Epidermalni rac1 regulira odgovor oštećenja dna i štiti od uv-svjetlosti izazvane apoptoze keratinocita izazvanih uv-svjetlom i karcinogenezu kože | stanična smrt i bolest

Epidermalni rac1 regulira odgovor oštećenja dna i štiti od uv-svjetlosti izazvane apoptoze keratinocita izazvanih uv-svjetlom i karcinogenezu kože | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Odgovor oštećenja DNA
  • onkogcnczom
  • Rak kože

Sažetak

Rak kože koji nije melanom (NMSC) je najčešća vrsta raka. Pojačana ekspresija i aktivnost Racl, male Rho GTPaze, ranije je pokazano kod NMSC i drugih humanih karcinoma; što sugerira da Rac1 može djelovati kao onkogen u koži. Studije karcinogeneze kože DMBA / TPA na miševima pokazale su da je Rac1 potreban za kemijski izazvano stvaranje kožnog papiloma. Međutim, UVB zračenje od sunca, koje uzrokuje oštećenje DNA, najrelevantniji je uzrok za NMSC. Do sada nije istražena potencijalna uloga Rac1 u karcinogenezi kože izazvanoj UV svjetlom. Da bismo to istražili, ozračili smo miševe s epidermalnim nedostatkom Racl (Rac1-EKO) i njihove kontrole koristeći dobro uspostavljen protokol za dugotrajno UV zračenje. Većina miševa Rac1-EKO razvila je jake erozije kože nakon dugotrajnog UV zračenja, za razliku od njihove kontrole. Ove kožne erozije u Racl-EKO miševima zarastale su naknadno. Iznenađujuće, opazili smo razvoj karcinoma pločastih stanica (SCC) unutar polja UV zračenja. To pokazuje da prisutnost Rac1 u epidermi štiti od karcinogeneze kože izazvane UV svjetlom. Kratkoročni eksperimenti s UV zračenjem otkrili su pojačanu apoptozu UV svjetlosti izazvanu epidermalnim keratinocitima s nedostatkom Racl in vitro, kao i in vivo . Daljnja ispitivanja korištenjem transgenih miševa ciklobutanske pirimidin-dimer fotozeze otkrila su da uočeno povećanje apoptoze keratinocita izazvanog UV svjetlom kod miševa Rac1-EKO ovisi o oštećenju DNA i korelira s aktivacijom kaspaze-8. Nadalje, keratinociti s nedostatkom Racl pokazali su smanjenu razinu p53, γ- H2AX i p-Chk1, sugerirajući atenuirani odgovor oštećenja DNA nakon UV zračenja. Navedeni zajedno pružaju izravne dokaze o zaštitnoj ulozi Rac1 u karcinogenezi kože uzrokovanoj UV svjetlom i apoptozi keratinocita vjerojatno kroz reguliranje mehanizama reakcije oštećenja DNA i popravljanja putova.

Glavni

Rak kože koji nisu melanom (NMSC) su najčešći karcinomi kože. 1, 2, 3 Iako je njihova etiologija multifaktorijalna, UVB zračenje suncem je najrelevantniji uzrok za NMSC. 4 UVB dio sunčevog UV zračenja izravno apsorbira DNA. Oštećenje DNK uzrokovano UV svjetlom obično dovodi do stvaranja dvije glavne DNK lezije: ciklobutanskih pirimidinskih dimera (CPD) i 6-4 fotoprodukta pirimidina (6-4 PP). 5, 6, 7 CPD tvori većinu mutacija DNA koje nastaju kao rezultat oštećenja DNA izazvanog UV svjetlom. 8, 9

U mnogih biljaka i životinja, ali ne i kod sisavaca u placenti, CPD se učinkovito popravljaju i uklanjaju specijalizirani enzimi: CPDL fotozaze (CPDPL). 10 Nakon aktivacije vidljivom svjetlošću, fototaliziraju se izravno i lezija specifično reverzira lezije DNA uzrokovane UV svjetlom. 10, 11 Kod placentarnih sisavaca uklanjanje CPD-a prvenstveno se provodi pomoću vrlo očuvanog i složenog višestupanjskog mehanizma koji se naziva nukleotidni popravak ekscizije (NER). Pokazalo se da gubitak mutacija funkcije u putu reguliranja NER dovodi do dramatično povećane karcinogeneze kože kod bolesnika s Xeroderma pigmentosumom. 12

Za zaštitu od karcinogeneze kože keratinociti pokazuju preventivni mehanizam zvan odgovor oštećenja DNA (DDR), koji može imati različite fiziološke ishode, kao što su zaustavljanje staničnog ciklusa, aktiviranje strojeva za popravak DNK, apoptoza ili starenje; ovisno o razini oštećenja DNA i sposobnosti keratinocita da saniraju štetu. 13, 14 Put ATR-Chk1 primarno se aktivira u DDR-u izazvanom UV svjetlom. 15 Stanice s teškim oštećenjem DNA djelomično se uklanjaju apoptozom. Vjeruje se da ako ovaj mehanizam eliminacije ne uspije, neke stanice s ozbiljnim oštećenjem DNA akumuliraju mutacije, što rezultira malignom transformacijom. 7, 13

Apoptoza keratinocita izazvana UV svjetlom rezultira stvaranjem stanica za opekline u epidermi. 16, 17 Sunčane stanice su apoptotični keratinociti koji imaju jako i nepovratno oštećenu DNK kao rezultat UV zračenja. Te stanice za sunčanje predodređene su za smrt i pokazuju karakteristična morfološka obilježja: tamno piknotičko jezgro i oskudno, eozinofilna citoplazma. Smatra se da apoptoza keratinocita izazvana UV zračenjem uključuje unutarnje i vanjske pro apoptotske signalne putove, ovisno o aktiviranju kaspaza-9 i -8. U svojstvenom putu aktivacija kaspaze-9 ovisi o oštećenju DNA i regulaciji p53 nagore. Vanjski apoptotski put može se pokrenuti aktivacijom različitih receptora stanične površinske smrti kao što su Fas, TNFR-1 i TRAIL-R2, 18, 19 koji zatim pokreću aktivaciju kaspaze-8.

