Epigenetska modifikacija nrf2 u stanicama karcinoma debelog crijeva rezistentnih na 5 fluorouracila: uključivanje tet-ovisne demetilacije dna | stanična smrt i bolest

Epigenetska modifikacija nrf2 u stanicama karcinoma debelog crijeva rezistentnih na 5 fluorouracila: uključivanje tet-ovisne demetilacije dna | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • kemoterapija
  • Rak crijeva
  • Metilacija DNA

Sažetak

5-fluororouracil (5-FU) je široko korišteni antikancerogeni lijek za liječenje kolorektalnog karcinoma (CRC). Međutim, rezistencija na 5-FU često sprječava uspjeh kemoterapije. Faktor 2 povezan s nuklearnim faktorom-eritroidom 2 (Nrf2) je transkripcijski regulator i mogući cilj za prevladavanje 5-FU otpornosti. Ova studija ispituje epigenetske promjene povezane s indukcijom Nrf2 u ljudskoj CRC staničnoj liniji (SNUC5) otpornoj na 5-FU (SNUC5 / 5-FUR). Ekspresija Nrf2, nuklearna translokacija i vezanje za promotor bile su veće u stanicama SNUC5 / 5-FUR nego u stanicama SNUC5. Aktivirani Nrf2 u SNUC5 / 5-FUR stanicama doveo je do porasta ekspresije proteina i aktivnosti heme oksigenaze-1 (HO-1), gena reguliranog Nrf2. Stanice SNUC5 / 5-FUR proizvele su veću količinu reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) od SNUC5 stanica. Propadanje NRf2 ili HO-1 posredovano siRNA ili shRNA značajno je potisnulo vitalnost stanica raka i rast tumora in vitro i in vivo , rezultirajući poboljšanom osjetljivošću 5-FU. Podaci o metilaciji (MS) ili kvantitativni MS-PCR podaci u stvarnom vremenu pokazali su hipometilaciju otoka CpG promotora Nrf2 u stanicama SNUC5 / 5-FUR u usporedbi sa SNUC5 stanicama. Ekspresija DNA demetilaze deset-jedanaest translokacija (TET) je pogurana u SNUC5 / 5-FUR stanicama. ROS generiran ekspresijom i funkcijom reguliranog 5-FU TET1, dok je antioksidans imao suprotan učinak. Ovi rezultati sugeriraju da mehanizam koji stoji na osnovi sticanja 5-FU rezistencije u CRC-u uključuje reguliranje ekspresije Nrf2 i HO-1 putem epigenetskih modifikacija demetilacije DNA.

Glavni

Fluoropirimidin 5-fluorouracil (5-FU) je antikancerogeni lijek koji se široko koristi u liječenju čvrstih tumora, uključujući kolorektalni karcinom (CRC). 1 Mehanizam djelovanja 5-FU povezan je s inhibicijom timidilat sintaze i ugradnjom 5-FU u RNK i DNK. 1 Iako je posljednjih godina stečeno bolje razumijevanje mehanizma djelovanja 5-FU-a, razvoj fenotipa rezistentnih na lijekove ostaje značajno ograničenje njegove kliničke primjene. Stoga su hitno potrebne nove strategije liječenja s ciljem prevladavanja otpornosti na 5-FU.

Heme oksigenaza-1 (HO-1) igra važnu ulogu u održavanju stanične redoks homeostaze i na taj način sprečava transformaciju normalnih stanica u stanice karcinoma prekancera suprotstavljanjem karcinogenezi posredovanoj reaktivnim kisikom (ROS). 2 Međutim, pronađeni su nenormalno povećani nivoi HO-1 kod različitih karcinoma, uključujući CRC, što ga opisuje kao molekulu prekancera zbog njegovih antiapoptotičkih i proangiogenih učinaka. 3, 4, 5 Nadalje, prekomjerna ekspresija HO-1 omogućuje stanicama raka aktivna svojstva preživljavanja koja mogu rezultirati lošim kliničkim ishodom. 6, 7 HO-1 ekspresija u stanicama raka povećava se antikancerogeni tretman, poput kemoterapije, radioterapije i fotodinamičke terapije. 8 Posebno, HO-1 je uključen u otpornost stanica raka na kemoterapijska sredstva, uključujući 5-FU. 9, 10, 11

