Učinak dvostrukog mača il-1β na osteogenezu matičnih stanica parodontalnog ligamenta putem preslušavanja između nf-κb, mapk i bmp / ​​smad signalnih puteva | stanična smrt i bolest

Učinak dvostrukog mača il-1β na osteogenezu matičnih stanica parodontalnog ligamenta putem preslušavanja između nf-κb, mapk i bmp / ​​smad signalnih puteva | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična smrt
  • Stanična signalizacija
  • Mezenhimske matične stanice

Sažetak

Mikroekološki uvjeti mogu ometati funkcionalnu ulogu i diferencijaciju mezenhimskih matičnih stanica (MSC). Najnovija istraživanja sugeriraju da upalno mikrookruženje može značajno utjecati na osteogeni potencijal matičnih stanica parodontalnog ligamenta (PDLSC), ali precizni učinci i mehanizmi koji su uključeni ostaju nejasni. Ovdje prvi put pokazujemo da interleukin-1 β (IL-1 β ) ima dvostruku ulogu u osteogenezi PDLSC-a u koncentracijama u rasponu od fiziološki zdravih razina do onih utvrđenih u kroničnom parodontitisu. Male doze IL-1 β aktiviraju signalni put BMP / Smad za promicanje osteogeneze PDLSC-ova, ali veće doze IL-1 β inhibiraju BMP / Smad signalizaciju aktiviranjem nuklearnog faktora κ B (NF- κ B) i signalizacija mitogenom aktivirane proteinske kinaze (MAPK), inhibirajući osteogenezu. Ovi rezultati pokazuju da preslušavanje između signalizacije NF- κ B, MAPK i BMP / Smad posreduje taj dvostruki učinak IL-1 β na PDLSC. Također pokazujemo da oslabljena osteogeneza PDLSC-a rezultira oslobađanjem više upalnih citokina i hemokina, što izaziva kemotaksiju makrofaga, što dodatno pojašnjava ulogu PDLSC-a u patogenezi parodontitisa.

Glavni

Otprilike 90% populacije pati od parodontitisa 1, 2 koji karakteriziraju kronične bakterijske infekcije u potpornim strukturama zuba i homeostatska neravnoteža između dva spojena procesa u parodontalnom sustavu - resorpcija kostiju osteoklastima i stvaranje kostiju osteoblastima. Ova bolest uključuje interakcije s bakterijskim proizvodima, brojnom staničnom populacijom i različitim upalnim posrednicima, a kod odraslih može dovesti do gubitka zuba. 1, 2

Matične stanice parodontalnih ligamenata (PDLSC), novopriznata sub-populacija mezenhimalnih matičnih stanica (MSC), privukle su sve veću pažnju u odnosu na njihov multipotencijal. Kako se PDLSC-ovi lako mogu dobiti iz parodontalnog tkiva, smatraju se važnim za perspektivnu terapiju zasnovanu na stanicama. Nedavno je pokazano da PDLSCs prelaze na mjesto parodontnih lezija i posreduju pri obnovi parodonata. 3, 4, 5 No nedavna istraživanja otkrila su da je osteogena sposobnost matičnih stanica oslabljena u upalnom mikrookolju 6, 7 i da postoje složene interakcije između matičnih stanica i mikrookoline u patološkim uvjetima. Naše prethodne studije otkrile su da poremećeno mikro-okruženje povezano s bolešću može utjecati na karakteristike i funkcije MSC-a.8, 9, 10 Osim toga, neka su istraživanja pokazala da MSC-ovi djeluju na imunomodulatorni način kako bi regulirali funkciju i hemotaksiju imunoloških stanica i da čimbenici okoliša mogu odrediti koji su imunomodulatorni putevi operativni u MSC-ima. 11 Dakle, pretpostavljamo da su međusobne interakcije matičnih stanica i upalne mikrookoline ključne za iskorištavanje regenerativnog potencijala PDLSC-a za terapijsku upotrebu.