Rac1 je mala Rho obitelj GTPase iz Rasveće obitelji. U epidermalnim keratinocitima pokazalo se da aktivator Racl Tiam1 sprječava apoptozu keratinocita nakon gladovanja faktorom rasta i tretmanom toplotnog šoka. 20 U nekoliko eksperimentalnih postavki i u različitim tipovima stanica pokazalo se da Rac1 ima važnu ulogu u pro-apoptotičkim ili anti-apoptotičkim mehanizmima. 21, 22, 23, 24 Inhibicija ili brisanje Rac1 u HeLa stanicama i stanicama karcinoma gušterače oslabila je DDR nakon UV zračenja ili ionizirajućeg zračenja, dok je DDR pojačan u modelu tumora jetre. 25, 26, 27

Rac1 je prekomjerno ekspresioniran u različitim vrstama karcinoma čovjeka, poput karcinoma testisa, želuca i dojke, kao i oralnim karcinomom pločastih stanica (SCC). 28 Prekomjerna aktivnost Racl zabilježena je i kod različitih humanih SCC-a i u staničnim linijama koje potječu iz SCC-a glave i vrata. 29, 30 Miševi s ciljanim brisanjem Racl faktora izmjene nukleotida guanina (GEF) Tiam1, pokazuju smanjenu tvorbu papiloma na koži u višestupanjskom modelu kemijske karcinogeneze, ali i relativno povećanje SCC-a u usporedbi s benignim kožnim papilomima. 31 Pokazalo se da ciljano brisanje Rac1 smanjuje stvaranje papiloma kože u kemijski induciranom modelu karcinogeneze kože kod miševa u miješanoj pozadini od 129 Sv / C57BL / 6. Iako je gubitak Rac1 iz epidermalnih keratinocita smanjio hiperproliferaciju epiderme, na apoptozu keratinocita nije utjecao. 32 Inhibicija aktivnosti Rac1 farmakološkim inhibitorom, NSC23766, u epidermalnim keratinocitima, također je smanjila stvaranje papiloma kože u kemijskom modelu karcinogeneze kože. 29 Nedavno smo pokazali da je aktivnost Rac1 s jedne strane potrebna za razvoj kožnih papiloma u transgenih miševa tipa 8 virusa papiloma virusa čovjeka. S druge strane, izostanak Racl iz epidermalnih keratinocita olakšao je napredovanje ovih papiloma u SCC. 33

S obzirom na predloženu ulogu Rac1 u stvaranju kožnog tumora i poznatu važnost UV svjetlosti kao glavnog kancerogena u koži, upitali smo je li Rac1 utjecati na karcinogenezu kože izazvanu UV svjetlom.

Rezultati

Erozije na koži nakon dugotrajnog UV zračenja kod miševa s delecijom Rac1 specifičnog za epidermu

Da bismo istražili da li brisanje Racl-a specifično za epidermu dovodi do promijenjene karcinogeneze kože uzrokovane UV svjetlom, zračili smo miševe divljeg tipa (kontrole) i miševe s nedostatkom Rapid-1 specifične za epidermu ( 34, 35, 36) (Rac1-EKO) s povećanim dozama UV svjetlosti u skladu s ranije korištenim protokolom. 33, 37 Niti jedan od 17 kontrolnih miševa nije razvio vidljive promjene na koži do kumulativne doze od 25 J / cm2, dok je 12 od 15 (80%) Racl-EKO miševa razvilo područje mrlje, erozivne kože unutar polja zračenja., počevši od 12 J / cm 2 (slike 1a i b). Te su se lezije prvo pojavile kao eritem sa skaliranjem. Kasnije smo primijetili erozije prekrivene kore, koje su se povećavale i prekrile cijelo polje ozračenja. Histološka analiza otkrila je da su područja erozivne kože lišena epiderme (slika 1c).

Image

Brisanje Rac1 specifično za epidermu dovodi do ozbiljnih erozija na koži nakon kroničnog UV zračenja. ( a ) Kaplan-Meierova krivulja preživljavanja kontrola i erozije kože bez erozije i Rac1-EKO nakon kroničnog UV zračenja. ( b ) Reprezentativne fotografije kontrolnih i Rac1-EKO miševa liječenih kroničnim UV-zračenjem u kumulativnoj dozi od 24, 12 J / cm2. ( c ) H / E bojenje kožnog dijela iz erozivnog područja miša Racl-EKO prikazano u ( b ). Linija mjerila = 100 μ m

Slika pune veličine

Brisanje Rac1 za specifičnu epidermu povećava inkorporciju keratinocita izazvanog UV svjetlom in vivo i in vitro

Naše studije su pokazale da miševi s nedostatkom Rac1 specifičnog za epidermu razvijaju jake erozije kože nakon dugotrajnog UV zračenja (Slike 1a-c). Stoga smo pitali je li apoptoza promijenjena u miševa Racl-EKO nakon UV-zračenja. Da bismo to ispitali, izveli smo kratkoročne eksperimente sa UV zračenjem s jednom dozom od 1 J / cm 2 UVB.

U 12 h nakon UV zračenja, histološka analiza dijelova kože otkrila je značajno povećanje ( P- vrijednost <0, 001) broja stanica za opekotine od sunca (apoptotske stanice kao rezultat UV zračenja) kod Rac1-EKO miševa u usporedbi s Rac1 fl / fl miševi (slike 2a i b). U skladu s H / E obojenjem, imunološki ostaci pokazali su jasan porast broja cijepljenih stanica kapaza-3 pozitivnih u epidermi Rac1-EKO (Slika 2c). To je dodatno potvrdilo zapadnom blot analizom epidermalnih lizata (slika 2d). U skladu s našim imunološkim rezultatima, primijetili smo mnogo jače pojaseve za cijepanu kaspazu-3 kod Racl-EKO miševa nego kod Racl fl / fl miševa nakon UV zračenja (Slika 2d). Densitometrijska analiza otkrila je nevjerojatan porast odcjepljene razine kaspaze-3 u epidermi Racl-EKO miševa u usporedbi s Racl fl / fl miševima (Slika 2e).