Nuklearni faktor-eritroid 2-faktor 2 (Nrf2) je redoks-osjetljiv transkripcijski faktor koji regulira ekspresiju faza II gena antioksidanata, uključujući HO-1, i pruža citoprotekciju protiv oksidativnog stresa. 12, 13 U stanicama koje nisu pod stresom, Nrf2 sekvestrira proteinom 1 (Keap1 nalik kelch-u) koji potiče njegovu brzu razgradnju posredanu proteasomom. 14 Međutim, kao odgovor na oksidativni stres, Nrf2 se stabilizira odvajanjem od Keap1 i veže na cis-elemente koji se nazivaju antioksidativni elementi reakcije (ARE). 15 Nedavna istraživanja pokazala su da je ekspresija Nrf2 povećana kod različitih karcinoma čovjeka, što sugerira njezinu moguću uključenost u karcinogenezu tijekom nekoliko faza raka, kao što su inicijacija, progresija i otpornost na kemoterapiju. 16, 17 Nedavno je pregledano da Nrf2 i njegov glavni ciljni protein HO-1 mogu imati onkogeni potencijal, što sugerira proliferaciju stanica karcinoma, otpornost na liječenje protiv raka i metastazu ili angiogenezu u progresiji raka. 8 Stoga, Nrf2 i HO-1 mogu predstavljati ključni sustav uključen u otpor 5-FU.

Metilacija DNA epigenetski je događaj uključen u kontrolu ekspresije gena za koju se zna da ima važnu ulogu u rezistenciji na lijekove protiv raka i kemoterapije. Na primjer, promjene u strojevima za metiliranje DNA povezane su s otpornošću na docetaksel u stanicama raka dojke. 18 Aberantna regulacija ahaete scute-a 2, aktivatora transkripcije DNA, promocijskim demetilacijom potiče rast i 5-FU otpornost stanica karcinoma želuca. 19 metilaciju DNA kataliziraju tri DNA metiltransferaze (DNMT): DNMT1, DNMT3A i DNMT3B, a sve to dodaje metilnu skupinu u C5 položaj citozinskog prstena DNK koji vodi do 5-metilcitozina (5-mC). Ekspresija DNMT1 je regulirana u stanicama karcinoma dojke otpornim na tamoksifen i dovodi do aberrantnog metiliranja promotora gena fosfataze i tenznog homologa (PTEN), što rezultira niskom ekspresijom PTEN-a. 20 Stanice karcinoma dojke rezistentne na adriamicin pokazale su fenotip rezistentan na više droga praćen globalnom DNA hipermetilacijom, prekomjernom ekspresijom DNMT gena i povećanom aktivnošću DNMT. 21 Ova izvješća sugeriraju da je DNA hipermetilacija DNMT-om barem djelomično odgovorna za razvoj fenotipa otpornog na lijekove protiv raka.

Taj se postupak metilacije može preokrenuti DNA demetilazama, deset-jedanaest translokacijskih enzima (TETs): TET1, TET2 i TET3. 22 Ti enzimi mogu pretvoriti 5-mC u 5-hidroksimetilcitozin (5-hmC), 5-formilcitozin (5-fC) i 5-karboksilcitozin (5-caC), što konačno dovodi do citozina. 22, 23 Te modificirane baze mogu služiti ne samo kao intermedijari u procesu demetilacije DNA, već također mogu povećati raznolikost epigenetskih stanja genomske DNK. U ovoj studiji istražili smo mehanizme koji stoje na osnovi 5-FU rezistentnosti, usredotočujući se na uključenost Nrf2 i promjene metilacije DNA u CRC.