Interleukin-1 (IL-1) je pleiotropni citokin i središnji posrednik urođene imunosti i upale. 12 U kliničkim studijama nađeno je da su IL-1 β u povećanim koncentracijama u gingivalnoj krevikularnoj tekućini (GCF) i na mjestima oštećenja parodontala 13, 14 i razine IL-1 β zabilježeni da će se smanjiti nakon parodonttalnog liječenja. 15, 16 U usporedbi s razinama na zdravim mjestima, otkriveno je da su lokalni nivoi IL-1 β i faktora nekroze tumora- α (TNF- α ) u mikro okruženju kroničnog parodontitisa značajno povišeni i da su povezani s razaranjem tkiva parodonata.17, 18, 19 IL-1 stimulira resorpciju kostiju promičući aktivaciju osteoklasta17 , 20 , 21 i posreduje osteoklastogeno djelovanje TNF- a pojačavajući ekspresiju RANKL.15. U upalnim mikrookolima IL-1 i TNF imaju istaknutu ulogu u patogenezi parodontitisa.19 Iako TNF- α ima aktivnost sličnu onoj u kojoj ima IL-1 β , IL-1 β prisutan je na višim razinama u upalnim gingivnim tkivima i njegova ekspresija je ograničena na sloj vezivnog tkiva.22 Višestruka ispitivanja istraživali su utjecaj IL-1 β na diferencijaciju osteoblasta, 23, 24, ali predstavljeni su oprečni podaci i temeljni mehanizam njegovog djelovanja ostaje nejasan.25 Prethodna studija pokazala je da je koncentracija IL-1 β u GCF je 145 ± 167 pg / ml u zdravih ispitanika i 6452 ± 2289 pg / ml u bolesnika s kroničnim parodontitisom.26 U ovom istraživanju oponašali smo upalno mikrookruženje koristeći IL-1 β u različitim koncentracijama u rasponu od zdravih fizioloških razina onima opaženima u GCF-u u slučaju kroničnog parodontitisa26 i pokušali uspostaviti in vitro model osteogeneze kako bi istražili učinke različitih doza IL-1 β na PDLSC.

Prije je izvješteno da signalni putevi nuklearni faktor-B (NF- κ B) i mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK) imaju presudnu ulogu u regulaciji upale i metabolizmu kostiju. 27 28 Osim toga, signalni putevi BMP / Smad imaju važnu ulogu u regulaciji diferencijacije osteoblasta.29 Međutim, uloge koje ovi signalni putevi imaju u osteogenezi MSC-a u upalnim mikro okruženjima ostaju nejasne. U ovoj studiji istraživali smo interakcije signalnih putova BMP / Smad, MAPK i NF- κ B u posredovanju IL-1 β regulirane osteogene diferencijacije PDLSC-a. Budući da rezidencijalne parodontalne stanice mogu proizvesti različite upalne posrednike koji induciraju upalne stanice da napadnu tkivo i utječu na resorpciju kostiju, 30, dodatno smo ispitali ulogu PDLSC-a u patogenezi parodontitisa određivanjem proizvodnje upalnih citokina i hemokina pomoću PDLSC-a u kojima osteogeneza inhibirao je IL- 1P .

Rezultati

Identifikacija PDLSC-ova

Koristili smo protočnu citometrijsku analizu za karakterizaciju PDLSC-ova na temelju površinskih molekula. PDLSC pokazali su karakterističan uzorak mezenhimalnih površinskih markera, uključujući STRO-1, CD146 i CD90, i negativno su izrazili marker endotelne ćelije CD31 i hematopoetske markere CD45 i CD14 (dopunska slika 1).

Dvostruki učinak IL-1 β na osteogenezu PDLSC-a

Osteogena diferencijacija PDLSC izazvana je kultiviranjem u osteogenim medijima sa ili bez IL-1 β . I obojenje ALP-om (Slika 1a) nakon 7 dana i alizarinsko crveno obojenje (Slika 1b) nakon 21 dana pokazali su da IL-1 β pri 0, 01 ng / ml stimulira osteogenezu PDLSC-a, a IL-1 β na 0, 05 ng / ml ne pokazuje značajna promjena osteogeneze PDLSC-a, dok IL-1 β u koncentracijama 0, 25, 1, 25 i 6, 25 ng / ml sve jasno inhibira osteogenu diferencijaciju PDLSC-a. Kvantitativni podaci za ALP aktivnost prikazani na slici 1c i za oslobađanje alizarin crvene boje prikazano na slici 1d takođe ukazuju na različite učinke IL-1 β u različitoj koncentraciji na osteogenezu PDLSC-a.