Image

Brisanje Rac1 za specifičnu epidermu povećava in vivo apoptozu keratinocita izazvanu UV svjetlom. ( a ) H / E bojanje UV-ozračene kože Racl fl / fl i Racl-EKO miševa 12 h nakon UV zračenja. Crne strelice označavaju stanice za opekotine od sunca. ( b ) Grafikon prikazuje postotni broj sunčanih stanica u 12 h s (crvenim trakama) ili bez (plave trake) UV-zračenjem kod Racl fl / fl ( n = 4) i Racl-EKO ( n = 5) miševa. Postotak stanica za izgaranje u epidermi nakon UV zračenja kod miševa Racl fl / fl iznosio je 3, 4%, dok je u miševima Racl-EKO iznosio 8, 6% ukupnih epidermalnih keratinocita. Nezračeni uzorci su pokazali <1% stanica opeklina u oba genotipa. ( c ) Imunostanosti protiv cijepljene kaspaze-3 (zelene) kože UV zračene od Racl fl / fl i Rac1-EKO miševa u 12 h nakon UV zračenja. Nuklei su obojeni u plavo. Linija mjerila = 100 μ m. ( d ) analiza Western blot cijepljene kaspaze-3 iz epidermalnih lizata neobrađenih (bez UV) i Racl fl / fl i Racl-EKO miševa tretiranih UV svjetlom. Kontrole bez ozračenja nisu pokazale trake za cijepljenu kapsazu-3, dok uzorci ozračene epiderme pokazuju rascijepljene trake specifične za kaspazu-3 pri ~ 25 kDa i 23 kDa. Brojevi na lijevoj strani označavaju molekulske težine u kDa. ( e ) Grafikon prikazuje denzitometrijsku analizu Western blota u ( d ). Trake pogrešaka prikazuju SD zvijezde pokazuju P- vrijednost <0, 001

Slika pune veličine

Da bismo istražili da li keratinociti s nedostatkom Racl u kulturi (dopunska slika S2) također pokazuju sličan odgovor na UV svjetlost, ozračili smo keratinocite Racl fl / fl i Rac1-EKO s 0, 5 J / cm2 UV svjetla. Uočili smo jače pojase za cijepanu kaspazu-3 u lizatima UV-ozračenih Racl-EKO keratinocita u usporedbi s lizatima Racl fl / fl keratinocita 6 h i 12 h nakon UV zračenja (slike 3a-c). Da bismo isključili razliku između Racl fl / fl i Rac1-EKO keratinocita u stupnju neposredne oštećenja DNA izazvanom UV svjetlošću, analizirali smo količinu CPD-a odmah nakon UV zračenja. I Racl-EKO i kontrolne stanice pokazali su usporedivu razinu CPD-a (slika 3d).

Image

Nedostatak Rac1 povećava osjetljivost in vitro na induciranu keratinocitom izazvanom UV svjetlom. ( a i b ) Analiza zapadne mrlje od cijepljene kaspaze-3 iz Racl fl / fl i Racl-EKO uzgajanih keratinocita u 6 h ( a ) i 12 h ( b ) sa (UV) ili bez (bez UV) zračenja, ( c ) Densitometrijska analiza cijepljene kaspaze-3 u 6 h nakon UV zračenja iz Racl fl / fl i Racl-EKO keratinocita. ( d ) Kvantifikacija CPD-a pomoću CPD ELISA-e provedena iz genomske DNA izolirane iz Racl fl / fl i Rac1-EKO mišjih primarnih keratinocita odmah nakon UV zračenja. Trake pogrešaka prikazuju SD zvijezde P- vrijednost <0, 01

Slika pune veličine

Ovi podaci pokazuju da nedostatak Rac1 povećava apoptozu keratinocita nakon UV zračenja in vivo, kao i in vitro sugerirajući da su stanični autonomni mehanizmi odgovorni za povećanu osjetljivost na apoptozu izazvanu UV svjetlom.

Oštećenje DNA ima važnu ulogu u povećanoj apoptozi keratinocita izazvanoj UV svjetlom u epidermi Rac1-EKO in vivo

Prije je pokazano da popravak CPD-a enzimskom fotoaktivacijom putem CPDPL-a, izraženog kao transgen pod kontrolom promotora keratina 14 (K14), spašava apoptozu izazvanu UV-svjetlom kod ovih transgeničnih miševa. 38 Da bismo istražili hoće li prisilni popravak CPD-a spasiti pojačanu apoptozu uzrokovanu UV-svjetlom kod miševa Rac1-EKO, stvorili smo CPDPL / Rac1-EKO miševe uzgajanjem transgenih miševa 38 CPDPL s Racl-EKO miševima (Slika 4a). Zatim smo ozračili miševe CPDPL / Racl-EKO s jednom dozom 1 J / cm 2 UV svjetla i jednu skupinu držali u mraku (Dark), a drugu pod plavim svjetlom za foto reaktivaciju (PR) 12 h. Analiza CPD-a i apoptoze provedena je na histološkim dijelovima uzoraka tkiva kože uzetim 12 sati nakon UV-zračenja (slika 4b). Imunoziranje protiv CPD pokazalo je značajno smanjenje ( P- vrijednost = 0, 018) u broju CPD-pozitivnih stanica u PR grupi (33%) u usporedbi s Dark grupom (56%) (Slike 4c i d), sugerirajući djelomični popravak CPD-a u PR grupi.

Image

Stvaranje CPDPL / Racl-EKO miševa i fotoreaktivacija CPDPL u CPDPL / Rac1-EKO miševima. ( a i b ) Shematski prikaz generacije CPDPL / Rac1-EKO miševa i fotoreaaktivacijskih eksperimenata, respektivno. ( c ) Imunološke boje protiv CPD (zelene) kože UV-ozračene miševe CPDPL / Racl-EKO koji se drže u mraku i pod lampom za fotoreaktivu. Nuklei su obojeni u plavo. Isprekidana crta ocrtava granicu između epiderme i dermisa. Linija mjerila = 100 μ m. ( d ) Grafikon prikazuje kvantifikaciju CPD-pozitivnih stanica iz UV-zračenih CPDPL / Racl-EKO miševa čuvanih u mraku i pod lampom za fotoreaktiviranje (PR) (svaka n = 5). Trake pogrešaka prikazuju SD zvijezda pokazuje P- vrijednost <0, 05

Slika pune veličine

Štoviše, histološka analiza otkrila je značajno smanjenje ( P- vrijednost = 0, 0045) u broju stanica opeklina iz PR grupe (4, 9%) u usporedbi s Darkovom skupinom (10, 3%) (Slike 5a i b); to je potvrđeno za cijepljene stanice pozitivne na kaspazu-3 (5, 8% naspram 14, 2%; P- vrijednost = 0, 0005) (Slike 5c i d). U skladu s tim, analiza zapadne blot epidermalne lizate za cijepanu kaspazu-3 pokazala je snažne pojaseve u grupi Dark i mnogo slabije pojaseve u PR grupi (slike 5e i f). Ovi podaci pokazuju da prisilni popravak CPD-a foto-reaktivacijom putem CPDPL-a značajno smanjuje apoptozu keratinocita izazvanu UV-svjetlom kod miševa Rac1-EKO.

