Edaravon suzbija smrt mrežastih ganglijskih stanica u mišjem modelu glaukoma normalne napetosti | stanična smrt i bolest

Edaravon suzbija smrt mrežastih ganglijskih stanica u mišjem modelu glaukoma normalne napetosti | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična smrt
  • Glaukom
  • Farmakologija

Sažetak

Glaukom, jedan od vodećih uzroka nepovratne sljepoće, karakterizira progresivna degeneracija optičkih živaca i staničnih ganglijskih stanica (RGC). U mrežnici sisavaca ekscitacijski nosač aminokiselina 1 (EAAC1) eksprimiran je u neuronskim stanicama, uključujući RGC. Gubitak EAAC1 dovodi do degeneracije RGC bez povišenog intraokularnog tlaka (IOP) i pokazuje glaukomatoznu patologiju, uključujući neurotaksičnost glutamata i oksidativni stres. U ovom istraživanju otkrili smo da edaravon, sredstvo za uklanjanje slobodnih radikala koje se koristi za liječenje akutnog infarkta mozga i amiotrofične lateralne skleroze (ALS), smanjuje oksidativni stres i sprječava smrt RGC i stanjivanje unutarnjeg sloja mrežnice u nedostatku EAAC1 ( KO) miševi. Pored toga, in vivo elektrofiziološke analize pokazale su da je oštećenje vida kod EAAC1 KO miševa poboljšano liječenjem edaravonom, jasno utvrdivši da edaravon blagotvorno utječe na histološke i funkcionalne aspekte glaukomatozne mrežnice. Naši nalazi podižu intrigantne mogućnosti za upravljanje glaukomom korištenjem široko propisanog lijeka za liječenje akutnog infarkta mozga i ALS, edaravona, u kombinaciji s konvencionalnim tretmanima za snižavanje IOP-a.

Glavni

Glaukom je progresivna neurodegenerativna bolest oka i drugi vodeći uzrok sljepoće svijeta nakon katarakte. 1 Procjenjuje se da će glaukom do 2020. godine utjecati na ~ 80 milijuna pojedinaca u svijetu, a 11, 1 milijuna pojedinaca postaje obostrano slijepo. 2 Glaukom uzrokuje više faktora i karakterizira ga progresivna degeneracija mrežastih ganglionskih stanica (RGC) i njihovih aksona, zajedno s oštećenjima vidnog polja koja su obično povezana s povišenim intraokularnim tlakom (IOP). 3 Glaukom normalne napetosti (NTG) je podvrsta glaukoma koji se pojavljuje sa statistički normalnim IOP-om. Prenosi se da je prevalencija NTG-a veća kod Japanaca nego kavkasaca. 4 Međutim, čak i prilikom snižavanja povišenog IOP-a, glavnog čimbenika rizika za progresiju glaukoma, bolest može napredovati. 5 Ovi nalazi sugeriraju mogućnost da faktori koji nisu ovisni o IOP mogu doprinijeti napredovanju bolesti glaukoma, osobito u kontekstu NTG-a. 4, 6

Ranije smo izvijestili da gubitak transportera glutamata (ekscitacijski nosač aminokiselina 1 (EAAC1) ili transporter glutamata / aspartata (GLAST)) kod miševa dovodi do progresivnog gubitka RGC i degeneracije optičkog živca bez visokog IOP, što je slično NTG. 7 EAAC1 se eksprimira na ganglijskim ćelijama i prenosi cistein, kao i glutamat, u RGC kao prekursor za sintezu neuronskog glutationa. 8 Glutation, antioksidans, štiti stanice od reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), poput slobodnih radikala i peroksida. 9 Dakle, gubitak RGC kod EAAC1 miševa s nokautom (KO) dijelom je posljedica smanjene sinteze glutationa što dovodi do povećanog oksidacijskog stresa stvaranjem ROS-a. 7, 10

