Dokozaheksaenska kiselina inducira razgradnju onkoproteina hpv e6 / e7 aktiviranjem sustava ubikvitin-proteasom | stanična smrt i bolest

Dokozaheksaenska kiselina inducira razgradnju onkoproteina hpv e6 / e7 aktiviranjem sustava ubikvitin-proteasom | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapija raka
  • Infekcije virusom tumora

Sažetak

Onkogeni humani papiloma virus (HPV) E6 / E7 proteini su važni za nastanak i održavanje maligniteta povezanih s HPV-om. Ovdje izvješćujemo da aktiviranje staničnog ubikvitin-proteasomnog sustava (UPS) omega-3 masnom kiselinom, dokozaheksaenoičnom kiselinom (DHA) dovodi do proteasom-posredovane razgradnje E6 / E7 virusnih proteina i indukcije apoptoze u HPV- zaražene stanice raka. Povećana aktivnost UPS-a i razgradnja onkoproteina E6 / E7 povezana su s prekomjernom proizvodnjom mitohondrijskih reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) uzrokovanih DHA. Egzogeni oksidativni stres i farmakološka indukcija mitohondrijskog ROS-a pokazali su učinke slične onima DHA, a inhibicija proizvodnje ROS-a ukinula je aktivaciju UPS-a, destabilizaciju virusnog proteina E6 / E7 i apoptozu. Ovi nalazi identificiraju novu ulogu DHA u regulaciji UPS-a i virusnih proteina te pružaju dokaze za uporabu DHA kao mehanički jedinstvenog antikancerogenog sredstva za kemoprevenciju i liječenje tumora povezanih s HPV-om.

Uvod

Onkogeni humani papiloma virus (HPV) usko je povezan s razvojem nenenitalnih i genitalnih maligniteta. Od onkogenih HPV-a HPV-16 i HPV-18 najčešće su detektirani genotipovi u zloćudnim biopsijama. 1 Tijekom progresije karcinoma povezanih s HPV-om, cijeli ili fragmenti HPV genoma nasumično se integriraju u DNK kromatinske stanice domaćina, što dovodi do konstitutivnog izražaja dvaju ranih virusnih proteina: E6 i E7. 2 Kao glavni transformirajući proteini proizvedeni onkogenim HPV-om, E6 / E7 prvenstveno doprinosi kancerogenezi modulacijom komponenata signalizacije glavnih stanica, uključujući tumorske supresore p53 i retinoblastom (Rb). 3, 4 Dok E6 cilja p53 za razgradnju, usporavajući njegove učinke na inhibitor rasta i apoptozu, E7 inaktivira Rb, promovirajući napredovanje staničnog ciklusa. 5 Kako trajna inaktivacija p53 i Rb pogoduje dereguliranom staničnom rastu, E6 / E7 su atraktivni terapijski kandidati za liječenje tumora povezanih s HPV-om. 6 Zaista, inhibicija E6 / E7 vraća funkciju p53 i Rb i na taj način izaziva zaustavljanje rasta i smrt u stanicama zaraženim HPV-16/18. 7, 8, 9

HPV E6 / E7 brzo se razgrađuje ubikvitin-proteasomski sustav (UPS). 10, 11, 12, 13 U UPS-u supstratni proteini najprije se uvvkvificiraju kroz sekvencijalnu enzimsku kaskadu, a ubikvitini konjugati (Ub-konjugati) zatim se razgrađuju proteasomom. 14 Ovi su događaji podjednako važni i blokada bilo kojeg od njih može smanjiti razgradnju proteina UPS supstrata. 15 Nadalje, osim što razgrađuje sveprisutne proteine, proteasom je odgovoran i za proteolizu nekih nebikvitiniranih proteina, poput ornitinske dekarboksilaze (ODC). 14, 16 Ključne komponente UPS-a, uključujući proteasom i sve klase enzima koji sudjeluju u ubikvitaciji, su osjetljivi na redoks, 17 a ubikvitacija i proteasomalna razgradnja UPS supstrata povezana su s reaktivnim kisikovim vrstama (ROS). Na primjer, kao odgovor na razne ROS-induktore, pojačavaju se enzimske aktivnosti sustava konjugacije ubikvitin, što rezultira povećanom razinom Ub-konjugata, 18, 19 i inhibicija ROS-a smanjuje aktivnost proteasoma u stanicama karcinoma; 20 ovi nalazi sugeriraju da ROS može imati pozitivan utjecaj na staničnu UPS funkciju.

Pokazano je da dokosaheksaenoinska kiselina (DHA), najzasićenija omega-3 masna kiselina posjeduje pro-apoptotičku aktivnost protiv tumorskih stanica. 21, 22 Također smo izvijestili da DHA izaziva apoptozu u stanicama karcinoma SiHa koja eksprimira HPV-16, što bi se moglo djelomično spasiti inaktivacijom proteasoma, 23 sugerirajući da je UPS uključen u smrt uzrokovanu DHA-om onkogenih HPV-inficiranih stanica. Ovdje smo okarakterizirali molekularni mehanizam koji stoji u osnovi UPS-povezanog antikancerogenog djelovanja DHA u stanicama karcinoma pozitivnog na HPV, pomoću UPS-ovih podloga za temeljene na GFP-u. Ravni unutarstanični stacionarni nivo ovih izvjestitelja, uključujući GFP-CLl (peptid razgradnje signala razgradnje 16-aminokiselina CL1 spojen na karboksi kraj GFP-a) 16 i Ub G76V -GFP (mutirani neprelazni ubikvitinski dio spojen na amino-kraj od GFP-a) 24 odražavaju ukupni tok kroz UPS; ometanje funkcije UPS-a dovodi do njihovog nakupljanja. Naši rezultati pokazuju da je DHA promovirao razgradnju E6 / E7 putem UPS-a posredovane UPS aktivacije, izazivajući apoptozu u stanicama karcinoma inficiranim HPV-om. Ovo je prva studija koja pruža dokaze za DLC-induciranu post-translacijsku regulaciju virusnih onkoproteina, a nalazi dovode do boljeg razumijevanja kako DHA utječe na UPS.