Rezultati

Osjetljivost SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanica na 5-FU

Uspoređivani su citotoksični učinak 5-FU u staničnoj liniji SNUC5 i njegova 5-FU otporna varijanta, SNUC5 / 5-FUR. Koncentracija 5-FU koja je dovela do 50% inhibicije rasta (IC50) bila je 9 μM u SNUC5 stanicama i 2264 μ M u SNUC5 / 5-FUR stanicama, pri čemu je otpor induciran kontinuiranom kulturom u 140 μ M 5-FU (Slika 1a). Ovi rezultati potvrđeni su testom formiranja kolonija; broj kolonija u obje stanične linije smanjen je IC50 koncentracijom 5-FU u usporedbi s neliječenom skupinom (Slika 1b). Tretman 5-FU izazvao je apoptozu u obje stanične linije, što pokazuje i bojenje aneksinom V – propidijum-jodidom (PI) i bojenje označenim TUTT posredovanim dUTP nick-endom (TUNEL). Populacija annexin V + PI - (apoptotična) pokazala je 29% u SNUC5 i 31% u SNUC5 / 5-FUR stanicama (Slika 1c). Podaci o bojenju TUNEL-om bili su u skladu s podacima iz priloga V-PI (slika 1d).

Image

Osjetljivost SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanica na 5-FU. Stanice su tretirane s 5-FU. ( a ) Nakon 2 dana stanična vitalnost je procijenjena korištenjem MTT testa. ( b ) Nakon 10 dana, sposobnost formiranja kolonije (CFA) ocijenjena je korištenjem kita za bojenje kolonija. * Znatno se razlikuje od netretiranih SNUC5 stanica ( P <0, 05) i # značajno se razlikuje od netretiranih SNUC5 / 5-FUR stanica ( P <0, 05). Apoptoza je otkrivena ( c ) bojenjem u aneksinu V – PI i ( d ) bojenjem TUNEL

Slika pune veličine

Indukcija HO-1 i Nrf2 u SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanicama

Ekspresija i aktivnost HO-1 bili su veći u stanicama SNUC5 / 5-FUR nego u stanicama SNUC5 (Slike 2a i b). Nuklearni Nrf2, transkripcijski faktor za HO-1 i aktivna ekspresija Nrf2 (fosfo Nrf2) bili su veći u stanicama SNUC5 / 5-FUR nego u stanicama SNUC5, a ekspresija Nrf2 i fosfo Nrf2 u citosolu bila je niža u SNUC5 / 5-FUR stanicama nego u stanicama SNUC5 (slika 2c). Pojačana translokacija proteina Nrf2 iz citosola u jezgru (slika 2d) i njegovo vezanje za ARE slijed u promotoru HO-1 (slika 2e) prikazani su u stanicama SNUC5 / 5-FUR.

Image

Ekspresija HO-1 i Nrf2 u SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanicama. ( a ) HO-1 ekspresija i ( b ) aktivnost kao i ( c ) Nrf2 ekspresija su određene. Antitijelo za β- aktin korišteno je kao kontrola opterećenja za ukupni ili citosolni protein, a TBP antitijelo za nuklearni protein. * Znatno se razlikuje od SNUC5 stanica ( P <0, 05). ( d ) Konfokalne slike pokazuju Nrf2 i fosfo Nrf2 (zeleni) izraz. DAPI bojenje označava jezgre (plavo). Spojena slika označava nuklearno mjesto proteina Nrf2. ( e ) ChIP analiza procijenjena je korištenjem antitijela i primera protiv Nrf2 za amplifikaciju HO-1 promotorske regije i kvantificirana. Unos predstavlja amplifikaciju ukupne DNK iz celičnih lizata. IgG je korišten kao negativna kontrola

Slika pune veličine

Intracelularne razine ROS-a u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR

Podaci protočne citometrije pokazali su da su razine ROS veće u stanicama SNUC5 / 5-FUR (intenzitet fluorescencije (FI) 342) nego u SNUC5 stanicama (FI 132), a tretiranje H2O2 u SNUC5 stanicama (FI 640) korišteno je kao pozitivno kontrola (slika 3a). Ovi rezultati potvrđeni su konfokalnim mikroskopskim podacima; zeleni FI generiran ROS-om pojačan je u stanicama SNUC5 / 5-FUR u usporedbi sa SNUC5 stanicama (Slika 3b). Ovi rezultati sugeriraju da su stanice SNUC5 / 5-FUR bile izložene stanju oksidativnog stresa u odnosu na stanice SNUC5.

