Nitrosomonas (Webster i sur., 2005.), a ekološki značaj AOB i AOA sintetiziran je na temelju njihove fiziološke raznolikosti (Prosser i Nicol, 2012). Nedavno istraživanje pokazalo je da AOA ima najveći afinitet supstrata identificiran za bilo koji autotrofični oksidant amonijaka, što je u skladu s kinetikom nitrifikacije in situ mjerenom u otvorenom oceanu niske hranjive tvari (Martens-Habbena i sur., 2009). Uzgoj obligate acidofilne Nitrosotalea devanaterre pružio je daljnje dokaze za izvanrednu sposobnost AOA da napreduje u tlima niskih pH (Lehtovirta-Morley i sur., 2011). Suprotno tome, sve veći broj dokaza podrazumijeva prevladavanje bakterijskih oksidansa amonijaka u okruženjima s visokom razinom amonijaka (Jia i Conrad, 2009; Xia i sur., 2011). Međutim, ekološke generalizacije populacija AOA i AOB nastale su eksperimentalnim istraživanjima fizikalno-kemijski kontrastnih okoliša (Prosser i Nicol, 2012) i mogu biti ograničene visokim razinama heterogenosti okoliša, jer niti jedan faktor ne može odrediti funkciju i prilagodbu nitrificiranja populacije u složenim prirodnim sredinama.

Polja riže jedinstveni su antropogeni vodeni ekosustav. Upravljanje poplavom brzo troši kisik ispod površine tla, pri čemu se gradijent kisika može stvoriti unutar nekoliko milimetara tanke površinske zemlje zbog difuzije atmosferskog kisika kroz poplavu vode, a u rizosferi zbog istjecanja kisika iz korijena riže. (Liesack i sur., 2000). AOA i AOB mogu se međusobno nadmetati zbog ograničene opskrbe kisikom iz mikroaerobnih niša u poljuljanom polju. Molekularne studije sugeriraju da se AOA bolje prilagođava suboksanskim / anoksičnim uvjetima neobrađenih tla, što dovodi do većeg obilja AOA u odnosu na AOB (Chen i sur., 2008; Herrmann i sur., 2009; Bannert i sur., 2011), Nadalje, poplava često dovodi do nakupljanja davalaca elektrona u organskoj tvari u tlu i uzastopnog smanjenja akceptora elektrona, poput nitrata i sulfata (Kimura, 2000). Takve promjene u fiziokemijskim svojstvima tla mogu također imati važnu ulogu u obrascima korištenja resursa populacija AOA, AOB i NOB (Ke i sur., 2013). Unatoč tome, linearna povezanost između svojstava tla i struktura zajednice ne mora nužno predstavljati funkcionalnu važnost nitrificirajuće populacije u složenom tlu (Prosser i Nicol, 2012). Stoga se ispitivanje stabilnog izotopa zasnovano na DNK (SIP) koristilo za povezivanje aktivnosti nitrifikacije s taksonomskim identitetom aktivnih mikroorganizama u četiri neobrađena tla iz različitih geografskih područja južne Kine. Također smo htjeli povezati aktivnu populaciju nitriranja sa svojstvima tla kako bismo postigli bolje razumijevanje okolišnih čimbenika koji su vjerovatno oblikovali strukturu zajednice oksidanti amonijaka i nitritnih oksidansa u neospornom ekosustavu.

Rezultati

Aktivnost nitrifikacije tla

Aktivnost nitrifikacije tla procijenjena je mjerenjem promjena koncentracije nitrata tijekom inkubacije mikrokozmosa u nedostatku acetilena, inhibitora samoubojstva autotrofne oksidacije amonijakom (Slika 2a). Gnojidba uree dovela je do postepene proizvodnje NO 3 - -N u odsutnosti C2H2 tijekom inkubacijskog tijeka od 56 dana, i nismo primijetili značajnu razliku u koncentraciji anorganskog dušika između označenih 13 CO2 i 12 CO 2 kontrolira mikrokosmose na dan 56 (dopunska slika S2). Pretpostavljajući linearnu kinetiku, aktivnost nitrifikacije neto je procijenjena kao stopa porasta koncentracije nitrata u tlu, što je pokazalo trend pada od ZY do JD do LZ i konačno do JX, s ∼ 11, 9, 9, 46, 3, 03 i 1, 43 µg NO 3 - -N g −1 dws dnevno. Tome je pridonio i rastući trend koncentracije amonija u tlu, s ∼ 119, 243, 600 i 706 µg NH 4 + -N g -1 -1 dws za tla ZY, JD, LZ i JX (dopunska slika S2), Dodavanje C2H2 u potpunosti inhibira proizvodnju nitrata u svim tlima testiranim tijekom 56-dnevnog razdoblja inkubacije. Uspravne usporedbe između mikrokosmova tla izmijenjenih sa i bez C2H2 pokazale su da je potrošnja amonijaka u tlu iz hidrolize uree oporavljena u gotovo stehiometrijskoj količini na osnovi nitrata proizvedenog u svim tlima testiranim u 56-dnevnom tečaju inkubacije (Dodatna slika S2).

