Ušutkivanje endospanina 1 u jezgri hipotalamičkog luka pridonosi neprekidnom gubitku težine dijetalnih pretilih miševa s visokim udjelom masnoće | genska terapija

Ušutkivanje endospanina 1 u jezgri hipotalamičkog luka pridonosi neprekidnom gubitku težine dijetalnih pretilih miševa s visokim udjelom masnoće | genska terapija

Anonim

teme

  • Stanična biologija
  • Otkrivanje droge
  • Neuroznanost

Sažetak

Leptin cilja specifične receptore (OB-R) izražene u hipotalamusu radi regulacije energetske ravnoteže. Leptin smanjuje unos hrane kod pojedinaca s normalnom tjelesnom masom, ali taj je učinak pojačan kod pretilih osoba koje karakterizira stanje otpornosti na leptin. Prevencija leptinske rezistencije jedan je od glavnih ciljeva istraživanja pretilosti. Nedavno smo identificirali endospanin 1 kao negativni regulator OB-R, koji interakcijom s OB-R zadržava receptor unutar stanice. Ovdje pokazujemo da je kod pretilih miševa endospanin 1 reguliran u jezgru hipotalamičkog luka (ARC), glavne moždane strukture koja je uključena u regulaciju tjelesne težine, sugerirajući da je endospanin 1 uključen u razvoj pretilosti i / ili ugradnju rezistencije na leptin. Suprotno tome, prigušivanje endospanina 1 s lentivirusnim vektorima u ARC-u pretilih miševa u potpunosti vraća reakciju na leptin u kombinaciji s prelaskom na dijetu koja se hrani ad libitum . Oporavak središnje osjetljivosti na leptin popraćen je stalnim gubitkom tjelesne težine i poboljšanjem parametara lipida u krvi i steatoze. Kolektivno, naši rezultati definiraju endospanin 1 kao novi terapeutski cilj protiv pretilosti.

Uvod

Signal adiposity, leptin, je važan za regulaciju energetske homeostaze. Leptin, izlučen masnim tkivom, uglavnom odražava i kontrolira količinu tjelesne masti u mehanizmu negativne povratne sprege između periferije i središnjeg živčanog sustava. Leptin ispoljava svoje djelovanje aktiviranjem recepta za leptin (OB-R) koji se visoko izražava u mozgu, a posebno u jezgru hipotalamičkog luka (ARC), središnjoj živčanoj strukturi za koju je poznato da regulira energetsku homeostazu. OB-R posreduje učinke leptina aktiviranjem više intracelularnih signalnih putova, uključujući janus kinazu 2 / signalni pretvarač i aktivator transkripcije 3 (STAT3). 1, 2 Nedostatak leptina ( ob / ob miševi) ili recepta za leptin ( db / db miševi, fa / fa štakora) uzrokuje pretilost i dijabetes kod ljudi i glodara zbog hiperfagije, smanjenog trošenja energije i inzulinske rezistencije. 3, 4 Međutim, većina pretilih ljudi ima visoku razinu leptina u krvi proporcionalnu njihovoj prekomjernoj masnoj masi i ne reagira na hormon, što karakterizira stanje „otpornosti na leptin“. 5, 6, 7 Nekoliko štetnih mehanizama, kao što je stres endoplazmatskog retikuluma 8, 9 ili oslabljen transport kroz krvno-moždanu barijeru 10, 11, doprinose rezistenciji na leptin. Jedan drugi mogući mehanizam na kojem se nalazi rezistencija na leptin mogao bi uključivati ​​smanjenu izloženost OB-R na površini stanica neurona, što dovodi do nižeg signala i osjetljivosti na leptin. Razina OB-R na staničnoj površini važna je jer se samo mali udio OB-R (5–20%) izražava na plazma membrani, gdje se može aktivirati leptinom. 12

Identificirali smo endospanin 1, prvotno nazvani protein povezan sa receptom za leptinski receptor (OB-RGRP), kao negativni regulator OB-R funkcije. 14, 15 Humani endospanin 1 i OB-R genetski su povezani jer su oba odgovarajuća transkripta stvorena iz istog db gena. 16, 17 Međutim, ne opaža se sličnost niza na razini proteina. Prethodno smo pokazali da prekomjerna ekspresija endospanina 1 smanjuje izloženost OB-R staničnoj površini, dok prigušivanje endospanina 1 povećava broj OB-R na staničnoj površini istodobno s pojačanom fosforilacijom izazvanom leptinom. U skladu s ovim rezultatima, nedavno smo pokazali da endospanin 1 djeluje u interakciji s OB-R i cilja OB-R iz endosoma u lizosome povećavajući njegovu razgradnju. 14 Dakle, prigušivanje endospanina 1 u ARC-u mladih i mršavih miševa dovoljno je da spriječi razvoj pretilosti u modelu miša s pretilošću pretilosti s visokom masnoćom (HFD). 15