Edaravone je sredstvo za uklanjanje slobodnih radikala koje uključuje davanje elektrona slobodnim radikalima. 11 Doniranje elektrona lipidnom peroksilnom radikalu pretvara edaravonski anion u edaravonski radikal, koji se oksidira da se dobije 3-metil-l-fenil-2-pirazolin-4, 5-dion i njegov hidrolat, 2-okso-3- (fenilhidrazono) butanojeva kiselina. 12 Edaravon gasi hidroksilne radikale (˙OH) i inhibira lipidnu peroksidaciju ovisnu i neovisnu o ˙OH. 12, 13 U in vitro studiji koja je upotrebljavala RGC-5, model stanične kulture za proučavanje neurobiologije RGC-a, edaravon je očistio unutarćelijski ˙OH, superoksidni anion (O 2 - ˙) i vodikov peroksid (H 2 O 2 ) i pokazivao je jaču aktivnost čišćenja od ˙OH od ostalih. 14 Oftalmička studija pokazala je da edaravon ublažava ishemiju retine / reperfuzijsku ozljedu kod štakora 15 i oštećenje mrežnice kod eksperimentalnih miševa s visokim IOP glaukomom. 16 Ovi nalazi sugeriraju mogućnost da edaravon štiti RGC-ove pomoću efekta uklanjanja ROS-a.

U Japanu je edaravon prvi put odobren za liječenje akutnog infarkta mozga od 2001. godine. Višenamjensko, randomizirano, placebo kontrolirano, dvostruko slijepo istraživanje na bolesnicima s akutnim ishemijskim moždanim udarom pokazalo je značajno poboljšanje funkcionalnog ishoda u skupini s edaravonom u usporedbi s placebo grupa. 17 Dalje, provedena su klinička ispitivanja za njegovu upotrebu u amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi (ALS) i pokazala su da edaravon suzbija napredovanje motoričke disfunkcije bez klinički značajnih štetnih reakcija lijeka. Razina 3-nitrotirozina, markera oksidativnog stresa, u cerebrospinalnoj tekućini bila je niža nakon liječenja edaravonom u gotovo svih bolesnika, što sugerira da edaravon može zaštititi neuronske stanice od oksidativnog stresa. 18 Kao odgovor na ove rezultate, edaravon se klinički koristi za liječenje ALS-a od 2015. godine.

U ovom istraživanju ispitali smo učinke svakodnevne primjene edaravona na degeneraciju mrežnice slične NTG kod EAAC1 KO miševa kako bismo utvrdili je li edaravon učinkovit za liječenje glaukoma.

Rezultati

Edaravone štiti RGC-ove kod EAAC1 KO miševa

Da bismo istražili je li edaravon sposoban spriječiti NTG slične fenotipe kod EAAC1 KO miševa, svakodnevno smo intradaleksalno davali edaravone ili PBS (kontrolu) EAAC1 KO miševima u dobi od 5 tjedana (5 W) do 8 ili 12 W (slika 1a), Retine EAAC1 KO miševa pokazuju normalnu organizaciju na 5 W, ali gubitak RGC i prorjeđivanje u unutarnjoj mrežnici bio je jasan na 8 i 12 W (slika 1b). 7, 19, 20, 21 Broj stanica u sloju ćelija gangliona (GCL) na 8 i 12 W bio je značajno niži kod EAAC1 KO miševa u usporedbi s WT miševima (Slika 1c). Pored toga, debljina unutarnjeg retinalnog sloja (IRL) značajno je smanjena na 8 i 12 W kod EAAC1 KO miševa (slika 1d). U EAAC1 KO miševima tretiranim edaravonom, broj preživjelih neurona bio je značajno veći od onog u kontrolnih EAAC1 KO miševa na 8 i 12 W (Slike 1b i c). Pored toga, liječenje edaravonom spriječilo je stanjivanje IRL-a (slika 1d). Budući da GCL sadrži vrste stanica osim RGC-a, uključujući raseljene amacrine stanice, 22, zatim smo izvršili retrogradno obilježavanje RGC-a fluoro-zlatom (FG) i utvrdili učinak edaravona na preživljavanje RGC-a. U skladu s rezultatima brojanja stanica u GCL-u (slika 1c), broj RGC-a kod miševa tretiranih edaravonom je značajno povećan u usporedbi s kontrolnim miševima koji su tretirani s PBS-om (slika 2).

Image

Učinci edaravona na degeneraciju mrežnice u EAAC1 KO miševima. ( a ) Eksperimentalni protokoli. Edaravonu (3 mg / kg) ili PBS ubrizgavali smo se intraperitonealno svakodnevno od 5 W. Miševi su ubijeni na 5, 8 i 12 W. ( b ) H&E obojenim dijelovima mrežnice. Linija mjerila, 100 i 50 μm, u gornjoj i odmah donjoj ploči, respektivno. GCL, sloj ćelija gangliona; INL, unutarnji nuklearni sloj; ONL, vanjski nuklearni sloj; IRL, unutarnji sloj mrežnice. ( c, d ) Kvantifikacija broja ćelija u debljini GCL ( c ) i IRL ( d ). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za šest uzoraka za svaki eksperiment. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