Image

Promjena aktivnosti nitrifikacije i zajedničke strukture oksidatora amonijaka i nitritnih oksidatora u mikrokosmovima tla tijekom inkubacijskog razdoblja od 56 dana. AOA, AOB i NOB predstavljaju arheje koje oksidiraju amonijak, bakterije i bakterije koje oksiduju nitrit u ukupnom DNK ekstraktu iz mikrokozmosa. Proizvodnja nitrata u tlu ( a ) analizirana je za procjenu aktivnosti nitrifikacije u mikroskosima tla inkubiranim s 12 CO 2, 13 CO 2 ili 13 CO 2 + C 2 H2 tijekom 56 dana. Broj kopija gena amoA od AOA ( b ) i AOB ( c ) određen je korištenjem kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu. Pirosekcioniranje je provedeno na razini ukupne mikrobne zajednice u SIP mikrokosmosima korištenjem univerzalnog para prajmera 515F-907R, a relativno obilje AOA ( d ), AOB ( e ) i NOB ( f ) izraženo je kao omjer ciljanih 16S rRNA gen čita na ukupni mikrobni 16S rRNA gen očitava u svakom mikrokozmosu. Svaki mikrokosmos tla primao je 100 μg ureje-N g -1-1 dws na tjednoj osnovi. 56. dan označava mikrokosmos tla koji se inkubirao 56 dana. 13 CO 2 + C2H2 predstavlja mikrokosmove tla inkubirane s 13 CO2 u prisutnosti inhibitora nitrifikacije acetilena (C2H2). Oznake pored osi x predstavljaju mjesta uzorkovanja tla nejasnih polja kao što je prikazano na slici 1. Svi tretmani provedeni su u trostrukim mikrokozmosima. Trake pogrešaka predstavljaju standardne pogreške srednje trostruke mikrokozmose. Različita slova iznad stupaca pokazuju značajnu razliku ( P <0, 05) na temelju analize varijance.

Slika pune veličine

Veličina populacije i sastav zajednica koje nitriraju tlo

Veličine populacije AOA i AOB određene su korištenjem kvantitativnog PCR amoA gena u mikrokozmosu u dane 0 i 56 (slike 2b i c). U nedostatku C2H2 , broj kopija arhealnih amoA gena porastao je za 12, 4-, 2, 67- i 1, 83 puta u mikrokozmosu tla ZY, JD i LZ na dan 56 nakon dodavanja uree na dan 0; konkretno, broj kopija povećao se s 1, 4 × 10 7 na 1, 7 × 10 8, 3, 3 × 10 8 na 8, 8 × 10 8 i 4, 0 × 10 7 na 7, 3 × 10 7 g -1 ds (slika 2b). Međutim, broj primjeraka smanjio se sa 7, 0 × 10 6 na 5, 1 × 10 6 u tlu JX. Kopije bakterijskih gena amoA značajno su porasle s 2, 2 × 10 6, 5, 3 × 10 7, 5, 5 × 10 5 i 8, 4 × 10 6 g -1 dws na dan 0 do 1, 6 × 10 7, 3, 0 × 10 8, 8, 2 × 10 6 i 2, 0 × 10 7 g −1 dws na dan 56. na tlima ZY, JD, LZ i JX, što predstavlja 7, 2-, 5, 66-, 14, 8- i 2, 38 puta veće (Slika2c). Dodatak C2H2 u potpunosti je ukinuo porast obilja gena amoA i u populaciji AOA i AOB u sva četiri tla.