Image

Oštećenje DNA ima važnu ulogu u povećanoj apoptozi keratinocita izazvanoj UV svjetlom u Ravo-EKO epidermi in vivo . ( a i c ) H / E bojenje i imunološki uklanjanje protiv cijepljene kaspaze-3 (zelene) kože UV-ozračene miševe CPDPL / Rac1-EKO, držane u mraku i pod lampom za fotoreaktivu. Nuklei su obojeni u plavo. Izlomljena crta u c označava granicu između epiderme i dermisa. Linija mjerila = 100 μ m. ( e ) Analiza Western blotta cijepljene kaspaze-3 iz epidermalnih lizata CPDPL / Rac1-EKO miševa koji su zračeni UV, i čuvani su u mraku i pod fotoreaktivnom lampom. GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja. Brojevi na lijevoj strani označavaju molekulsku masu u kDa. ( b, d, i f ) Grafikoni prikazuju kvantifikaciju stanica sunčanja ( n = 5, 4) ( b ), cijepljene pozitivne stanice kaspaze-3 ( n = 9, 8) ( d ) i denzitometrijsku analizu cijepljene kaspaze-3 zapadne mrlje ( n = 4, 6) ( f ) sa CPDPL / Rac1-EKO miševima koji su zračeni UV, i koji se drže u mraku (crne trake) i pod lampom za fotoreaktivnost (PR) (sive trake). Trake pogrešaka pokazuju zvjezdice SD pokazuju P- vrijednost. ** <0, 01, *** <0, 001

Slika pune veličine

Keratinociti s nedostatkom Rac1 pokazuju promijenjeni DDR nakon UV zračenja in vitro

Naši rezultati in vivo sugeriraju da povećana apoptoza keratinocita u epidermi s manjkom Rac1 ovisi o oštećenju DNA. Da bismo istražili potencijalnu ulogu Rac1 u DDR putu izazvanom UV svjetlošću, analizirali smo razinu proteina p53 i fosforilaciju histon H2A.X varijante ( γ -H2AX). razina proteina p53 i γ -H2AX reguliraju se ATR / Chk1 DDR putem. 13, 15 γ -H2AX je široko korišteni marker DDR-a. Western blot analiza pokazala je vrlo nisku razinu p53 i bez γ- H2AX u nezračenim uzorcima (slike 6a i b). Rac1-EKO uzorci pokazali su značajno smanjenu ( P- vrijednost = 0, 002) razine p53 u usporedbi s Racl fl / fl uzorcima nakon UV zračenja (Slike 6b i c). Slično p53, razine u-H2AX su smanjene ( P- vrijednost = 0, 053) u uzorcima Racl-EKO u usporedbi s Racl fl / fl uzorcima nakon UV zračenja (Slike 6b i d).

Image

Keratinociti s nedostatkom Rac1 pokazuju promijenjeni odgovor oštećenja DNA nakon UV zračenja. ( a ) Western blot analiza p53 i fosforilacija H2AX ( γ- H2AX) iz Racl fl / fl i Rac1-EKO keratinocita u naznačenim vremenskim točkama sa (UV) ili bez (bez UV) UV zračenja. Eksperimenti s vremenskim tokom otkrili su najviše razine p53 i γ -H2AX u 6 h nakon UV zračenja u Racl fl / fl keratinocitima u usporedbi s nezračenim kontrolama. Zbog toga smo koristili vremensku točku od 6 sati za daljnju analizu razine proteina p53 i γ -H2AX. ( b ) Reprezentativna analiza zapadnog mrlja p53 i γ -H2AX iz Racl fl / fl i Rac1-EKO kultivirana keratinocitima u 6 h sa (UV) ili bez (bez UV) zračenja. ( c i d ) Densitometrijska analiza promjena nabora p53 ( n = 3 svaki) ( c ) i γ -H2AX ( n = 5 svaki) ( d ) normalizirano na GAPDH u uzorcima Rac1 fl / fl i Rac1-EKO u 6 h nakon UV zračenja. Trake pogrešaka pokazuju da SD *** predstavlja P- vrijednost <0, 001. ( e ) Analiza Western blot-a p-Chk1 i Chk1 iz Racl fl / fl keratinocita u naznačenim vremenskim točkama nakon UV zračenja. Eksperimenti s vremenskim tokom otkrili su maksimalnu fosforilaciju Chk1 u 2 sata nakon UV zračenja u Racl fl / fl primarnim keratinocitima. Stoga je u sljedećim eksperimentima fosforilacija Chk1 ispitivana već 2 sata nakon UV zračenja. ( f ) Reprezentativne zapadne mrlje p-Chk1, Chk1 iz Racl fl / fl i Rac1-EKO kultivirane keratinocite 2 sata s (UV) ili bez (bez UV) zračenja. GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja. Brojevi na lijevoj strani označavaju molekulske težine u kDa. ( g ) Dijagram točaka koji pokazuje rezultate analize denzitometrije nabora promjene p-Chk1 normaliziranog na ukupni Chk1 u uzorcima Rac1 fl / fl i Rac1-EKO nakon UV zračenja

Slika pune veličine

Zatim smo analizirali fosforilaciju Chk1 kao očitavanje aktivnosti puta ATR-Chk1, koji se primarno aktivira u DDR-u izazvanom UV svjetlom. 15 Western blot analiza pokazala je vrlo slabe ili nikakve pojave u neozračenim kontrolama (Slike 6e i f). Već 2 sata nakon UV-zračenja opaženi su znatno slabiji pojasi za p-Chk1 u keratinocitima Racl-EKO u usporedbi s Racl fl / fl keratinocitima (Slika 6f). Densitometrijska analiza doista je otkrila smanjenu fosforilaciju Chk1 u Racl-EKO keratinocitima u seriji od osam uzoraka, sugerirajući smanjenu aktivaciju ATR / Chk1 DDR putanje u Rac1-EKO keratinocitima nakon UV zračenja (slika 6 g). Unatoč visokoj varijabilnosti u razini p-Chk1 fosforilacije, većina uzoraka Racl-EKO pokazala je smanjenu fosforilaciju u usporedbi s kontrolama. Ovi podaci pokazuju da nedostatak Rac1 u primarnim mišjim keratinocitima inhibira signalizaciju preko ATR / Chk1 DDR puta nakon UV zračenja, što sugerira važnu ulogu Rac1 u putu DDR u epidermi.

