Dizajnirani faktor rasta fibroblasta 19 štiti od ozljede jetre izazvane acetaminofenom i potiče starosnu regeneraciju jetre kod miševa | stanična smrt i bolest

Dizajnirani faktor rasta fibroblasta 19 štiti od ozljede jetre izazvane acetaminofenom i potiče starosnu regeneraciju jetre kod miševa | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Signalizacija faktora rasta
  • Bolesti jetre
  • Molekularni inženjering
  • regeneracija

Sažetak

Jetra pokazuje izvanredan regenerativni kapacitet koji se pokreće nakon ozljede ili resekcije tkiva. Međutim, regeneraciju jetre može se prevladati od prekomjernog uništavanja parenhima ili umanjiti postojećim uvjetima koji otežavaju popravak. Faktor rasta 19 fibroblasta (FGF19, glodavac FGF15) je enterokin koji regulira metabolizam jetre i žuči u jetri, te potiče sintezu i proliferaciju hepatocelularnih proteina. FGF19 / 15 je također važan za regeneraciju jetre nakon djelomične hepatektomije (PH). Stoga bi rekombinantni FGF19 bio idealna molekula za poticanje regeneracije jetre, ali njegovu primjenjivost može se smanjiti kratkim poluživotom. Razvili smo himernu molekulu nazvanu Fibapo u kojoj je FGF19 kovalentno povezan s apolipoprotein AI. Fibapo zadržava biološke aktivnosti FGF19, ali značajno je povećao poluživot i hepatotropizam. Ovdje smo procijenili proregenerativnu aktivnost Fibapoa u dva klinički relevantna modela kod kojih može doći do poremećaja regeneracije jetre: trovanje acetaminofenom (APAP) i PH u starijim miševima. Jedina odobrena terapija za intoksikaciju APAP-om je N- acetilcistein (NAC) i nisu dostupni lijekovi za poticanje regeneracije jetre. Pokazujemo da je Fibapo smanjio ozljede jetre i potaknuo regeneraciju miševima intoksikiranim APAP-om. Fibapo je poboljšao preživljavanje miševima otrovanim APAP-om kada su dani u kasnijim vremenskim točkama, kada NAC nije učinkovit. Mehanički gledano, Fibapo je ubrzao oporavak razine glutationa u jetri, potencirao putove povezane sa rastom stanica i povećao funkcionalnu masu jetre. Kad su Fibapo primijenjeni na stare miševe prije PH-a, regeneracija jetre izrazito se povećala. Pogoršana ozljeda koja se razvijala kod ovih miševa nakon PH bila je umanjena, a pojačana je biosintetska sposobnost jetre. Fibapo je ukinuo metaboličke i molekularne promjene koje sprečavaju regeneraciju u starijoj jetri. Smanjena je steatoza jetre i snižavanje razine p21 i nuklearnog faktora 4 hepatocita 4 α ( Hnf4α ), dok je potaknuo ekspresiju gena Foxm1b . Zajedno naša otkrića ukazuju na to da varijante FGF19 koje zadržavaju metaboličke i rastuće efekte ovog enterokina mogu biti korisne za poticanje regeneracije jetre.

Glavni

Jetra ispunjava ključnu ulogu u detoksikaciji metabolita i egzogenih spojeva. U tom procesu mogu se stvoriti štetni podražaji koji na kraju uzrokuju hepatocelularnu smrt. Da bi se nosila sa ovom situacijom, jetra je razvila izvanrednu regenerativnu sposobnost kakvu nemaju drugi organi. 1 Regeneracija jetre također se očituje kao snažan odgovor nakon kirurškog uklanjanja dijela tkiva. 2, 3, Stoga, u kontekstu oštećenja parenhima ili resekcije tkiva, pokreće se snažna hepatoprotektivna i regenerativna reakcija unutar jetre kao i sistemski. 1, 4 Regeneracija jetre uključuje preživljavanje i pro-mitogene mehanizme aktivirane fluktuirajućim metabolitima, citokinima i faktorima rasta u zamršenom staničnoj i molekularnoj preslici. 1, 2 Regenerativni odgovor obično završava obnavljanjem histološkog integriteta i jetrene funkcije, što je bitno za homeostazu i preživljavanje. 5, 6 Međutim, postoje okolnosti u kojima je regenerativni kapacitet jetre nadjačan opsegom uništenja parenhima ili smanjen već postojećim stanjima koja povećavaju ozljede i otežavaju obnavljanje tkiva. 7

U kliničkom kontekstu, akutna ozljeda jetre koja vodi do oštećenja funkcije jetre i regenerativnog kapaciteta može se pojaviti u različitim situacijama. Među njima je vodeća intoksikacija lijekovima, a predoziranje acetaminofenom (APAP) čini gotovo 50% svih slučajeva u zapadnom svijetu. 8 Trenutno je jedini odobreni lijek za liječenje intoksikacije APAP-om N- acetilcistein (NAC). 8, 9 Učinkovitost NAC-a uglavnom se temelji na njegovim pozitivnim učincima na razine glutationa u jetri (GSH), koje je iscrpio toksični APAP metabolit N- acetil- p- benzokinon (NAPQI). NAPQI pokreće disfunkciju mitohondrija, oksidativni stres i masivnu nekrozu hepatocita. 10 Smrt hepatocelule usporava aktiviranje urođenog imunološkog sustava, reakciju koja se sve više prepoznaje kao zaštitna i progenerativna, a ne štetna reakcija. 9 Klinička opažanja pokazuju da se regeneracija novih parenhimskih stanica čini ključnim za preživljavanje nakon akutnog zatajenja jetre izazvanog APAP-om. 11 Dakle, razumijevanje endogenih mehanizama zaštite i regeneracije jetre može omogućiti identificiranje terapijskih strategija. 12, 13 U ovom je razmišljanju pojačanje prirodnog regenerativnog odgovora eksperimentalnom primjenom faktora rasta i citokina nedavno pokazalo obećavajuće učinke na APAP toksičnost. 14, 15, 16, 17, 18 Istraživanje novih terapijskih pristupa je važno jer je NAC učinkovit samo ako se primjenjuje rano nakon intoksikacije APAP-om i transplantacijom jetre, jedina terapijska alternativa u teškim slučajevima. 10, 13

