Poremećaj regulacije osnovnih komponenti scf kompleksa u poremećajima poli-glutamina | stanična smrt i bolest

Poremećaj regulacije osnovnih komponenti scf kompleksa u poremećajima poli-glutamina | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Huntingtonova bolest
  • neurodegeneracija
  • Patologija

Sažetak

Poli-glutamin (polyQ) bolesti su neurodegenerativni poremećaji karakterizirani ekspandiranim CAG ponavljanjima u uzročnim genima čiji proteini tvore inkluzijska tijela. Razne E3 ubikvitinske ligaze uključuju se u neurodegenerativne poremećaje. Izvješćujemo da je disfunkcija SCF (Skp1-Cul1-F-box proteina) kompleksa, jedne od najkarakterističnijih ubikvitinskih ligaza, povezana s patologijom kod poliQ bolesti poput Huntington-ove bolesti (HD) i Machado-Joseph-ove bolesti (MJD), Otkrili smo da su Cullin1 (Cul1) i Skp1, osnovne komponente SCF kompleksa, smanjeni u mozgu HD miševa. Smanjenje razine Cul1 opaženo je i kod ćelijskih HD modela i letećih modela HD i MJD. Pokazujemo da je Cul1 sposoban genetski modificirati mutantne agregate za lov, jer njegovo prigušivanje rezultira povećanim opterećenjem agregata u uzgojenim stanicama. Nadalje, pokazujemo da prigušivanje dCul1 i dSkp1 u Drosophili rezultira povećanim opterećenjem agregata i pojačanom toksičnošću izazvanom poliQ-om. Naši rezultati pokazuju da smanjena razina SCF kompleksa može doprinijeti patologiji polyQ bolesti.

Glavni

Huntington-ova bolest (HD) je dobni neurodegenerativni poremećaj koji se očituje kao motoričko, psihijatrijsko i kognitivno oštećenje. 1 Spada u skupinu bolesti zvanih poli-glutamin (polyQ) bolesti, koje su u svojim uzročnim genima proširile ponavljanje trinukleotida (kodirajući glutamin). HD je autosomno dominantan i manifestira se kada broj CAG-a koji se ponavlja u egzonu1 gena Huntingtin prelazi 37. 2 Spinocerebelarna ataksija 3 / Machado-Josephova bolest (SCA3 / MJD) također pripada ovoj kategoriji neurodegenerativnih bolesti i uzrokovana je ekspanzijom CAG-a ponavlja se u genu Ataxin3 . 3 Gotovo sve neurodegenerativne bolesti, uključujući poliQ bolesti, karakterizira prisutnost proteinskih agregata za koje se vjeruje da su toksični i uzrokuju smrt neurona. 4

Za proučavanje molekularnih osnova HD patologije u nadi da će se objasniti potencijalni terapeutski ciljevi koriste se različiti sustavi modela. 5 Sustavi koji nisu sisavci poput drosofila i stanični modeli korisni su za ispitivanje potencijalnih genetskih modifikatora mutantnih agregata za lov. Na primjer, prekomjerna ekspresija ekson1 gena Huntingtin gena s proširenim CAG ponavljanjima u Drosophili rezultira stvaranjem proteinskih agregata i naknadnom neurodegeneracijom. 6, 7 Kada se izraze u fotoreceptorskim neuronima muha, vidna je degeneracija mrežnice povezana s godinama. U staničnom modelu, ekspresija mutiranih Huntingtin gena rezultira stvaranjem peruklearnih agregata. 8 Transgenetski model miša R6 / 2 za HD dobro je utvrđen model miševa koji izražava mutirani humani Huntingtin ekson1 s 150 CAG ponavljanja. 9 Ovi miševi pokazuju tešku neurodegeneraciju povezanu s godinama kako je testirana biokemijskim i ponašanjem.

Sustav ubikvitin proteosom (UPS) jedan je od sustava kontrole kvalitete koji se koriste za održavanje stanične cjelovitosti. Pokazalo se da su proteinski agregati različitih neurodegenerativnih bolesti pozitivni na ubikvitin, a vjeruje se da je funkcioniranje UPS-a kod ovih bolesti ugroženo. 10, 11 UPS uključuje funkcioniranje tri enzima - E1, E2 i E3, kaskadno, koji označavaju pogrešno razgrađene proteine ​​ubikvitinom što rezultira njihovom naknadnom razgradnjom kroz proteosom. Od toga su E3 ligaze odgovorne za specifičnost supstrata. Pored toga, E3 ligaze su uključene u patogenezu različitih neurodegenerativnih bolesti, uključujući polyQ bolesti. 12, 13, 14, 15, 16, 17 SCF kompleks (Skpl-Cul1-F-box protein) jedna je od najkarakterističnijih E3 ligaza. U ovom kompleksu, Cullin1 (Cul1) djeluje kao skeletni protein čija N-terminalna regija veže Skpl, a C-terminalna regija veže protein RING prsta nazvan Rbx1. Skp1, zauzvrat, može vezati različite F-box proteine ​​koji pružaju supstratnu specifičnost kompleksa. 18 Na primjer, poznato je da kada SCF kompleks veže protein F-box β -TrCP1, on razgrađuje β- katenin. 19 Povrh toga, nedavno je pokazano da Nedd8, 8-kDa protein, veže Cul1, a ovo nediliranje Cul1 važno je za njegovu aktivnost. 20 Uloga SCF kompleksa kao regulatora staničnog ciklusa u aktivnom dijeljenju stanica već je dobro utvrđena. 21 Međutim, Cul1 i Skp1 prisutni su i u post-mitotičkim stanicama neurona, a njihovu funkciju tek treba razjasniti. 22, 23 Pokazano je da oborenje Cul1 u primarnom mišjem srednjem mozgu, kao i kortikalna kultura, čine neurone osjetljive na smrt, sugerirajući da Cul1 može imati ulogu u održavanju integriteta post-mitotičkih neurona. 24 To znači da bi njihova disfunkcija mogla rezultirati neurodegeneracijom.