Pirokvenciranje gena 16S rRNA izvršeno je na razini čitave mikrobne zajednice u SIP mikrokozmosu četiri tla nakon inkubacije za 0 i 56 dana. Dobiveno je oko 450 000 visokokvalitetnih čitanja 16S rRNA, a ciljana čitanja iz pretpostavljenih AOA, AOB i NOB nizova su odabrana za naknadnu analizu (Dodatna tablica S2). Relativno obilje AOA općenito je bilo veće od onog AOB u svim tlima testiranim na dan 0, dok se činilo da je populacija AOB stimulirana u većoj mjeri od AOA populacije nakon inkubacije 56 dana. Relativno obilje AOA poraslo je s 0, 88 ‰, 1, 60 ‰ i 0, 69 day na dan 0 do 12, 4 ‰, 5, 05 ‰ i 1, 64 ‰ na tlima ZY, JD i LZ na 56. dan, što predstavlja porast od 14, 0, 3, 15 i 2, 38 puta, odnosno (slika 2d). Sličan trend zabilježen je za relativno obilno AOB, koje je nakon inkubacije mikrokozmosa 56 dana poraslo za 22, 5 puta (ZY), 4, 92 puta (JD) i 138 puta (LZ) (Slika 2e). Populacija NOB-a također je snažno stimulirana 83, 0-, 4, 01- i 1, 83-puta više puta na tlima ZY, JD i LZ (Slika 2f). Međutim, u JX tlu su i AOA i NOB pokazali neznatne opadanja, iako je zabilježen porast AOB od 2, 26 puta nakon inkubacije za 56 dana.

Provedeno je pirokvenciranje amoA gena u ukupnim DNK ekstraktima iz 13 C i obilježenih mikrokozmosa u danima 0 i 56. Ukupni broj visokokvalitetnih očitavanja amoA bio je - 280 000 i 182 000 za AOA odnosno AOB (dopunska tablica S2). Filogenija gena amoA bila je u velikoj mjeri u skladu s 16S rRNA genima za oba AOA (dopunska slika S3) i AOB (dopunska slika S4). Većina arhealnih očitavanja amoA razvrstana je u liniju tla 1.1b skupine tla, uključujući devet različitih OTU-ova unutar četiri klastera: klaster tla fosmid 29i4, grozd povezan sa 29i4, grozd fosmida tla 54d9 i grozd Nitrososphaera viennensis (dopunska slika S3a). Filogenetska analiza arhealnih 16S rRNA gena nadalje je otkrila prisutnost termofilnih sekvenci sličnih AOA, ali nije bilo očitavanja moguće dodijeliti grupi fosmida tla 54d9 tla (dopunska slika S3b). Što se tiče AOB, filogenetska analiza gena amoA i gena 16S rRNA pokazala je visoku sličnost srodnika s članovima unutar klastera Nitrosomonas communis i klastera Nitrosospira 0 i 3 (Dodatna slika S4). Bakterijski amoA geni grupirani su u sedam OTU (dopunska slika S4a), što je u skladu s analizom gena 16S rRNA (dopunska slika S4b). U odnosu na NOB, sve sekvence gena 16S rRNA spadale su isključivo u rod Nitrospira i Nitrobacter (dopunska slika S5). OTU-1 nalik Nitrospira moscoviensis dominirao je u populaciji nitritnih oksidatora. Klaster Nitrospira defluvii bio je sastavljen od tri jedinstvene OTU, dok su dvije OTU povezane s marinom Nitrospira . U okviru klastera Nitrobacter hamburgensis postojao je samo jedan jedinstveni OTU-7 (dopunska slika S5).

SIP aktivnih nitrirajućih zajednica

Izvedena je izopikna centrifugacija ukupnog DNK ekstrakta da bi se odvojila 13 C obilježena DNK iz 12 C matične DNK u četiri neobrađena tla nakon inkubacije 56 dana (Slika 1). Kvantitativni PCR gena amoA u stvarnom vremenu u frakcioniranoj DNK pokazao je snažno obilježavanje populacija AOA na tlima ZY i JD i snažno obilježavanje AOB populacija na sva četiri testirana tla (Slika 3). U mikrokosmovima SIP kontrola ( 12 CO 2 i 13 CO 2 + C 2 H 2 ), najveći broj amoA kopija i AOA i AOB detektiran je u 'svjetlosnim' frakcijama tipičnim za neobilježenu DNK, uz gustu gustoću od 20 1.720 g ml −1 . Međutim, u mikrokozmosima označenim sa 13 CO 2, arhealni geni amoA u tlima ZY i JD dosegli su "teške" frakcije DNK, uz gustinu plovnosti od 40 1.740 g ml −1, što sugerira da je genom populacija AOA označen i zaustavio se tijekom izopikanske ultracentrifugiranja cjelokupnog ekstrakta DNK (Slike 3a i c). U mikrokozmosima označenim sa 13 CO2 na tlu LZ, mala količina arhealnih amoA gena otkrivena je u 'teškoj' frakciji (slika 3e), dok u JX tlu nije primijećen vidljivi vrh arhealnih amoA gena (slika 3g). Suprotno tome, većina bakterijskih amoA gena može se naći u 'teškim' frakcijama DNK sva četiri testirana tla. Najveći broj kopija bakterijskih gena amoA zabilježen je u 'teškim' frakcijama, s plovnom gustoćom od 1.730-1.735 g ml -1 na tlima ZY i JD (slike 3b i d), dok su se vrhovi pojavljivali u težim frakcijama 1, 740 g ml -1 za tla LZ i JX (slike 3f i h). Obilježavanje amoA gena nije opaženo kod SIP mikrokozmosa izmjenjenih s 13 CO 2 + C 2 H2, što sugerira da je asimilacija 13 CO 2 s AOA i AOB ovisila o oksidaciji amonijaka u ovoj studiji (Slika 3). Pirokvanziranje gena 16S rRNA na razini čitave mikrobne zajednice dodatno je pokazalo značajno obogaćivanje AOA, AOB i NOB, čineći do 30, 0%, 36, 0% i 58, 1% ukupnih mikrobnih zajednica u 'teškim' frakcijama DNA ( Dopunska tablica S3). To nije primijećeno u SIP kontrolnim mikrokosmovima (dopunska tablica S3), što sugerira kemolitoautotrofni način života aktivnih nitrifikatora koji se testiraju (dopunski rezultati).