Image

Učinci edaravona na RGC degeneraciju u EAAC1 KO miševima. ( a ) Reprezentativne slike retrogradno označenih RGC-ova na 8 i 12 W. Ljestvica: 100 μm. ( b ) Kvantitativne analize točke ( a ). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za šest uzoraka za svaki eksperiment. * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Također smo vizualizirali slojeve mrežnice kod živih miševa primjenom optičke koherencijske tomografije (OCT), neinvazivnom tehnikom snimanja koja se može koristiti za stjecanje tomografskih slika mrežnice in vivo . 19, 23 Prosječna debljina kompleksa ganglionskih stanica (GCC), koji uključuje sloj živčanih vlakana, GCL i unutarnji pleksiformni sloj, bila je značajno veća na 8 i 12 W kod miševa tretiranih edaravonom EAAC1 KO u usporedbi s kontrolnim EAAC1 KO miševima (Slika 3a). Za kvantitativnu analizu, GCC je izmjeren skeniranjem mrežnice u krugu koji se centrira oko diska optičkog živca (slika 3b), a prosječna debljina GCC određena je iz stečenih slika (slika 3c). Debljina GCC na 8 i 12 W značajno je smanjena kod kontrolnih miševa, ali je bila gotovo nepromijenjena u miševima tretiranim edaravonom (Slika 3d). Ovi podaci pokazuju da liječenje edaravonom štiti RGC-ove od NTG-slične neurodegeneracije.

Image

In vivo snimanje mrežnice kod EAAC1 KO miševa liječenih edaravonom. ( a ) OCT slike poprečnog presjeka mrežnice na 5, 8 i 12 W. (b) Slika kruga koji je centriran oko diska optičkog živca. ( c ) OCT kružna skenirana slika snimljena iz ( b ). ( d ) Uzdužna procjena debljine GCC-a kružnim pregledom. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za šest uzoraka za svaki eksperiment. *** P <0, 001

Slika pune veličine

Edaravon ublažava oštećenje vida kod EAAC1 KO miševa

Da bismo utvrdili da li histološka promatranja neuroprotekcije posredovane edaravonom u EAAC1 KO miševima odražava funkcionalne aspekte, ispitali smo vizualnu funkciju pomoću multifokalnog elektroretinograma (mfERG). Analizirali smo komponentu jezgre drugog reda, koja je čini se da je osjetljiv pokazatelj unutarnje disfunkcije mrežnice i da je oslabljena kod pacijenata s glaukomom. 24, 25 Topografija odgovora koja pokazuje komponentu jezgre drugog reda otkrila je da su prosječni vizualni odgovori oslabljeni u svim vidnim poljima kod EAAC1 KO miševa, ali liječenje edaravonom je poboljšalo pogoršanje vizualne funkcije (Slika 4). Ovi rezultati potvrđuju da su neuroprotektivni učinci edaravona na glaukomatoznu degeneraciju mrežnice u EAAC1 KO miševi funkcionalno značajni.

Image

Učinci edaravona na vizualni odgovor u EAAC1 KO miševima. ( a ) Prosječni vizualni odgovori jezgre drugog reda demonstrirani pomoću trodimenzionalnih crteža. ( b ) Kvantitativna analiza amplitude vizualnog odgovora. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za šest uzoraka za svaki eksperiment. * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Dalje smo ispitali učinke edaravona na IOP. Prethodna studija pokazala je da je IOP u EAAC1 KO miševima sličan onome u WT miševima. 7 IOP vrijednosti miševa tretiranih edaravonom EAAC1 KO nisu značajno izmijenjene u usporedbi s vrijednostima kontrolnih miševa (Slika 5). Ovi rezultati sugeriraju da edaravon sprečava NTG-sličnu patologiju kod EAAC1 KO miševa, a ovaj neuroprotektivni učinak ne ovisi o IOP.