Drugi klinički scenarij u kojem regeneracija jetre može propasti je kada se u bolesnih ili starijih jetri izvede djelomična hepatektomija radi uklanjanja primarnih ili metastaznih tumora ili nakon segmentarne transplantacije jetre. 7 Na primjer, pacijenti s masnom jetrom, stanje koje obično prati kolestaza, često imaju lošiji ishod nakon resekcije. 19, 20 Ovaj je oslabljeni odgovor široko potvrđen u eksperimentalnim modelima hepatosteatoze. 21, 22 Slično, regeneracija jetre je kompromitirana u starijih bolesnika i starijih glodavaca. 23, 24, 25 Mehanizmi koji stoje na osnovi pada regenerativne sposobnosti starijih jetri nisu u potpunosti poznati, iako su izloženi neki epigenetski i unutarćelijski mehanizmi signalizacije koji vode do promjena staničnog ciklusa. 23, 26, 27, 28, 29, 30 Otkrivanje ovih temeljnih procesa može dovesti do razvoja farmakoloških terapija kako bi se ublažili oštećeni poremećaji regeneracije jetre, što je eksperimentalno dokazano u nedavnim studijama. 23, 29, 31 Uz sve stariju populaciju važno je osmisliti takve terapije.

Nedavno smo pokazali značajnu ulogu faktora rasta enterokine fibroblasta 19 (FGF19; FGF15 kod glodavaca) 32, 33 i njegovog receptora FGFR4 u regeneraciji jetre nakon PH. 34, 35, 36 FGF15 / 19 kontrolira homeostazu žučnih kiselina (BA), smanjuje nakupljanje masti u jetri i povećava preživljavanje i proliferaciju hepatocita. Dostava FGF15 / 19 iz virusnih vektora poboljšava preživljavanje miša nakon opsežne resekcije jetre, 22, 34 i rekombinantnog FGF19 štiti od kolestatske ozljede jetre i lipotoksičnosti. 22, 37, 38 Iz translacijske perspektive, ove karakteristike identificiraju FGF15 / 19 kao obećavajući alat za poboljšanje regeneracije jetre u nepovoljnim uvjetima. Međutim, FGF15 / 19 ima vrlo kratak poluživot s visokom brzinom glomerularne filtracije. 38 Da bismo zaobišli ovo ograničenje, nedavno smo razvili himernu molekulu koja se temelji na fuziji FGF19 s apolipoproteinom AI (ApoA-I) nazvanim Fibapo. 22 Dio ApoA-I daje Fibapou povećanu biološku stabilnost i cilja je na jetru interakcijom skupine ApoA-I s hepatocitnom skupinom receptora razreda B tipa I. 22 Ovdje pokazujemo primjenu Fibapoa za liječenje APAP-inducirana ozljeda jetre i u stimulaciji starije regeneracije jetre.

Rezultati

Fibapo štiti od APAP toksičnosti i pospješuje regeneraciju jetre

Da bi analizirali učinak Fibapo na toksičnost APAP, miševi su primili tri doze rekombinantnog proteina 2, 10 i 24 sata nakon injekcije APAP (300 mg / kg). Razina transaminaza u serumu i centrilobularna nekroza jetre smanjeni su primjenom Fibapo-a (slike 1a i b). Ozljeda jetre izazvana APAP-om prati kompenzacijski regenerativni odgovor. 39 Otkrili smo jasan porast omjera mase jetre i tjelesne mase (Slika 1c), veličine hepatocitne stanice i hepatocelularne proliferacije (označavanje Ki-67) nakon liječenja Fibapoom (slika 1d i dopunska slika 1). Dosljedno, inducirana je ekspresija regulatornih gena staničnog ciklusa Foxm1b , Cdc25b , Ccne1 i Ccnb2 (slika 1e i dopunska slika 2). U velikoj mjeri FGF19 regulira hepatocelularnu proliferaciju i rast aktiviranjem mehaničkog cilja staze rapamicin kompleksa 1 (mTORCl) -p-70S6 kinaze (p70S6K). 22, 40 Primijetili smo da miševi liječeni Fibapo-om nakon primjene APAP-a pokazuju povećane razine p-p70S6K (Slika 1f). Razina jetrene ekspresije interleukina 10, citokina uključenog u endogeni hepatoprotektivni odgovor na intoksikaciju APAP-om 41, također je bila izrazito inducirana (dopunska slika 3).

Image

Davanje Fibapoa štiti od APAP izazvane ozljede jetre. ( a ) Razine ALT i AST u serumu kod kontrolnih miševa (C), miševa koji su tretirani APAP (A) (300 mg / kg) ili miševa koji su 2, 10 i 24 sata nakon APAP injekcije primili tri doze Fibapo (A + FA) ( n = 7 miševa po grupi). Uzorci krvi i tkiva uzeti su 36 sati nakon primjene APAP-a, kada su ubijeni miševi. ( b ) Reprezentativne dijelove jetre obojenih s H i E od miševa koji su tretirani kako je opisano. Nekrotična područja su naznačena (N). Grafikon prikazuje kvantifikaciju nekrotičnih područja tkiva. ( c ) Omjer jetrene mase i tjelesne mase (indeks jetre) kod miševa iz različitih opisanih skupina liječenja. ( d ) Lijeva ploča pokazuje prosječnu veličinu hepatocita, a desna ploča pokazuje kvantifikaciju hepatocita s Ki-67-pozitivnim jezgrama u odjeljcima jetrenih miševa kod miševa liječenih kako je opisano. ( e ) Kvantitativna PCR analiza ekspresije gena povezanih sa staničnim ciklusom u jetrenim tkivima od miševa liječenih kako je opisano. ( f ) analiza Western blot fosfo-p-70S6K (pp-70S6K) i ukupne razine p70S6K u uzorcima tkiva jetre kod miševa tretiranih kako je opisano. Prikazane su reprezentativne mrlje. * P <0, 05 i ** P <0, 01 nasuprot APAP-tretiranim miševima. AU: proizvoljne jedinice

Slika pune veličine

Za daljnje testiranje hepatoprotektivnih učinaka Fibapa liječili smo miševe s većom dozom APAP-a (500 mg / kg), što inducira značajnu smrtnost (vidjeti dolje). Dva sata nakon APAP injekcije miševi su primili jednu dozu Fibapa i ubijeni su 6 i 10 sati kasnije. U hepatotoksičnosti APAP-a, kritični početni korak uključuje iscrpljivanje GSH zahvaljujući konjugaciji s NAPQI, reaktivnim metabolitom APAP-a. 10 Glavni enzim u stvaranju NAPQI je citokrom 2E1 ( Cyp2E1 ). 9 Izraz CYP2E1 je Fibapo nepromijenjen (slika 2a). Iako rano iscrpljivanje jetrenog GSH-a nije spriječeno Fibapo-om, sadržaj GSH-a vraćen je na kontrolne razine do 10 h (slika 2b). Ova opažanja sugeriraju da Fibapo ne bi utjecao na metabolizam APAP-a niti na početne faze toksičnosti APAP-a10, ali može pomoći u funkcionalnom oporavku hepatocita kako je naznačeno sa razinama GSH-a.