Image

Intracelularne razine ROS-a u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR. Kao pozitivna kontrola korišten je tretman ROS induktor H20 (1000 µM) u SNUC5 stanicama. ROS su otkriveni ( a ) protočnom citometrijom i ( b ) konofokalnim snimanjem nakon bojenja DCF-DA. FI označava intenzitet fluorescencije DCF. * Znatno se razlikuje od SNUC5 stanica ( P <0, 05)

Slika pune veličine

Osjetljivost 5-FU na Nrf2 i HO-1 rušenje in vitro i in vivo

Pretpostavljene uloge Nrf2 i HO-1 na osjetljivosti 5-FU u SNUC5 / 5-FUR stanicama su ispitivane siRNA ili shRNA posredovanim šutnjom in vitro i in vivo . Transficirane ćelije siNrf2- ili siHO-1 značajno su smanjile životnu sposobnost stanica ili broj formiranih kolonija u odnosu na stanice koje su transficirane siCon (Slike 4a i b). Tretman 5-FU (140 µM) u stanicama koje su transficirane siNrf2- ili siHO-1 značajno je smanjio životnu sposobnost stanica ili broj formiranih kolonija nego 5-FU tretman u stanicama koje su bile transficirane siConom ili 5-FU-netretiranim siNrf2- i siHO-1- transfektirane stanice (slike 4a i b). Pored toga, miševi implantirani s SNN5 / 5-FUR stanicama koje su transficirane shNrf2- ili shHO-1 imali su smanjeni volumen, veličinu, težinu i apoptotske stanice tumora nego miševi implantirani s ćelijama transficiranim s shCon (Slike 4c-f). Tretman 5-FU (20 mg / kg / dan) kod miševa implantiranih s transficiranim stanicama shNrf2 ili shHO-1 smanjio je volumen, veličinu, težinu i apoptotske stanice tumora nego 5-FU tretman u miševa implantiranih s shCon-transficiranim stanicama ili fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom (PBS) kod miševa implantiranih stanicama koje su transficirane shNrf2- ili shHO-1 (Slike 4c-f).

Image

Nrf2 i HO-1 knockdown senzibilizira stanice SNUC5 / 5-FUR na 5-FU in vitro i in vivo . SNUC5 / 5-FUR stanice su transficirane sa siCon, siNrf2 ili siHO-1 i inkubirane 24 sata. ( a ) Stanice su kultivirane u odsutnosti ili prisutnosti 5-FU (140 µM ) 48 h. Stanična vitalnost je određena korištenjem MTT testa. ( b ) Za ispitivanje kolonije, stanice su kultivirane u odsutnosti ili prisutnosti 5-FU (140 µM ) 10 dana. Prebrojane su kolonije s više od 50 stanica. * Značajno različite od stanica koje su transficirane siCon-om u odsustvu 5-FU ( P <0, 05), # značajno različite od stanica koje su transficirane siCon-om u prisutnosti 5-FU ( P <0, 05), značajno različite od stanica koje su transficirane siNrf2 u nedostatku 5-FU ( P <0, 05), a značajno se razlikuje od stanica koje su transficirane siHO-1 u odsutnosti 5-FU ( P <0, 05). Ispitivanje in vivo provedeno je korištenjem mišjeg modela ksenografita tumora. SNUC5 / 5-FUR stanice su transficirane s shCon, shNrf2 ili shHO-1 RNA, a zatim implantirane supkutano u leđa golih miševa. Nakon 14 dana, nosač (PBS; n = 6) ili 5-FU (20 mg / kg / dan; n = 6) izravno su se ubrizgavali u tumor svaka 2 dana (9 puta). Miševi su ubijeni, a tumori su sakupljeni 35 dana nakon injekcije tumorskih stanica. ( c ) Izmjereni su volumen, ( d ) veličina i ( e ) težina tumora. * Znatno se razlikuje od miševa tretiranih nosačem koji su primili stanice transficirane s shCon ( P <0, 05), # značajno različite od miševa tretiranih s 5 FU koji su primili stanice transficirane s shCon ( P <0, 05), značajno različite od miševa tretiranih nosačem koje su primile transfektirane s shNrf2 stanice ( P <0, 05), i značajno se razlikuju od miševa tretiranih nosačem koji su primili stanice shHO-1 transficirane ( P <0, 05). ( f ) Indukciju apoptoze od strane 5-FU procijenio je TUNEL. Prikazane su reprezentativne slike