Image

Učinci edaravona na intraokularni tlak. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za šest uzoraka za svaki eksperiment

Slika pune veličine

Edaravon smanjuje razinu oksidativnog stresa u mrežnici miša EAAC1 KO

Zatim smo istražili potencijalne mehanizme koji stoje na osnovi neurozaštite posredovane edaravonom. Jedan od glavnih uzroka koji je povezan s glaukomatoznom degeneracijom mrežnice u EAAC1 KO miševima je povećana razina oksidativnog stresa. 7, 19, 20, 26 Stoga smo ispitali da li liječenje edaravonom potiskuje indukciju oksidativnog stresa kod EAAC1 KO miševa. U tu svrhu koristili smo 4-hidroksi-2-nonenal (4-HNE), koji pruža pouzdanu mjeru oksidativnog stresa. 20, 26 4-HNE uglavnom je opažen u GCL EAAC1 KO miševa, ali teško je detektiran u WT miševima ili EAAC1 KO miševima tretiranim edaravonom na 8 i 12 W (Slika 6a). Kvantitativne analize potvrdile su da se razina oksidativnog stresa u GCL-u značajno suzbija tretmanom edaravona kod EAAC1 KO miševa (Slika 6b). Ovi rezultati sugeriraju da edaravon sprječava degeneraciju mrežnice u EAAC1 KO miševima suzbijanjem indukcije oksidativnog stresa u mrežnici.

Image

Edaravon smanjuje razinu oksidativnog stresa u mrežnici miša EAAC1 KO. ( a ) Reprezentativne slike 4-HNE u mrežnici na 8 i 12 W. Linija skale: 100 µm. ( b ) Kvantitativne analize točke ( a ). Podaci su normalizirani na intenzitet 4-HNE na GCL kod kontrolnih WT miševa (100%). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za šest uzoraka za svaki eksperiment. * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Rasprava

U ovom istraživanju pokazali smo da edaravon sprječava progresivni gubitak RGC, prorjeđivanje IRL-a i poremećaje vida kod EAAC1 KO miševa bez utjecaja na IOP. Kako bismo demonstrirali ove nalaze na istoj životinji, koristili smo OCT i mfERG koji omogućuju in vivo , neinvazivnu i kvantitativnu procjenu promjena u morfologiji mrežnice i funkcije kod EAAC1 KO miševa. Ove tehnike jasno su vizualizirale terapeutske učinke edaravona i pružaju korisne informacije i eksperimentalnim životinjama, kao i kliničkim ispitivanjima i liječenju.

Ranije smo izvijestili da manjak EAAC1 uzrokuje gubitak RGC-a uglavnom kroz oksidativni stres. 7, 20, 26 Glavna uloga EAAC1 je transport cisteina u RGC kao prekursor sinteze neuronskog glutationa, važnog antioksidansa. 27 Koncentracija glutationa u plazmi smanjena je kod pacijenata s glaukomom. 28, 29 Sukladno tome, suzbijanje oksidativnog stresa ima neuroprotektivne učinke kod EAAC1 KO miševa. 10, 19, 20, 26 Otkrili smo da je edaravon značajno potisnuo regulaciju 4-HNE, koja nastaje lipidnom peroksidacijom tijekom oksidativnog stresa, u GCL kod miševa EAAC1 KO (Slika 6). Povećani 4-HNE modificira kovalentno nekoliko biomolekula koje sadrže amino skupine, poput proteina, nukleotida i fosfolipida, što dovodi do poremećaja njegovih staničnih funkcija. Ovi rezultati sugeriraju da edaravon djeluje antioksidativno u mrežnici kod EAAC1 KO miševa.

Oksidativni stres je neravnoteža između antioksidacijskog sustava i proizvodnje ROS-a. ROS uključuje O2 - ˙, -OH, H202 i singlet kisik (1O2). Konkretno, O2 - ˙ i ˙OH, koji imaju nespareni elektron, poznati su kao slobodni radikali. Edaravon uklanja ˙OH i inhibira peroksidaciju lipida i nitriranje tirozina. 12, 13 Kako edaravon suzbija peroksidaciju lipida i u vodi i u lipidima, 12 može inhibirati oksidativni stres i na citosolu, gdje je voda glavna komponenta, i na plazma membrani koja ima temeljnu strukturu fosfolipidnog sloja. Pored antioksidativnih učinaka, edaravon ima i antiapoptotski učinak. Pokazuje neuroprotektivni učinak protiv ishemije / reperfuzijske ozljede mozga kroz antiapoptotski mehanizam ovisan o Bax / Bcl-2. 30 Pokušali smo otkriti učinke edaravona na apoptotičke staze kod EAAC1 KO miševa, ali nažalost, teško smo mogli otkriti terminalne deoksinukleotidil transferazom posredovane dUTP nick-end pozitivne apoptotske stanice, možda zbog blagog napredovanja RGC degeneracije. Dakle, nismo mogli kvantificirati učinke edaravona na težinu apoptoze u ovoj studiji, ali vjerujemo da je moguće da edaravon sprječava degeneraciju mrežnice modulacijom više apoptotskih putova u EAAC1 KO miševima.