Mandel i kolege 25, 26, 27, 28 pokazali su da prigušivanje Skp1 u modelima Parkinsonove bolesti dovodi do narušenog funkcioniranja i preživljavanja dopaminergičnih neurona i rezultira stvaranjem agregata sličnih Lewyjevim tijelima, koji su obilježje bolesti. Međutim, malo je dostupnih podataka o statusu SCF kompleksa u poremećajima polyQ poput HD, iako su jezgrene komponente kao i interaktivni partneri SCF kompleksa poput cul1 , Skp1 i nedd8 među mnogim genima koji su identificirani kao modifikatori mutantnih lovnih agregata u Drosophili , u dva neovisno izvedena RNAi ekrana. 29, 30

U ovoj smo studiji istražili status Cul1 i Skp1 SCF kompleksa u staničnim, muhastim i mišjim HD modelima. Također smo genetski manipulirali Cul1 i Skp1 u Drosophili i pokazali posljedičnu modulaciju fenotipa bolesti. Naši nalazi u HD-u potvrđeni su u letećim modelima i za MJD / SCA3 i za proširena polyQ ponavljanja. Zajedno, naši rezultati sugeriraju da smanjena aktivnost SCF kompleksa pogoršava patogenezu polyQ bolesti.

Rezultati

Razine proteina Cul1 i Skp1 snižene su u R6 / 2 transgeničnom mišjem modelu HD

Istražujući status osnovnih komponenti SCF kompleksa u mozgu divljeg tipa miševa, otkrili smo da su endogeni protein Cul1 i Skp1 detektirani u imunoblotu lizata napravljenog od korteksa i moždanog tkiva i 6–8- i 12–14- tjedana stari miševi. Kada su uspoređene razine proteina Cull između HD miševa i njihovih divljih vrsta, u usporedbi s dobom, opaženo je značajno 30% smanjenje kod HD miševa u obje dobi (slike 1a i b; blot je prikazan samo u dobi od 6-8 tjedana miševa). U HD-u, utvrđeno je da se brojni proteini reduciraju u citosolu jer se regrutiraju do netopljivih agregata. Kad se moždani dijelovi oboje za ove proteine, agregati su vidljivi kao guste strukture u jezgri (dopunska slika 1). Kako bi se provjerilo da li je smanjenje topljivog Cull također posljedica njegova regrutovanja u agregate, imunohistokemija je provedena na moždanim dijelovima miševa pomoću Cull antitijela (Slika 1c). Iako je smanjena ekspresija proteina Cull očitana u kortikalnom i cerebelarnom presjeku, nije pronađeno da Cull kokalizira lokalizaciju sa mutiranim agregatima lovačke kiseline.

Image

Endogeni Cull u mozgu R6 / 2 transgenih HD miševa. ( a ) Imunoblot Cull u lizatima korteksa i moždanog mišića divljeg tipa i HD miševa starih 6–8 tjedana. GAPDH koristi se kao kontrola opterećenja. ( b ) Kvantifikacija Cul1 u mozgu i moždanu moždinu mozga HD miševa. Kvantifikacija je izvršena pomoću softvera za analizu slike NIH. Vrijednosti su srednje ± SEM za tri različita miševa u svakoj skupini. * P <0, 05 u odnosu na kontrolu (jednosmjerna ANOVA). ( c ) Imunohistokemija na odsjecima mozga 6-8 i 12-14 tjedana miševa koji koriste Cull antitijelo. Postoji smanjenje proteina Cul1 u mozgu HD miševa, ali ne postoji lokalizacija lokalizacije agregata. GCL, zrnati stanični sloj; PL, sloj Purkinje. Slike su snimljene objektivom × 40 (ljestvica skale: 20 µm)

Slika pune veličine

Nadalje, s obzirom da se zna da je Skp1 sastavni dio SCF kompleksa i da komunicira s Cull, mi smo analizirali njegove razine na divljim i HD miševima. Slično kao u Cul1, opaženo je značajno 30% smanjenje nivoa Skp1 u korteksu i moždini HD miševa starijih od 6 do 8 tjedana u imunoblotu (slike 2a i b) i imunohistokemiji na dijelovima mozga (slika 2c). Smanjena razina članova SCF kompleksa trebala bi dovesti do nakupljanja njegovih supstrata. Prema dogovoru, otkriveno je da se β- katenin nakuplja u korteksu HD miševa starih 6 do 8 tjedana (dopunska slika 2).