Image

Kvantitativna raspodjela arhealnih i bakterijskih gena amoA kroz čitav gradijent bujnog gustoće DNK frakcija iz mikrokozmosa tla inkubirane s 12 CO 2, 13 CO 2 ili 13 CO 2 + C 2 H2 tijekom 56 dana. Normalizirani podaci predstavljaju omjere broja kopija gena u svakoj DNK frakciji i zbroja amoA gena kroz cijeli gradijent DNK frakcija za svaki tretman. Osjenjeno područje označava aktivne frakcije ( 13 C označene) iz označenih mikrokozmosa. Aktivna frakcija za 13 C-AOA pokazala je uski raspon plovne gustoće od 1.735 do 1.745 mg 1-1 za tla ZY, JD i LZ. Zabilježeni su 13 C-AOB u aktivnim frakcijama s gustoćom plivanja DNA od 1.730 do 1.745 mg l -1 za ZY i JD, a od 1.735 do 1.745 mg l -1 za tla LZ i JX. Trake pogrešaka predstavljaju standardne pogreške trostrukih mikrokozmosa, a svaka sadrži tri tehničke replike. Sve ostale oznake iste su kao one na slikama 1 i 2.

Slika pune veličine

Biblioteke klona izgrađene su iz 13 C- amoA gena za filogenetsku analizu (slika 4a). Klasteri 29i4 sadržavali su 95%, 60% i 80% od 13 arheoloških klonova s amoA označenim u C na tlima ZY, JD i LZ (Tablica 2). Otprilike 20% obilježenih gena arheološkog amoA u tlu JD palo je u klaster povezan sa 29i4. Pored toga, 5%, 20% i 20% obilježenih gena arheološkog amoA u tlima ZY, JD i LZ mogu se dodijeliti grupi N. viennensis (tablica 2). Slični rezultati dobiveni su za 13 C-obilježene 16S rRNA gene (Slika 4b). U arhealnim zajednicama prednjačili su članovi unutar klastera 29i4, koji su činili 94, 3%, 71, 6% i 64, 0% 13S-rNNA gena označenih 16S u tlima ZY, JD i LZ. Nadalje, 21, 8% i 36, 0% obilježenih gena 16S rRNA pokazali su veliku sličnost s AOA u nizu N. viennensis u tlima JD i LZ (tablica 2).

Image

Filogenetska analiza amoA ( a ) i 16S rRNA gena ( b ) AOA u 13 C-označenoj DNK iz 13 CO2-mikrokozmi obrađenih nakon razdoblja inkubacije od 56 dana. Oznaka 'HF' označava 13 C-DNA u aktivnoj frakciji nakon ultracentrifugiranja ukupnog DNK ekstrakta s obilježenog mikrokosmosa. Oznaka 'ZY-454-AOA-16S rRNA-HF-OTU-1-149- (5, 28%)' ukazuje da OTU-1 sadrži 149 čitanja s> 97% sličnosti sekvence, što čini 5, 28% ukupne arhealne AOA 16S rRNA gen očitava u 13 C-DNA iz mikrokozmosa tla ZY. Normalizacija podataka za svaku OTU provedena je slučajnom ekstrakcijom 5000 čitanja gena 16S rRNA za analizu. Odabran je jedan reprezentativni niz iz svakog OTU-a pomoću softvera mothur za izgradnju stabala. Nizovi dobiveni na različitim neravnim tlima su označeni simbolima boja za ZY (

Image
), J D (
Image
) i LZ (
Image
). Sekvence organizama za koje su poznate sekvence gena 16S rRNA i amoA , prikazane su sivo. ZY-rRNA-OTU-1 doista je pokazao sličnu sekvencu kulturi obogaćivanja fosmid 29i4 roda (označen plavom bojom), od čega amoA kolega još uvijek nedostaje (Alves i sur., 2013). Vrijednosti početnog podizanja veće od 50% naznačene su na čvorovima grane. Stupci skale predstavljaju 2% i 5% odstupanja nukleinskih kiselina za 16S rRNA i amoA gene. Sve ostale oznake iste su kao one na slikama 1 i 2.