Slika pune veličine

Razine metilacije DNA u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR

Metilacija Nrf2 promotora ocijenjena je korištenjem metilacijskog specifičnog PCR (MS-PCR) i kvantitativnog MS-PCR. Specifična CpG mjesta u promotorskoj regiji gena Nrf2 metilirana su u SNUC5 stanicama, ali manje metilirana u SNUC5 / 5-FUR stanicama (Slika 5a). Ti su rezultati potvrđeni kvantitativnim MS-PCR-om; razine metilacije gena Nrf2 u SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanicama bile su 35% i 5%, respektivno (Slika 5b).

Image

Status metilacije Nrf2 promotora u SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanicama. ( a ) MS-PCR analiza Nrf2 promotora izvedena je na genomskoj DNK izoliranoj iz SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanica. Metilacija je otkrivena amplifikacijom produkta upotrebom primera specifičnih za metilaciju. Nemetilacija je otkrivena amplifikacijom produkta upotrebom primera specifičnih za metilaciju. M, metilirana DNA; U, nemetilirani DNK. ( b ) Provjerena je QMSP analiza u NRf2 u stvarnom vremenu u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR. Barovi predstavljaju postotak metilacije otoka CpG. * Znatno se razlikuje od SNUC5 stanica ( P <0, 05)

Slika pune veličine

DNKT-ovi i TET-ovi proteini povezani sa metilacijom DNA u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR

Ekspresija proteina povezanih sa epigenetskom modifikacijom u smislu metilacije DNA istraživana je procjenom razine DNMT-a DNMT1, DNMT3A i DNMT3B, i DNA demetilaza TET1, TET2 i TET3. DNMT ekspresija nije pokazala značajnu razliku između SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanica, dok je TET ekspresija bila veća u SNUC5 / 5-FUR stanicama nego u SNUC5 stanicama (Slika 6a). Također, TET1 ekspresija je potvrđena konfokalnim slikanjem (slika 6b). Vezivanje TET1 na promotor Nrf2 značajno je povišeno u stanicama SNUC5 / 5-FUR, što je procijenjeno korištenjem testa imunoprecipitacije kromatina (ChIP), dok DNMT1 nije pokazao značajnu razliku u vezivanju promotora Nrf2 u obje stanične linije (Slika 6c). Nadalje, padom TET1 smanjena je ekspresija Nrf2 mRNA i proteina u SNUC5 / 5-FUR stanicama, dok oborenje DNMT1 nije utjecalo na to (Slike 6d i e). Također, oborenje TET1 rezultiralo je smanjenjem ekspresije i aktivnosti proteina HO-1, ali obaranje DNMT1 nije ga promijenilo (Slike 6e i f). Ovi rezultati sugeriraju da TET1 može pozitivno regulirati aktivaciju Nrf2 u SNUC5 / 5-FUR stanicama.