Image

Endogeni Skp1 u mozgu HD miševa. ( a ) Imunoblot Skpl u lizatama korteksa i moždanog mišića divljeg tipa i HD miševa starih 6–8 tjedana. GAPDH koristi se kao kontrola opterećenja. ( b ) Kvantifikacija Skp1 u korteksu i moždini mozgova divljeg tipa i HD miševa. Vrijednosti su srednje ± SEM; n = 3. * P <0, 05 u odnosu na divlje vrste miševa (jednosmjerna ANOVA). ( c ) Imunohistokemijsko bojenje Skp1 u odjeljcima mozga divljeg tipa i HD-miševa starih 6 do 8 tjedana. GCL, zrnati stanični sloj; PL, sloj Purkinje. Slike su snimljene objektivom × 40 (ljestvica skale: 20 µm)

Slika pune veličine

Razine Cul1 snižene su u staničnom HD modelu, a njegova prekomjerna ekspresija ima dominantan negativan učinak na agregaciju mutantnih lova

Koristili smo dobro utvrđeni stanični model HD, gdje je skraćeno N-terminalni lov (tNhtt) sa 150Q ponavljanja spojen na GFP inducirano izražen. 8 Stanična linija dobila je ime HD-150Q. Endogena razina Cull određena je u stanicama HD-150Q u kojima je mutirani lovintin induciran 12 h primjenom 1 µM ponasterona A i uspoređivan s neinduciranom kontrolom. Primijećeno je snažno smanjenje razine Cul1 (60%) nakon indukcije mutantnog lova (slika 3a i b). Ovo smanjenje je bilo vidljivo i imunološkom bojom, jer stanice sa agregatima pokazuju smanjenu razinu Cull u usporedbi s onima bez njih (Slika 3c). Kao što se može vidjeti u odjeljcima mozga miševa, nije pronađeno da je endogeni Cull lokaliziran pomoću agregata za lov.

Image

Cul1 u ćelijskom modelu HD. ( a ) Imunoblotska analiza Cull u HD-150Q stanicama u kojima je 12 sati induciran mutantni lov s ponasteronom A (1 µM). GAPDH koristi se kao kontrola opterećenja. ( b ) Kvantifikacija Cull pokazuje značajno smanjenje ( * P <0, 001; n = 5) razine endogenog proteina nakon indukcije mutantnog lovnog luka u usporedbi s neinduciranim kontrolnim stanicama. ( c ) Fluorescentno bojenje Cull u HD-150Q stanicama pokazuje pad njegove razine. Linija mjerila: 10 μ m. ( d ) HD-150Q stanice su transficirane 24 h sa myc-označenim hCull. Mutantni lov na indukciju induciran je 12 sati, a zatim podvrgnut imunofluorescentnom obojenju myc radi otkrivanja prekomjerno eksprimiranog hCul1. Linija mjerila: 10 μ m. ( e ) Prebrojavanje agregata pokazuje da je postotak stanica transficiranih hCul1 koje sadrže agregate značajno više ( * P = 0, 015; n = 3, Studentov t- test) od kontrolnih stanica

Slika pune veličine

Zabilježeno je da prekomjerno izraženi skraćeni, kao i cjeloviti Cul1 djeluju dominantno negativno i smanjuju aktivnost endogenog proteina u Drosophila C. elegans , kao i u staničnoj kulturi sisavaca. 31, 32 Stoga smo transficirali stanice HD-150Q s ljudskom Cul1 cijelom dužinom (slika 3d) kako bismo provjerili utječe li na skupljeno opterećenje nakon porasta razine Cul1. Za to je broj agregata u transfektiranim stanicama ručno odbrojen i uspoređen s onim u stanicama koje su transficirane s praznim vektorom. Otkriveno je da je postotak transficiranih stanica koji sadrže agregate značajno veći nego u kontroli (slika 3e). Činjenica da prekomjerno eksprimiranje hCul1 povećava ukupno opterećenje u staničnoj kulturi, podrazumijeva, u dogovoru s ranijim studijama, 25, 26 da djeluje na dominantno-negativan način i Cull je doista u stanju genetski modificirati mutantne agregate za lov. Stoga smo istražili ovu mogućnost pomoću Drosophila HD modela.

Moduliranje razine dCul1 i dSkp1 u Drosophili

Da bismo provjerili učinak prekomjernog ekspresije Cul1 u cijeloj dužini u muhama, stvorili smo transformatorske muhe kloniranjem hCul1 iz pcDNA3 u pUASTattB i provodeći transformaciju usmjerenu na mjesto (vidi Materijali i metode). Paralelno s tim, dobivene su RNAi linije od VDRC, Beč, kako bi se utišala endogena ekspresija dCul1 i dSkp1. Ekspresija ovih transgena na GMR-GAL4 na oku specifičan način nije uzrokovala letalnost (tablica 1a), ali u obje dCul1 modifikacije oči su pokazale grubi fenotip u usporedbi s odgovarajućim roditeljskim kontrolama (slika 4a). Iznenađujuće, utišavanje dSkp1 u očima pomoću RNAi nije rezultiralo grubom mrežom. Vanjska morfologija oka vidljiva je na fotografijama, kao i otisci laka na noktima. Otisci laka na noktima normalnih očiju prikazuju organizirani ommatidijalni raspored, koji je poremećen u mušicama koje spuštaju dCul1 ili prekomjerno eksprimiraju hCul1, ali ne i u onima koji smanjuju dSkp1 (slika 4a). Protein izvađen iz glave muha pokazao je očekivano povećanje ili smanjenje razine Cul1 u usporedbi s divljim tipom (OregonR + ) (slika 4b), kao i očekivano smanjenje razine dSkp1 na RNAi u usporedbi s kontrolama (Slika 4c).