Slika pune veličine

Tablica pune veličine

Što se tiče aktivnog AOB (dopunska slika S6a), 95%, 50%, 100% i 50% od 13 bakterijskih amoA gena obilježenih C- om bili su filogenetski usko povezani sa skupom Nitrosospira 3 u tlima ZY, JD, LZ i JX. (Tablica 2). Nitrosomonas communis AOB sadržavao je 50% od 13 amoA gena obilježenih C u tlu JD, dok je 50% 13 bakterijskih gena s amoA obilježenim C C bilo povezano s Nitrosospira klasterom 0 u tlu JX. Slični rezultati opaženi su za 13 C-obilježene 16S rRNA gene (dopunska slika S6b). Na primjer, .4 91, 4%, 38, 2%, 100% i 55, 4% gena od 13 C-16S rRNA može se dodijeliti grupi Nitrosospira 3 u tlima ZY, JD, LZ i JX (tablica 2). U međuvremenu, grozd Nitrosomonas communis sadržavao je 61, 8% 13 A-označenih AOB u tlu JD, dok je 43, 6% aktivnog AOB-a grupirano u skupinu Nitrosospira 0 u tlu JX. 13 C-označeni 16S rRNA geni nitritnih oksidansa bili su povezani s poznatim NOB-om (dopunska slika S7) i prednjačili su Nitrospira - umjesto NOB-a slični NOB (tablica 2).

Usklađivanje svojstava tla s amonijačnim oksidantima i nitritnim oksidansima

Potencijalni odnos između oksidacije amonijaka i svojstava tla pod in situ uvjetima (dan 0) izveden je neograničenom (BIO-ENV) (Clarke i Ainsworth, 1993) i ograničenom (CCA) multivarijantnom analizom. Neobrađena tla bila su blago kisela do umjereno lužnata, u rasponu od pH 6, 08 u JX tlu do pH 8, 28 u zemljištu ZY (tablica 1). OXC je porastao iz ZY (7, 40 mmol kg -1 ) u JD (9, 21 mmol kg -1 ) na LZ (19, 9 mmol kg -1 ) i konačno na JX (27, 3 mol kg -1 ). Tla LZ i JX sadržavala su znatno niži SOM od tla ZY i JD. Nadalje, dvomjesečno plavljenje sirovog tla u laboratoriju pokazalo je da su kumulativne koncentracije kisika u tlima na tlima ZY (19, 2 µg l- 1 ) i JD (20, 5 µg l −1 ) značajno niže od vrijednosti LZ (128 µg l -1 i JX (183 µg l − 1 ) tla (slika 5a).

Image

Okomiti profili koncentracija kisika u poplavljenim rižinim tlima ( a ) i kanonička korelacijska analiza biplota ( b ) između oksidansa amonijaka i fiziokemijskih karakteristika četiri neobrađena tla u polju. Koncentracija kisika u tlu mjerena je s neiskusnim kisikovim mikroelektrodom (± se, n = 3). Filotipi oksidansa amonijaka grupirani su na osnovi sekvence gena amoA , a postoci varijance distribucije filotipa koji se mogu objasniti s dvije glavne kanonske osi prikazani su u zagradama u blizini osi. Filotični udio (PR) oksidansa amonijaka normaliziran je na temelju veličine populacije AOA i AOB u mikrokosmovima tla pomoću jednadžbe PR = r × A / ( A + B ), gdje A i B označavaju veličinu populacije AOA i AOB, odnosno na temelju broja kopija gena amoA u tlu (dws), a gdje ' r ' označava relativno obilje filotipa u populaciji AOA ili AOB kako je otkriveno piroakvizacijom gena amoA . Oznake A1 – A9 odnose se na filotipove AOA, dok B1 – B7 označava filotipove AOB kao što je prikazano na dodatnoj slici S9. Aktivni AOA i AOB u 13 C-DNA označeni su crvenim i zelenim trokutima, respektivno. Uvjetne varijable predstavljene su crnim strelicama. Kratice OM, OXC i TN predstavljaju organsku tvar tla, oksidacijski kapacitet i ukupni dušik. Sve ostale oznake iste su kao i one na slici 2.