Image

Dvostruki učinak IL-1 β na osteogensku diferencijaciju PDLSC-a. Stanice se inkubiraju s osteogenim diferencijacijskim medijem sa ili bez naznačenih koncentracija IL-1P (0, 01–6, 25 ng / ml). ( a ) Cijeli prikazi ploča i mikrografije alkalne fosfataze (ALP) obojeni u roku od 7 dana. ( b ) Cijeli prikazi s ploča i mikrograme boje alizarin crvene boje 21 dan. Šipke predstavljaju 100 µm. ( c ) Kvantitativno ocjenjivanje aktivnosti ALP-a. ( d ) Kvantifikacija rezultata bojenja alizarin crvenim bojenjem. ( e ) BMP2, OSX, ALP, Runx2, OPN i OC mRNA su podvrgnute PCR analizi u stvarnom vremenu nakon 6, 10 i 14 dana. Razine ekspresije su normalizirane u vrijednosti β- aktina. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 nasuprot Diff skupini ( c i d ) ili Diff grupi za 6 dana ( e ), # P <0, 05, ## P <0, 01, ### P <0, 001 nasuprot Diff grupi tijekom 10 dana ( e ), P <0, 05, ○ ○ P <0, 01, ○ ○ ○ P <0, 001 u odnosu na Diff skupinu u 14 dana ( e ). Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali razinu mRNA BMP2 i gene za markere osteoblasta, uključujući ALP, RUNX2, OSX, OPN i OC na 6, 10 i 14 dana. Transkripcija BMP2, OPN, ALP (6, 10 i 14 dana), OC (14 dana) i OSX (10 i 14 dana) povećala se za IL-1 β na 0, 01 ng / ml i smanjila se za IL u stupnjevima -1 β kod 0, 05–6, 25 ng / ml. RUNX2 i OC (6 i 10 dana) postupno su se smanjivali kao odgovor na IL-1P na 0–6, 25 ng / ml, ovisno o dozi (Slika 1e).

Da bi se procijenilo mogu li promjene razine ekspresije osteogenih markera rezultat IL-1 β- inducirane stanične smrti, održivost PDLSCs određena je analizom CCK8 tijekom ranih faza diferencijacije. CCK8 analiza nije pokazala statistički značajne promjene tijekom rane faze diferencijacije (dopunska slika 2). Stoga zaključujemo da koncentracije IL-1 β korištene u ovom istraživanju (0–6, 25 ng / ml) nisu imale citotoksične učinke na PDLSC i da učinci na osteogenezu uzrokovani IL-1 β nisu bili povezani sa fizikalno-kemijskim oborina koja se obično opaža tijekom stanične smrti u kulturama koštanih stanica.31

Aktivacija NF- κ B i MAPK signalizacije u PDLSC-ovima

Da bismo utvrdili utječu li različite doze IL-1 β na diferencijaciju PDLSC-a putem signalnih putova NF- κ B i MAPK, istraživali smo učinke tretmana primjenom western blot analize (slike 2a i b) i kvantificirali dobivene podatke (slika 2c), IL-1 β izazvao je brzu i snažnu aktivaciju signalizacije NF- κ B (slika 2a) i MAPK (slika 2b) u 10 min i doveo do fosforilacije ovisnih proteina o dozi, uključujući I κ B α , P65, P38 i JNK (c-jun N-terminalna kinaza), ali nisu uključeni izvanstaničnom signalno reguliranom kinazom (ERK). Nadalje, fosforilirana razina proteina koja se odnosi na NF- κ B (I κ B α i P65) i MAPK (P38 i JNK) signalno je opala nakon 20 min. Ovi podaci sugeriraju da IL-1 β može utjecati na osteogenezu PDLSC-ova putem NF- κ B i MAPK signalizacije.

Image

Ekspresijske karakteristike signalnih molekula NF- κ B i MAPK tijekom osteogene diferencijacije PDLSC-a sa ili bez naznačenih koncentracija IL-1β (0.01-6.25 ng / ml). ( a ) Razine fosforiliranog i ukupnog IkBa i P65 u trajanju od 10 min i 20 min ispitivane su u lizatima cijelih stanica putem Western blottinga. ( b ) Razine fosforiliranog i ukupnog P38, JNK i ERK nakon 10 i 20 minuta ispitivane su u lizatima cijelih stanica putem zapadnog blotiranja. ( c ) Prosječni omjeri p-IkBα / GAPDH, t-IkBα / GAPDH, p-P65 / P65, p-P38 / P38, p-JNK / JNK i p-ERK / ERK izračunati su na temelju analize sive intenziteti pojasa. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 nasuprot Diffovoj skupini u 10 min. # P <0, 05, ## P <0, 01, ### P <0, 001 nasuprot Diff grupi na 20 min. Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Aktiviranje BMP / Smad signalizacije u PDLSCs