Image

Učinci Fibapo-a na rane reakcije jetre na smrtonosne doze APAP-a. ( a ) Analiza Western blot ekspresije CYP2E1 u jetri miševa ( n = 7 po skupini) liječenih APAP (A) (500 mg / kg) koji su 2 sata kasnije primili jednu dozu Fibapo-a (FA). Miševi su ubijeni 6 i 10 h nakon injekcije APAP. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( b ) Ukupne razine glutation-a (GSH) u jetri miševa koji su tretirani kako je opisano i ubijeni 6 h i 10 h nakon injekcije APAP. ( c ) Analiza Western blot fosfo-JNK (p-JNK) i ukupne razine JNK u frakcijama mitohondrija dobivenih iz jetre miševa tretiranih kako je opisano i ubijenih u 6 i 10 h nakon injekcije APAP. Razine proteina COX IV analizirane su kao kontrola opterećenja. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( d ) Analiza Western blot fosfo-ERK1 / 2 (p-ERK1 / 2) i ukupne razine ERK1 / 2 u jetrenim homogenatima dobivenim od miševa tretiranih kako je opisano i ubijenih u 6 i 10 sati nakon APAP primjene. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( e ) Kvantitativna PCR analiza nivoa Bcl-xL mRNA u jetri miševa koji su tretirani kako je opisano i ubijeni 10 sati nakon aplikacije APAP. ( f ) Kvantitativna PCR analiza razine IL-6 i IL-22 mRNA u jetri miševa koji su tretirani kako je opisano i ubijeni u 6 h i 10 h nakon primjene APAP-a. ( g ) Kvantitativna PCR analiza nivoa mRNA FGF19 receptora FGFR4, FGFR1c i ko-receptora Klb u primarnim kultiviranim mišjim makrofagama. AU: proizvoljne jedinice. ND: nije otkriveno. * P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001 nasuprot APAP (A) -obrađenim miševima

Slika pune veličine

Izdvojena aktivacija i mitohondrijska translokacija c-jun- N- terminalne proteinske kinaze (JNK), što dovodi do gubitka mitohondrijskog potencijala i proizvodnje ATP-a, mehanički je povezana s hepatotoksičnošću APAP-a. 9, 42 U skladu s tim, primijetili smo da APAP povećava JNK fosforilaciju i mitohondrijsku translokaciju (Slika 2c). Iako u 6 h nakon APAP administracije Fibapo na p-JNK razinu nije utjecala, one su značajno smanjene za 10 sati (Slika 2c). Istodobno, pojačana aktivacija izvanćelijske signalno regulirane kinaze 1/2 (ERK1 / 2), koja se smatra dijelom kompenzacijske proregenerativne signalizacije potaknute APAP toksičnošću, 39, 43 primijećena je kod miševa koji su tretirani Fibapo (slika 2d). Ekspresija Bcl-xL , inhibitora stanice ovisne o mitohondrijama, koja je uključena u hepatoprotekciju od APAP-a izazvane ozljede, 14, 42, pojačana je nakon liječenja Fibapo-om (Slika 2e).

U-regulacija IL-6 otkrivena je u miševima intoksikiranim APAP-om i smatra se dijelom endogenog zaštitnog odgovora. 41 Kod miševa liječenih Fibapo-om jetrena IL-6 izrazito je pojačana (Slika 2f). Ekspresija IL-6 povezanog hepatoprotektivnog citokina IL-22 41 također je održana nakon liječenja Fibapoom (slika 2f). Nedavno je zabilježeno indukciju IL-6 primjenom FGF19 kod db / db miševa. 44 Stanični izvor IL-6 u ovih životinja bile su mijeloidne stanice jetre koje su infiltrirale jetru, međutim precizan mehanizam pomoću kojeg je FGF19 izazvao proizvodnju IL-6 nije procijenjen. 44 FGF19 signala kroz FGFR4 i FGFR1 izoformu c (FGFR1c), a koekspresija membranskog proteina β- Klotho (Klb) apsolutno je potrebna za učinkovitu signalizaciju. 45 Ispitali smo ekspresiju tih receptora u primarnim kultiviranim mišjim makrofazima. Zanimljivo je da smo otkrili da ove stanice izražavaju FGFR1c i Klb, ali ne i FGFR4 (Slika 2g).

Kasna primjena Fibapoa štiti od smrtonosnih doza APAP-a i potiče retenciju parenhima

Da bi bolje oponašali kliničku situaciju, u kojoj se pacijenti liječe u kasnim vremenima nakon trovanja APAP-om, miševi su primili Fibapo ili NAC u 6 i 24 sata nakon APAP-a. U ovom slučaju koristili smo 500 mg / kg APAP-a, doze koja uzrokuje značajnu smrtnost i može ugroziti endogeni regenerativni odgovor. 39 U tim uvjetima, liječenje NAC-om nije poboljšalo preživljavanje miša, dok su miševi koji su primali Fibapo pokazali manju smrtnost i nižu razinu cirkulirajućih jetrenih enzima (slike 3a i b). Uočena je i povećana hepatocelularna proliferacija (označavanje Ki-67) (slika 3c i dodatna slika 4) i omjer težine jetre i tjelesne težine (slika 3d).