Tablica pune veličine

Image

Moduliranje razine dCul1 i dSkp1 u očima Drosophila . ( a ) Gornja ploča - Vanjska morfologija površine oka Drosophila koja izražava ili dCul1 RNAi ili UAShCul1 u očima pokazuje blago okrvavljene oči u usporedbi s kontrolom. dSkp1 RNAi u očima ne rezultira grubom mrežnicom. Donja ploča - otisak kontrole laka za nokte pokazuje paralelne nizove šesterokutne ommatidije i ta se pravilna struktura gubi kada se utiša dCul1 ili je hCul1 prekomjerno izražen, ali ne i kada je srušen dSkp1. ( b ) Imunoblotska analiza i kvantifikacija promjene nabora u dCul1 na ekstraktima kontrolnih muha (staza 1) u usporedbi s prekomjernim pritiskom muha (traka 2, * P = 0, 0005; n = 3) i drenjem regulacije dCul1 (traka 3, * P = 0, 001 ; n = 3). Korištena je jednosmjerna ANOVA praćena Holm-Sidak post-hoc testom. P- aktin koji se koristi kao kontrola opterećenja. ( c ) Imunoblot i kvantificiranje promjene nabora u dSkp1 na ekstraktima kontrolnih muha (linija 1) u usporedbi s mušicama koje spuštaju dSkp1 (traka 2, * P = 0, 0004 koristeći Studentov t- test; n = 3). P- aktin koji se koristi kao kontrola opterećenja

Slika pune veličine

Razina proteina dCul1 i RNA snižene su u letećem modelu HD

Ljudski Huntingtin gen ekson1, koji sadrži 93 poliQ ponavljanja (HTT-EXON1-PQ93), izražen je u očima muva koristeći GMR-GAL4 pokretač. Muhe su stare 15 dana kako bi se omogućila degeneracija mrežnice. Kad su ispitivane lizate glave ovih muha na endogeni dCul1, opaženo je značajno (oko 30%) smanjenje proteina dCul1 u mušicama HD u usporedbi s GMR-GAL4 kontrolama koje odgovaraju dobi (Slika 5a). DCul1 RNA je također značajno smanjena u mušicama HD (slika 5b), što ukazuje da ekspresija ekspandiranog proteina polyQ utječe na transkripciju gena dCul1 .

Image

dCul1 u HD mušicama. ( a ) Imunoblotska analiza endogenog dCull u lizatima glave muha iz HD-a od 15 dana u usporedbi s kontrolama dobi prilagođenim dobi. P- aktin koji se koristi kao kontrola opterećenja. Kvantifikacija intenziteta dCul1 opsega pokazuje značajno smanjenje njegove razine ( * P = 0, 0013 koristeći Studentov t- test; n = 5). ( b ) RT-PCR analiza dCul1 transkripta u lizatima glave muha iz 15 dana stare HD muhe u usporedbi s kontrolama koje se podudaraju sa dobi. RP49 koji se koristi kao kontrola opterećenja. Kvantifikacija pokazuje značajno smanjenje ( * P <0, 001 koristeći Studentov t- test; n = 5) dCul1 transkripta. ( c ) Vanjska morfologija (gornja ploča) i otisci laka na noktima (donja ploča) očne površine Drosophila s dCul1 RNAi u prisustvu Htt -exon1 koji sadrži 93 poliQ ponavljanja u usporedbi s kontrolom. RNAi dCul1 pojačava degeneraciju mrežnice (strelica) u HD mušicama kao što je vidljivo na fotografijama očiju, kao i poremećaj ommatidijskih nizova

Slika pune veličine

Šutnja dCul1 ubrzava patogenezu bolesti kod muha iz HD

Kako bi se utvrdilo može li dCul1 modificirati HD patogenezu u muhama, dCul1 RNAi koekspresioniran je s HTT-EXON1-PQ93 pod kontrolom vozača GMR-GAL4 . Iznenađujuće, ovaj križ rezultirao je smrtonosnošću muha jer je samo 9% potomstva koje je pomračilo sadržavalo sva tri transgena, za razliku od očekivanih 25% (Tablica 1b). Također, oči svih preživjelih odraslih osoba imale su hrapavu mrežnicu s pojačanom degeneracijom, što je rezultiralo lukastom strukturom na oku (strelica na slici 5c). Ommatidalni nizovi, kako su otkrili otisci laka na noktima, 33, bili su mnogo oštećeniji nego kod kontrolnih muha GMR-GAL4 / UASHTT-EXON1-PQ93 .

Razina proteina dCul1 i RNA snižene su u modelu MJD-a, a prigušivanjem se poboljšava degeneracija mrežnice

MJD je još jedna neurodegenerativna bolest uzrokovana proširenim ponavljanjem polyQ Ataxina3. Prekomjerna ekspresija humanog Ataksina3 sa 78 polyQ ponavlja GMR-GAL4, što rezultira degeneracijom mrežnice i služi kao model za drugu poliQ bolest kod muha (MJD muhe). 34 Slično kao HD, i razina proteina dCull i RNA bile su smanjene u mušicama MJD u usporedbi s kontrolama (slike 6a i b). Pored toga, kada se dCul1 RNAi koeksprimirao s UASMJD-PQ78 (s), to je rezultiralo smrtonosnošću muha (tablica 1b), a nekolicina GMR-GAL4 / UASMJD-PQ78 (s); odrasli koji su se pojavili UASdCUL1-RNAi pokazali su se poboljšanima degeneracija u usporedbi s kontrolnim mušicama i pojava gustih crnih mrlja u oku (slika 6c).