Povećanje apoptoze izazvane UV svjetlom u keratinocitima s nedostatkom Rac1 zahtijeva aktivaciju kaspaze-8

Da bismo ispitali uključenost intrinzičnih / vanjskih apoptotskih putova, analizirali smo aktivaciju kaspaze-8 i kaspaze-9 u primarnim keratinocitima sa nedostatkom Rac1. Iako nismo otkrili razlike u cijepanju kaspaze-9 (podaci nisu prikazani), cijepljena kaspaza-8 bila je detektirana na niskim razinama u Rac1 fl / fl, ali na mnogo višim razinama u uzorcima Rac1-EKO (slike 7a i b) na 6 sati nakon UV zračenja. Pored toga, specifična inhibicija kaspaze-8 sa Z-IETD-FMK otkrila je da povećana apoptoza u Racl-EKO keratinocitima nakon UV zračenja ovisi o aktivnosti kaspaze-8 (dopunska slika S5).

Image

Povećanje apoptoze izazvane UV svjetlom u keratinocitima s nedostatkom Rac1 zahtijeva aktiviranje kaspaze-8. ( a ) Western blot analiza odcepljene kaspaze-8 iz Racl fl / fl i Racl-EKO kultivirana keratinocitima u 6 h sa (UV) ili bez (bez UV) UV zračenja. ( b ) Analiza denzitometrije nabora promjene cijepljene kaspaze-8 u ( a ) normalizirane na GAPDH u uzorcima Racl fl / fl i Rac1-EKO nakon UV zračenja. ( c ) Analiza zapadne mrlje odcepljene kaspaze-8 iz epidermalnih lizata CPDPL / Rac1-EKO od miševa držanih u mraku ili pod fotoreaktivnom lampom (PR). ( d ) Denzitometrijska analiza cijepljenih zapadnih mrlja kaspaze-8 u c . Stupci pogrešaka pokazuju SD ( e ) analizu razrijeđene kaspaze-3 iz divljeg tipa (WT) i TNFR-1 KO) uzgajanih keratinocita 6 sati s (UV) ili bez (bez UV) UV-zračenje. ( f ) Analiza Western blotta cijepljene kaspaze-3 iz kultiviranih keratinocita TNFR-1 KO inkubirana sa DMSO ili Racl inhibitorom (EHT 1864) u 6 h sa (UV) ili bez (bez UV) zračenja. GAPDH koristi se kao kontrola opterećenja. Brojevi na lijevoj strani označavaju molekulske težine u kDa. * i *** predstavljaju P- vrijednost <0, 05 i <0, 001, respektivno

Slika pune veličine

Da bismo istražili da li aktivacija kaspaze-8 ovisi i o oštećenju DNA izazvanog UV svjetlom, ozračili smo miševe CPDPL / Rac1-EKO kako je gore opisano. Western blot analiza epidermalnih lizata za cijepanu kaspazu-8 pokazala je snažne pojase u grupi Dark i mnogo slabije pojaseve u PR grupi (slike 7c i d).

Ovi podaci pokazuju da porast apoptoze u Racl-EKO keratinocitima ovisnim o UV svjetlu i ovisi o aktivaciji kaspaze-8.

Pokretanje vanjskog apoptotskog puta ovisnog o kaspazi-8 događa se nakon aktivacije receptora smrti poput Fas, TNF receptora 1 i TRAIL receptora2. 18, 19 Da bismo ispitali uključenost TNFR-1, izveli smo eksperimente UV zračenja na keratinocitima izoliranim iz knofout-miševa TNFR-1 (TNFR-1 KO) i divljim miševima. U skladu s prethodnim in vivo studijama, 39 analiza blot-a pokazala je upadljivo slabije pojaseve cijepljene kaspaze-3 u TNFR-1 KO keratinocitima nego keratinociti divljeg tipa nakon UV zračenja (slika 7e), sugerirajući da apoptoza izazvana UV svjetlom u keratinociti divljeg tipa uglavnom ovise o TNFR-1.

Kako bismo istražili da li porast apoptoze izazvane UV svjetlom u Racl-EKO keratinocitima ovisi o TNFR-1, farmakološki smo inhibirali Racl u TNFR-1 KO keratinocitima koristeći specifični inhibitor Racl EHT-1864. Western blot analiza za rascepljenu kaspazu-3 pokazala je slabe pojase u ne-ozračenim keratinocitima TNFR-1 KO inkubiranim sa DMSO ili EHT-1864 (slika 7f). Mnogo jače trake za cijepanu kaspazu-3 primijećene su u kefinocitima TNFR-1 KO inkubiranim s EHT-1864 nego u DMSO kontroli 6 h nakon UV zračenja (Slika 7f). Ovi podaci sugeriraju da se porast apoptoze izazvane UV svjetlom u keratinocitima s nedostatkom Rac1 događa putem TNFR-1 neovisnih mehanizama.

Brisanje Rac1, specifično za epidermu, olakšava SCC nakon dugotrajnog UV zračenja

U našim dugotrajnim eksperimentima sa UV zračenjem, samo su miševi Rac1-EKO razvili erozije kože. Kad su te erozije dostigle veličinu polja za ozračivanje, ozračivanje je trebalo zaustaviti. Zatim smo pratili 11 ovih miševa. Sve kožne erozije izliječile su se u roku od 4-6 tjedana bez vidljivih ožiljaka. Počevši 4 tjedna nakon završetka tretmana, primijetili smo razvoj malih, zbližavajućih, nodula u boji kože, koji su kasnije prekriveni ljuskicama i kore u 5 od 11 (45%) Racl-EKO miševa. Nisu primijećene makroskopske promjene na koži kod kontrolnih miševa (slike 8a i b). Miševi su žrtvovani, a njihova koža podvrgnuta je istražitelju oslijepljenom histološkom procjenom. Histološka analiza kože kontrolnih miševa otkrila je laganu akantozu bez ikakvih drugih značajnih promjena (Slika 8c). Nasuprot tome, mikroskopska analiza kožnih uzoraka iz zacijeljenih erozija kože Racl-EKO miševa otkrila je jasne histološke znakove malignosti u uzorcima 9 od 11 (81, 8%) miševa. U tim uzorcima primijetili smo asimetrični i invazivni rast, stanični i nuklearni pleomorfizam, poremećenu diferencijaciju i povećanu brzinu mitotike (Slika 8c). Ove histološke karakteristike primijećene su samo u Racl-EKO miševima, ali ne i kod kontrolnih miševa.