Image

Kasna primjena Fibapoa štiti od smrtonosnih doza APAP-a i potiče regeneraciju jetre. ( a ) Miševi su tretirani s APAP (A) (500 mg / kg) i 6 i 24 sata kasnije primili su dvije doze ili NAC (A + NAC) ili Fibapo (A + FA). Grafikon prikazuje ukupno preživljavanje miša u 48 sati nakon intoksikacije APAP-om. ( b ) Razina jetrenih enzima u serumu kod miševa liječenih kako je opisano i izmjereno 24 i 48 h nakon intoksikacije APAP-om. ( c ) Kvantifikacija hepatocita s Ki-67-pozitivnim jezgrama kako je određeno imunohistohemijskom analizom koja je izvršena na dijelu jetrenog tkiva kod miševa koji su tretirani kako je opisano. Uzorci tkiva jetre dobiveni su od preživjelih miševa 48 sati nakon primjene APAP-a. ( d ) Omjer jetrene mase i tjelesne mase (indeks jetre) kod miševa iz različitih opisanih skupina liječenja. Ovaj je parametar izmjeren na miševima koji su preživjeli 48 sati nakon APAP primjene. a P <0, 05 nasuprot A, b P <0, 05 nasuprot A + NAC, ** P <0, 01 nasuprot A + NAC, *** P <0, 001 nasuprot A + NAC

Slika pune veličine

Fibapo poboljšava regeneraciju jetre kod starijih miševa

Nedavno smo izvijestili da Fibapo značajno poboljšava regeneraciju steatotičnih jetri. 22 stariji miševi također pokazuju oslabljenu regeneraciju, pa smo testirali učinak Fibapoa kod starih miševa koji su podvrgnuti PH. Fibapo je primjenjivan 3 uzastopna dana prije resekcije. Kao što je opisano, opazili smo da je ponovni rast jetre nakon PH značajno smanjen kod starih miševa 46, dok je ovaj odgovor značajno pojačan Fibapo (slike 4a i b). Parenhimska ozljeda, koja se pogoršava kod starijih glodavaca nakon PH, 46, 47, također je smanjila Fibapo (slika 4c). Zanimljivo je da je biosintetski kapacitet jetre također bio znatno povećan, što pokazuju i koncentracije albumina u serumu (Slika 4c). Dosljedno, nakon Fibapo injekcije otkrili smo povećanu razinu p-p70S6K i snažnu aktivaciju S6 fosforilacije, koja povezuje signalizaciju FGF19 s sintezom proteina u stanicama jetre (slika 4d). 32, 40

Image

Fibapo poboljšava regeneraciju jetre kod starijih miševa. ( a ) Oporavak jetrene mase nakon 66% PH kod mladih miševa, starijih miševa i starijih miševa koji su primili tri injekcije Fibapo (FA) 3 uzastopna dana prije operacije ( n = 6 miševa po skupini). ( b ) Kvantifikacija hepatocita s Ki-67-pozitivnim jezgrama utvrđenih imunohistohemijskom analizom koja je izvršena na odjeljcima jetrenih tkiva starijih miševa i starih miševa liječenih Fibapo (FA) u naznačenim vremenskim točkama nakon PH. ( c ) Cirkuliranje razine jetrenih enzima i albumina u serumu kod mladih miševa, starih miševa i starih miševa liječenih Fibapo (FA) izmjereno u naznačenim vremenskim točkama nakon PH. ( d ) Analiza zapadne mrlje razine fosfo-S6 (p-S6) (lijeva ploča) i razine p-p70S6K (desna ploča) u jetri mladih miševa, starih miševa i starih miševa tretiranih s Fibapo (FA). Uzorci jetre analizirani su 3 sata nakon primjene Fibapo-a. Prikazane su reprezentativne mrlje. ND: nije otkriveno. * P <0, 05 prema starijim miševima koji su tretirani s Fibapo

Slika pune veličine

Tretmanom Fibapo ispravlja se biokemijska i molekularna oštećenja povezana s poremećajem regeneracije jetre kod starijih miševa

Steatoza, koja se obično nalazi u starijoj jetri, 47, 48, i prisutnost kolestaze povezane sa steatozom 22, 49 povezane su s oštećenom regeneracijom nakon PH. 19, 20 Prema tome, stariji miševi imali su povećanu razinu intrahepatičnih triglicerida (TG) i ukupni BA u usporedbi s mladim miševima (slika 5a). U skladu s moćnim regulatornim učincima Fibapo-a na metabolizam lipida u jetri i BA, 22, 33 razine intrahepatije TG-a i BA značajno su smanjene (Slika 5a). Mehanički gledano, Fibapo je inhibirao ekspresiju receptora γ varijante 2 gena za peroksisom proliferatore i gena citokroma 7a1, ključnih medijatora jetrene akumulacije TG i sinteze BA, odnosno 50, 51 (slika 5a).

Image

Fibapo poboljšava metaboličke parametre i molekularne promjene povezane s poremećajem regeneracije jetre kod starijih miševa. ( a ) Analiza intrahepatijskih razina triglicerida (TG) i žučnih kiselina (BA) kod mladih miševa, kontroliranih starih miševa i miševa u dobi koji su primili tri injekcije Fibapo (FA) 3 uzastopna dana prije operacije ( n = 6 miševa po operaciji skupina). Kvantitativna PCR analiza razina mRNA Pparg2 i Cyp7a1 u jetri mladih, starijih i starih miševa liječenih kako je opisano. ( b ) Kvantitativna PCR analiza nivoa Hgf , c-met, p21 i p16 mRNA u jetri mladih, starih i starijih miševa liječenih kako je opisano. ( c ) Kvantitativna PCR analiza nivoa mRNA Foxm1b , Dhfr i Cdc25b u jetri mladih, starih i starijih miševa liječenih kako je opisano. * P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001 nasuprot kontrolnim dobi miševa

Slika pune veličine

Poremećena regeneracija jetre u starijoj dobi povezana je s defektnom ekspresijom gena uključenih u signalizaciju faktora rasta i regulaciju staničnog ciklusa. 23, 30 Primijetili smo da je Fibapo smanjio ekspresiju faktora rasta hepatocita ( Hgf ) i njegovog receptora c-met pronađenog u jetri starih miševa 25, 46 (Slika 5b). Kao što je opisano, također smo otkrili povećane razine mRNA inhibitora staničnog ciklusa p21 i p16 u jetri. 46, 52 p21 prekomjerna ekspresija značajno je ispravljena Fibapo-om, no p16 je ostala nepromijenjena (slika 5b i dopunska slika 5). Među najbolje okarakterizirane mehanizme koji sudjeluju u poremećaju regeneracije jetre kod starenja je transkripcijska represija gena ovisnih o E2F. 23 Ovo se pokazalo za gene koji se odnose na proliferaciju ključnih stanica poput Foxm1b i Dhfr . 53, 54 Foxmlb i Dhfr ekspresija je izrazito povećana kod starijih miševa liječenih Fibapo (Slika 5c). U skladu s jakom indukcijom ekspresije Foxm1b , također je induciran Cdc25b , Cdk fosfataza važna za progresiju staničnog ciklusa hepatocita i transkripcijski cilj Foxm1b, 55 (Slika 5c). U skladu s tim, povećana je i ekspresija nuklearnog antigena koji proliferira (PCNA) (dopunska slika 5).