Učinak različitih doza IL-1 β na BMP / Smad signalizaciju određen je analizom western blota. Kao što je prikazano na slici 1e, IL-1 β raznoliko je aktivirao BMP2 ekspresiju gena, pri čemu je transkripcija BMP2 značajno povišena IL-1 β na 0, 01 ng / ml, a IL-1 β snižena na 0, 05–6, 25 ng / ml. Također smo ispitali aktivaciju nizvodnih komponenti Smad signalnih putova tijekom osteogeneze PDLSC-a. Otkrili smo da niska doza IL-1 β (0, 01 ng / ml) izrazito potiče fosforilaciju Smad1 / 5 u 6 dana, dok veće doze IL-1 β (0, 05–6, 25 ng / ml) pokazuju ovisne o dozi učinak, što rezultira stalnim padom razine fosforilacije Smad1 / 5 (Slika 3a). U 9 ​​dana razina fosforilacije Smad1 / 5 pokazala je lagani porast reakcije na IL-1 β na 0, 01 ng / ml i postupno se smanjivala s povećanjem koncentracije IL-1 β (0, 01–6, 25 ng / ml) (Slika 3a ). Kvantificirani podaci prikazani su na slici 3b. Pored toga, otkrili smo da razine ekspresije Smad4 nisu promijenjene nakon stimulacije IL-1 β (slika 3a). Prema tome, ovi nalazi sugeriraju da IL-1 β aktivira BMP / Smad u nižim koncentracijama, ali deaktivira ove signalne putove u većim koncentracijama. Ovo sugerira ukrštanje između BMP / Smad signalizacije i drugih mehanizama u osteogenezi PDLSC-a.

Image

Karakteristike ekspresije koštanih morfogenetskih proteina (BMP) / SMAD signalnih molekula tijekom osteogene diferencijacije PDLSC sa ili bez naznačenih koncentracija IL-1 β (0, 01–6, 25 ng / ml). ( a ) Razine fosforiliranog Smad1 / 5 i ukupnog Smad1 / 5 i Smad4 nakon 6 i 9 dana ispitivane su u celularnim lizatima Western blottingom. ( b ) Prosječni omjeri fosforiliranog (p) -Smad1 / 5 / GAPDH izračunati su na temelju analize intenziteta sive pojaseve. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. ** P <0, 01, *** P <0, 001 prema Diff grupi. Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa. GAPDH, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza

Slika pune veličine

Inhibicija NF- κ B i MAPK spašava oštećenu osteogenu diferencijaciju uzrokovanu inhibicijom IL-1 β u visokim dozama

Da bismo dodatno pojasnili ulogu NF- κ B i MAPK u diferencijaciji osteoblasta, blokirali smo signalne putove NF- κ B i MAPK pomoću inhibitora NF- κ B (BAY11-7082), P38 (SB203580), JNK (SP600125) i ERK (U0126). Provedena je Western blot analiza kako bi se odredilo učinkovito smanjenje nivoa fosforilacije NF- κ B i MAPK nakon 10 min (Slika 4a). Kvantificirani rezultati Western blota prikazani su na Dodatnoj slici 3.