Rezultati

DHA-inducirana apoptoza u stanicama raka zaraženih HPV-om uključuje represiju E6 / E7

DHA inducira apoptozu u SiHa stanicama zaraženim HPV-16. 23 Da bismo utvrdili utječe li DHA na sudbinu stanica zaraženih drugim vrstama onkogenih HPV-a, uspoređivali smo održivost i morfološke promjene u HeLa stanicama koje eksprimiraju HPV-18 i SiHa stanice liječene DHA-om. DHA je smanjila vitalnost i HeLa i SiHa stanica (slika 1a), i izazvala slične morfološke promjene u dvije stanične linije (dopunska slika 1a). Pored toga, došlo je do značajnog povećanja broja HeLa stanica koje nose nuklearne fragmente i puknuća DNA DNA (dopunske slike 1b i c) nakon izlaganja DHA. Ekspresija dvaju uobičajenih apoptotskih molekularnih markera, cijepljene kaspaze 3 i poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP), regulirana je u stanicama HeLa inkubiranim s DHA, ali ne u stanicama koje su inkubirane s drugim visoko nezasićenim masnim kiselinama, uključujući eikosapentaenoinsku kiselinu i arahidonsku kiselinu (Dopunska slika 1d). Ovi nalazi potvrđuju da je apoptoza način smrti uzrokovan specifičnom vrstom omega-3 masne kiseline, DHA, u stanicama karcinoma koji eksprimiraju onkogeni HPV.

Image

Suzbijanje E6 / E7 uzrokovano DHA povezano je s apoptozom u onkogenim stanicama raka zaraženim HPV-om. ( a ) Stanice SiHa (lijevo) i HeLa (desno) inkubiraju se s povećanjem koncentracija (0, 25, 50 i 75 μM ) DHA tijekom 6, 12 i 24 h, a stanična vitalnost mjerena je MTT testovima. ( b ) HeLa (lijevo) i SiHa (desno) stanice inkubiraju se sa 50 µM DHA kroz naznačena vremena, a razine ekspresije PARP i E6 / E7 procjenjuju se zapadnim blotiranjem. ( c ) Fazno-kontrastne slike spojene HeLa stanice tretirane nosačem ili 50 µM DHA 6 h i obojene za p53 (vrh) i Rb (dno) (zeleno). Nuklei su obojeni DAPI (ljestvica ljestvice, 10 μm). ( d i e ) A549 stanice zasađene na pločama s 96 jažica ili 10 cm posuđa su prolazno transficirane kontrolnim praznim vektorom (EV) ili s ekspresijskim vektorima HPV-18 E6 / E7. U 36 h nakon transfekcije, stanice su tretirane, ili ne, sa 50 µM DHA tijekom 6 h, a zatim podvrgnute MTT ispitivanjima ( d ) ili Western blotiranju ( e ). Rezultati su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD vrijednosti. Trake pogrešaka označavaju SD ( n = 3). * P <0, 05; # P <0, 001

Slika pune veličine

E6 / E7 imaju važnu ulogu u održavanju zloćudnog fenotipa stanica karcinoma zaraženih HPV-om; 3 stoga smo slijedeće ispitali učinak DHA na E6 / E7. Iako je DHA doveo do povećanja cijepljenog PARP-a u stanicama HeLa i SiHa, on je smanjio razinu E6 / E7 (Slika 1b). Inhibiranje E6 / E7 vraća funkcije njihovih primarnih staničnih ciljeva, p53 i Rb. 7 U skladu s tim, iako je nuklearno bojanje p53 / Rb u kontrolnim ćelijama gotovo neprimetno, značajno se povećalo u HeLa-stanicama tretiranim DHA (slika 1c). Kontinuirana ekspresija E6 / E7 ključna je za preživljavanje stanica karcinoma zaraženih HPV-om. 5 Kako naši rezultati ukazuju na uključenost represije E6 / E7 u apoptotski proces izazvan DHA, pretpostavili smo da DHA može izazvati apoptozu potiskivanjem E6 / E7. Da je to slučaj, uvođenje E6 ili E7 u stanice trebalo bi umanjiti apoptozu uzrokovanu DHA. Uistinu, učinci DHA na citotoksičnost i ekspresiju cijepanog PARP-a (slike 1d i e) znatno su smanjeni kada je HPV-18 E6 ili E7 bio prolazno eksprimiran u stanicama karcinoma A549 sa nedostatkom HPV-a. Ovi podaci pokazuju da DHA atenuira E6 / E7, potičući tako apoptozu u stanicama karcinoma inficiranim HPV-om.

DHA stimulira razgradnju E6 / E7 ovisnu o UPS-u

Budući da E6 / E7 prolazi proteasomalnu degradaciju, 12, 13 inaktivirali smo proteosom upotrebom laktacistina i ispitali učinke na DHA-posredovanu regulaciju E6 / E7 u HeLa stanicama prethodno inkubiranim sa ili bez cikloheksimida (CHX), inhibitora prevođenja. Laktacistin je ukinuo CHX-inducirano iscrpljivanje E6 / E7 i spriječio inhibitorne učinke CHX plus DHA na E6 / E7 (slika 2a). Sposobnost laktacistina da spriječi smanjenje E6 / E7 bila je specifična posljedica inhibicije proteasoma, jer su inhibitori lizosoma NH4C1 i različiti inhibitori proteaze, uključujući leupeptin, E64d i pepstatin A, imali samo neznatno (ili nikakvo) utjecaj (slika 2b). Ova opažanja sugeriraju da DHA smanjuje vrijednost E6 / E7 na posttralacijskoj razini ubrzavajući njihovu proteasomalnu degradaciju. Da bi se ovo potvrdilo, HeLa stanice bile su izložene još dvije različite klase inhibitora proteasoma, MG262 ili MG132, 15 prije nego što je praćena DHA i razina E6 / E7 (Slike 2c i d). Liječenje MG262 i MG132 dovelo je do značajnog povećanja početnih razina E6 / E7, što je potvrdilo da je E6 / E7 razgradio proteasom. Nadalje, slični laktacistinu, ovi inhibitori su također blokirali gubitak E6 / E7 uzrokovanog DHA; međutim, blok nije završen, jer ćelije koje su preplavljene DHA i MG262 (ili MG132) pokazuju niže razine E6 / E7 od onih liječenih samo inhibitorima.