U ovom istraživanju pokazujemo da su razine ekspresije endospanina 1 povećane kod miševa hranjenih sa HFD, što ukazuje da povišena razina ekspresije endospanina 1 može pridonijeti razvoju pretilosti. Da bismo potvrdili ovu hipotezu i procijenili kurativni potencijal prigušivanja endospanina 1 na razvoj pretilosti, ovaj smo put ušutkali endospanin 1 u hipotalamičkom ARC-u potpuno pretilih miševa. Primijetili smo kako je smanjivanje endospanina 1 u ARC-u pretilih miševa korisno na nekoliko razina: normaliziranje tjelesne težine (BW), obnavljanje osjetljivosti na leptin i poboljšanje parametara lipida u krvi. Ovo sugerira da bi utišavanje endospanina 1 moglo predstavljati terapijsku metu protiv pretilosti.

Rezultati

Ekspresija Endospanina 1 povećana je kod pretilih miševa i njegova snižavanje vrijednosti ARC-a dovoljna je za poništavanje pretilih fenotipa

Prethodno smo pokazali da utišavanje endospanina 1 u ARC-u, glavnom kontrolnom centru energetske homeostaze koji izražava visoku razinu OB-R, kod mladih odraslih mršavih miševa sprječava DIO. 15 To znači da bi povećani broj endospanina 1 mogao sudjelovati u rezistenciji na leptin na razini ARC-a. Da bismo izravnije potvrdili ovu hipotezu, odredili smo razinu ekspresije endospanina 1 kod miševa koji su hranjeni HFD-om tijekom 3 mjeseca. Zanimljivo je da je opažen značajan porast razine mRNA endospanina 1 u ARC-u, bijelom masnom tkivu (WAT) i smeđem masnom tkivu, što potvrđuje mogući doprinos endospanina 1 u razvoju pretilosti (slika 1). Ovo povećanje endospanina 1 tijekom hranjenja HFD-om nije uočeno u jetri i mozgu (slika 1), što sugerira da fenomen nije slično reguliran u svim tkivima. Kako bismo dalje razvili važnost endospanina 1 u razvoju pretilosti, postavili smo pitanje hoće li smanjenje ekspresije endospanina 1 u ARC-u biti dovoljno za poništavanje i liječenje DIO pretilih miševa. Da bismo odgovorili na to, koristili smo RNS (shRNA) endospanin 1 koji eksprimira lentivirusne vektore, što je smanjilo ekspresiju endospanina 1 za 80% u N46 hipotalamičkoj staničnoj liniji (Slika 2a). U DIO modelu miša, nakon 3 mjeseca primjene HFD-a, in vivo prigušivanje endospanina 1 postignuto je stereotaktičkom bilateralnom injekcijom lentivirusnih vektora koji eksprimiraju endospanin 1 shRNA u ARC muških C57 / Bl6 miševa s potpuno razvijenom pretilošću, što dovodi do smanjenja regulacije endospanin 1 od najmanje 30% (dopunska slika 1), kako je ranije postignuto. Kao što je prethodno prikazano, procjenjuje se da je stupanj prigušivanja u ARC udarcima podcjenjivan jer su ARC udarci obogaćeni u ARC, ali uključuju i okolna jezgra hipotalamusa, koja nisu izrazila endospanin 1 shRNA.

Image

HFD povećava transkript endospanina 1. Ekspresija Endospanina 1 mRNA u ARC-u, mozgu, epigonadalnom bijelom masnom tkivu (WAT), smeđem masnom tkivu (BAT) i jetri muških miševa C57Bl6J, hranjenih na CD-u (crne šuplje brade) ili HFD (sive šipke). * P <0, 05.