Image

dCul1 u MJD leti. ( a ) Imunoblotska analiza endogenog dCull u lizatima glave muha MJD u usporedbi s kontrolom. P- aktin koji se koristi kao kontrola opterećenja. Kvantifikacija pokazuje značajno smanjenje ( * P <0, 001 koristeći Studentov t- test; n = 3) dCul1 proteina. ( b ) RT-PCR analiza dCul1 transkripta u lizatima glave muhe MJD u usporedbi s kontrolom. RP49 koji se koristi kao kontrola opterećenja. Kvantifikacija pokazuje značajno smanjenje ( * P <0, 001 koristeći Studentov t- test; n = 5) dCul1 transkripta. ( c ) Vanjska morfologija (gornja ploča) i otisci laka na noktima (donja ploča) očne površine Drosophila s dCul1 RNAi u prisutnosti 78 poliQ ponavljanja u Ataxin3 u usporedbi s kontrolom. RNAi dCul1 pojačava degeneraciju mrežnice u MJD mušicama, što je vidljivo kao tamne crne mrlje na očima na fotografijama, kao i poremećaj ommatidijalnih nizova

Slika pune veličine

Šutnja dSkp1 u mušicama HD i MJD pojačava degeneraciju mrežnice

Kako bi se potvrdilo da je povećanje patogeneze HD i MJD nakon manipulacije u razinama dCul1 zbog njegove uloge u kompleksu SCF, dSkp1, još jedna jezgra SCF-a ušutkana je pomoću RNAi. dSkp1 RNAi u HD modelu letenja rezultirao je smrtonosnošću (tablica 1b), a preživjeli odrasli ljudi imali su pojačanu degeneraciju mrežnice (slika 7a). Kod muha MJD-a nije primijećena drastična smrtonosnost, umjesto svih GMR-GAL4 / UASMJD-PQ78 (s); UASdSKP1-RNAi muhe koje su se pojavile imale su crne mrlje na očima (slika 7b). Dakle, knockdown dSkp1 također povećava toksičnost polyQ bolesti, što ukazuje na uključenost SCF kompleksa u patogenezu ovih bolesti.

Image

Učinak prigušivanja dSkp1 u HD i MJD mušicama. ( a ) Tiho dSkp1 u mušicama HD rezultira pojačanom degeneracijom u obliku velikih crnih mrlja, što je vidljivo u vanjskoj morfologiji (gornja ploča) i otiscima laka na noktima (donja ploča) oka. ( b ) Šutnja dSkp1 u mušicama MJD pojačava degeneraciju, a u očima su vidljive crne mrlje. Prikazani su vanjska morfologija (gornja ploča) i otisci laka za nokte (donja ploča) oka

Slika pune veličine

Šutnja dCul1 i dSkp1 povećava opterećenje agregata i pojačava polyQ toksičnost

Željeli smo provjeriti je li štetni učinak prigušivanja dCul1 i dSkp1 ograničen na HD i MJD ili se uopće može proširiti na polyQ bolesti. U tu svrhu, aktivni dCul1 smanjen je prekomjernim pritiskom dominantno-negativnog hCul1 ili upotrebom dCul1 RNAi u mušicama koje izražavaju HA-označene 127 glutaminskih ponavljanja (127Q) pod kontrolom vozača GMR-GAL4 . Slično tome, dSkp1 je smanjen pomoću RNAi kod GMR-GAL4.UAS127Q muva. Ovi križevi rezultirali su ekstremnijim fenotipom. Nađeno je da vrlo malo (0–4% umjesto očekivanih 50%) potomstva sadrži sva tri transgena (Tablica 1c). Čvrsta eklozija muha s RNAi ili transgeneracijskim transgenskim i ravnotežnim kromosomom iz istog križa, služila je kao unutarnja kontrola za uvjete rasta.

Ispitivanje očiju preživjelih GMR-GAL4.UAS127Q; UASdCUL1-RNAi i GMR-GAL4.UAS127Q; UASdSKP1-RNAi muha (nema GMR-GAL4.UAS127Q; UAShCUL1 odraslih zatvorenih) otkrilo je pretjerano oštećenje oka u usporedbi s GMR-GAL4 .UAS127Q kontrole (slika 8a). Ovo je oštećenje bilo vidljivo na razini brze vanjske morfologije oka, kao i ommatidijalnog rasporeda. Analizirali smo učinak prigušivanja dCull i dSkp1 na polyQ agregate obojenjem stražnjih trećih instalacijskih larinških diskova u HA antitijelo. Skupno opterećenje bilo je značajno veće kada su aktivne razine dCull smanjene ili prekomjernom ekspresijom dCull RNAi ili hCull, ili je dSkp1 smanjen RNAi (Slika 8b). Ova opažanja ukazuju na ovisnost opterećenja i toksičnosti polyQ od funkcioniranja SCF kompleksa u Drosophili .

Image

Učinak moduliranja razine dCul1 i dSkp1 na polyQ koji izražava transgene muhe. ( a ) Vanjska morfologija (gornja ploča) i otisci laka na noktima (donja ploča) očne površine Drosophila s dCul1 ili dSkp1 RNAi uz prisustvo 127 polyQ ponavljanja u usporedbi s kontrolama GMR-GAL4.UAS127Q . Smanjenje regulacije i dCul1 i dSkp1 pojačava polyQ toksičnost što se vidi kod pogoršanja degeneriranih očiju i pojave crnih mrlja. ( b ) Imunoziranje HA-označenih 127 poliQ agregata (korištenjem HA protutijela) u razvijajućem očnom imaginalnom disku ličinki trećih primjera. Smanjena regulacija dCul1 ili dSkp1 i prekomjerna ekspresija hCul1 dovode do porasta ukupnog opterećenja. Linija mjerila: 10 μ m

Slika pune veličine

Rasprava

Nedavno je dCul1, zajedno s dCul3, uključen u razvoj oka u Drosophili . 35 Dakle, ne čudi što utišavanje dCul1 u oku muha rezultira lagano iscrpljenom mrežnicom. Međutim, intrigantno dSkp1-RNAi u oku nije rezultirao grubljim okom. U svom radu, Ou i sur. 35 su se obratili ulozi dCul1 i dNedd8 u razvijajućem diskidu oka putem mutantnih i klonalnih analiza, ali nisu izvijestili o oštećenjima na očima odraslih. U ovom radu nismo analizirali nedostatke u razvoju maštovitih diskova oka, te stoga naš rad ne isključuje ulogu dSkp1 u razvoju oka. Međutim, to također ne isključuje činjenicu da dCul1 može djelovati neovisno o dSkp1 u procesu razvoja oka u muha.