Image

DHA inducira UPS-ovisnu razgradnju E6 / E7 virusnih onkoproteina. ( a ) HeLa kulture prethodno su obrađene ili nisu s laktacistinom (5 µM) 1 sat prije dodavanja CHX (0, 5 µg / ml), DHA (50 µM ) ili kombinacije dviju. Stanice su sakupljene 6 sati kasnije i podvrgnute Western blot analizi. ( b ) HeLa stanice ostavljene su neobrađene ili obrađene sa 50 µM DHA u trajanju od 6 h uz 1 h predobrade 5 µM laktacistina, 10 µM leupeptina, 2, 5 µg / ml E64d, 1 µ M pepstatina A i 10 mM NH 4 Cl, respektivno. Lizati s celim stanicama su ekstrahirani i izbrisani antitijelima protiv E6 / E7. ( c ) HeLa stanice su prethodno inkubirane sa ili bez 0, 5 μM MG262 tijekom 1 sata prije dodavanja 50 μM DHA. Nakon 6 h, lizatima cijelih stanica izbrisani su anti-E6 / E7 antitijelima. ( d ) HeLa stanice su prethodno obrađene, ili ne, sa 5 µM ili 10 µM MG132 tokom 1 h, zatim obrađene sa 50 µM DHA tokom 6 h. Razine ekspresije naznačenih proteina su zatim ispitivane Western blottingom (WB). ( e ) DHA povećava sveprisutnu upotrebu E6 / E7. HeLa stanice koje prolazno eksprimiraju kontrolni vektor ili FLAG-ubikvitin plazmid prethodno su obrađene, ili ne, sa 5 µM MG132 tokom 1 sata, a zatim su obrađene sa 50 µM DHA tokom 6 h. Ljeta iz cijelih stanica podvrgnuta je imunoprecipitaciji (IP) s anti-E6 (lijevo) ili -E7 (srednja) antitijela, kako je naznačeno, nakon čega slijedi WB s anti-FLAG (gornji dio) ili anti-E6 / E7 (donja) antitijela. Ispravno, cijeli stanični lizati su izbrisani anti-FLAG, -ubikvitin (Ub-konjugati) i -E6 / E7 antitijela za ispitivanje razine ekspresije

Slika pune veličine

Proteini su općenito sveprisutni prije razgradnje proteasomom. 14, 15 Stoga smo ispitali učinak DHA na sveprisutni status E6 / E7, pretpostavljajući da pojačana ubikvitacija u prisutnosti inhibitora proteasoma ukazuje da degradacija izazvana DHA posreduje ubikvitacijom. HeLa stanice su prolazne transfekcije kontrolnim vektorom ili plazmidom koji kodira ubikvitin označen FLAG, a zatim su obrađene sa DHA u prisutnosti MG132. Ubikvitacija E6 / E7 zatim je procijenjena imunoprecipitacijom E6 / E7, a zatim zapadnim blottacijom s anti-FLAG protutijelima (Slika 2e). U skladu s našim prethodnim opažanjima, MG132 nije u potpunosti spriječio smanjenje uzrokovano DHA-om u E6 / E7 (usporedite traku 2 s trakom 3). Međutim, unatoč nižim razinama E6 / E7 u stanicama izloženim DHA plus MG132, količine sveprisutnih E6 / E7 u tim stanicama bile su usporedive s količinama u stanicama koje su tretirane samo MG132. Stoga, relativno veće razine sveprisutnih E6 / E7 u stanicama uzimanima DHA i MG132 sugeriraju da DHA pokreće E6 / E7 ubikvitaciju.

Propadanje E6 / E7 uzrokovano DHA povezano je s poboljšanom funkcijom UPS-a

Iako su DHA i inhibitor proteasoma MG132 povećali razinu Ub-konjugata (slika 2d), imali su suprotne učinke na aktivnost proteasoma (slika 3a), a nakupljanje Ub-konjugata i inhibiciju proteasoma izazvano pomoću MG132 moglo je djelomično preokrenuti DHA. Ovo sugerira da stvaranje Ub-konjugata uzrokovano MG132 i DHA može biti različito posredovano njihovim učincima na UPS. Da bi se ovo testiralo i utvrdilo da li se propadanje E6 / E7 uzrokovano DHA odnosi i na UPS, HeLa stanice su prolazno transficirane s UPS izvjestiteljem, GFP-CL1 ili izvještačem o proteasomskoj aktivnosti, GFP-ODC, 16 i učincima MG132 i DHA o ekspresiji tih izvjestitelja, E6 / E7 i Ub-konjugati uspoređeni su (slika 3b). Dok je MG132 povećao ekspresiju i GFP-ODC i GFP-CL1, njihova ekspresija je smanjena DHA. Pored toga, dobro dokumentirani proteasomalni supstrat, p53 je potisnut kao odgovor na dugotrajno DHA liječenje, koje je moglo spasiti MG132 (dopunska slika 2). Ovi nalazi pokazuju da, za razliku od MG132, DHA pojačava aktivnost proteasoma i povećava ekspresiju Ub-konjugata bez blokiranja UPS-a, te da degradacija E6 / E7 uzrokovana DHA istodobno s pojačanom funkcijom UPS-a.