Slika pune veličine

Image

Ušutnjavanje endospanina 1. ( a ) Blještanje endospanina 1 u N46 hipotalamičkoj staničnoj liniji s lentivirusnim vektorima koji izražavaju kontrolu (Ctrl) shRNA ili shRNA Endo1. *** P <0, 001. ( b ) eksperimentalni protokol. Nakon 3 mjeseca HFD-a, gojazni miševi C57Bl6 podvrgnuti su (na dan 0) na stereotaktičku injekciju lentivirusnih vektora koji eksprimiraju Ctrl shRNA ili endospanin 1 shRNA u ARC-u i zadržani su na HFD ili prebačeni na CD. Vremenske točke oduzimanja krvi za mjerenje lipidnih parametara i dan kada su ubijeni označeni su strelicom.

Slika pune veličine

Gojazne životinje ili tretirane s kontrolnom ili endospanin 1 shRNA potom su zadržane na HFD (Ctrl-HFD-HFD ili Endo 1-HFD-HFD) ili vraćene u redovitu prehranu s kravom (CD) (Ctrl-HFD-CD ili Endo1-HFD-CD ) (Slika 2b). Ušutka Endospanin 1 kod životinja Endo1-HFD-HFD održavana na HFD pokazala je smanjeno BW dobitak u usporedbi s kontrolnim Ctrl-HFD-HFD miševima tijekom prva 3 mjeseca nakon šutnje endospanin 1, ali ne u 4. mjesecu (Slika 3a), što ukazuje na prolazno, ali nije trajno poboljšalo BW nakon prigušivanja endospanina 1 u tim uvjetima. Kod kontrolnih životinja prelazak s HFD-a na CD bio je dovoljan da zaustavi porast BW i da smanji BW pretilih Ctrl-HFD-CD miševa, počevši 2 tjedna nakon prelaska na dijetu (-5%), kao što se očekivalo. Međutim, budući da su životinje hranjene ad libitum , nakon stabilizacije njihove BW, kontrolne životinje Ctrl-HFD-CD vraćale su svu težinu koju su u početku izgubile. Suprotno tome, prigušivanje endospanina 1 dovelo je do većeg gubitka težine i spriječilo povrat tjelesne težine. Stoga je kombinacija prehrane s prehrane s HFD-a na CD s prigušivanjem endospanina 1 (Endo1-HFD-CD) bila u stanju smanjiti BW na 20% od početnih razina i održati taj gubitak tjelesne mase čak i dugoročno nakon 4 mjeseca dijeta prekidač. Gubitak tjelesne mase miševa bio je praćen manjim unosom hrane (slika 3b) i smanjenom masnom masom do razine životinjskih životinja koje se neprestano hrane CD-om (slika 3c). Smanjenje težine jastučića za masnoće očekivano je praćeno manjom veličinom adipocita kod životinja koje su ušutkale Endo1-HFD-CD u usporedbi s kontrolama (Slika 3d). Životinje koje su ušutkale Endospanin tijekom nastavka HFD hranjenja, kao i prebacivanje na CD pokazale su neočekivani trend (za većinu njih, bez postizanja statističkog značaja) povećanih središnjih orexigenskih neuropeptida i smanjenih anoreksigenih peptida u odnosu na odgovarajuće kontrole. Ovaj je profil u skladu s razdobljima kalorijskog ograničenja18, unatoč tome što se životinje hrane ad libitum (dopunska slika 2).

Image

Smanjenje regulacije endosanina 1 u ARC pretilih miševa smanjuje tjelesnu masu, unos hrane i masnu masu. ( a ) BW pretilih miševa nakon stereotaktične injekcije lentivirusnih vektora koji izražavaju kontrolu (Ctrl) shRNA ili endospanina 1 shRNA u ARC-u i drže se na HFD (sive linije) ili su prebačeni na CD (crne linije); n = 20 po skupini, ** P <0, 01, *** P <0, 001 u usporedbi s CTRL-HFD-CD; # P <0, 05 u usporedbi s CTRL-HFD-HFD. ( b ) Unos kalorija u razdoblju od 12. do 15. tjedna (navodi se kao prosjek dnevno). ( c ) Epigonadna masa masnih jastučića naivnih miševa na CD-u ili HFD-u (šrafirane šipke) i pretilih miševa tretiranih Ctrl (obične šipke) ili endospanina 1 shRNA (prazne šipke) zadržanih na HFD (sive trake) ili prebačenih na CD ( crne trake). ( d ) Lijeva ploča: mrlja hematoksilina i eozina masnog tkiva ugrađenog u parafin Ctrl-HFD-CD i Endo1-HFD-CD. Prikazane su dvije reprezentativne slike WAT odjeljaka različitih miševa iste skupine. Desna ploča: Prosječna veličina adipocita procijenjena iz masnog tkiva obojenog parafinom obojenim parafinom ili eozinom. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

Slika pune veličine

Uzeto zajedno, smanjivanje razine endospanina 1, posebno u ARC-u, pretilih miševa, očito olakšava oporavak od DIO, inducirajući trajni gubitak kilograma u kombinaciji s CD-om.