Image

DNA metilacija povezana u proteinima u SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR stanicama. ( a ) Ekspresije DNA metilaza DNMT1, DNMT3A i DNMT3B, te DNK demetilaze TET1, TET2 i TET3 određene su zapadnim blotiranjem. ( b ) Konfokalne slike pokazuju TET1 (zeleno), a DAPI bojenje označava jezgre (plavo). Spojena slika označava nuklearno mjesto proteina TET1. ( c ) ChIP analiza provedena je korištenjem antitijela i prajmera anti-TET1 ili anti-DNMT1 za amplifikaciju regije promotora Nrf2. Trake označavaju razine TET1 ili DNMT1 u Nrf2 promotorskoj regiji. Unos predstavlja amplifikaciju ukupne DNK iz celičnih lizata. * Znatno se razlikuje od razine TET1 u SNUC5 stanicama ( P <0, 05). SNUC5 / 5-FUR stanice su transficirane 24 sata s siCon, siTETl ili siDNMT1 RNA. ( d ) Ekspresija Nrf2 mRNA procjenjivana je korištenjem RT-PCR. ( e ) Ekspresija proteina Nrf2 i HO-1 određena je primjenom Western blottinga. ( f ) određena je aktivnost HO-1. * Znatno se razlikuje od stanica inficiranih siConom ( P <0, 05)

Slika pune veličine

TET aktivnost u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR

Aktivnost TET-a procijenjena je mjerenjem razina 5-mC, 5-hmC i 5-fC. Razina 5-mC bila je niža u stanicama SNUC5-5FUR nego u stanicama SNUC5, dok su razine 5-hmC i 5-fC više u SNUC5-5FUR stanicama nego u SNUC5 stanicama, što pokazuje analiza dot blot analizom (Slika 7a), konfokalna slika (slika 7b), protočna citometrija (slika 7c) i ELISA (slika 7d).

Image

TET-katalizirani procesi u stanicama SNUC5 i SNUC5 / 5-FUR. TET-katalizirana pretvorba 5-mC u 5-hmc i 5-fC ocijenjena je ( a ) dot blot analizom, ( b ) konfokalnim slikanjem, ( c ) protočnom citometrijom i (d) ELISA analizom. * Znatno se razlikuje od SNUC5 stanica ( P <0, 05)

Slika pune veličine

Učinci 5-FU na Nrf2, ROS i TET

Liječenje 5-FU povećalo je razinu nuklearnog Nrf2 i aktivnog Nrf2 (fosfo Nrf2) u SNUC5 stanicama (Slika 8a). Metilacija Nrf2 promotora smanjena je u SNUC5-tretiranim 5-FU stanicama (Slika 8b). Ovi su rezultati potvrđeni u stvarnom vremenu QMSP; razine metilacije Nrf2 promotora u kontroli i 5-FU tretmanu u stanicama SNUC5 bile su 44% i 29%, respektivno (Slika 8c). Nadalje, 5-FU tretman značajno povećava TET1 ekspresiju (Slika 8d) i TET aktivnost u SNUC5 stanicama (Slika 8e). Nadalje, istraživali smo učinak 5-FU na ROS i TET1 u SNUC5 stanicama. 5-FU promovirao je proizvodnju ROS-a u stanicama SNUC5, dok je liječenje antioksidansom N- acetilcisteinom (NAC) imalo suprotan učinak (slika 8f). 5-FU povećao je ekspresiju TET1 (slika 8 g) i TET-katalizirane procese (slike 8h i i), ali NAC tretman je smanjio regulaciju, sugerirajući da učinak 5-FU na TET ekspresiju i funkciju posreduje njegovom indukcijom ROS.