Fibapo regulira ekspresiju gena faktora 4 α (HNF4 α ) hepatocita

HNF4 α je ključni transkripcijski faktor za očuvanje diferencijacije i smirivanja hepatocita. Otpad 5 HNF4 α u jetri miša rezultira snažnim hepatoproliferativnim odgovorom. 56, 57, 58, 59 Izuzetno je nedavno objavljeno da je jetrena ekspresija Hnf4α povećana u starijih štakora. 60 To smo zapažanje potvrdili u starijim miševima, a otkrili smo i da Fibapo smanjuje HNF4 α mRNA i razinu proteina (Slika 6a). Aktivnost transkripcije HNF4 α potiskuje se prvih sati nakon PH, što omogućava indukciju ranih gena koji posreduju u početku regeneracije jetre. 61, 62 Slijedom toga, procijenili smo ekspresiju HNF4 α nedugo nakon PH i otkrili prolaznu, ali značajnu smanjenu ekspresiju Hnf4α tijekom normalnog regenerativnog odgovora kod mladih miševa (Slika 6b). Ova zapažanja sugeriraju da snižavanje regulacije Hnf4α također može doprinijeti regeneracijskoj aktivnosti Fibapoa u jetri starijih miševa. Mehanizmi koji reguliraju ekspresiju HNF4 α u jetri odraslih vjerojatno su složeni i nisu u potpunosti poznati. 5 Prije toga, izvijestili smo da je regulator spajanja SLU7 temeljni faktor u očuvanju hepatocelularne diferencijacije i mirnoće te pozitivan efektor ekspresije gena HNF4 α u mišjoj jetri. 63 Stoga smo utvrdili ekspresiju SLU7 u jetri mladih i starijih miševa, kao i kod starijih miševa liječenih Fibapo-om. Kao što je primijećeno za HNF4 α , otkrili smo da su razine mRNA SLU7 veće u jetri starih miševa i značajno su smanjene nakon primjene Fibapo-a (dopunska slika 6a).

Image

Učinak signalizacije Fibapo i FGF19 / FGFR4 na ekspresiju gena HNF4 α . ( a ) Razina mRNA Hnf4α i proteina u jetri mladih, starijih i starijih miševa koji su tri uzastopna dana primili tri injekcije Fibapo-a (FA) ( n = 6 miševa po skupini). Razine Hnf4α mRNA analizirane su kvantitativnim PCR i razinama proteina Hnf4α zapadnim blontom . Prikazane su reprezentativne mrlje. ( b ) Kvantitativna PCR analiza HNf4α mRNA i Western blot analiza razine Hnf4α proteina u jetri mladih miševa u ranim vremenskim točkama nakon PH ( n = 5 po vremenskoj točki i stanju). Uzorci tkiva jetre od miševa koji su podvrgnuti laparotomiji, ali nisu hepatektomimizirani (lažni operirani miševi, SH) koriste se kao kontrola. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( c ) Lijeva ploča prikazuje razine mRNA HNF4a analizirane kvantitativnim PCR-om u stanicama Hep3B liječenih 12 h s naznačenim koncentracijama Fibapo-a. Desna ploča prikazuje razine proteina HNF4 α određene zapadnim upijanjem u stanicama Hep3B liječenih s 50 ng / ml Fibapo-a za naznačena razdoblja. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( d ) Učinak Fibapo- a na razine proteina HNF4 α u Hep3B stanicama u prisutnosti inhibitora signala MEK-ERK UO126, analiziranog Western blottingom. Stanice su prethodno tretirane s UO126 (10 μM) 45 min prije dodavanja Fibapo (50 ng / ml) i lizirane su nakon 8 sati liječenja. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( e ) Učinak Fibapo na razine proteina HNF4 α u Hep3B stanicama u prisutnosti inhibitora proteasoma MG-132. Gdje su naznačene stanice su prethodno tretirane s MG-132 (10 µM) 45 minuta, a zatim stimulirane s Fibapo tijekom 8 h. Prikazane su reprezentativne mrlje. ( f ) Lijeva ploča pokazuje učinak bazalne FGFR4 signalizacije na razine proteina HNF4 α u Hep3B ćelijama. Stanice su tretirane s naznačenim koncentracijama inhibitora BLU9931 specifičnog za FGFR4 tijekom 8 h i određene su razine proteina HNF4 a . Desna ploča prikazuje razine proteina HNF4 α u Hep3B stanicama transfektiranim s FGF19 specifičnom siRNA (siFGF19) ili kontrolnom siRNA (siGL) kako je određeno zapadnom blotiranjem 72 h nakon transfekcije. Prikazani su reprezentativni zapadni blotovi

Slika pune veličine

Zatim smo procijenili može li Fibapo izravno regulirati ekspresiju HNF4 α u stanicama jetre. Razina HNF4 α mRNA i proteina smanjena je u stanicama Hep3B nakon liječenja Fibapo-om (slika 6c), a to je djelomično ovisilo o signalizaciji proteina kinaza-kinaza (MEK) -ERK aktiviranom mitogenom (slika 6d i dodatna slika 6b). Dosljedno tome, FGF19 je također smanjio razinu mRNA i proteina HNF4 i proteina u stanicama Hep3B (dopunska slika 6c). Zanimljivo je da je smanjivanje regulacije HNF4 α posredovano Fibapoom u velikoj mjeri ovisilo o proteasomima (Slika 6e). Specifičnost ovih nalaza i značaj signalnog sustava FGF19 / FGFR4 u regulaciji ekspresije HNF4 α dodatno su potkrijepljeni opažanjem da obje inhibicije FGFR4 s BLU9931, inhibitorom malih molekula specifičnih za FGFR4, 64 ili na FGF19 destrukcija siRNA transfekcijom, povećana bazalna razina proteina HNF4 α (Slika 6f i Dodatna slika 6d).