Slika pune veličine

BIO-ENV analiza pokazala je najbolje korelacije OXC, pH, NO3 -, SOM i TN s populacijom oksidanta amonijaka u in situ uvjetima na osnovi filogenije gena amoA (Dopunska tablica S5). CCA analiza je također pokazala da kombinacija ovih svojstava tla objašnjava najveći postotak varijance (Slika 5b). Prvu CCA os predstavljen je TN ( r = -0, 86, P <0, 05) i NO3 - ( r = -0, 85, P <0, 01) i mogao je objasniti 47, 2% razlike u filotipovima oksidanta amonijaka u in situ uvjetima. Druga CCA os pokazala je OXC ( r = 0, 95, P <0, 01), pH ( r = −0, 66, P <0, 05) i SOM ( r = −0, 72, P <0, 01), i objasnila je 37, 6% ove varijance, Aktivni oksidanti amonijaka bili su usko povezani s pH, OM i OXC zajedno s CCA osi 2 (slika 5b). Na primjer, 13 OTU označene sa C, 1, 3 i 4 populacije AOA povezane su s blago alkalnim pH tla, SOM i niskim OXC tla. Za razliku od toga, 13 A-obilježeni AOB filotipi OTU-2 i OTU-5 pokazali su blisku povezanost s niskim pH tlaka i SOM-om, pored visokog OXC-a tla, dok je OTU-7 bio usko povezan s visokim SOM (Dopunski Tablica S6).

Rasprava

Više od 50% svjetske populacije hrani se rižom, a najveći dio se uzgaja u vodenim uvjetima i intenzivnim režimima gnojidbe. To nameće dvostruke pritiske selekcije populaciji nitrificirajuće populacije, jer kisik i amonijak služe kao glavni spojevi koji stvaraju energiju za oksidante amonijaka i nitrita. Naši rezultati pružaju uvjerljive dokaze o funkcionalnoj važnosti AOA, AOB i NOB tijekom aktivne nitrifikacije u sirovom tlu. Arhealni doprinosi smanjili su se sa ZY na JD na LZ, dok je AOB bio jedini odgovoran za oksidaciju amonijaka u tlu JX. Statistička analiza nadalje je pokazala značajan odnos omjera 13 C-AOA / AOB i OXC.

DNA-SIP u potpunosti se oslanja na staničnu proliferaciju, a 13 asimilacija CO 2 u AOA i AOB stanicama ovisi isključivo o energiji dobivenoj oksidacijom amonijaka (slika 3). Omjer AOA / AOB u 13 C-DNK tako može u velikoj mjeri predstavljati relativni značaj AOA i AOB tijekom aktivne nitrifikacije tla. Kvantitativna analiza gena amoA otkrila je da su omjeri AOA / AOB u DN-u s oznakom 13 C bili 37, 0, 10, 5 i 1, 91 u tlima ZY, JD i LZ, dok je AOB isključivo otkriven u tlu JX (Dodatna tablica S4 ) .To je dodatno podržano piroakvizacijom 13 C-DNA ukupnih mikrobnih zajednica (dopunska tablica S3), koji su pokazali slične obrasce odnosa gena AOA / AOB 16S rRNA od 6, 25, 1, 40 i 0, 12 u tlima ZY, JD i LZ, respektivno. Ovi rezultati pokazali su važnu ulogu za arhealnu oksidaciju amonijaka u tlu ZY. Zapravo, pod pretpostavkom da je stvaranje nitrata iz tla rezultat isključivo bakterijske oksidacije amonijakom, promatrana proizvodnja nitrata iz ZY tla trebala bi potrebnu stopu specifičnu AOB do 131, 1 fmol N po ćeliji h −1 (dopunska tablica S4), što daleko premašuje do sada identificiranu najveću stopu kod bilo kojeg poznatog oksidanta amonijaka (Koops i sur., 2006). Unatoč tome, označavanje AOA i AOB ovisi o asimilaciji 13 CO 2 u ovoj studiji, a odnos između fiksacije CO 2 i oksidacije amonijaka je slabo razumljiv. Nedavna studija pokazala je da AOA ima energetski najučinkovitiji put fiksacije CO 2 (Könneke i sur., 2014.), sugerirajući da se molni omjer oksidacije NH3 i ugradnje C uvelike razlikuje među vrstama AOA i AOB (Belser, 1984 .; Feliatra i Bianchi, 1993). Također je važno da je učinkovitost unosa ugljika i dušika pomoću AOA iz hidrolize uree ostala nejasna (Alonso-Sáez i sur., 2012; Lu i Jia, 2013), iako su u ovoj studiji otkriveni sumnjivi arhealni ureC geni (Dodatna slika S8).