Image

Učinak inhibitora NF- κ B i MAPK na osteogeno diferenciranje PDLSC-a. Stanice se inkubiraju s osteogenim sredstvom za diferencijaciju u prisutnosti IL-1 β (6, 25 ng / ml) zajedno s inhibitorom NF- k B (Bay11-7085), p38 (SB203580), JNK (SP600125) ili ERK (U0126), ( a ) Rezultati analize Western blotta za razine fosforiliranih i ukupnih I κ B α , P65, P38, JNK i ERK u 10 min. ( b ) Čitav pregled ploča i mikrografije alkalne fosfataze (ALP) obojene 7 dana. ( c ) Cijeli prikazi s ploča i mikrografije crvene boje na alizarinu u roku od 21 dana. Šipke predstavljaju 100 µm. ( d ) Kvantitativno ocjenjivanje aktivnosti ALP-a. ( e ) Kvantifikacija rezultata bojenja alizarin crvenim bojenjem. ( f ) BMP2, OSX, ALP, RUNX2, OPN i OC mRNA podvrgnute su PCR analizi u realnom vremenu za 10 dana. Razine ekspresije su normalizirane u vrijednosti β- aktina. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 nasuprot Diff + IL-1 β ( d i e ) ili IL-1 β skupina ( f ). Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Kao što je prikazano na slikama 4b-e, blokiranje NF- κ B povećavalo je razinu ALP-a i mineralizacije, a blokiranje MAPK-a povećalo prisutnost mineraliziranih nodula u PDLSC-ima. Ovi rezultati potvrđuju da NF- κ B i MAPK imaju negativne uloge u osteogenezi PDLSC-a. Ovo opažanje je dodatno potkrijepljeno rezultatima PCR-a u stvarnom vremenu (slika 4f), koji pokazuju da blokiranje aktivacije NF- κ B spašava ekspresiju BMP2 i gena markera osteoblasta ( OSX, RUNX2, ALP, OC i OPN ) na 10 dana, dok blokiranje P38 signala spašava proizvodnju BMP2, OSX, RUNX2 i OPN . Inhibicija JNK povećala je ekspresiju BMP2, OSX, RUNX2, OC i OPN , dok blokiranje aktivacije ERK nije imalo značajnog utjecaja na osteogenezu PDLSCs pod stimulacijom IL-1 β .

Inhibicija NF- κ B i P38 / MAPK reaktivira BMP / Smad signalizaciju reguliranu visokom dozom IL-1 β tretmanom

Kao što je ranije izviješteno, signalizacija NF- κ B i MAPK i signalizacija BMP / Smad imaju suprotne biološke funkcije tijekom upalnih i osteogenih procesa. 27, 28, 32, 33 Stoga smo hipotetirali da NF- κ B i MAPK inhibiraju PDLSC osteogenezu inhibicijom BMP / Smad signalizacije. Da bismo to testirali, korišteni su specifični inhibitori signalizacije NF- κ B i MAPK da inhibiraju aktivaciju NF- κ B i MAPK, a mi smo primijetili utjecaj ove inhibicije na aktiviranje signala BMP / Smad putem Western blot analize u 9 dana. Kao što je prikazano na slikama 5a i b, inhibicija NF- k B i P38 / MAPK dovela je do oporavka nivoa fosforilacije Smad1 / 5, dok blokiranje JNK i ERK nije pokazalo značajan učinak. Kolektivno, ovi rezultati sugeriraju preslušavanje između NF- κ B, MAPK i BMP / Smad signalizacije. NF- κ B i P38 / MAPK signalizacija inhibirala je diferencijaciju osteoblasta PDLSCs supresijom Smad1 / 5 fosforilacije, a čini se da NF- κ B i MAPK djeluju kao glavni posrednici za negativnu regulaciju osteogeneze PDLSC-ova.

Image

Karakteristike ekspresije koštanih morfogenetskih proteina (BMP) / SMAD signalnih molekula tijekom osteogene diferencijacije PDLSC u prisutnosti IL-1 β (6, 25 ng / ml) i inhibitora NF- κ B (Bay11-7085), p38 (SB203580 ), JNK (SP600125) i ERK (U0126) u 9 dana. ( a ) Razine fosforiliranog Smad1 / 5 te ukupni Smad1 / 5 i Smad4 tijekom 9 dana ispitivane su u lizatima cijelih stanica putem Western blottinga. ( b ) Prosječni omjeri fosforiliranog (p) -Smad1 / 5 / GAPDH izračunati su na temelju analize intenziteta sive pojaseve. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. * P <0, 05 nasuprot Diff + IL-1 β grupi. Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Poništavanje BMP2 blokira osteogenu diferencijaciju PDLSC-a induciranu niskom dozom IL-1 β

Hipotetizirali smo da BMP2 ima važnu ulogu u osteogenoj diferencijaciji induciranoj niskom dozom IL-1 β . Da bismo procijenili ovu hipotezu, prvo smo analizirali transkripciju BMP2 mRNA PDLSC-a liječenih testom aktivnosti luciferaze u malim dozama IL-1 β (Slika 6a). U usporedbi s kontrolnom skupinom, IL- 1P (0, 01 ng / ml) potaknuo je transkripciju BMP mRNA u 3, 6 i 9 dana.