Rasprava

Procijenili smo terapeutski potencijal Fibapo-a, projektirane verzije FGF19 s poboljšanom farmakokinetikom 22 u dva klinički relevantna modela akutnog zatajenja jetre i oslabljene regeneracije. U APAP-induciranoj ozljedi jetre, Fibapo je smanjio parenhimsku nekrozu i promovirao snažan regenerativni odgovor. Fiziološki, ekspresija FGF19 inducirana je u ilealnim enterocitima BA tijekom njihove enterohepatičke cirkulacije, a FGF15 je nedavno identificiran kao važan endogeni posrednik regeneracije mišje jetre i zaštite parenhima nakon PH. 34, 35, 36 Uloga endogenog FGF15 / 19 u toksičnosti APAP-a nije poznata. Međutim, inhibicija ilealne ekspresije FGF15 uklanjanjem BA iz enterohepatičke cirkulacije ili njegova regulacija hranjenjem miševa prehranom sa dodatkom čolata, povezana je s povećanom ili smanjenom APAP-om posredovanom ozljedom jetre. 65 Ovi nalazi, zajedno s našim trenutnim opažanjima korisnih učinaka Fibapo-a, sugeriraju citoprotektivnu i regenerativnu ulogu za FGF15 u hepatotoksičnosti APAP-a. Mehanizmi posredovanja Fibapo hepatoprotekcije vjerojatno su različiti. Iako nije inhibirao rano iscrpljivanje jetrenog GSH-a, oporavak razina GSH bio je brži u liječenih miševa. Zanimljivo je da je sličan učinak na razine GSH zabilježen i kod miševa intoksikanih APAP-om liječenih faktorima rasta vaskularnog endotela. 15 U slučaju Fibapa, to može odražavati poboljšanje ukupnih metaboličkih kapaciteta jetre, što bi bilo u skladu s snažnim pozitivnim učincima FGF19 na metabolizam hranjivih tvari, sintezu proteina i hepatocelularnu energiju. 32, 40 U prilog ovom konceptu opazili smo povećanu fosforilaciju p70S6K kod miševa tretiranih Fibapo. Nedavno je prijavljeno aktiviranje puta mTORC1-p70S6K od strane FGF19 u jetri. 22, 40 Ovaj put posreduje snažne anaboličke učinke, uključujući poticanje rasta i proliferacije stanica. 66 Osim p70S6K, otkrili smo i pojačanu aktivaciju ERK1 / 2, kinaze koja je snažno povezana s proliferacijom hepatocita. 32, 67 Zanimljivo je da je Fibapo povećao ekspresiju Foxm1b , transkripcijskog faktora koji je neophodan za proliferaciju hepatocita, ali također povezan s hepatocelularnom hipertrofijom. 55, 68 Prema tome, primijetili smo hiperproliferativni i hipertrofični odgovor na miševima koji su primili Fibapo nakon intoksikacije APAP-om. Ovi kombinirani učinci mogu biti mehanički značajni, jer se rast i regeneracija jetre pojavljuju kao ključne odrednice ishoda intoksikacije APAP-om. Dosljedno, nedavno je pokazano da inhibicija receptora epidermalnog faktora rasta, ključni posrednik regeneracije jetre nakon PH, 69 rezultira poremećenom regeneracijom, pogoršanom ozljedom jetre i visokom smrtnošću u intoksikaciji APAP-om. 70

Proregenerativne učinke Fibapa popraćene su smanjenim parenhimskim ozljedama. Produljena translokacija aktivnog JNK u mitohondrije središnji je događaj u hepatocelularnoj smrti uzrokovanoj APAP-om. 9, 42 Primijetili smo smanjenu aktivaciju mitohondrijskog JNK-a nakon primjene Fibapa. Mehanizmi koji su uključeni u ovaj odgovor trenutno su nepoznati. Aktivacija JNK tijekom ozljede jetre posredovane APAP-om snažno je povezana s mitohondrijskim stresom i proizvodnjom reaktivnih kisikovih vrsta. 10, 42 Mogli bismo nagađati da pojačani oporavak GSH razina Fibapo-om može smanjiti oksidativni stres, oslabiti JNK-aktivaciju i stoga ograničiti njegovu mitohondrijsku translokaciju. 42 Ipak su potrebne daljnje studije koje će precizirati precizne mehanizme ovog odgovora. Povišena regulacija Bcl-xL također može pridonijeti zaštitnim učincima Fibapoa, jer je Bcl-xL povezan s hepatoprotektivnom aktivnošću faktora matičnih stanica i c-kitom kod APAP izazvane ozljede jetre. 14

Aktivacija urođenog imunološkog sustava nakon intoksikacije APAP-om sve se više smatra dijelom endogene zaštitne reakcije. 9 Čini se da je izraz IL-6 neophodan za regeneraciju jetre. 71 Intrigantno smo primijetili da primjena Fibapo miševima tretiranim APAP-om značajno poboljšava IL-6 ekspresiju. Ovo sugeriše da bi Fibapo mogao također promovirati regeneraciju jetre putem ne-staničnih autonomnih putova. Naši nalazi su u skladu s nedavnim izvještajem koje pokazuje jetrenu IL-6 regulaciju jetre nakon primjene FGF19 na db / db miševima. 44 U toj su studiji izvor IL-6 izazvanog FGF19 bile jetrene infiltrirane mijeloidne stanice, iako točan mehanizam indukcije IL-6 koji posreduje FGF19 nije ispitan. 44 S obzirom na ta i naša trenutna zapažanja, procijenili smo ekspresiju FGF19 receptora FGFR4, FGFR1c i obveznog ko-receptora Klb 45 u mišjim makrofazima. Otkrili smo da mišji makrofagi eksprimiraju FGFR1c i Klb, ali ne i FGFR4 mRNA. Prema našem saznanju, ovo je prvi opis ekspresije tih receptora u imunološkim stanicama mišjih urođenih, a sugerira da bi stanični ciljevi FGF19 i Fibapo mogli biti širi nego što se prvobitno mislilo.