Image

DHA promiče razgradnju E6 / E7 virusnih proteina povećavajući aktivnost UPS-a. ( a ) HeLa stanice su ostavljene neobrađene ili prethodno obrađene sa 5 µM MG132 tokom 1 sata, a potom izložene 50 h M DHA u trajanju od 6 sati. Pripremljeni su ukupni stanični ekstrakti (10 µg) i inkubirani 1 h fluorogenim peptidom Suc-LLVY-aminometilcoumarinom, te je izmjeren fluorescentni signal. Neobrađena kontrola postavljena je na 1. ( b ) HeLa stanice koje su prolazno transficirane navedenim izvještačima inkubirane su sa 50 µM DHA ili 5 µM MG132 u trajanju od 6 h, a ekspresija izvještača, E6 / E7, i sveprisutni konjugati ( Ub-konjugati) ispitani su Western blottingom. ( c ) HeLa stanice koje su prolazno transficirane s Ub G76V -GFP izveštačem prethodno su obrađene, ili ne, sa 5 µM MG132 tokom 1 h, zatim obrađene sa 50 µM DHA tokom 6 h. Lijeva, razina ekspresije novinara i E6 / E7 analizirani su Western blottingom; desno, fluorescentne mikrografije Ub G76V -GFP reporterskih izraza nakon različitih tretmana (kako je opisano na lijevoj ploči). Linija mjerila, 100 µm. ( d i e ) DHA povećava razgradnju Ub G76V -GFP izveštača i E6 / E7 proteina. Stanice Ub G76V -GFP HeLa ili su neobrađene ili prethodno inkubirane sa 2, 5 µM MG132 u trajanju od 4 sata da se inducira akumulacija reportera. Stanice su tada tretirane ili nisu s 50 µM DHA tokom 6 h. Stanice su sakupljene i GFP fluorescencija je ispitana protočnom citometrijom ( d ). Vrijednosni grafikon prikazuje rezultate četiri neovisna pokusa. Fluorescentne slike i histogrami pokazuju reprezentativan eksperiment (ljestvica ljestvice, 100 µm). Alternativno, stanice su podvrgnute imunoblotingu ( e ). Podaci su prikazani kao srednje ± SD vrijednosti, a trake pogrešaka označavaju SD ( n 3). # P <0, 001

Slika pune veličine

Da bi potvrdili ove nalaze i istražili odnos između uočenog povećanja razgradnje E6 / E7 i aktivnosti UPS-a kao odgovor na DHA, stanice HeLa koje prolazno izražavaju drugog UPS izvjestitelja, Ub G76V -GFP, 24 prethodno su tretirane sa ili bez MG132 prije izlaganja DHA (Slika 3c). DHA smanjila bazalnu razinu Ub G76V -GFP i E6 / E7. U međuvremenu, razine Ub G76V -GFP izvještača i E6 / E7 u stanicama izloženim samo MG132 bile su veće od onih u stanicama koje su tretirane s MG132 plus DHA. Ovi nalazi potvrdili su rezultat dobiven s izvještačem GFP-CL1, tvrdeći da DHA istovremeno inducira UPS aktivaciju i propadanje E6 / E7 ovisnog o UPS-u. Značajno, jer su HeLa stanice prethodno inkubirane s MG132, UPS funkcija unutar stanica djelomično je inhibirana prije DHA tretmana. Stoga, opažanje da stanice koje su pretrpane MG132 i DHA pokazale nižu razinu ekspresije Ub G76V- GFP reportera u odnosu na onu u stanicama tretiranim MG132 sugerira da DHA (u određenoj mjeri) poništava inhibitorni učinak MG132 na UPS. Ovo je dalje potvrđeno u HeLa stanicama koje stabilno eksprimiraju Ub G76V -GFP reporter (Ub G76V -GFP HeLa). Izvještač Ub G76V -GFP se ne akumulira u stabilnim transfektantima u odsustvu UPS inhibicije zbog njegove vrlo učinkovite razgradnje od strane UPS-a. 24 Kao što je prikazano na slici 3d, nakupljanje Ub G76V -GFP reportera izazvano MG132 značajno je inhibirano kad je DHA dodan u medij. Isto tako, DHA inhibirao je porast E6 / E7 uzrokovan MG132 (slika 3e). Ovi podaci pokazuju da je stanična UPS-aktivacija izazvana DHA-om, barem djelomično, odgovorna za razgradnju E6 / E7.

ROS su povezani sa smanjenjem DHA-induciranog E6 / E7

DHA pokreće nakupljanje ROS-a u stanicama tumora22, a pokazalo se da selektivno inhibira rast onkogenih keratinocita immortaliziranih HPV-om putem lipidne peroksidacije. 25 Stoga smo ispitali potencijalnu uključenost ROS-a u smanjivanje regulacije E6 / E7 izazvane DHA-om. Protok citometrijske analize pomoću opće ROS osjetljive sonde, CM-H2DCFDA, za ukupno mjerenje staničnog ROS-a, pokazao je vremenski ovisan porast fluorescencije diklorohidrofluoresceina (DCF) u stanicama HeLa i SiHa izloženim DHA (Slika 4a; Dodatna slika 3a). ROS-čistač, N -acetil-cistein (NAC), značajno je oslabio DF-fluorescenciju izazvanu DHA (slika 4b; dopunska slika 3b) i spriječio smanjenje E6 / E7 i cijepio nivo PARP izazvan DHA i egzogenim vodikovim peroksidom ( H 2 O 2 ) (slike 4c i d; dopunska slika 3c). Nadalje, preinkubacija HeLa stanica s drugim antioksidansima (EUK8 i natrijevim piruvatom) također inhibira DHA-posredovane učinke na staničnu smrt i E6 / E7 ekspresiju (dopunska slika 3d). Ova opažanja sugeriraju da DHA potiče proizvodnju ROS-a koji regulira E6 / E7 i apoptozu.