Image

Propadanje koštanog morfogenetskog proteina 2 (BMP2) blokira osteogenu diferencijaciju PDLSC-a induciranu IL-1 β (0, 01 ng / ml). ( a ) Aktivnosti luciferaze promotora BMP2 detektirane su na 0, 1, 3, 6 i 9 dana i normalizirane na negativnu kontrolu. ( b ) Razine BMP2, fosforilirani Smad1 / 5 i ukupni Smad1 / 5 i Smad4 tijekom 6 dana ispitivane su u lizatima cijelih stanica putem Western blottinga. ( c ) Cijeli prikazi ploča i mikrografije alkalne fosfataze (ALP) koji se boje 7 dana, a alizarin crvenom bojom 21 dan. Šipke predstavljaju 100 µm. ( d ) Kvantitativno ocjenjivanje aktivnosti ALP-a. ( e ) Kvantifikacija rezultata bojenja alizarin crvenim bojenjem. ( f ) BMP2, OSX, ALP, Runx2, OPN i OC mRNA su podvrgnute PCR analizi u realnom vremenu za 10 dana. Razine ekspresije su normalizirane u vrijednosti β- aktina. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 nasuprot Diff ( a ) i Scramble grupi ( d - f ). Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali učinak BMP2 korištenjem malenog ometanja RNA (siRNA) posredovanog prigušivanja gena. Kao što je prikazano na slici 6b, analiza zapadnjačke mrlje pokazuje da je prigušivanje BMP2 značajno smanjilo razinu fosforilacije Smad1 / 5 u 6 dana, a kvantificirani rezultati prikazani su na dopunskoj slici 4. Nakon propadanja BMP2 aktivnost ALP u 7 dana (slike 6c i d) inhibicija alizarin crvenog obojenja na 21 dan bila je inhibirana (Slike 6c i e). Ekspresija gena za obilježavanje osteoblasta, uključujući ALP, RUNX2, OSX, OPN i OC , također je inhibirana nakon 10 dana (Slika 6f). Svi ovi podaci sugeriraju da BMP2 posreduje osteogeno diferenciranje PDLSC-a inducirano niskom dozom IL-1 β .

IL-1 β povećava hemotaksiju makrofaga i proizvodnju citokina PDLSC-a

Da bismo istražili ulogu PDLSC-a u inhibiranju osteogeneze i njihovu međusobnu interakciju s upalnim mikrookruženjem u modulaciji migracije makrofaga, proveli smo test kemotaksije. Prvo smo stavili PDLSC-ove (3 × 10 4 / jažicu) u donju transwell komoru. Osteogeni mediji s različitim koncentracijama IL-1 β (0–6, 25 ng / ml) dodani su nakon što su inkubirani PDLSC postigli 80% konfluenciju. Zatim smo posadili RAW 264.7 makrofage (3 × 10 5 / jažicu) s kulturom u gornju komoru ploča za prolazak. Nakon 24 sata, opazili smo povećanje broja stanica koje su prelazile iz gornje u donju komoru. To pokazuje da kada pod inhibiranjem osteogeneze IL-1P, PDLSC potiču hemotaksiju RAW 264.7 makrofaga (Slika 7a). Broj makrofaga je izbrojen i prikazani su na slici 7b. Da bismo dalje utvrdili kako PDLSC u kojima je inhibirana osteogeneza može utjecati na migraciju makrofaga i njihovu ulogu u upali, sljedeće smo ispitivali hemokine i citokine izražene u 24 h. Podaci pokazuju da se transkripcija CCL2 i CCL5 značajno povećala o dozi pod utjecajem IL-1 β stimulacije (0, 05–6, 25 ng / ml) (Slika 7c). Ekspresija upalnih citokina TNF- a i IL-6 povećala se na isti način (slike 7d i e), dok se ekspresija IL-1 β prvo značajno povećala liječenjem IL-1 β na 0–0, 25 ng / ml a zatim se postupno smanjivao za IL-1 β na 0, 25–6, 25 ng / ml, pokazujući da PDLSC-ovi pod inhibiranjem osteogeneze u upalnim mikro okruženjima povećavaju infiltraciju makrofaga i oslobađaju više upalnih medijatora, što može doprinijeti resorpciji kosti.