Šutnja dCul1 RNAi ili prekomjerna ekspresija dominantno-negativnog hCul1 i prigušivanje dSkp1 od strane RNAi u očima ne utječu na ekloziju odraslih muha, što ukazuje na to da ovi konstrukti nisu smrtonosni kad ih sami u očima izraze. Stoga je bilo iznenađujuće primijetiti da je prigušivanje dCul1 i dSkp1 u očima kod modela polyQ bolesti HD, SCA3 i umjetnog HAQ označenog polyQ konstrukta rezultiralo smrtonosnošću muha. Ova smrtonosnost ukazuje na to da je povećana toksičnost polyQ i to potvrđuje činjenica da preživjeli odrasli pokazuju pogoršanu degeneraciju mrežnice u odnosu na kontrolu. Pojačanje GMR-GAL4 -driven toksičnosti polyQ u nekim drugim genotipima također je poznato da rezultira visokom letalnošću zjenica. 7 Imginalni diskovi larvalnog oka pokazuju povećano ukupno opterećenje nakon smanjenja Skp1 RNAi i dCul1 RNAi ili prekomjerne ekspresije dominantno-negativnog hCul1, što uspoređuje pretjeranu degeneraciju mrežnice opaženu u preživjelim muhama odraslih. Pojačano agregatno opterećenje nakon ekspresije dominantno negativnog hCul1 konstrukta je također primijećeno u staničnoj kulturi, što ukazuje da ovaj učinak SCF kompleksa na mutirane lovne agregate nije svojstven samo modelu muha.

U ovom radu utvrdili smo da se endogeni protein Cul1 smanjuje na mišjim, staničnim i letećim modelima HD. Također je smanjen u letećem modelu MJD. Ovo smanjenje razine proteina vjerojatno se događa na nivou transkripcije, jer je otkriveno da je obilje mRNA transkripta uvelike smanjeno kod modela muhe obje bolesti. Smatra se da je transkripcijska disregulacija zaštitni znak poliQ bolesti, možda zbog činjenice da su agregati odvojeni različiti transkripcijski faktori. 36 Očekuje se da će poremećaj SCF funkcije u HD-u i MJD-u rezultirati u nakupljanju njegovih supstrata. SCF kompleks potencijalno ima široku mrežu supstrata zbog činjenice da se može vezati s čak 70 F-box proteina. 18 Većina njegovih poznatih supstrata, poput β- katenina, P21, P27 i ciklina E, uključena je u regulaciju staničnog ciklusa. 37 Vjeruje se da kod neurodegenerativnih bolesti disregulacija staničnog ciklusa također pridonosi apoptozi i smrti neurona. 38 Kao što se očekivalo, zbog smanjene razine komponenata E3 ligaze, SCF-a i naknadne akumulacije proteina povezanih s ciljanim staničnim ciklusom, zabilježeno je povećanje razine β- katenina kod bolesnika s HD, kao i kod staničnih, muhe i mišji modeli HD i drugih neurodegenerativnih bolesti. 39 Nadalje, Godin i kolege 19 pokazali su da se štetni učinak mutantnih agregata za lovački luk može ukloniti u Drosophili prekomjernim pritiskom Slimb-a , Drosophila homologa β-TrCP , što u kombinaciji s SCF kompleksom rezultira razgradnjom β- katenina, Naš rad sugerira da bi različiti drugi akumulirani SCF supstrati također mogli pridonijeti toksičnosti i smrti neurona i, prema tome, također bi mogli biti potencijalno ciljani u terapeutske svrhe.

Neke prethodne studije sugeriraju povezanost SCF-a i neurodegenerativnih bolesti, uključujući poliQ bolesti poput MJD i dentatorubralno-pallidoluizijsku atrofiju. Na primjer, otkriveno je da je Nedd8, protein neophodan za aktivnost Cul1, ko-lokaliziran s inkluzijskim tijelima u odjeljke mozga kod različitih bolesnika s neurodegenerativnom bolešću. 40, 41 Uz to, izviješteno je da prigušivanje cul1 , skr1 i rbx1 ( C. elegans homolozi sastojaka SCF-kompleksa) pojačava paralizu uzrokovanu poliQ-om u nematodama. 42 U ovom radu pokazujemo da Cul1 i Skp1 modificiraju neurodegeneraciju u HD, MJD i umjetnom polyQ ekspanziji u fly modelima. S obzirom na izvješća u drugim modelima poliQ bolesti i naše podatke ovdje iznesene, vjerojatno je da su i Cul1 i Skp1 također uključeni u druge neurodegenerativne bolesti. Istraživanje uloge SCF kompleksa u letu i drugih modela ovih drugih bolesti moglo bi na taj način dati uvid u zajedničke aspekte njihove patogeneze.