Image

Smanjenje ekspresije E6 / E7 uzrokovano DHA ovisi o akumulaciji ROS. ( a ) HeLa stanice su tretirane s 50 µM DHA tijekom naznačenog vremena, a unutarćelijske ROS razine detektirane su protočnom citometrijom pomoću CM-H2DCFDA sonde. ( b ) HeLa stanice sa opterećenjem CM-H2DCFDA prethodno su obrađene, ili ne, s 5 mM NAC u trajanju od 1 sata, nakon čega je slijedilo 50 μM DHA, tijekom 2 sata, a razine ROS ispitivane su protočnom citometrijom. ( c ) HeLa stanice su prethodno obrađene, ili ne, 1 sat sa 5 mM NAC, a zatim 50 h M DHA u trajanju od 6 h. Lizati s celim stanicama bili su izbrisani navedenim antitijelima. ( d ) HeLa stanice inkubirane su sa 300 µM H2O2 naznačeni puta (lijevo), ili prethodno tretirane, ili ne, 1 sat sa 5 mM NAC, nakon čega je slijedila inkubacija sa 300 µM H2O2, tijekom 6 sati (desno ). Cjele stanični lizati su ekstrahirani i izbrisani navedenim antitijelima

Slika pune veličine

Smanjena razina ekspresije E6 / E7 uzrokovana DHA uključuje mitohondrijsku ROS prekomjernu produkciju

Preliminarni eksperimenti identificirali su obilježenu DCF fluorescenciju u stanicama HeLa već 20 minuta nakon DHA tretmana; ova fluorescencija prvenstveno kolokalizirana vitalnom mitohondrijskom bojom, MitoTracker Red (Molekularne sonde, Eugene, OR, SAD) (dopunske slike 4a i b), implicirajući da su mitohondrije vjerovatni izvor ROS-a induciranog DHA. Otkrivanje mitohondrijalnog ROS-a pomoću MitoSOX Red otkrilo je da je DHA uzrokovao porast proizvodnje ROS-a koji je mitohondrija, inhibirao NAC (slika 5a). Prekomjerna proizvodnja mitohondrija ROS često je popraćena gubitkom potencijala mitohondrijske membrane i neoksidovanim kardiolipinom mitohondrijalne membrane, koji su važni za održavanje funkcije mitohondrija. 26 U skladu s tim, DHA je smanjila razinu potencijala mitohondrijske membrane i neoksidiranog kardiolipina, a ti su učinci DHA znatno promijenjeni od strane NAC-a (dopunska slika 4c). Da bismo pružili daljnje dokaze o uključenosti mitohondrija u produkciju ROS-a izazvanih DHA, uspoređivali smo mitohondrijsku funkciju u stanicama HeLa liječenih DHA i / ili NAC-om praćenjem promjena u potrošnji kisika (OCR). Rezultat je pokazao da NAC inhibira DHA-vrijeme uzrokovano smanjenjem OCR-a (Slika 5b). Konfokalna mikroskopska analiza stanica obojenih s MitoTracker Red 2 sata nakon tretmana potvrdila je da NAC sprečava gubitak umirućih mitohondrija uzrokovanih DHA (slika 5c). Ovi podaci jasno pokazuju da mitohondrijski ROS predstavlja prekomjernu akumulaciju ROS-a u stanicama karcinoma inficiranim HPV-om koji su izloženi DHA. Otkrivši to, pokušali smo neposrednije procijeniti utjecaj mitohondrijalnog ROS-a na E6 / E7. HeLa stanice tretirane su s NAC i / ili karbonil cijanidom m-klorofenilhidrazonom (CCCP), induktorom mitohondrijske disfunkcije za kojeg se pokazalo da izaziva prekomjernu produkciju ROS u mitohondrijama. 27, 28 CCCP povećao proizvodnju mitohondrija ROS u stanicama HeLa (dopunska slika 4d). Znatno je također smanjio E6 / E7, a ovaj bi učinak mogao blokirati NAC (slika 5d). Ovi rezultati sugeriraju da mitohondrijski ROS utječe na E6 / E7 ekspresiju i pogoduju gubitku E6 / E7 uzrokovanom DHA.

Image

Uključivanje mitohondrijskog ROS-a u silaznu regulaciju E6 / E7. ( a ) HeLa stanice su prethodno obrađene, ili ne, tokom 1 h sa 5 mM NAC, a zatim 50 h M DHA u trajanju od 2 sata, a razine mitohondrija ROS su ispitivane protočnom citometrijom pomoću MitoSOX Red probe (Molekularne sonde). ( b ) Brzina potrošnje kisika (OCR) HeLa stanica tretiranih s 5 mM NAC, 50 μM DHA ili NAC plus DHA izmjerena je primjenom Seahorse Bioscience XF analizatora. Strelica označava vrijeme dodavanja DHA. ( c ) Reprezentativne konfokalne mikroskopske slike HeLa stanica obojenih vitalnim mitohondrijskim bojama (MitoTracker Red) nakon inkubacije s NAC, DHA ili NAC plus DHA. Stanice su prethodno inkubirane 1 h NAC-om, te obrađene sa ili bez 50 µM DHA još 2 sata. Donja ploča prikazuje prikaze veće snage okvira s kutijama u gornjoj ploči (ljestvica ljestvice, 10 µm). ( d ) HeLa stanice su prethodno inkubirane 1 h NAC 1 h, zatim obrađene sa ili bez 1 µM CCCP još 6 h. Razine proteina E6 / E7 i PARP analizirane su Western blottingom. Prikazane su srednje vrijednosti ± SD, a trake pogreške pokazuju SD ( n = 3). * P <0, 05