Image

Brisanje Rac1, specifično za epidermu, olakšava razvoj SCC-a nakon dugotrajnog UV zračenja. ( a i b ) Reprezentativne fotografije miševa s hiperkeratotičkim papulama u zacijeljenim kožnim erozijama Racl-EKO miševa. Slika na slici b je krupni prikaz lezije koju vidimo u mišu Rac1-EKO iz ( a ). ( c ) H / E bojenje i imunološke boje protiv keratina 14, keratina 10 i BrdU (zeleno) uzoraka kože i tumora kontrolnih i Rac1-EKO miševa. Nuklei su obojeni u plavo. Linija mjerila = 100 μ m. ( b ): Grafikon prikazuje rezultate histološke analize kožnih uzoraka ili tumora iz kontrolnih i Racl-EKO miševa. Miševi bez tumora prikazani su u plavoj boji, a miševi sa SCC-om u sivoj boji. Apsolutni broj miševa dan je unutar rešetaka

Slika pune veličine

Da bismo dodatno analizirali ove tumore, proveli smo imunostanje. Kod kontrolnih miševa, imunološki bojenje Keratina 14 pokazalo je da su pozitivne keratinske 14 stanice ograničene na bazalni sloj epiderme sa jasnim razgraničenjem dermisa i epiderme, dok je kod miševa Rac1-EKO keratin 14 bio ekspresioniran u cijelom tumoru i nije pokazao jasno razgraničenje dermisa epiderme na određenim područjima (slika 8c). Kod miševa Racl-EKO imunološki utjecaj protiv markera diferencijacije keratin 10 je smanjen unutar tumora, dok je kod kontrolnih miševa obojenje keratinom 10 bilo redovito i ograničeno na suprabasalne slojeve (slika 8c). Boje za ugrađeni BrdU su povećane u tumorima Racl-EKO miševa u usporedbi s kontrolnom kožom (Slika 8c). Stoga su tumori u Racl-EKO miševima klasificirani kao SCC. Svi SCC-ovi u Racl-EKO miševima pokazali su uzorak dubokog prodora rasta (slika 8c). Ovi podaci pokazuju da odsutnost Rac1 olakšava razvoj malignog kožnog tumora nakon kroničnog UV zračenja kod miševa. Dakle, epidermalni Rac1 štiti od razvoja SCC-a izazvanog UV svjetlom.

Rasprava

Epidermal Rac1 štiti od apoptoze keratinocita izazvanog UV svjetlom

U nekoliko eksperimentalnih postavki i u različitim tipovima stanica pokazano je da Rac1 ili promovira ili inhibira apoptozu. 21, 22, 23, 24 Keratinociti s nedostatkom aktivatora Racl Tiam1 pokazuju pojačanu apoptozu nakon lišavanja faktora rasta ili liječenja toplinskim šokom, podupirući anti-apoptotičku ulogu Racl u keratinocitima. Naši rezultati pružaju izravan dokaz važne funkcije Rac1 u inhibiciji apoptoze izazvane UV svjetlom u epidermalnim keratinocitima. Pojačana keratinocitna apoptoza pruža uvjerljivo objašnjenje za uočeno stvaranje kožnih erozija kod Racl-EKO miševa. Ostali mogući mehanizmi, poput mehaničke iritacije kože ili epidermalne nekroze, vjerojatno neće imati ulogu budući da su erozne lezije na stražnjoj strani bile nepristupačne za ogrebotine, a doze UV ​​svjetla korištene za eksperimente kroničnog zračenja bile su poderitne i, stoga nije mogao izazvati nekrozu kože.

Uz erozije kože u eksperimentima s kroničnim UV zračenjem, dosljedno smo opazili odvajanje epiderme od donjeg dermisa kod miševa Rac1-EKO, ali ne u njihovoj kontroli 24 sata nakon jedne doze UV-zračenja (dopunska slika S1D). Poznato je da masivna apoptoza keratinocita kao posljedica teških alergijskih reakcija lijekova izaziva slično odvajanje epiderme, na primjer, kod Stevens-Johnsonovog sindroma ili toksične epidermalne nekrolize. 40, 41 Stoga je dobro zamisliti da povećana apoptoza keratinocita izazvana UV svjetlom kod miševa Racl-EKO uzrokuje i odvajanje epiderme, kao i kožne erozije uočene u dugoročnim studijama UV zračenja.

Oštećenje DNA ima važnu ulogu u povećanoj apoptozi keratinocita izazvanoj UV svjetlom u miševa Rac1-EKO

Oštećenja DNA izazvana UV svjetlom, kao što su CPD, glavni su uzrok keptoinocitne apoptoze in vivo . 38 Naše studije in vivo na CPDPL / Rac1-EKO miševima sugeriraju da povećanje apoptoze izazvane UV svjetlošću kod miševa Rac1-EKO ovisi o oštećenju DNA. Iako smanjenje broja CPD-pozitivnih stanica dobro korelira sa smanjenjem broja stanica za izgaranje i cijepljenih stanica kaspaze-3-pozitivnih, moguće je da i drugi, neovisni mehanizmi oštećenja DNA doprinose povećanju apoptoze keratinocita u Rac1-EKO miševi.

Izmijenjeni DDR nakon UV zračenja u keratinocitima sa nedostatkom Rac1

Pokazalo se da Rac1 ima važnu ulogu u regulaciji putova DDR-a i popravaka. 25, 26 U skladu s ovim istraživanjima, naši in vitro eksperimenti pokazuju da delecija Racl smanjuje DDR izazvan UV svjetlom, što pokazuje smanjena razina γ -H2AX, p53 i pChk1 u primarnim keratinocitima miša (Slika 6). Ovi podaci sugeriraju funkciju Rac1 u regulaciji DDR-a izazvanog UV svjetlom u epidermalnim keratinocitima. Zanimljivo je da Rac1-EKO keratinociti nisu uspjeli regulirati p53 nakon UV-zračenja, pa je shvatilo da povećani apoptotički odgovor nije isključivo ovisio o svojstvenom pro-apoptotičkom putu.