Image

Imunomodulatorni učinci na osteogeno diferenciranje PDLSC-a sa ili bez naznačenih koncentracija IL-1 β (0, 01–6, 25 ng / ml). ( a ) Transvelopovi su korišteni za određivanje migracije RAW 264.7 makrofaga u roku od 24 sata. Šipke predstavljaju 100 µm. ( b ) Kao u točki ( a ), broj stanica koje se kreću računa se pri povećanju × 200. ( c ) CCL2, CCL5 mRNA PDLSC-a podvrgnuta je PCR analizi u realnom vremenu u roku od 24 sata. Razine ekspresije su normalizirane u vrijednosti β- aktina. ( d ) TNF-α, IL-1β i IL-6 mRNA PDLSC-a podvrgnuti su PCR analizi u realnom vremenu u roku od 24 sata. Razine ekspresije su normalizirane u vrijednosti β- aktina. ( e ) Izlučene koncentracije TNF-a, IL-1p i IL-6 u supernatantu kulture PDLSC izmjerene su kemijskom analizom citokina kroz 24 sata. Izlučeni IL-lp izračunan je kao koncentracija supernatanta umanjena za početnu koncentraciju IL-lp. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 nasuprot Diff grupi. Svi su podaci dobiveni iz najmanje tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Rasprava

Ova studija istraživala je ulogu upalnog okruženja i mogućnost unakrsnog razgovora između signalnih putova NF- κ B, MAPK i BMP / Smad u regulaciji osteogene diferencijacije. Mi smo oponašali upalno mikrookruženje liječeći PDLSC-ove s IL-1 β u koncentracijama u rasponu od zdravih razina do razine pronađene u kroničnom parodontitisu i po prvi put pokazali da (1) postoji dvostruka uloga IL-1 β u modulaciji ovisna o dozi osteogeneza PDLSC-a; (2) mala doza IL-1 β pojačava diferencijaciju osteoblasta uglavnom kroz BMP / Smad-put, dok veće doze IL-1 β imaju inhibicijske učinke uglavnom kroz NF- κ B i MAPK put; (3) unakrsni razgovor izlazi između signalnih putova NF- κ B, MAPK i BMP / Smad koji modulira osteogenezu PDLSC-a; i (4) pod uvjetima koji inhibiraju osteogenezu, PDLSC povećavaju kemotaksiju makrofaga. (Slika 8).

Image

Shema učinka IL-1 β -oštrice s dvoreznim mačem na osteogenezu PDLSC-a putem unakrsnog razgovora između NF- κ B, MAPK i koštanog morfogenetskog proteina (BMP) / Smad

Slika pune veličine

Općenito je poznato da upalni citokini djeluju kao negativni modulatori u osteogenezi rezidencijalnih stanica. Neke studije su objavile da IL-1 inhibira osteogenezu MSC-a ili suzbija ekspresiju gena povezanih s osteoblastom. 7, 34 Međutim, drugi sukobljeni rezultati pokazuju da IL-1 β povećava osteogeni potencijal ljudskih MSC-a. 24, 35, 36 Moguće je da su ovi suprotni učinci IL-1 β povezani s razlikama u izvoru MSC-a i različitim koncentracijama IL-1 β i vremenu izloženosti. Iznenađujuće, našli smo dvostruku ulogu IL-1 β u modulaciji osteogeneze PDLSC-a. Pokazali smo da IL-1 β u nižim koncentracijama (0–0, 01 ng / ml) potiče osteogenezu PDLSC-a, dok IL-1 β u višim koncentracijama (0, 05–6, 25 ng / ml) inhibira osteogenezu. Nagađamo da upalni citokini prisutni u mikro okruženju mogu poslužiti kao važan modulator osteogeneze PDLSC-a, a slični nalazi su također pokazali da IL-1 β na mjestu prijeloma može modulirati zacjeljivanje kostiju.24 Dakle, ciljanje upalne mikrookoline moglo bi poboljšati uspjeh terapijskih pristupa za liječenje parodontitisa pomoću rezidentnih MSC-a.