Slika pune veličine

DHA-inducirani ROS promiču razgradnju E6 / E7 povećavajući aktivnost UPS-a

ROS su uključeni u regulaciju komponenata UPS-a, 17, 18, 19, pa je moguće da oni mogu imati uzročnu ulogu u DPS-induciranoj UPS aktivaciji i daljnjoj degradaciji E6 / E7. Da bismo to testirali, najprije su procijenjeni učinci egzogenog ROS-a na funkciju UPS-a i smanjivanje regulacije E6 / E7 posredovane UPS-om. Izloženost HeLa i SiHa stanica H202 povisila je razinu ekspresije Ub-konjugata (slika 4d, desna ploča; dodatna slika 3c, desna ploča). Čini se da je ta akumulacija Ub-konjugata rezultat pojačane ubikvitacije stanica, umjesto inaktivacije proteasoma, jer su stanice tretirane H2O pokazale značajno poboljšane aktivnosti proteasoma (Slika 6a), čak i u uvjetima preinkubacije s MG132. Pored toga, kada su stanice HeLa prolazno transfektirane s GFP-CL1 ili GFP-ODC izveštačima inkubirane s H2O2 (slika 6b), razina ekspresije ovih izvjestitelja i E6 / E7 su smanjeni. Eksperimenti provedeni u HeLa stanicama koje su prolazno transficirane izvještačem Ub G76V- GFP (slika 6c) nadalje su pokazale da ne samo da je H2O2 smanjio bazalnu razinu Ub G76V -GFP i E6 / E7, već je ukinuo povećanje uzrokovano MG132 u Ub G76V -GFP reporter i E6 / E7. Ovi nalazi pokazuju da egzogeni ROS ubrzavaju razgradnju E6 / E7 ovisnu o UPS-om povećanjem UPS-ove aktivnosti u našem staničnom kontekstu i povećavaju mogućnost da ROS-inducirani DHA može imati sličnu ulogu. Zapravo, otkrili smo da u HeLa stanicama koje prolazno eksprimiraju Ub G76V -GFP reporter (slika 6d), inhibicija ROS-a posredovana NAC-om dovela je do značajnog preokreta smanjenja Ub G76V -GFP i E6 / E7 uzrokovanog DHA. Štoviše, farmakološki mitohondrijski ROS induktor, CCCP inhibira MG132-inducirano povećanje ekspresije E6 / E7 (slika 6e, usporedi traku 5 s trakom 4), dok je NAC blokirao ovaj inhibitorni učinak (usporedi traku 6 s trakom 5), podupirući mišljenje da mitohondrija izvedena ROS također aktivira UPS i inducira UPS-ovisnu degradaciju E6 / E7. Daljnji eksperimenti na HeLa stanicama koje sadrže Ub G76V -GFP (Slike 6 f i g) potvrdili su ove rezultate. Nakupljena od MG132 nakupljanja Ub G76V -GFP izvjestitelja i E6 / E7 bila je nevjerojatno inhibirana od DHA, H202 i CCCP. Važno je da su ti učinci DHA, H202 i CCCP djelomično obrnuti u prisutnosti RAC inhibitora ROS. Ovi rezultati pokazuju da ROS djeluje uzvodno od UPS-a i potiče DHA-induciranu degradaciju E6 / E7 povećavajući funkciju UPS-a.

Image

ROS su odgovorni za porast aktivnosti UPS-a i naknadnu degradaciju E6 / E7. ( a ) HeLa stanice su ostavljene neobrađene ili prethodno obrađene sa 5 µM MG132 tokom 1 sata, a zatim su izložene na 300 µM H2O2 tokom 6 h. Izmjereno je relativno proteasomsko djelovanje u staničnim ekstraktima koji sadrže 10 μg proteina. Neobrađena kontrola postavljena je na 1. ( b ) HeLa stanice koje su prolazno transficirane navedenim novinarima inkubirane su sa 300 µM H2O2 ili 5 µM MG132 u trajanju od 6 h, a razine izvještaja, E6 / E7 i Ub -konjugati su ispitani Western blottingom. ( c ) HeLa stanice koje prolazno eksprimiraju Ub G76V -GFP izvještaj su prethodno obrađene, ili ne, tokom 1 sata sa 5 µM MG132, a zatim su inkubirane 6 h sa 300 µM H202. Razine ekspresije GFP i E6 / E7 su zatim ispitane zapadnim blotiranjem. ( d ) HeLa stanice koje prolazno eksprimiraju Ub G76V -GFP izvještaj su prethodno obrađene, ili ne, 1 sat sa 5 mM NAC, a zatim su inkubirane 6 h DHA 50 h. Razine ekspresije GFP i E6 / E7 su zatim ispitane zapadnim blotiranjem. ( e ) HeLa stanice su prethodno inkubirane sa ili bez 5 µM MG132 tijekom 1 sata, a zatim izložene NAC (5 mM), CCCP (1 µM ), ili kombinaciji obaju, 6 h. Gdje je naznačeno, NAC je dodan 1 sat prije CCCP tretmana, a razine ekspresije E6 / E7 analizirane su Western blottingom. ( f i g ) HeLa stanice Ub G76V -GFP ostavljene su neobrađene ili unaprijed inkubirane s 2, 5 µM MG132 4 sata, a zatim obrađene sa NAC (5 mM), DHA (50 µM ), H2O2 (300 µM ), CCCP (1 μM ), ili kombinacija NAC i DHA / H202 / CCCP u trajanju od 6 h. Gdje je naznačeno, NAC je dodan u medij 1 sat prije tretmana s DHA, H20 ili CCCP. ( f ) Stanice su sakupljene i podvrgnute imuno blotiranju navedenim antitijelima. ( g ) GFP ekspresija je fotografirana pod fluorescentnim mikroskopom (gornja strana), a zatim ispitivana protočnom citometrijom (dno). Linija skale, 200 μ m. Podaci su prikazani kao srednje ± SD vrijednosti, a trake pogrešaka označavaju SD ( n 3). # P <0, 001

Slika pune veličine

Rasprava

E6 / E7 održavaju zloćudni fenotip stanica karcinoma zaraženih HPV-om i ometaju molekule koje sudjeluju u apoptotičkom putu. 29 Pokazali smo da je DHA inducirala apoptozu u stanicama HeLa i SiHa koje sadrže dvije najraširenije vrste onkogenih HPV-a i snižene razine E6 / E7. Ovaj nalaz, zajedno s uočenom rezistencijom na apoptozu izazvanu DHA u stanicama raka negativnih HPV-om koji eksprimiraju E6 / E7, u skladu je s inhibicijskim učincima E6 / E7 na apoptozu. Nadalje, nuklearni p53 / Rb gotovo se ne može prepoznati u tumorskim stanicama zaraženim HPV-om zbog njihove kontinuirane inaktivacije uzrokovane prisutnošću E6 / E7; 30 ovaj gubitak p53 / Rb pridonosi anti-apoptotičkim svojstvima E6 / E7. 9, 31 U skladu s tim prethodnim studijama, otkrili smo da je smanjivanje regulacije E6 / E7 i indukcije apoptoze posredovano DHA povezano s povećanim nuklearnim bojenjem za p53 / Rb. Obnova P53 / Rb okarakterizirana je kao glavni mehanizam koji stoji iza apoptoze posredovane represijom E6 / E7. 8, 9, 32 Stoga je razumno pretpostaviti da je reaktivacija p53 / Rb (potaknuta inhibicijom E6 / E7) odgovorna za DHA-induciranu smrt apoptotske stanice. Međutim, osim p53 / Rb, pokazalo se da i molekule uključujući Notch i Sirtuin-1 sudjeluju u apoptozi uzrokovanoj gubitkom E6 / E7. 33, 34 Stoga će važan izazov za buduće studije razlučiti ove mogućnosti i utvrditi uključuje li apoptotski proces izazvan DHA-om novi cilj E6 / E7.