Ušutka Endospanin 1 u ARC pretilih miševa prebačenih na CD poboljšava steatozu i lipidne parametre

DIO model prati hiperlipidemija. Da bismo provjerili učinak prigušivanja endospanina 1 na metaboličke parametre, odredili smo razinu plazme u nekoliko lipida i stupanj steatoze jetre. Prigušivanje endosanina 1 kod miševa prebačenih na CD bilo je popraćeno sniženim lipidnim parametrima u usporedbi s kontrolama kao što su prikazane razine glicerola u plazmi (slika 4a), triglicerida (slika 4d), lipoproteina-kolesterola visoke gustoće (slika 4e) i ukupnog kolesterola (Slika 4f) bez promjena nesteterificiranih masnih kiselina (slika 4b) i ketona (slika 4c). Omjer lipoproteina i kolesterola s visokom gustoćom smanjen je kod miševa koji su ušutkali endospanin 1 (Slika 4 g), što ukazuje na manji rizik od koronarne srčane bolesti. Dok je jetra HFD miševa bila steatotična kao što je ocijenjeno bojenjem Oil Red-O u dijelu jetre, nakupljanje jetrenih lipida je smanjeno nakon prelaska na CD, u skladu s prethodnim nalazima 19 (Slika 4g). Važno je primijećeno daljnje smanjenje nakupljanja lipida kod miševa koji su ušutkali endospanin 1 u usporedbi s kontrolama prebačenim na CD (Slike 4h-j). Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da prigušivanje endospanina 1 u ARC-u pretilih miševa prebačenih na CD ne samo da normalizira BW, već i poboljšava parametre lipida u krvi i steatozu jetre.

Image

Smanjenje regulacije endosanina 1 u ARC gojaznih miševa smanjuje lipidne parametre u plazmi i steatozu. ( a - g ) Plazemske koncentracije lipidnih parametara u krvi prikupljene u 11. tjednu nakon prigušivanja. ( h ) Boje u ulju Red-O bojenje masti na smrznutom dijelu jetrenog tkiva naivnih miševa koji su hranili HFD ili tretirane miševe. Prikazane su dvije reprezentativne slike jetrenih odjeljaka različitih miševa iste skupine. ( i ) Kvantifikacija kapi masnoće softverom ImageJ. ( j ) Kvantifikacija veličine kapi masti pomoću softvera ImageJ. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

Slika pune veličine

Ušutka Endospanina 1 u ARC pretilih miševa prebačenih na CD značajno poboljšava oporavak fosforilacije STAT3, stimulirane leptinom, u ARC

ARC neuroni kao što su proopiomelanokortin i neurotički povezani peptidni (AgRP) neuroni mogu osjetiti i integrirati informacije iz leptina u plazmi za regulaciju unosa hrane i BW. Fosforilacija STAT3, koja regulira ekspresiju ciljnih gena odgovornih za anorektički učinak leptina, povećava se nakon aktiviranja leptina. Taj je učinak u velikoj mjeri izmučen kod pretilih miševa. 20 Hipotetirali smo da je učinak prigušivanja endospanina 1 na BW povezan s poboljšanom sposobnošću leptina da aktivira STAT3. Stoga smo procijenili fosforilaciju izazvanu leptinom u STC3 kontrolnih i prigušenih miševa. Miševi (Ctrl-HFD-HFD) izazvani HFD-om tijekom 4 mjeseca nisu pokazali fosforilaciju izazvanu leptinom fosforilacijom u ARC-u nakon intraperitonealne injekcije leptina, otkrivajući dobro poznatu središnju otpornost na leptin (slika 5a). Slično tome, prigušivanje endospanina 1 nije uspjelo oporaviti odgovor leptina kod pretilih miševa koji su se dugo vremena držali na HFD-u (slike 5a i c), što je u skladu s odsutnošću bilo kakve razlike u BW između prigušenih i kontrolnih životinja nakon 4 mjeseca na HFD-u (vidi sliku 3a). Važno je da su se nakon prelaska na CD, kontrolne životinje (Ctrl-HFD-CD) samo djelomično oporavile od inhibicije STAT3 uzrokovane DIO u ARC-u, dok su miševi koji utišavaju endospanin 1 (Endo1-HFD-CD) pokazali važno povećanje leptina -inducirana STAT3 aktivacija (slike 5b i c).