Nizvodni signali IL-1 β puta uključuju NF- κ B i MAPK signalne putove. MAPK signali reguliraju se karakterističnim sustavom fosforilacije u kojem niz tri proteinske kinaze fosforiliraju i aktiviraju jedni druge. Ova signalizacija uključuje put ERK, put JNK i put P38 kinaze.37 Aktivacija NF- κ B ima važnu ulogu u nastanku upale i stanične proliferacije ili diferencijacije. 38 Ovdje pokazujemo da su staze NF- κ B, P38 / MAPK i JNK / MAPK, ali ne i put ERK / MAPK, postupno fosforilirani na način ovisan o dozi, nakon kratkog (10 min) tretmana IL-1 β , budući da inhibicija NF- κ B i MAPK upotrebom inhibitora NF- κ B (BAY11-7082), P38 (SB203580) i JNK (SP600125) djelomično spašavaju diferencijaciju osteoblasta koja je oslabljena na višim razinama IL-1 β ( 0, 05–6, 25 ng / ml).

Signalni putevi BMP / Smad imaju važnu ulogu u regulaciji diferencijacije osteoblasta, 29 a na tu signalizaciju mogu utjecati upalni faktori, uključujući TNF- α i LPS. 27, 35 Naša otkrića pokazuju da niska razina IL-1 β (0, 01 ng / ml) značajno povećava ekspresiju BMP2 u PDLSC i potiče aktiviranje BMP / Smad signalnog puta. To dovodi do pojačane ekspresije gena koji stvaraju osteoblast, uključujući OSX , ALP i OPN , ali ne i RUNX2 i rani OC . Neke studije pokazuju da BMP / Smad signalizacija može funkcionirati neovisno o RUNX2, dok ekspresija OSX inducirana BMP2 uglavnom posreduje Dlx5, ali ne i RUNX2.39 Međutim, u usporedbi s učincima niske razine IL-1 β ( 0, 01 ng / ml), viša razina IL-1 β (0, 05–6, 25 ng / ml) inhibira signalizaciju BMP / Smad na način ovisan o dozi.

Zabilježeno je da BMP ima biološke funkcije koje su suprotne onima NF-B i MAPK tijekom upalnih procesa. 27, 28, 32, 33 Nadalje smo istražili potencijalni presjek između BMP / Smad, NF- κ B i MAPK signalizacije. Suzbili smo NF- κ B i MAPK uporabom specifičnih inhibitora i otkrili da inhibicija NF- κ B i P38 / MAPK djelomično obnavlja razinu fosforilacije Smad1 / 5 pod tretmanom IL-1 β visoke doze. Stoga se dvostruka uloga IL-1 β može regulirati slijedećim mehanizmom: tretman s niskom dozom IL-1 β aktivira BMP / Smad signalizaciju za promicanje osteogene diferencijacije PDLSC, dok tretman IL-1 β u visokim dozama aktivira i NF - κ i MAPK staze, koji proizvode signale dovoljno jake da suzbijaju fosforilaciju Smad1 / 5, što dovodi do inhibicije osteogeneze.

Studije parodontalne bolesti sugeriraju ulogu hemokina CCL2 i CCL5 u migraciji makrofaga, 40 a citokini poput TNF- α , IL-1 β i IL-6 također doprinose aktiviranju osteoklasta i regrutnom regrutovanju stanica. 41, 42 Naši rezultati pokazuju da istodobno s oštećenom osteogenezom, PDLSC-ovi tretirani IL-1P mogu inducirati hemotaksiju makrofaga ekspresijom CCL2 i CCL5 i stvaranjem upalnih citokina, što pomaže u daljnjem objašnjavanju imunomodulatornih učinaka PDLSC-a u posredovanju imunoloških stanice i patogeneza parodontitisa.

Ukratko, naša studija pruža novi uvid u učinak IL-1 β s dvoreznim mačem pokazujući da različite koncentracije IL-1 β , u rasponu od fiziološki zdravih razina do one opažene u slučajevima kroničnog parodontitisa, imaju različite učinke na osteogeneza PDLSC-ova putem preslušavanja između signalnih putova NF- κ B, MAPK i BMP / Smad. Nadalje, u uvjetima koji inhibiraju osteogenezu, PDLSC povećavaju kemotaksiju makrofaga.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

MSC

mezenhimske matične stanice

PDLSC

matična stanica parodontalnog ligamenta

IL- 1P

interleukin-1 β

NF- κ B

nuklearni faktor κ B

MAPK

mitogen-aktivirana protein kinaza

GCF

gingivalna krevikularna tekućina

TNF- α

faktor nekroze tumora- α

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)