Uključenost vanjskog pro-apoptotičkog puta u apoptozu izazvanu UV svjetlom

Vanjski pro-apoptotski put aktiviran je u Racl fl / fl i Racl-EKO keratinocitima nakon UV zračenja, što je prikazano cijepanjem kaspaze-8 (slike 7a i b). Nadalje, u skladu s prethodnim studijama na miševima TNFR-1 KO, 39 naše studije in vitro s inhibitorom kaspaze-8 pokazale su da je taj put potreban za apoptozu izazvanu UV svjetlom u Rac1-EKO keratinocitima (dopunska slika S5). Preosjetljivost keratinocita s nedostatkom TNFR-1 na apoptozu izazvanu UV svjetlom farmakološkom inhibicijom Rac1 sugerira da mehanizam ovisan o kaspazi-8, što dovodi do povećanja apoptoze izazvane UV svjetlom, nije ovisan od TNFR-1. Stoga, povećana apoptoza izazvana UV svjetlom u Rac1-EKO keratinocitima uključuje i zahtijeva aktivnost vanjskog puta, ovisnog o kaspazi-8, ali ne i TNFR-1. Povezanost između staničnog opterećenja CPD-a i aktivnosti kaspaze-8 (Slika 7c) sugerira preklapanje između unutarnjih i vanjskih pro-apoptotskih putova izazvanih UV svjetlom u epidermalnim keratinocitima. Moguća uključenost drugih receptora smrti poput Fas ili TRAIL-R2 zasad je otvorena.

Epidermal Rac1 štiti SCC-ove izazvane UV-svjetlom

Brisanje Rac1 specifično za epidermu dovelo je do razvoja SCC-a u našim eksperimentima s kroničnim UV zračenjem (Slika 8). This is particularly surprising, since Rac1 has been reported to be essential for skin papilloma formation in chemical carcinogenesis experiments. 32 On the other hand, deficiency of the Rac1 activator Tiam1 inhibited skin papilloma formation but facilitated the development of SCCs in mouse skin, which corresponds to our findings. In previous studies with FVB/N wild-type mice in a similar UV-irradiation treatment regimen, first skin tumors appeared after 248 days of irradiation on average. 37 In our long-term UV-irradiation experiments, however, we were forced to stop UV-irradiation after 134 days because by then the Rac1-EKO mice developed severe skin erosions. The much lower UV-light dose received in our long-term UV-irradiation experiments provides a plausible explanation for the fact that mice in the control group did not develop any skin tumors. Although the exact molecular mechanisms are not entirely clear, our data make it conceivable that protection from both apoptosis and SCC development by Rac1 could be due to a common mechanism: the regulation of the DDR. When Rac1 is absent from epidermal keratinocytes, the normal DDR to UV-light is disturbed, which results in increased apoptosis. Cells, which escape apoptosis, would accumulate unrepaired DNA damage and, therefore, could serve as the origin for the SCCs, which we observed in our long-term UV-irradiation experiments.

Although inhibition of the DDR appears to be the most likely mechanism to explain the development of SCCs in Rac1-EKO mice, we cannot exclude other hypothetical mechanisms, for example, disturbance of cell polarity and adhesion or modulation of epidermal stem cell properties leading to increased UV light-induced mutagenesis. 42, 43, 44, 45, 46, 47

Chronic inflammation has been proposed to support the development of cancer. 48, 49 In accordance with a previous study, 50 our in vivo data show an increased inflammatory response in Rac1-EKO mice upon UV-irradiation as shown by increased numbers of γδ T cells and neutrophils in the skin of Rac1-EKO mice (Supplementary Figure S4). Hence, an increased inflammatory response upon UV-irradiation in Rac1-EKO mice could contribute to the development of skin SCCs.

Our results provide, for the first time, evidence for a tumor suppressing function of Rac1 in the epidermis. Regulation of UV-light-induced DDR by Rac1 may be connected to its tumor suppressive function in the epidermis. This function must be taken into account by strategies in which Rac1 is used as a therapeutic target in skin.

Materijali i metode

In vivo eksperimenti

All animal experiments were conducted in accordance with European, national and institutional guidelines and were approved by local governmental authorities. For single-dose UV-irradiation experiments, mice in a pure C57/Bl6 background were used and for chronic UV-irradiation experiments, mice in a pure FVB/N background were used. Experimental groups of mice were matched for age and sex.

Chronic UV-irradiation experiments

Rac1-EKO mice 34, 36 and their controls (Rac1 fl/fl, Rac1 fl/+ and K14Cre Rac1 fl/+) were irradiated repeatedly with UVB light using a protocol described previously. 37 Briefly, mice were irradiated three times per week with a gradually increasing dose under anesthesia with 2.5% Isofluoran. Mice were shaved before the start of the experiment and at regular intervals thereafter. Mice received a UVB dose of 0.23 J/cm 2 for the first 12 treatments, 0.41 J/cm 2 for treatments 13-36, 0.51 J/cm 2 for treatments 37–48 and 0.61 J/cm 2 from treatment 49 till the end of the experiment. On average, each mouse received a cumulative dose of >20 J/cm 2 UVB.

Mice were monitored during each treatment for their general condition, changes in skin morphology and tumor formation. Time to tumor development was taken until a visible nodule in the irradiation field appeared. The UV-irradiation treatment was stopped for mice with severe skin erosions and their controls. Mice were photographed typically once in a week to monitor the skin changes.

Single-dose UV-irradiation experiments

Back skin of the mice was shaved using an electric clipper one day before UV-irradiation. Mice were anesthetized with intraperitonial injection of 200 μ l anesthetic solution Ketavet (Pharmacia, New Jersey, NJ, USA) 10 mg/ml (500 μ l), Rompun (Bayer, Leverkusen, Germany) 0, 1% (250 μ l), NaCl 0, 9% (4.25 ml) and Bepanthen eye cream (Bayer) was applied to the eyes shortly before UV-irradiation. The back skin of each mouse (area of ~4 cm 2 ) was irradiated while the rest of the skin was covered with UV-light impermeable aluminum foil. The non-irradiated area of back skin was used as an internal control (no UV control). The irradiation experiments were performed with a broadband UV lamp (Teilkoerper UV Therapiesystem TP-4 equipped with Waldmann UV-6 UVB bulbs, Herbert Waldmann GmbH & Co. KG, Villingen- Schwenningen). Mice were irradiated with a single dose of UVB (1 J/cm 2 ) and were killed to collect skin samples for further analysis after 6 h, 12 h, or 24 h.

Photoreactivation experiments

Mice expressing a CPD photolyase (CPDPL) transgene driven by a keratin 14 promoter 38 were kindly provided by Prof Jan Hoeijmakers. These CPDPL mice were bred with Rac1-EKO mice to obtain CPDPL/Rac1-EKO mice. CPDPL/Rac1-EKO mice were irradiated with a single-dose of UV-light as described above. One group of mice was immediately kept in the dark and another group was placed under the photoreactivation lamp made up of 5 Philips TL-D 15 W/33-640 tubes (Philips, Amsterdam, Netherlands). After 12 h mice were killed and the skin samples were collected for further analysis.