Image

Učinak snižavanja regulacije endospanina 1 u ARC gojaznih miševa na fosforilaciju izazvanu leptinom. Fosforilacija STAT3, promovirana leptinom, u ARC pretilih miševa kojima je ubrizgan kontrolni ili endospanin 1 shRNA ekspresionirajući lentivirusne vektore HFD ( a ) ili prebačeni na CD ( b ) ( * P <0, 05; ** P <0, 01) i kvantificirani sa ImageJ softver ( c ). Svaka traka predstavlja jedan miš miša ARC. Odabir miševa ubrizganih bilo leptinom ili fiziološkom otopinom prije nego što su ubijeni, a ARC udarci su provedeni nasumično.

Slika pune veličine

Uzeto zajedno, smanjenje povišene razine endospanina 1, posebno u ARC-u, pretilih miševa, očito olakšava oporavak od DIO, inducirajući dugotrajni gubitak težine u kombinaciji s CD-om, poboljšanom leptinskom reaktivnošću STAT3 puta.

Rasprava

U našem modernom društvu unos visoko kaloričnih obroka obogaćenih masnoćama glavni doprinosi ljudskoj pretilosti. U ovoj studiji istražili smo terapijska svojstva prigušivanja endospanina 1 na miševima koji su bili hranjeni dijetom s visokim udjelom masti i pokazali su da endospanin 1 ima kurativni potencijal. Središnja uloga endospanina 1 u regulaciji BW-a sugerira se opažanjem da je endospanin 1 reguliran u pretilih miševa i da je njegovo smanjivanje vrijednosti u ARC-u dovoljno za poništavanje DIO-a kada je povezano sa standardnom prehranom.

Smanjenje regulacije endosanina 1 u ARC utječe na kontrolu BW

Kod kontrolnih životinja (Ctrl-HFD-CD), prelazak na CD sa libertom pokazao je samo prolazan i neznatan utjecaj na gubitak BW. Slična zapažanja izvijestila su Guo i sur., 21 koji su otkrili da je vraćanje miševa na ne-pretilu prehranu, nakon hranjenja ad libituma, nakon izlaganja HFD-u, rezultiralo stalnim porastom tjelesne masne mase. U drugom istraživanju opaženo je učinkovito mršavljenje nakon prebacivanja HFD miševa na CD, ali samo pod uvjetima kalorijskog ograničenja koje odgovara unosu hrane u normalnih miševa, 22 što sugerira da neučinkovit gubitak težine karakterizira neograničen veći unos hrane. Održavanje trajnog gubitka težine tijekom dugog vremenskog razdoblja također je izazov koji se ne može lako postići kod ljudi određenom prehranom. Zapravo, kalorijsko ograničenje potencijalno znači smanjenje kilograma, ali kao i kod glodavaca, smanjenje težine se ne može dugoročno sačuvati zbog povećane gladi, koja potiče ponovno dobivanje kilograma. 23, 24, 25 Jedno od predloženih objašnjenja za to je obrana tjelesne masnoće i energetske homeostaze, čiji je cilj postizanje izuzetno precizne ravnoteže između unosa energije i potrošnje energije, što otežava dobrovoljno mršavljenje. 26, 27

Kao što je prikazano u ovoj studiji, smanjivanje regulacije endospanina 1, u kombinaciji s prelaskom na CD, može poništiti potpuno razvijenu pretilost s poboljšanim povoljnim učincima na cirkulirajuće lipidne parametre i steatozu. Dok samo prebacivanje na CD ad libitum nije uspješno, istodobno prigušivanje endospanina 1 u ARC smanjio je i unos hrane i masnu masu, što je dovelo do značajnog i održivog gubitka težine, najvjerojatnije povećanjem osjetljivosti ARC neurona na leptin. Predloženo je da se gubitak tjelesne težine povezan s gubitkom masne mase doživljava kao stanje 'nedostatka leptina', što potiče pojačani apetit i prejedanje zbog vožnje do povraćanja kilograma. 25 Kod miševa koji su ušutjeli endospanin, ovaj obrambeni mehanizam nadoknađuje se višom osjetljivošću na leptin u hipotalamičkom ARC-u, što vjerojatno rezultira održavanjem gubitka težine.