Materijali i metode

HD transgeni miševi

Ženke s transplantiranom jajničnom hemizigotom koje nose htt exon1 s otprilike 150 CAG ponavljanja (naziv soja - B6CBA-Tg (HDexon1) 62Gpb / 3J) dobivene su iz laboratorija Jackson (Bar Harbour, ME, USA) i održavane su križanjem s mužjacima B6CBAF1 / J, Svi pokusi na životinjama provedeni su u skladu s odobrenjem Institucionalnog odbora za etiku životinja Nacionalnog centra za istraživanje mozga, Manesar. Genotipizacija je izvedena prethodno opisanom metodom. 9 životinja je ubijeno dislokacijom vrata maternice, mozgovi su pažljivo secirani i pohranjeni na -80 ° C.

imunohistokemija

Transgeni (R6 / 2) i divlji miševi u dobi od 6–8 i 12–14 tjedana bili su anestezirani i perfuzirani s 4% PFA. Mozak je zatim seciran i obrađen za kriosekciju kako bi se dobili dijelovi debljine 20 μm. Odjeljci su zatim obrađeni za imunohistokemiju korištenjem reagensa iz Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). Ukratko, nakon uzimanja antigena 45-minutnom inkubacijom na 70 ° C, presjeci su blokirani i ispitivani pomoću zečjeg anti-Cul1 (1: 100, Abcam, Cambridge, MA, SAD), zečjeg anti-Skp1 (1: 100, stanica Signaling, Danvers, MA, SAD) ili zečji anti-ubikvitin (1: 500, Dako, Glostrup, Danska). Biotinilirana sekundarna antitijela korištena su u razrjeđivanju od 1: 250, a signal je pojačan korištenjem ABC kompleta (Vector Laboratories). Bojenje je vizualizirano pomoću ImmPACT Novared Peroxidase supstrata (Vector Laborations). Slike su snimljene u svijetlom polju pomoću Leica (Wetzlar, Njemačka) DM RXA2 mikroskopa i × 40 cilja.

Stanična kultura

Stabilna stanična linija HD-150Q, koja sadrži ekdizon-inducibilnu konstrukciju pIND-tNhtt-150Q-GFP, već je opisana. 8 Stanični kulturi i goveđi serum fetusa (FBS) dobiveni su od Gibca. Stanice su održavane na DMEM-u, uz dodatak toplinski inaktiviranog 10% FBS-a i antibiotika (0, 4 mg / ml Zeocina i 0, 4 mg / ml G418). Oni su prolazno transficirani s pcDNA3-myc-CUL1 ili pcDNA3.1 (prazan vektor) pomoću reagensa Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Proizvodnja agregata označenih s GFP tNhtt-150Q inducirano je na naznačeno vrijeme upotrebom 1 μM ponasterona A (Invitrogen).

Imunoziranje i kvantifikacija agregata

Stanice su fiksirane u 4% PFA 30 minuta na sobnoj temperaturi, zatim obrađene za imunofluorescenciju kako je ranije opisano. 43 Endogeni Cull obojen je pomoću zečjeg anti-Cull (1: 1000, Abcam) i transficiran Cull koristeći mišji anti-c-myc (1: 1000, Biotehnologija Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Alexafluor 594 konjugirani anti-zečji ili antimišji (1: 500, Invitrogen) korišten je kao sekundarno antitijelo. Za brojanje agregata, stanice su uzgajane u dijapozitivima s dvije jažice, transfektirani myc-hCUL1 i agregati su inducirani ponasteronom A tokom 12 h. Nasumične slike rađene su u regijama svake komore tako da se u komoru može prebrojati najmanje 75 transficiranih i kontrolnih stanica. Četiri neovisne komore korištene su za usporedbu postotka transficiranih stanica koje sadrže agregate za kontrolu.

Leteće zalihe

Zalihe su održavane na 25 ± 1 ° C u inkubatorima BOD na standardnoj hrani sa kvascima sa šećerom koja sadrži nipagin i propionsku kiselinu radi sprečavanja bakterijske i gljivične kontaminacije. RNAi zalihe su dobivene od VDRC (brojevi dionica - 42445, 108558, 33406 za dCul1 i 46605, 46607 za dSkp1 ). U ovom istraživanju generirane su muhe prekomjerne ekspresije hCul1 ( w - ; +; UAShCUL1 / TM6B ). Ostale zalihe korištene u ovom istraživanju bile su: OregonR +, w - ; GMR-GAL4; +, w - ; UASHTT-EX1-PQ93 / CyO; +, w - ; UASMJD-PQ78 (s); + i w - ; GMR-GAL4 UAS127Q / CyO; + .

Stvaranje muha prekomjerno izražavajući hCul1

pcDNA3-myc-CUL1 (plazmid broj 19896, Addgene, Cambridge, MA, SAD) sadrži kodirajuću sekvencu za svih 752 aminokiselina ljudskog Cull (približno 87 kDa proteina) zajedno s myc oznakom na kraju N-terminala. Vektor transformacije Drosophila , pUASTattB , dobiven je iz FlyC31. HCul1 umetak (bez myc oznake) je digestiran iz pcDNA3-myc3-CUL1 pomoću Bam HI (Roche, Penzberg, Njemačka). pUASTattB je linearniziran pomoću Bgl II (Roche) da bi se dobili Bam HI kompatibilni krajevi. Dva fragmenta su pročišćena gel upotrebom Qiagen gela za ekstrakciju i ligirana pomoću T4 DNA ligaze (Invitrogen). Nakon transformacije, orijentacija umetka provjerena je restriktivnom probavom i ispravan klon poslan je u Transgene Fly Facility (TFF, C-CAMP, Bangalore) radi stvaranja transgenih linija.