BrdU injection of mice

To analyze proliferation, mice were injected with 200 μ l of 16 mg/ml BrdU (Serva, Heidelberg, Germany) (No. 15240) per adult mouse 1 h before the mice were killed and tissue samples were collected.

Separation of epidermis and dermis

Mice were killed and whole-skin tissue was isolated. Mouse epidermis was scraped off after incubating whole-skin tissue samples in 0.5 M ammonium thiocyanate (NH 4 SCN) in phosphate buffer, pH 6.8 (0.1 M NH2HPO4, 0.1 M KH2PO4) for ~30 min on ice and was snap frozen in liquid nitrogen immediately.

Histopathology and immunostaining

Tumors and skin samples were excised and tissues were fixed in 4% formalin and subsequently embedded in paraffin. H/E stained tissue sections were obtained using standard procedures. Histopathological examination and immunostainings were carried out as described previously. 35 Primary antibodies against cleaved caspase-3 (AF835) (R and D systems, Minneapolis, MN, USA), CPD (Thymine dimers, MC-068) (Kamiya biomedicals, Seattle, WA, USA), keratin 14 (PRB-155-P) (Covance, Princeton, NJ, USA), keratin 10 (PRB-159-P) (Covance) and BrdU (347580) (BD biosciences, San Jose, CA, USA) were used. Alexa 488 linked anti-rabbit (A11034) and anti-mouse (A21121) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondary antibodies were used.

Primary mouse keratinocyte isolation and culture

Primary epidermal keratinocytes from new-born FVB/N mice at post-natal day 0–3 (P0-P3) were isolated. Briefly, mice were decapitated, decontaminated by serial washes in povidone-iodine solution, sterile PBS, 70% EtOH and antibiotic-antimycotic solution (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) (No. 15240-096) for 30 s each. Whole-skin samples were collected from the torso and incubated with 5 mg/ml dispase II (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (No. D4693-1G) in keratinocyte culture medium overnight at 4 °C. The epidermis was separated and was incubated with TrypLE (Gibco) (No. 12604-013) for 30 min at RT. Afterwards, basal keratinocytes were isolated from the epidermis by several washes with low calcium FAD medium, 51 and cultured on collagen type-1 coated cell culture plates in a cell culture incubator at 34 °C and 5% CO 2 .

UV-irradiation experiments in vitro

Keratinocyte culture medium was removed from cultured keratinocytes and keratinocytes were washed once with sterile PBS. Cells were irradiated with 0.5 J/cm 2 dose of UV-light while in the thin PBS layer covering the cells. After UV-irradiation, PBS was removed and cells were incubated in culture medium for the indicated time points.

CPD ELISA

Keratinocytes in culture were irradiated with 50 mJ/cm 2 as described above and were harvested immediately. Genomic DNA was purified using the isopropanol precipitation procedure. CPDs were quantified by ELISA with monoclonal antibodies (TDM-2 Kamiya biomedicals, USA) (No: MC-062). The protocol was adapted from Nakagawa et al. , 1998. 52 In brief, 96-well plates (VWR, USA) (No. 62409-024), were coated with sample DNA (200 ng per well in triplets). Binding of CPD-specific monoclonal antibodies to immobilized DNA was detected with HRP-labeled goat anti-mouse antibody (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) (7076) using TMB substrate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) (No. PI34028). The absorbance of colored products was measured at 450 nm with a reference of 620 nm using a plate reader (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Inhibition studies

Keratinocytes in culture were incubated with or without the caspase-8- [Z-IETD-FMK (FMK 007)] specific inhibitor (R&D systems, USA) from 1 h before the UV-irradiation until they were harvested.

Western blotting

Skin tissue or cultured keratinocytes were lysed with lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA). Extracted proteins were denatured at 100 °C for 5 min and subjected to electrophoresis using 4-12% Bis-Tris gels (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) (No. BG04125BOX). Gels were blotted onto polyvinyldiene fluoride membranes using the iBlot transfer system (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Afterwards, membranes were incubated in blocking solution (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) (No. 11921673001) 1:10 in Tris buffered saline with 0.01% Tween 20 (TBST).

Blots were probed with primary antibodies against cleaved caspase-3 1:1000 (R and D systems, USA) (MAB835), p-Chk1 (2348), Chk1 (2360), p53 (2524), γ -H2AX (9718), cleaved caspase-9 (9509), cleaved caspase-8 (9429) 1:1000 (Cell Signaling Technology, USA) and GAPDH 1:5000 in TBST (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) (No. 2275). HRP linked anti-rabbit (7074) or anti-mouse (7076) secondary antibodies (Cell Signaling Technology, USA) 1:2000 were used. Immunoreactive proteins were detected using chemiluminescence (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) (No. NEL103001EA) and the blots were developed using X-ray films (Thermo scientific, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) (No. 34089).

Colony forming assays

Typically, low passage primary mouse keratinocytes were plated in 6-well plates (5000 cells per well) and cultured for approximately 2–3 weeks in the presence of mitomycin treated feeder fibroblasts. Fibroblasts were changed once a week. Finally, fibroblasts were removed and keratinocytes were fixed with 1% PFA for 15 min. Subsequently colonies were stained for minimum 1 h with 0.05% crystal violet in PBS. Afterwards, cell culture dishes were washed with dH2O and left for drying 30 min RT. Digital images were obtained using canon camera EOS 1100 D (Canon, Tokyo, Japan).

Adhesion assays

Primary mouse keratinocytes in passage 1 were seeded on to 96 well plate in triplicates and were incubated for 3 h at 37 °C. After a PBS wash, cells were incubated with lysis buffer (9% TritonX100) for 45 min at 37 °C. Ninety-six-well plates were centrifuged, and 50 μ l supernatant from each well was transferred to a fresh 96-well enzymatic assay plate. 50 μ l of reconstituted substrate mix from CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI, USA) (No. G1780) was added to each well and incubated at room temperature for 30 min protected from light. Fifty microliters of stop solution was added and the absorbance was recorded at 490 nm using TriStar LB941 plate reader (Berthold technologies, Zug, Switzerland). Experimental samples were compared for absorbance and the numbers of cells attached were calculated according to the manufacturer's instructions (G1780, Promega).

Statistička analiza

Significance between the samples was calculated using the Student's t -test using Prism 6 (GraphPad) unless stated otherwise. The asterisks shown in graphs correspond to the P -values as stated in the figure legends and text. P -value <0.05 was considered as statistically significant. P -value <0.05 (*), P -value <0.01 (**), P -value <0.001 (***).

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 4

  4. 4.

    Dopunska slika 5

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)