Rezultati ove studije pokazali su dominantnu ulogu AOA u blago alkalnom tlu. Globalno ispitivanje sugerira široku prisutnost i veliko obilje članova AOA unutar grupe tla 1.1b u nekiseljivom tlu (Bates i sur., 2011). Metaanalize arhealnih amoA gena na globalnoj, regionalnoj i lokalnoj ljestvici snažno su sugerirale bolju prilagodbu ove AOA skupine na relativno veće vrijednosti pH (Gubry-Rangin i sur., 2011; Hu i sur., 2013), ali njezina je funkcija ostala neuhvatljivo u složenom okruženju tla (Schleper i Nicol, 2010). Naši rezultati pokazali su najveće obilježavanje AOA u tlu ZY s pH vrijednošću čak 8, 23, što sugerira očigledno nadmetanje AOA-e nad AOB. ZY tla u ovoj studiji imala su koncentraciju amonijaka od 368 μM u in situ uvjetima. Gnojenje tla na tjednoj osnovi moglo bi dodatno poboljšati sadržaj amonijaka u tlu tijekom razdoblja inkubacije (dopunska slika S2), što ukazuje na širu specifičnost supstrata AOA nego što se prije mislilo (Verhamme i sur., 2011). Pored toga, važno je napomenuti da je aktivni AOA dobro pao unutar novo predložene loze 29i4, čija je reprezentativna kultura nedavno izolirana iz arktičkog tla pri niskim temperaturama (Alves i sur., 2013). Brz rast AOA dogodio se na 28 ° C na tlima ZY i JD, koji su bili u velikoj mjeri slični uvjetima na terenu u vrijeme uzorkovanja tla. To sugerira da niske temperature arktičkih područja ne mogu biti jedini faktor koji određuje strukturu i aktivnost ove nesuvisle vrste AOA. Tlo tundra fenova zaista je pronađeno u poplavnim uvjetima, a statističke analize sugeriraju da vlaga tla ima važnu ulogu u odabiru ove AOA skupine na arktičkom tlu (Alves i sur., 2013).

U sustavima zamrznutog riže, OXC tla može u velikoj mjeri predstavljati redox potencijal i može imati važnu ulogu u oblikovanju strukture AOA i AOB. Poplave su dovele do brzog iscrpljivanja kisika i stvorile su različite vertikalne profile koncentracija kisika na četiri tla (Slika 5a). Uzastopno smanjivanje alternativnih akceptora elektrona došlo je nakon iscrpljivanja kisika (Thauer i sur., 1977). Tla ZY i JD pokazala su mnogo niže vrijednosti OXC (tablica 1) i niže koncentracije kisika od tla LZ i JX. Osim toga, SOM se često smatra reducirajućim agensom (Liesack i sur., 2000) i može se značajno poboljšati pod dugoročnim upravljanjem poplavama (Kalbitz i sur., 2013). Zanimljivo je da je SOM bio gotovo dva puta veći na tlima ZY i JD nego na tlima LZ i JX (tablica 1), što je bilo u skladu s uzorcima tla OXC i kisika u zemlji. U kombinaciji, ovi rezultati sugeriraju da se aktivni pripadnici AOA unutar roda 29i4 mogu bolje prilagoditi mikroaerofilnom okruženju pod relativno smanjenim uvjetima. Na primjer, najveće obilježavanje AOA zabilježeno je na tlu ZY koje je bilo poplavljeno tijekom padajućeg godišnjeg doba (Dodatna tablica S3), što ga čini sličnim uvjetima zamrznutosti tundrenih ispušnih zraka u polju (Alves i sur., 2013). Genska analiza sugerira da se put oksidacije amonijaka AOA može razlikovati od AOB, što zahtijeva samo 0, 5 O2 po molekuli oksidiranog NH3 (Walker i sur., 2010). Studije sa šaržnom kulturom doista su pokazale izuzetno visok afinitet kisika u AOA izolatima iz morskog (Martens-Habbena i sur., 2009) i zemljinog okruženja (Kim i sur., 2012). To je dodatno potkrijepljeno nedavnim nalazima da je AOA tolerantnija prema uvjetima s niskim kisikom od AOB u čistim kulturama (French et al., 2012) i terenskim istraživanjima (Pett-Ridge i sur., 2013).