S druge strane, na HFD-u prevencija razvoja pretilosti je moguća kada se dogodi prigušivanje endospanina 1 kod naivnih mladih miševa, ali preokret postaje teži kad se prigušivanje dogodi u ARC-u starijih i već pretilih miševa, za koje su potrebni samo prolazni ali nije primijećeno trajno smanjenje BW. Moguće je da promjene poput otpornosti na leptin, koje su već instalirane kod pretilih miševa, ne mogu poništiti samo snižavanjem regulacije endospanina 1 u ARC-u, u uvjetima kada se i dalje osigurava visokoenergetska dijeta. Taj nedostatak učinka koji se primjećuje kod endospanin 1-HFD-HFD miševa ne bi trebao biti posljedica slabog propadanja endospanina 1 u uvjetima HFD-a jer je u regulacija endopropanina 1 mRNA uzrokovana HFD-om također smanjena u tihim miševima u istoj mjeri kao u CD- ušutkali miševe.

Endospanin 1-utišeni miševi u ARC karakterizirani su povećanom ekspresijom mRNA AgRP u ARC u usporedbi s WT miševima. Viši nivoi AgRP kod glodavaca osjetljivih na leptin konzistentni su s prethodnim radovima koji pokazuju i trendove prema višim AgRP u mišićima osjetljivim na leptin na CD-u u usporedbi s DIO miševima, koji su otporni na leptin. 22 Štoviše, Bouret i sur. uočili su da su AgRP projekcije iz ARC-a u paraventrikularno jezgro značajno veće u štakora osjetljivih na leptin i DIO, u usporedbi s DIO štakorima. 28 Povišene razine AgRP-a u kontekstu veće osjetljivosti na leptin za razliku od činjenice da je poznato da primjena leptina smanjuje ekspresiju mRNA AgRP-a, zahtijeva daljnja istraživanja. U tom pogledu, stupanj projekcije AgRP-a u paraventrikularno jezgro miševa koji su ušutjeli endospanin, također bi zaslužio detaljnije ispitivanje.

Većina kampanja za identifikaciju potencijalnog cilja za gojaznost proučava uključivanje određenog gena u prevenciju razvoja pretilosti (tj. Knockdown ili knockout određeni gen prije instaliranja pretilosti), dok se terapijski aspekti često ne bave (tj. Preokretom pretilost kod pretilih miševa). Naša je studija pokušala riješiti posljednji aspekt, jer postoji očit nagon za ispitivanjem molekularnih ciljeva u terapijskom okruženju koje bi bolje objasnilo stvarne potrebe u pretilosti kod ljudi.

Bariatrična kirurgija je jedini stvarni tretman pretilosti koji je učinkovit i može smanjiti smrtnost bolesnika s morbidnom pretilošću. 29, 30 Međutim, smrtnost tijekom operacije i postoperativnih komplikacija nije zanemariva i često se susreće. 31, 32, 33 Osim toga, operacija se obično propisuje pacijentima s morbidnom pretilošću. Otuda postoji očigledan zahtjev za učinkovitim i sigurnim nehirurškim tretmanima. Liječenje gojaznosti sredinom jednokratne primjene lijeka pokazuje ograničenu učinkovitost 34 i može izazvati štetne učinke. 35, 36, 37 Multiterapija koja koristi istodobnu kombinaciju više lijekova čini se obećavajućim pristupom uklanjanju pretilosti s dovoljno sigurnosti i djelotvornosti. 38 Stoga je potrebno identificirati dobre ciljeve i razviti nekoliko lijekova koji bi utjecali na različite mehanizme koji kontroliraju regulaciju tjelesne mase na integrativan način. Povećavanje osjetljivosti stanice na leptin preokretom otpornosti na leptin preko inhibicije endospanina 1 moglo bi biti dio ovih rješenja.

Smatra se da rezistencija na leptin proizlazi iz nekoliko popratnih mehanizama, kao što su oslabljeni transport leptina preko krvno-moždane barijere, 10, 11, nedostatak veze između neurona, 28 stresplastičnog retikuluma u endoplazmi 8, 9 ili prekomjerna ekspresija OBR-negativnih regulatora. 39 Ovdje predlažemo da niska količina recepta za leptin na staničnoj površini neurona, istodobno s pojačanom ekspresijom endospanina 1, također može sudjelovati u razvoju otpornosti na leptin. Važnost bazenske površinske baze OBR u neuronima u razvoju otpornosti na leptin kod ljudi nije razmotrena i trebat će ih dodatno istražiti. U skladu s ovom hipotezom, terapeutski tretman koji dovodi do smanjene ekspresije endospanina 1 poboljšao bi rezistenciju na leptin kod pretilih pojedinaca. Stoga bi u terapijskom okruženju tretmani kofarmakoterapijom, kao što je davanje leptina s GLP-1 40 ili amilinom 41, mogli imati dodatnu korist od povećane osjetljivosti na leptin tijekom prigušivanja endospanina 1 čak iu kontekstu unosa velike masnoće.