Nedavna istraživanja pokazala su da oksidativni stres ima važnu ulogu kod mnogih očnih bolesti, uključujući glaukom, 10, 29, 31, 32 odvajanje mrežnice, 33 dijabetičku retinopatiju, 34 degeneracija makule povezane s dobi, 35 retinitis pigmentoza 36 i makularna distrofija. 37 U skladu s tim, pronađeno je da intraperitonealna injekcija edaravona značajno smanjuje smrt RGC u dijabetesu izazvanom streptozotocinom. 34 Uz to, intratravne i intravenske injekcije edaravona značajno su zaštitile retinalne neurone od neurotoksičnosti glutamata. 14 Iako su potrebna daljnja ispitivanja, ovi nalazi sugeriraju mogućnost da je edaravon koristan za razne degenerativne poremećaje mrežnice i optičkih živaca.

Nedavno smo pokazali da je svakodnevno gladovanje (EODF), oblik kalorijskog ograničenja, suzbio smrt RGC i degeneraciju mrežnice u EAAC1 KO miševima bez promjene IOP-a. 20 Neurotrofni faktor (BDNF) koji potiče od mozga koji potiče EODF, koji potiče neuroprotekciju, aksonalni rast i neurogenezu, u mrežnici. 38, 39, 40 Zanimljivo je da se BDNF signalizacija aktivira valproičnom kiselinom i čini se da taj put igra važnu ulogu u neuroprotekciji uzrokovanoj valproičnom kiselinom u GLAST KO miševima. 41 Također smo izvijestili da je oralno aktivni antagonist receptora angiotenzina II tipa 1 (AT1-R) potisnuo ekspresije sintaze dušičnog oksida sintaze dušikova oksida u ATA-R-1 u mišjoj mrežnici EAAC1 KO. 19 Valproična kiselina i AT1-R antagonisti su široko propisani lijekovi za liječenje epilepsije i visokog krvnog tlaka. 19, 41, 42 Ovi nalazi podižu intrigantne mogućnosti za upravljanje glaukomom korištenjem edaravona, široko propisanog lijeka za liječenje akutnog infarkta mozga i ALS-a, u kombinaciji s postojećim lijekovima za neuroprotekciju, kao i uobičajenim tretmanima za snižavanje IOP-a. 19, 21, 38, 41

Materijali i metode

Miševi

Eksperimenti su izvedeni korištenjem EAAC1 KO miševa (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Njemačka) 7, 19, 43 na pozadini C57BL6 u skladu s smjernicama Tokio Metropolitan Institute of Medical Science o njezi i korištenju životinja.

Davanje lijekova

EAAC1 KO miševi svakodnevno su primali intraperitonealno davanje vehikla (PBS) ili edaravona (3 mg / kg; Mitsubisi Tanabe Pharma Co., Osaka, Japan) od 5 do 8 ili 12 W. Odabrali smo dozu i put primjene edaravona na osnovu prethodnog studije koje su pokazale njegove učinke na oštećenja mrežnice. 16, 34

Histološka i morfometrijska ispitivanja

Miševi su perfuzirani sa Zambonijevim fiksativom (2% paraformaldehid i 15% pikiselina u 0, 1 M fosfatnom puferu) na 5, 8 i 12 W. Oči su zgrčene i postfiksirane u 3% otopini glutaraldehida (3% glutaraldehid, 9% formaldehid, 37, 5% etanol i 12, 5% octene kiseline u destiliranoj vodi) 2 sata. Odjeljci mrežnice ugrađeni u parafinom debljine 7 μm presječeni su kroz optički živac i obojeni hematoksilinom i eozinom. RGC broj i opseg degeneracije mrežnice kvantificirani su na dva načina. 44 Prvo je analizirana debljina IRL (između unutarnje ograničavajuće membrane i sučelja vanjskog pleksiformnog sloja i vanjskog nuklearnog sloja). Drugo, u istim odjeljcima broj neurona u GCL-u se računa od jedne ora serrata kroz optički živac do druge ora serrata.