Bez prethodnog znanja o mikroorganizmima koji su aktivno uključeni u oksidaciju nitrita, visokopropusno piroviziranje ukupnih 16S rRNA gena u 13 C-DNA osiguralo je gotovo nepristrasnu strategiju profiliranja za identifikaciju aktivnog NOB-a na neviđenoj razini pokrivenosti (Dodatna tablica S3), NOB su označeni u znatno većoj mjeri od AOA i AOB (Dodatna tablica S3). To se može objasniti većom stopom rasta i bržim prometom NOB-a od oksidanti amonijaka pod uvjetima bogatim supstratima (Morrill i Dawson, 1962), što je dovelo do veće ugradnje 13 C u NOB genome. Međutim, filogenetski različite NOB vrste u neolušćenom tlu označene su različito, što sugerira da imaju različite doprinose oksidaciji nitrita (Tablica 2). Nitrospira- slične sekvence otkrivene su isključivo u LZ zemljištu i pretežno su prevladavale u NOB populacijama u 13 C-obilježenih DNK četiri neobrađena tla testirana u ovom istraživanju (Tablica 2). Suprotno tome, najveća relativna brojnost nizova sličnih Nitrobacteru činila je samo do 11, 8% aktivnih populacija NOB-a u sirovom tlu JD, što je značajno niže vrijednosti od 41, 0% u uzvisinskom alkalnom tlu (Xia i sur., 2011). To je podrazumijevalo jaču konkurentsku prednost Nitrospira- sličnog NOB-a u sirovim tlima nego u planinskom tlu, što bi se moglo pripisati boljoj prilagodbi prvog na niske koncentracije nitrita i kisika u usporedbi s drugim (Schramm et al., 1999, 2000; Lücker i sur., 2010). Na primjer, Nitrospira moscoviensis pokazao je optimalan rast pri niskoj koncentraciji nitrita 0, 35 mmol l -1 (Ehrich i sur., 1995.), a potpuna inhibicija novih morskih bakterija nalik Nitrospira opažena je s koncentracijom nitrita od samo 1, 5 mmol l -1 (Off i sur., 2010). Nadalje, vjerojatno je da je većina Nitrobactera rasla na organskom ugljiku (Daims i sur., 2001), te se ne može označiti sa 13 CO2 u ovoj studiji (Tablica 2). To može objasniti naizgled malu raznolikost aktivnog NOB-a (Dopunska slika S4). Uzgoj ekološki reprezentativnog NOB-a pomogao bi boljem razumijevanju funkcionalne kinetike i populacijske ekologije nitritnih oksidansa u složenom tlu.

Rezultati ove studije mogu u velikoj mjeri odražavati funkcionalni proces nitrifikacije u terenskim uvjetima, iako inkubacija SIP mikrokozmosa ne može u potpunosti reproducirati fiziokemijske i biološke karakteristike neobrađenih tla in situ . Na primjer, 13 C-AOA, AOB i NOB na dan 56 ostali su uglavnom slični onima u danu 0 (Dopunska slika S9). Statistička analiza pokazala je da su ukupne mikrobne zajednice jasno razdvojene na osnovu četiri mjesta uzorkovanja, a ne dvije vremenske točke dana 0 i 56 (dopunska slika S10), implicirajući da nije bilo značajnih promjena strukture mikrobne zajednice tijekom inkubacije SIP mikrokozmosi. Nadalje, površinsko tlo korišteno u ovom istraživanju bilo je podložno oranju svake godine nakon berbe riže i bilo je izloženo redovitom plavljenju i odvodnji. Ovo poljoprivredno upravljanje vrlo je vjerojatno da je smanjilo heterogenost tla neravnog polja, što implicira da aktivna nitrifikacijska populacija u ovom istraživanju može u određenoj mjeri predstavljati nitrifikaciju koja se prirodno događa u rižinom polju.

Uzeto zajedno, rezultati ovog istraživanja pružaju snažne dokaze za različit doprinos AOA, AOB i NOB u aktivnostima nitrifikacije četiri neobrađena tla. DNA-SIP jasno je naznačio da je AOA unutar grupe tla 1.1b dominirala oksidacijom amonijaka u blago alkalnom sirovom tlu, dok su aktivni oksidanti amonijaka u neutralnom JX tlu bili isključivo povezani s populacijom AOB. Oksidacija nitrita uglavnom je katalizirana filogenetski različitim filotipovima Nitrospira- sličnih, a ne NOB-sličnim NOB-om. Naši rezultati sugeriraju da su antropogena močvarna polja neravnih polja vjerojatno odabrana za različite nitrirajuće zajednice, a uske interakcije između oksidanta amonijaka i nitritnih oksidansa mogu biti usko povezane s fiziokemijskim svojstvima tla, uključujući pH i redox stanje.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

  5. 5.

    Dopunska slika S5

  6. 6.

    Dopunska slika S6

  7. 7.

    Dopunska slika S7

  8. 8.

    Dopunska slika S8

  9. 9.

    Dopunska slika S9

  10. 10.

    Dopunska slika S10

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije prate ovaj članak na web stranici ISME Journal (//www.nature.com/ismej)