Dokaz koncepta: terapijske perspektive

Ranije smo pokazali da endospanin 1 regulira postinternalizacijske korake trgovine OBR-om, razgradnju i ekspresiju stanične površine: 14, 15 endospanin 1 zadržava OBR unutar stanice i na taj način ograničava osjetljivost stanice na taj hormon. Zanimljivo je da u ovom radu pokazujemo da ćutanje endospanina 1 lentivirusnim vektorima u ARC-u preokreće razvoj pretilosti kod miševa koji su hranjeni s HFD-om. Ovi rezultati pokazuju da bi vraćanje osjetljivosti na leptin kod pretilih bolesnika i indukcija gubitka tjelesne težine povećanjem broja OBR-a na staničnoj površini moglo biti izvedivo terapijski pristup za liječenje pretilosti kod ljudi.

Ključna zabrinutost u terapiji je potreba da se ispita pitanje specifičnosti i mogućih nuspojava. Specifičnost endospanina 1 za OBR sugerira činjenica da su endospanin 1 i OBR genetski povezani u ljudi i da ih kodira isti gen. Štoviše, naša nedavna studija o ljudskoj deleciji dijela LEPR gena, što dovodi do odsutnosti endospanina 1 i OBR ekspresije, sugerira da odsutnost endospanina 1 nije imala većih fenotipskih posljedica kod ljudi različitih od konteksta funkcionalnog nedostatka OBR. 17 Ovo promatranje sugerira određeni stupanj specifičnosti funkcije endospanina 1 za OBR kod ljudi.

Ovdje pokazujemo da je ciljana isporuka molekula shRNA izražena iz lentivirusnih vektora izvediva i da može biti osnova za buduće genske terapijske strategije primjenom sigurnih virusnih vektora. Zanimljivo, dvije nedavne studije izvijestile su o obećavajućim rezultatima ispitivanja na genskoj terapiji usmjerenoj lentivijalima. 42, 43 Kao produžetak, klasičniji pristup zasnovan na spojevima male molekulske mase koji interferiraju s interakcijom OBR / endospanin 1 također može dovesti do povećanja izloženosti OB-R stanične površine i korisnih terapijskih učinaka na BW. 44 Općenitije, ciljanje specifičnih interaktivnih proteina, poput endospanina 1, umjesto samih receptora, može predstavljati zanimljivu alternativu za nove i učinkovite terapijske pristupe.

Zaključno, ovaj rad pokazuje da endospanin 1 nije reguliran u ARC-u pretilih miševa koji doprinose rezistenciji na leptin, a njegovo prigušivanje u ARC-u potpuno pretilih miševa povezanih s prestankom HFD-a može postići dugotrajni preokret pretilosti.

Materijali i metode

životinje

Muški miševi C57BL / 6J (Charles River, L'Arbresle, Francuska) bili su smješteni u životinjskom objektu bez biološke sigurnosti, nivoa 2, u standardnom 12-satnom svjetlosnom ciklusu 12 / h, prema institucionalnim smjernicama. Životinje su hranjene standardnom prehranom glodavaca (CD) ili HFD (D12451; Istraživačka dijeta) i osiguravale su im vodu i hranu ad libitum .

Ekstrakcija RNA i kvantitativni RT-PCR u stvarnom vremenu

RNA je ekstrahirana iz tkiva pomoću RNeasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Francuska). Retrotranskripcija izvedena je korištenjem reverzne transkriptaze (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francuska), a zatim qPCR-om sa LightCycler SYBR Green (Roche, Meylan, Francuska). Primeri za endospanin 1 (5'-GGACTTCCTGTTGTTCTTGC-3 'i 5'-AAGACGAGGAAGAAGCCTTG-3'), RPLP0 (5'-GGACCCGAGAAGACCTCCTT-3 'i 5'-GCACATCACTCAGAATTAGAGGATATAGTATAGG)

RNA iz ARC udaraca ekstrahirana je RNeasy Micro Kit (Qiagen), a reverzna transkripcija izvršena je pomoću cDNA sinteze Maxima First Strand za RT-PCR (Thermo Fisher, Villebon-sur-Yvette, Francuska). TaqMan popisana ekspresije gena testovi (Život Tehnologija, Saint Aubin, Francuska) su korišteni za ispitivanje razine ARC za AGRP (Mm00475829_g1), CART (Mm04210469_m1), endospanin 1 (Mm00838516_g1), NPY (Mm03048253_m1), propiomelanokortina (Mm00435874_m1) i RPLP0 (Mm00725448_s1 ).