Također smo pokazali terapeutski potencijal Fibapa u kontekstu stare regeneracije jetre. Zanimljivo je da su bazalni krugovi FGF19 u cirkulaciji niži kod starijih pojedinaca u usporedbi s mladim zdravim ljudima. 72 S obzirom na važnu regulatornu ulogu FGF19 u metabolizmu masti u jetri, 22, 33 njegova smanjena dostupnost u starijih osoba može biti podloga steatoze koja se obično nalazi u ovoj populaciji. 47, 48 Steatoza predstavlja značajnu prepreku uspješnoj obnovi jetre. 19, 20 Njegovo prigušivanje od strane Fibapo-a može djelomično objasniti smanjene ozljede i poboljšanu regeneraciju jetre koje su pronađene u starijih miševa. Ipak, vjerujemo da ova molekula također ima izravnije djelovanje na gene koji su uključeni u hepatocelularnu proliferaciju. Obnavljanje nivoa Hgf i c-met ekspresije, koji su depresivni u staroj jetri, 25, 46, može biti važan učinak Fibapoa s obzirom na presudnu ulogu HGF / c-Met sustava u regeneraciji jetre. 69

Jedna važna molekularna barijera u regeneraciji jerevih jetri je stvaranje represivnih kompleksa na promotorima ovisnim o E2F, poput onih gena Foxm1b i Dhfr , koji su neophodni za staničnu proliferaciju. 23 Primijetili smo da je Fibapo primjena snažne regulacije Foxm1B i Dhfr . Stimulacija izraza Foxm1b pomoću Fibapo-a može biti ključni mehanizam djelovanja. Dakako, prisilna jetrena ekspresija Foxm1b , bilo iz transgena ili adenovirusnog vektora, poboljšava regeneraciju jetre kod starih miševa, 30, 73, a korisni učinci hormona rasta i agonista receptora farnezoidnog X na regeneraciju jetre mišića povezani su s povećanjem regulacije Foxm1b , 26, 31, 53 Štoviše, inhibicija p21 i aktiviranje Cdc25b ekspresije gena izazvanog Fibapoom može također ovisiti o Foxm1b stimulaciji. 55 Paralelno s regulacijom foxm1b , otkrili smo da je Fibapo također smanjio razinu HNF4 α , ključnog čimbenika u očuvanju hepatocelularne diferencijacije i mirnoće. 5, 56, 58 Pojačana ekspresija HNF4 α nedavno pronađena u starijoj jetri, 60 godina i koju smo potvrdili, sigurno bi mogla predstavljati prepreku regeneraciji jetre kod starih životinja. Doista, nedavna ispitivanja pokazuju da ubrzo nakon PH dolazi do smanjenja transkripcijske regulatorne aktivnosti HNF4 α u jetri mladih miševa. 61, 62 Iako ovo smanjenje aktivnosti HNF4 α može biti posljedica njegove fizičke preraspodjele na genomu, kao što se događa tijekom razvoja jetre, 74, primijetili smo prolaznu, ali jasnu pad vrijednosti ekspresije gena HNF4 α u prvim satima nakon PH. Taj prethodno nepriznati odgovor može biti dio molekularnih mehanizama koji omogućuju ulazak inače mirnih hepatocita u stanični ciklus.

Mehanizmi odgovorni za reguliranje HNF4 α u jetri mišjih jetri vjerojatno će biti razni. Na primjer, zabilježeno je da tkivna hipoksija, stanje koje se razvija u jetri starih životinja, stimulira ekspresiju HNF4 α u hepatocitima. 60 Sada smo otkrili da su razine SLU7, gena koji potiče ekspresiju HNF4 α u odrasloj jetri, 63 povećane u jetri starih miševa i zanimljivo su bile regulirane nakon primjene Fibapo-a. Vrijedno je spomenuti da se ekspresija SLU7 također brzo smanjuje u mišjoj jetri, ubrzo nakon PH, 63, s kinetikom koja se preklapa s izrazima HNF4 α izražene ovdje zabilježene.

Iako identitet endogenih signala koji posreduju snižavanje regulacije HNF4 α nakon PH trenutno nije poznat, liječenjem Fibapoom mogli bismo inducirati taj efekt u jetri starih miševa. Naši eksperimenti in vitro dokazali su da Fibapo može izravno regulirati ekspresiju gena HNF4 α , na nivou transkripcije i post-transkripcije, promovirajući proteasomsku degradaciju HNF4 α . Ovi nalazi podudaraju se s ranije opisanom inhibicijom ekspresije gena HNF4 α nakon farmakološke aktivacije MEK-ERK putanje u stanicama jetre parenhima. 75 Zanimljivo je da smo također primijetili da interferencija s autokrinim FGF19 / FGFR4 signalizacijom u stanicama Hep3B povećava ekspresiju HNF4 α . Ovaj odgovor podržava specifičnost Fibapo efekata. Međutim, može imati i šire implikacije u kontekstu hepatocarcinogenesis, gdje je HNF4 α ekspresija dosljedno regulirana i FGF19 je često prekomjerno izražen. 5, 76

Skupno, naša zapažanja pokazuju učinkovitost molekula temeljenih na FGF19, poput Fibapoa, kao hepatoprotektivnih i regenerativnih sredstava. Dva eksperimentalna modela implementirana u ovom istraživanju reproduciraju kliničke situacije za koje nedostaje učinkovito liječenje. Stoga je valjanost ovih nalaza u modelima akutne ozljede jetre i regeneracije kod većih životinja zagarantirana.