Image
Image

Učinci 5-FU-induciranog ROS-a na TET u SNUC5 stanicama. SNUC5 stanice su tretirane s 5-FU (9 μM) i tada je ( a ) ekspresija Nrf2 određena Western blottingom. ( b ) Metilacija Nrf2 promotora izvedena je na genomskoj DNK izoliranoj iz 5-FU tretiranih SNUC5 stanica pomoću MS-PCR. M, metilirana DNA; U, nemetilirani DNK. ( c ) Provedena je QMSP analiza u realnom vremenu za Nrf2 u SNUC5-tretiranim 5-FU stanicama. * Znatno se razlikuje od kontrole ( P <0, 05). ( d ) Ekspresija TET1 analizirana je zapadnim blotiranjem i ( e ) Postupci povezani s TET-om analizirani su dot-blot testom. Stanice su prethodno obrađene sa 500 µM NAC, inkubirane su 1 sat na 37 ° C i obrađene sa 9 µM 5-FU tokom 48 h. Stanice su zatim obrađene sa 10 μM DCF-DA dodatnih 30 min na 37 ° C. ( f ) Razina unutarstaničnog ROS-a otkrivena je protočnom citometrijom. FI označava intenzitet fluorescencije DCF. * Znatno se razlikuje od kontrole ( P <0, 05). # Znatno se razlikuje od stanica tretiranih s 5 FU ( P <0, 05). Ekspresija TET1 i njegova aktivnost otkrivena je ( g ) western blotiranjem, ( h ) ispitivanjem točkica i ( i ) protočnom citometrijom

Slika pune veličine

Rasprava

5-FU ostaje standardna terapija za liječenje bolesnika s CRC-om, unatoč činjenici da je razvijena prije više od 50 godina. Međutim, većina bolesnika s CRC-om razvije rezistenciju na 5-FU. 1, 24 Stoga je rasvjetljavanje molekularnih mehanizama na kojima djeluje 5-FU otpornost važno za razvoj molekularno ciljanih strategija za prevladavanje otpornosti na lijekove. 1 Sve veći dokaz potvrđuje tvrdnju da epigenetske promjene igraju glavnu ulogu u otpornosti na lijekove kod različitih vrsta raka, uključujući CRC. 25 Ovo sugerira da se epigenetski agensi mogu upotrijebiti za prevladavanje otpornosti na lijekove protiv CRC-a i povećanje učinkovitosti konvencionalnih kemoterapijskih sredstava u klinici.

U ovom istraživanju pokazali smo da je ekspresija Nrf2 i gena HO-1 vezanog za Nrf2 regulirana u 5-FU otpornoj CRC staničnoj liniji (SNUC5 / 5-FUR) u usporedbi s roditeljskom staničnom linijom (SNUC5). Iako je zaštitna uloga antioksidacijskog sustava Nrf2 protiv karcinogeneze i kemikalija dobro dokumentirana u normalnim stanicama, njegova produljena aktivacija u stanicama raka može povećati otpornost na lijekove protiv raka. Nrf2 kontrolira bateriju gena uključujući HO-1 koji štite stanice od kemijskih i oksidativnih stresa i aktiviraju se u CRC-ima. 26 Nadalje, Nrf2 aktivira 5-FU, možda kao rezultat proizvodnje ROS-a izazvanog lijekom, u staničnoj liniji HT-29 humanog karcinoma raka debelog crijeva. 27 U skladu s ovim izvješćem, naši su rezultati pokazali da su razine ROS-a i ekspresija Nrf2 i HO-1 povišene u stanicama SNUC5 / 5-FUR. Indukcija staničnih obrambenih gena reguliranih Nrf2 povezana je s povećanom otpornošću na 5-FU, a preokreće je siNrf2. 27 Nadalje, transkripcija Nrf2 inducirana onkogenom (K-Ras, B-Raf ili Myc) potiče detoksifikaciju i karcinogenezu ROS-om, a stabilno povisuje bazni antioksidansni program Nrf2 i na taj način snižava razinu unutarćelijskog ROS-a. 16 U ovom istraživanju, stanice SNUC5 / 5-FUR transficirane siRNA ili shRNA protiv Nrf2 ili HO-1 pokazale su povećanu citotoksičnost i smanjenu staničnu proliferaciju in vitro i in vivo te su bile osjetljivije na liječenje 5-FU.