DHA promovirala razgradnju E6 / E7 ovisnu o UPS-u, zajedno s povećanjem UPS-ove aktivnosti, a poremećaj funkcije UPS-a inhibirao je DHA-inducirano smanjivanje regulacije E6 / E7, sugerirajući da inhibitorni učinak DHA na E6 / E7 uključuje UPS aktivaciju. Ovo također pruža moguće objašnjenje za naše prethodne rezultate, 23 koji pokazuju da DHA samo prolazno pojačava p53 ekspresiju u SiHa stanicama, te da dugotrajna inkubacija (24 h) stanica s DHA smanjuje p53 na razinu nižu od one u netretiranim stanicama, Ovaj fenomen regulacije p53 praćen produljenim smanjenjem zabilježen je i u HeLa stanicama (dopunska slika 2a). Općenito, ubikvitin ligaza p53 i dvostruka minuta miša 2 (MDM2) međusobno se reguliraju automatskom regulacijskom petljom. Aktivirani p53 inducira transkripciju MDM2, što zauzvrat cilja p53 za proteolitičku razgradnju; međutim, put degradacije p53 degradacije p53 isključen je u stanicama karcinoma zaraženim HPV-om zbog trajne razgradnje p53 od strane E6. 31 Kako smanjivanje E6 uzrokovano DHA dolazi od aktivacije UPS-a, promatrani obrazac ekspresije p53 može se pripisati reaktivaciji p53, posredovanoj inhibicijom E6, i naknadnom daljnjom razgradnjom p53 uslijed povećane aktivnosti UPS-a. U prilog tome, ekspresija MDM2 je regulirana neposredno nakon što je p53 dostigao svoj maksimalan nivo (dopunska slika 2a), a UPS inhibicija posredovana MG132 ukinula je gubitak p53 izazvanog DHA u roku od 24 sata (dopunska slika 2b). Ovi rezultati pokazuju da je p53 induciran DHA transkriptivno aktivan, što potvrđuje njegovu reaktivaciju; s druge strane, one su u skladu s shvaćanjem da DHA također ubrzava destrukciju p53 ovisnog o UPS-u. Ova povećana degradacija p53 nije potpuno neočekivana, jer smo pokazali da DHA pojačava UPS funkciju. Osim p53, DHA također potiče razgradnju ovisnu o UPS-u drugih endogenih UPS supstrata, kao što je p- katenin, 35 estrogenski receptor, 36 i pojačivač zistera homologa, 37 u različitim staničnim linijama karcinoma. Iako ostaje nejasno je li razgradnja ovih proteina rezultat stanične UPS aktivacije, ova zapažanja podržavaju ideju da učinak DHA na UPS modulaciju ne može biti ograničen na tumorske stanice zaražene HPV-om.

Prompted by the observation that DHA-induced intracellular ROS primarily localized within mitochondria, we initially examined the contribution of mitochondria-produced superoxide to the total cellular ROS accumulation in DHA-treated HeLa cells. The results showed that DHA increased the mitochondrial ROS level, which was reversed by the antioxidant NAC pretreatment, suggesting that DHA induces cellular ROS by promoting mitochondrial ROS generation. However, in addition to mitochondrial ROS induction, other mechanisms responsible for DHA-induced total ROS accumulation also appear to exist. In support of this idea we found that, whereas NAC pretreatment almost completely blocked the increased level of MitoSOX fluorescence induced by DHA (Figure 5a, NAC+DHA), its inhibitory effect on the intensity of total cellular ROS indicator, DCF, was only partial (Figure 4b, NAC+DHA) when examined under the same conditions (2 h after 50 μ M DHA exposure). Previous studies have shown that DHA induces ROS accumulation in a number of malignant cell lines by elevating enzymatical and non-enzymatical lipid peroxidation. 22 It is therefore likely that DHA may elevate total cellular ROS through some as yet unidentified signaling cascades, which stimulate lipid peroxidation. How DHA exactly affects the mitochondrion to generate high levels of ROS in the organelle is currently not clear; however, our finding that OCR was attenuated immediately upon addition of DHA into the cultures suggests a possible role for DHA, via disruption of mitochondrial electron transport chain, in regulating mitochondrial ROS generation. Indeed, the mitochondrial respiratory chain has long been recognized as a target for unsaturated fatty acid-mediated production of ROS in vitro and in vivo . 38