Materijali i metode

Životinjski modeli

Svi eksperimentalni protokoli odobreni su i izvedeni prema smjernicama Odbora za brigu o životinjama Sveučilišta u Navarri. Za APAP miševe koji su tretirani (C57 / BL / 6 J, mužjaci u dobi od 8-12 tjedana) ubrizgavani su intraperitonealno s 300 mg / kg ili 500 mg / kg spoja nakon prekonoćnog posta. APAP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) je otopljen u toplom PBS-u (55 ° C) i ohlađen na 37 ° prije injekcije, kako je opisano. 77 Kada je naznačeno da su miševi ubijeni, a jetra je uklonjena da se ugradi u parafin ili da se smrznuta u tekućini N2. Dvije trećine PH provedeno je kod mladića (u dobi od 8–12 tjedana) i starijih (12–14 mjeseci) muških miševa C57 / BL / 6 J kako je prethodno opisano. 34 U APAP modelu, i u naznačenim vremenskim točkama za svaki eksperiment, miševi su primili intravensku injekciju Fibapoa (2 mg / kg), koji je sintetizirao na zahtjev GenScript (Piscataway, NJ, USA), 22 intraperitonealnu injekciju NAC ( 600 mg / kg) (Sigma-Aldrich), ili ista količina fiziološke otopine (300 μl). U dobi od muškog miševa C57 / BL / 6 J dobivali su svakodnevno jednu potkožnu injekciju Fibapo (2 mg / kg) ili fiziološku otopinu tri dana prije PH. Hepatektomije su izvedene 24 sata nakon posljednje injekcije, kako je ranije opisano. 22 Za analizu jetre, fosforilaciju S6 i p70S6K Fibapo (2 mg / kg) intravenski je ubrizgan miševima koji su stradali preko noći.

Stanična kultura i tretmani

Ljudska stanična linija hepatokarcinoma Hep3B (od ATCC) kultivirana je kako je opisano. 63 Stanice su tretirane s Fibapo u DMEM mediju bez seruma i dodatkom 0, 2% goveđeg serumskog albumina. Tamo gdje su naznačene stanice prethodno tretirane s inhibitorom MEK1 UO126 (10 μM) (Promega, Madison, WI, USA), inhibitorom proteasoma MG-132 (10 μM) (Sigma-Aldrich), ili specifičnim FGFR4 inhibitorom BLU9931 (100 nM) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, SAD). 64 Za spuštanje FGF19 stanice Hep3B transficirane su s FGF19 specifičnim siRNAs (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD), ili s kontrolnim siRNA (siGL) u trajanju od 48 h, kako je prethodno opisano. 63 Eksperimenti su izvedeni najmanje tri puta u duplikatima. Makrofagi iz koštane srži izvedeni su u osnovi kako je opisano. 78 Kako bi se inducirala proliferacija makrofaga, stanice koštane srži su posađene u plastične pločice s 10% fetalnog seruma teleta u RPMI1640 dopunjenim sa 100 ng / ml rekombinantnog faktora koji stimuliraju koloniju mišjeg makrofaga (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD).

Western blot analize

Stanice i jetrena tkiva lizirani su u RIPA puferu, a homogenati su podvrgnuti Western blot analizi kao što je izvješteno. 34, 63 Mitohondrije jetrenog tkiva izolirane su kako je prethodno opisano. 79 korištena antitijela su: anti-p-ERK1 / 2 (Thr202, Tyr204), anti-ERK1 / 2, anti-p-JNK (Thr183, Tyr185), anti-p-p70S6K (Thr389), anti-p70S6K, anti- p-S6 (Ser235, Ser236), anti-S6, anti- p- aktin i anti-GAPDH (obojica se koriste kao kontrole učitavanja) iz tehnologije ćelijske signalizacije (Beverly, MA, SAD); anti- α -bubulin, anti-CCNE1, anti-PCNA, anti-p21 i zečji poliklonski anti-HNF4 α (H-171) bili su iz Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SAD); mišji monoklonski anti-HNF4 α (PP-K9218-00) bio je iz tvrtke Perseus Proteomics Inc. (Tokio, Japan); anti-CYP2E1 i anti-citokrom oksidaza IV bili su iz tvrtke Abcam (Cambridge, Velika Britanija). Brojevi prikazani na blot slikama pokazuju kvantifikaciju intenziteta opsega (prosječne vrijednosti) u odnosu na kontrole, kojima je proizvoljno dana vrijednost jedna.

Izolacija RNA i qPCR

Ukupna RNA iz jetrenih tkiva i Hep3B stanica ekstrahirana je korištenjem automatiziranog Maxwell sustava iz Promega. Obrnuta transkripcija izvedena je kako je opisano. 63 PCR-a u stvarnom vremenu izvedena su s iQ SYBR Green supermixom (BioRad, Hercules, CA, USA) u CFX96 sustavu BioRad kao što je prethodno opisano. 63 Primeri su opisani u Dodatnoj tablici 1.

Određivanje sadržaja triglicerida u jetri

Intrahepatička koncentracija TG izmjerena je saponifikacijom u etanolnom KOH i određivanjem trioleinskih ekvivalenata pomoću komercijalno dostupnog kompleta (BQ029A-CR, BQ Kits, San Diego, CA, SAD) kako je opisano. 22

Histološka određenja

Uzorci jetrenog tkiva fiksirani su formalinom i ugrađeni u parafin. Za imuno obojavanje Ki-67 izvršeno je kako je opisano. 22 Pozitivan broj hepatocita Ki-67 određen je u 10 polja jetre po miševima (× 10 amplifikacija) primjenom softvera ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Da bi se procijenio stupanj nekroze tkiva izvedeno je H&E bojenje i ocijenjeno kao što je ranije objavljeno. 34 Veličina ćelija hepatocita određena je nakon imunološkog bojenja parafinskih presjeka β- kateninom da bi se ocrtali pojedinačni hepatociti, antitijelo protiv p- katenina dobiveno je iz Cell Signaling Technology. To calculate hepatocyte cell size 10 fields (× 40) per tissue sample were analyzed as we previosuly described. 80 GSH contents in liver tissues were determined as reported. 77 For the determination of hepatic levels of BA liver tissues were homogenated in water (5 mg/500 μ l), sonicated and centrifuged at 10 000 × g for 10 min. BAs concentrations were determined in supernatants by an enzymatic/colorimetric method using a commercially available kit (Randox Laboratories, Crumlin, UK) as reported. 22

Serum biochemistry

Serum levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase and albumin were measured as previously reported. 22, 34, 63

Statistička analiza

Data are means±SEM Data were compared using the Student t -test. A P- value of <0.05 was considered significant. Data analyses were performed using GraphPad Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) version 7.0 was employed for statistical analyses.

Publisher's Note:

Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska slika 6

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

  2. 2.

    Dopunska tablica 1

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)