Stanice raka koje se prilagođavaju oksidativnom stresu ureguliranjem manganove superoksidne dismutaze, peroksireoksina I i Bcl-2 otporne su na 5-FU. 28 Tretman siRNA protiv ROS modulatora 1 (Romo1) učinkovito blokira stvaranje ROS-a izazvanog 5-FU, što ukazuje da 5-FU tretman potiče proizvodnju ROS-a pomoću indukcije Romo1. 29 ROS može dovesti do epigenetskih promjena koje utječu na genom i imaju ključnu ulogu u karcinogenezi čovjeka. 30 Preciznije, proizvodnja ROS-a povezana je s promjenama u obrascima metilacije DNA. 31 U stvari, mnogi geni za supresiju tumora inaktivirani su ROS-posredovanim abberantnim metiliranjem promotorskih regija bogatih CpG otocima. 32 Na primjer, kada su izloženi oksidativnom stresu, geni za supresiju tumora p15 INK4B i p16 INK4A dobivaju abberantne metilacijske obrasce, a njihova ekspresija u konačnici je prigušena. 33

Metilacija DNA je vjerovatno najintenzivniji proučavani proces u epigenetikama s obzirom na kancerogenezu, i to je bio glavni fokus farmakoloških intervencija u kliničkim ispitivanjima. Ova se modifikacija događa uglavnom kod CG dinukleotidnih parova i DNMT-ovi prenose metilnu skupinu u 5-ugljikov položaj citozinskog prstena kako bi tvorili 5-mC. Pretvorba 5-mC u 5-hmC, 5-fC i 5-caC obrađena je TET proteinima. 22, 23, 34 Genomski sadržaj 5-hmC, 5-fC i 5-caC može se povećati ili smanjiti prekomjernom ekspresijom ili iscrpljivanjem TET proteina. 22 5-mC oksidativni put posredovan TET proteinima može biti relevantan za aktivaciju ili supresiju ekspresije gena kroz povezanost s transkripcijskim reprepresorima ili aktivacijskim faktorima. 35

Svi TET proteini sadrže regiju bogatu cisteinom, dvolančani β- helix nabor i CXXC domenu, koja je domena vezanja DNA s motivom vezanja CpG i uključena je u regrutovanju TET proteina u DNA. 36 TET1 je primarni enzim za oksidaciju 5-mC u 5-fC, iako ostali TET proteini, TET2 i TET3, nadoknađuju gubitak TET1. 37, 38 Osim toga, objavljeno je da TET1 igra bitnu onkogenu ulogu u leukemiji. 39 Stoga je ova studija bila usredotočena na TET1 među članovima TET obitelji.

U ovom istraživanju razina 5-mC bila je niža, a razine 5-hmC i 5-fC značajno veće u stanicama SNUC5 / 5-FUR nego u stanicama SNUC5. Indukcija TET1 dovodi do aktiviranja Nrf2 u SNUC5 / 5-FUR stanicama. Naši rezultati također pokazuju da porast TET1 i TET procesnih proteina za 5-FU posreduje porastom razine ROS.

Zaključno, ovi rezultati sugeriraju da razvoj otpornosti na 5-FU u CRC stanicama uključuje promjene u ekspresiji Nrf2 i HO-1 koje su izazvane epigenetskom modifikacijom demetilacije DNA. Stoga, Nrf2 može predstavljati potencijalnu terapijsku metu za prevladavanje otpornosti CRC-a na tretman 5-FU-om.

Glosar

5-FU

5-fluorouracil

CRC

Rak debelog crijeva

Nrf2

nuklearni faktor-eritroid 2, faktor 2

HO-1

heme oksigenaza-1

ROS

reaktivne vrste kisika

TET

deset-jedanaest translokacija

Keap1

proteini 1 povezani sa kelch-om

SU

element antioksidacijskog odgovora

DNMT

DNA metiltransferaza

5-mC

5-metilcitozin

5-HMC

5-hydroxymethylcytosine

5-Fc

5-formylcytosine

5-CAC

5-carboxylcytosine