Proizvodnja lektivira i intracerebralna stereotaktička injekcija

Proizvodnja leći i stereotaktična injekcija izvedeni su kako je ranije opisano. 15 Stereotaktična injekcija endospanina 1 ili kontrolna (1 neusklađenost u nizu endospanina 1) shRNA provedena je na 4 mjeseca starim pretilim miševima ( n = 80). Dva tjedna nakon operacije, polovina kontrolnih miševa ili utihnutih miševa bili su hranjeni CD-om ili HFD-om.

BW i unos hrane

BW je praćen 32 tjedna tjedno. Unos hrane izmjeren je u 12–15 tjedana nakon prigušivanja. Perigonadalni WAT ponderiran je za procjenu mase tjelesne masti nakon ubistva.

Histološka obojenja

Masno tkivo se inkubira u otopini za fiksiranje koja sadrži 4% paraformaldehida na 4 ° C preko noći i ugrađuje se u parafin prema standardnim protokolima. Tkivni blokovi rezani su na 7 mm sekcije na kliznom mikrotomu i montirani na tobogane prevučene želatinom. Nakon deparafinizacije (20 min ksilola, 2 min izopropanola, 2 min 96% -tnog etanola, 2 min 75% -tnog etanola), klizači su isprani fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom, a potom obojeni hematoksilinom i eozinom. Relativna veličina adipocita procijenjena je brojenjem broja adipocita na presjeku od 100 µm. Zamrznute dijelove jetre debljine 7 μm obojene smo za neutralnu masnoću svježe pripremljenim bojom uljem crveno-O (0, 5%) i vizualizirale laganom mikroskopijom.

Analiza plazme

Plazma je dobivena iz pune krvi prikupljene iz repne vene na kapilarima heparina i centrifugirana na 5000 g tijekom 5 minuta. Plazma je analizirana pomoću komercijalnih kompleta za koncentracije triglicerida (Beckman Coulter, Villepinte, Francuska), neterificirane masne kiseline (Randox, Roissy-en-France, Francuska), kolesterol (Beckman Coulter), lipoprotein visoke gustoće (Beckman Coulter), glicerol ( Randox) i hidroksibutirat (Beckman Coulter).

Leptin signalizacija u hipotalamičkom ARC-u

U 32. tjednu, 16-satni Ctrl-HFD-CD, Endo1-HFD-CD, Ctrl-HFD-HFD i Endo1-HFD-HFD miševima intraperitonealno su ubrizgani ili s 1 mg kg -1 min leptina (PLR Ltd, Rehovot, Izrael) ili fiziološkom otopinom i ubijen 60 min kasnije. Hipotalamički ARC, oporavljen mikropunjačama 200 μm smrznutih dijelova mozga, denaturiran je u puferu Laemmli koji sadrži inhibitore fosfataze (10 mM natrijevog fluorida i 2 mM ortovananadata) i analiziran u Western blot analizi.

Western blot analiza

Tkivni lizati su odvojeni elektroforezom natrijevim dodecil-sulfat-poliakrilamidnim gelom, preneseni u nitrocelulozne membrane i imunoblokirani anti-fosfotirozin (Tyr-705) STAT3 i anti-STAT3 (Cell Signaling, Danvers, MA, SAD) antitijela. Analiza Western blot-a skenirana je u Odyssey infracrvenom sustavu za obradu slika (Licor, Lincoln, NE, USA) i kvantificirana softverom ImageJ (Bethesda, MD, USA).

statistika

Podaci su analizirani ili jednosmjernom analizom varijancije, nakon čega slijedi Dunnettov ili Tukeyjev višestruki usporedni test pomoću GraphPad softvera (La Jolla, CA, SAD). Rezultati su predstavljeni kao sredstvo ± sem, a razlike su smatrane značajnim ako je P > 0, 05.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web lokaciji Gene Therapy (//www.nature.com/gt)