An intriguing finding of this work is that ROS, including mitochondrial-produced and exogenous ROS, repressed E6/E7. We additionally discovered that DHA-induced E6/E7 degradation was attributed to the UPS activation mediated by ROS. Interestingly, despite significant enhancement of proteasome activity in DHA- and H 2 O 2 -treated HeLa cells, such a marked increase was not seen when purified proteasome and cell extracts prepared from HeLa cells were directly exposed to DHA or H 2 O 2 (Supplementary Figure 5). This suggests that the increased proteasome function observed in cell cultures largely results from an indirect regulatory effect of ROS on the proteasome, probably through induction of Ub-conjugates. Prior work shows that ROS can activate the enzymes involved in ubiquitination, 18, 39 leading to Ub-conjugates accumulation, which enhances the degradative capacity of the proteasome by stimulating its gate opening. 40 In these cases, Ub-conjugates formation appears to be an initial step of the ROS-mediated cellular UPS activation, and necessary for the activation of proteasome. In fact, although ROS-mediated UPS activation induced by DHA and H 2 O 2 was accompanied by the accumulation of Ub-conjugates (Figures 3b and 6b), the attenuated UPS function caused by ROS inhibition was concomitant with decreased levels of Ub-conjugates (Figures 4c and d). These observations indicate a link between Ub-conjugates formation and the UPS function in response to ROS, and it is thus possible that Ub-conjugates may have a role in the ROS-mediated proteasome activation. Nonetheless, although the induction of Ub-conjugates represents one potential mechanism by which ROS indirectly improve proteasome function, results from some recent studies imply that alternative mechanisms may exist. For example, increased proteasome activity caused by interferons is attributed to the ROS-stimulated de novo synthesis of inducible proteasome peptidase subunits, 41 which replace their corresponding conventional peptidase subunits and thereby result in the formation of more functional immunoproteasomes. Further, in a report examining the regulatory effect of Parkin on mitophagy, it was found that mitochondrial dysfunction can act as a signal for proteasome activation and triggers the UPS-dependent clearance of damaged mitochondria. 27 As increased cellular ROS (including those caused by exogenous application of H 2 O 2 ) are known to induce mitochondrial malfunction, 26 we cannot rule out the possibility that ROS may indirectly enhance proteasome function by triggering mitochondrial failure. Indeed, it had been demonstrated that proteasome activity is correlated with mitochondrial malfunction and oxidative stress in a mouse model of neurometabolic disease, arguing for a role of mitochondria dysfunction in ROS-mediated proteasome activation. 42 It deserves mention, however, that despite the enhancing effect of ROS on UPS activity observed in this and other studies, impaired UPS function has also been correlated with ROS. 43, 44 Although not fully clear, these inconsistent results may be partly attributed to the presence of heterogeneous proteasome populations and the differences in experimental conditions, such as the type, dose, and duration of ROS insults. 45

Collectively, the results of the present study identify a unique strategy for inducing the degradation of E6/E7 by activating ROS-mediated UPS function with DHA (Figure 7). Our finding that DHA simultaneously induced UPS activation and E6/E7 degradation highlights a novel biological function of DHA, and reveals one important mechanism by which DHA provokes the death of HPV-associated cancer cells.

Image

Proposed model showing how DHA reduces the expression of the E6/E7 viral oncoproteins in oncogenic HPV-infected cancer cells. DHA stimulates cellular ROS accumulation primarily via inducing mitochondrial ROS overproduction, which leads to mitochondria failure and the activation of cellular UPS. As a result, the UPS-dependent degradation of E6/E7 viral proteins is accelerated. Note that mitochondrial dysfunction might contribute to the UPS activation induced by DHA (dashed line)

Slika pune veličine

Materijali i metode

Plasmids, transfection and treatment of stably transfected cells

The expressing plasmids pSG5-HPV-18 E6/E7 (provided by Professor Shih-Ming Huang, Department of Dermatology, Tri-service General Hospital, Taipei, Taiwan) and FLAG-tagged ubiquitin pCS4-FLAG-Ub (provided by Professor Dae-Won Kim, Department of Biochemistry, Yonsei University, Seoul, Korea) were used as reported previously. 46, 47 The mammalian expression vectors encoding GFP-CL1 and GFP-ODC were kindly provided by Dr. Jong-Bok Yoon (Yonsei University). The Ub G76V -GFP construct was a gift of NP Dantuma (Addgene plasmid #11941, Cambridge, MA, USA). Constructs (4−6 μ g/10-cm dish) were transfected into cells using Lipofectamine LTX reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; #15338-100) as recommended by the manufacturer. Twelve hours after transfection, the cells were subjected to serum deprivation for 24 h and then subjected to different treatments. HeLa cells stably transfected with Ub G76V -GFP plasmids (Ub G76V -GFP HeLa) were selected using 0.8 mg/ml G418 as described previously. 15 For use, Ub G76V -GFP HeLa cells were pretreated with the proteasome inhibitor, MG132, to induce the accumulation of the Ub G76V -GFP reporter, and then the test compounds were added into the media. To achieve the optimal inhibitory effect of MG132 on the UPS, while avoiding any cytotoxic effects, the cells were pretreated with 2.5 μ M MG132 for 4 h followed by a 6-h incubation with the test compounds.

Immunoprecipitation and western blotting

For immunoprecipitations, HeLa cells transiently transfected with FLAG-tagged ubiquitin vectors were lysed in lysis buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, and 5 mM EDTA). Supernatants were added with a HPV-18 E6 antibody or HPV-18 E7 antibody and protein G beads, and incubated at 4 °C for 6 h with shaking. Beads were washed and then boiled in sample buffer for 5 min, and proteins were separated by 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for ubiquitination analysis and detection of E6/E7 proteins. Western blotting of whole-cell lysates was performed as described in reference. 23

Measurement of oxygen consumption in real time

The OCR was measured using an XF24 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA). HeLa cells were plated at 2 × 10 4 /well in complete medium and allowed to attach overnight. After washing with serum-free medium, the cells were switched to 590 μ l of unbuffered serum-free DMEM containing 25 mM glucose in the absence or presence of 5 mM NAC. Cells were incubated in a CO 2 -free atmosphere at 37 °C for 1 h to allow temperature and pH equilibration before loading onto the XF24 equipment. After three successive 3-min measurements at 5-min intervals, 66 μ l of 500 μ M DHA (final concentration=50 μ M) or solvent vehicle (control) was injected into the corresponding wells. The OCR was monitored by repeating the above measurement cycles 20 times.

Statistička analiza

The statistical significance of difference between control and treated groups was analyzed using one-way ANOVA. The difference was considered significant when P -value was <0.05.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

CCCP

carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone

CHX

cikloheksimidna

CL1

a 16-amino-acid sequence (ACKNWFSSLSHFVIHL) degradation signal peptide

DHA

docosahexaenoic acid

DCF

dichlorodihydrofluorescein

H202

vodikov peroksid

HPV

human papillomavirus

MDM2

mouse double minute 2 homolog

NAC

N -acetyl-cysteine

OCR

stopa potrošnje kisika

ODC

ornithine decarboxylase

PARP

poly(ADP-ribose) polymerase

Rb

retinoblastoma protein

ROS

reaktivne vrste kisika

Ub-conjugates

ubiquitinated conjugates

UPS

ubiquitin–proteasome system

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)