Ispitivanje strukture letećih očiju

Vanjska bruto morfologija oka zamišljena je na Leica DM RXA2 mikroskopu pomoću × 5 cilja. Struktura ommatidija analizirana je pomoću otisaka na laku za nokte. 33 Ukratko, anestezirane muhe su obglavljene, a glave su im potapale u kapljicu laka za nokte i ostavile da se osuše. Kako se lak na noktima stvrdne, on čini otisak oka, a ovaj se otisak ljušti i slika pomoću mikroskopije sa svijetlim poljem.

Imunostanje i mikroskopija na svim organima

Očni imaginalni diskovi ličinki trećih primjera željenih genotipova secirani su u PBS i fiksirani u 4% PFA tijekom 45 minuta. Zatim su obrađeni za imunološku boju standardnim protokolima. Mišji anti-HA (Roche) korišten je kao primarno antitijelo pri razrjeđivanju 1: 1000. Sekundarno antitijelo protiv miša, konjugirano na AlexaFluor 594 (Invitrogen), korišteno je u razrjeđivanju od 1: 1000. Tkivo je postavljeno u Medij za učvršćivanje DAPI (Vector Laboratories). Slike Z serije snimljene su na mikroskopu ApoTome (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka) upotrebom ulja ulja 63 × (1.4 NA) i obrađene pomoću ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SAD) i Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, Kalifornija, SAD). Pri uspoređivanju ukupnog opterećenja između genotipova, sve postavke mikroskopa održavane su konstantnim.

imunoblatin

Protein je ekstrahiran iz Drosophila glava u puferu za lizu koji sadrži 20 mM HEPES, 0, 1 M KCl, 10 mM EDTA, 0, 1% TritonX-100, 1 mM DTT, 5% glicerola i koktel potpunog inhibitora proteaze (Roche). HD-150Q stanice su granulirane i lizirane u puferu za liziranje NP-40 (50 mM Tris, pH 8, 0, 150 mM NaCl, 1% NP-40 i potpuni koktel inhibitora proteaze) te su nakratko ultrazvučene. Dijelovi mozga miševa pažljivo su secirani i homogenizirani u puferu za liziranje NP-40. Svi lizirani uzorci proteina su centrifugirani na 15 000 × g 10 min i supernatant je upotrijebljen za imunobloting. Primarna protutijela koja su korištena su zečji anti-Cull (1: 1000, Invitrogen), zečji anti-Skp1 (1: 500, stanična signalizacija), mišji anti-c-myc (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), zečji anti- β - katenin (1: 1000, Biotehnologija Santa Cruz), mišji β- aktin (1: 5000, Abcam) i mišji anti-GAPDH (1: 5000, Biotehnologija Santa Cruz). Korištena su HRP-konjugirana sekundarna antitijela (Vector Laboratories), a mrlje su razvijene upotrebom Immobilon Western Chemiluminescent HRP supstrata (Millipore, Billerica, MA, USA). ImageJ je korišten za kvantificiranje signala od imunoblotova. Vrijednost dobivena za bjelančevine od interesa (Cull ili Skpl) normalizirana je na kontrolu opterećenja (GAPDH ili β -aktin). Prikazana promjena pregiba izračunana je u usporedbi s kontrolom za svaki eksperiment.

RT-PCR

Ukupna RNA izvađena je iz glave muha pomoću Trizolovog reagensa (Sigma) i slijedeći upute proizvođača. Ukupna RNA kvantificirana je i korišteno je 75 ng u svakoj RT-PCR reakciji. dcul1 RNA je amplificirana pomoću slijedećih prajmera - Forward primer 5 '-AGCGCCGAATTAACATCAAC-3'; Obrnuti temeljni premaz 5′-ACAGCCCCTGCAGAAGTCTA-3 ′. 44 RP49 korišten je kao kontrola opterećenja i pojačan pomoću Naprednog temeljnog premaza 5'-AGCGCACCAAGCACTTCATCCGCCA-3 '; Obrnuti temeljni premaz 5′-GCGCACGTTGTGCACCAGGAACTTC-3 ′. 45 RT-PCR izvedeno je korištenjem jednostepenog kompleta za obrnutu transkriptazu Superscript III (Invitrogen). PCR proizvod je tržen na etilijevom bromidu agaroznom gelu, a intenzitet pojasa kvantificiran je pomoću ImageJ.

Analiza podataka

Sve su slike složene pomoću Adobe Photoshopa, grafikoni su napravljeni na SigmaPlotu, a tablice u programu Microsoft Word. Svi statistički podaci dobiveni su provođenjem jednosmjernih ANOVA praćenih post-hoc testom ili dvostrukim Studentovim t- testovima kao što je prikazano na legendi slike. Vrijednosti su izražene kao prosjek ± SEM P <0, 05 i smatra se statistički značajnim.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

Glosar

SCF

Skp1-Cul1-F-box proteina

HD

Huntingtonova bolest

MJD

Machado-Josipova bolest

SCA3

Spinocerebelarna ataksija 3

polyQ

poli-glutamina

UPS

ubikvitin proteosomski sustav

tNhtt

skraćeni N-terminalni lov

Prilozi autora

SB i NRJ osmislili su eksperimente; SB, AD i MM izveli su eksperimente; SCL je doprinio reagense / materijale; a SB, SCL i NRJ napisali su rukopis.

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)