Retrogradno označavanje

Miševi su duboko anestezirani izofluranom (Intervet, Tokyo, Japan), stavljeni na stereotaksični okvir i ubrizgani s 2 μl 2% FG (Fluorochrome LLC, Denver, CO, USA) otopljeni u PBS-u u vrhunski kolikulus. 45 Deset dana nakon primjene FG, miševi su bili anestezirani, oči su im enkulisane i retine su izolirane za cijelu pripremu. Retine su fiksirane u 4% paraformaldehidu u 0, 1 M otopini PBS-a tijekom 20 minuta, postavljene na stakleni tobogan s nastavnim medijem (Vectashield; Vector Laboratories, Burlingame, CA, SAD), a gustoća RGC ispitivana je fluorescentnim mikroskopom. Valne duljine pobude i emisije za FG bile su 323 nm, odnosno 620 nm. Tri standardna područja (0, 04 mm 2 ) svake mrežnice u točki 0, 1 mm od optičkog diska odabrana su nasumično. Stanice označene FG-om ručno su brojene, a izračunat je srednji broj RGC-ova po kvadratnom milimetru. 45

Zamišljanje stjecanja OCT spektralne domene

Ispitivanja spektralne domene OCT (RS-3000; Nidek, Aichi, Japan) provedena su na 5, 8 i 12 W. Za snimanje fundusa, polimetil-metakrilatske kontaktne leće optimalne za miševe (UNICON, Osaka, Japan) postavljene su na rožnice. Korištenje leća sprječava napredovanje katarakte izazvane anestezijom. 60-D leća adaptera postavljena je na objektiv objektiva Multiline OCT radi fokusiranja na mrežnicu miša. Sve slike skeniranja linija podudaraju se s lokacijom vertikalno kroz središte glave optičkog živca u tri duljine promjera diska iznad glave optičkog živca. 19, 23 Izmjerena je prosječna debljina GCC (između unutarnje ograničavajuće membrane i sučelja unutarnjeg sloja pleksiforma i unutarnjeg nuklearnog sloja). U ovom istraživanju, za prosječenje je korišten najveći broj B-skeniranja koje je postavio proizvođač (50 za linijska ispitivanja).

mfERG

Miševi na 5, 8 i 12 W bili su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 87, 5 mg / kg natrijevog pentobarbitala. Zjenice su proširene s 0, 5% fenilefrin hidroklorida i 0, 5% tropikamida. mfERG snimljeni su korištenjem VERIS 6.0 sustava (Electro-Diagnostic Imaging, Redwood City, CA, USA). Vizualni poticaj sastojao se od sedam šesterokutnih područja umanjenih ekscentričnošću. Nizna stimulacija prikazana je na crno-bijelom monitoru visoke rezolucije, pokretanom brzinom od 100 Hz. Kernel drugog reda, koji je oštećen kod pacijenata s glaukomom, analiziran je kao što je ranije izvješteno. 7, 25, 44

Mjerenje IOP-a

IOP je izmjeren komercijalnim povratnim tonometrom (TonoLab; Colonial Medical Supply, Franconia, NH, USA) u anesteziranim miševima kao što je ranije navedeno. 19, 44 Da bi se smanjile varijacije, podaci su prikupljeni tijekom vremenskog razdoblja od 4–6 min nakon ubrizgavanja anestetika, tijekom kojeg su se pojavili platoi IOP-a. IOP je izmjeren na 5, 8 i 12 W. Kako je obrazac IOP od 24 sata u očima miša dvofazan, a IOP najviši u ~ 2100 h, 46 ispitivali smo IOP između 2000 i 2300 h.

imunohistokemija

Miševi su perfuzirani sa Zambonijevim fiksativom na 8 i 12 W. Oči su enkulirane, naknadno fiksirane u Zambonijevom fiksativu tijekom 2 sata, a zatim prebačene u saharozni pufer (30% saharoze u 0, 1 M fosfatnom puferu) radi krioprotekcije. Odjeljci mrežnice s kristastatom debljine 10 µm pripremljeni su i ispitani imunološkanjem pomoću 4-HNE mišjeg monoklonskog antitijela (0, 2 µg / mL; Japanski institut za kontrolu starenja, Shizuoka, Japan). Intenzitet 4-HNE u GCL-u analiziran je korištenjem ImageJ (//imagej.nih.gov/ij/; javno dostupno u Nacionalnom institutu za zdravlje, Bethesda, MD, SAD). 41

statistika

Podaci su predstavljeni kao sredstvo ± SEM Kada su provedene statističke analize, korištena je jednosmjerna ANOVA praćena turskim testom ili Studentovim t- testom. P <0, 05 je smatran statistički značajnim. Za statističke analize korištena je JMP verzija 12.2.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD).