Epigenetsko prigušivanje mikrorne-149 u fibroblastima povezanim s rakom posreduje signalizaciju prostaglandina e2 / interleukin-6 u mikrookolju tumora | stanično istraživanje

Epigenetsko prigušivanje mikrorne-149 u fibroblastima povezanim s rakom posreduje signalizaciju prostaglandina e2 / interleukin-6 u mikrookolju tumora | stanično istraživanje

Anonim

teme

  • Epigenetika raka
  • Stanična signalizacija
  • Rak želuca
  • miRNAs

Sažetak

Pokretanje i rast tumora ovise o njegovom mikrookolju u kojem fibroblasti povezani s rakom (CAF) u stromi tumora igraju važnu ulogu. Prostaglandin E2 (PGE2) i interleukin (IL) -6 signalni putevi uključeni su u presjek između tumorskih i stromalnih stanica. Međutim, kako način signalizacije posredovan PGE2 modulira ovaj presjek ostaje nejasno. Ovdje pokazujemo da mikroRNA (miR) -149 povezuje signalizaciju PGE2 i IL-6 pri posredovanju ukrštanja između tumorskih stanica i CAF-a kod karcinoma želuca (GC). miR-149 inhibira aktivaciju fibroblasta ciljajući IL-6 i miR-149 ekspresiju je značajno potisnut u CAFs GC. miR-149 negativno regulirani CAF-ovi i njihov utjecaj na razvoj GC-a i in vitro i in vivo . CAF-ovi su poboljšali prijelaz epitela u mezenhim (EMT) i matična svojstva GC stanica na način ovisan o miR-149-IL-6. Pored IL-6, otkriven je i PGE2 receptor 2 (PTGER2 / EP2) kao još jedna potencijalna meta miR-149 u fibroblastima. Nadalje, infekcija H. pylori , vodećim uzrokom ljudskog GC-a, bila je u stanju inducirati ciklooksigenazu-2 (COX-2) / PGE2 signalizaciju i poboljšati proizvodnju PGE2, što je rezultiralo hipermetilacijom miR-149 u CAF-ima i povećanjem IL-6 izlučivanje. Naši nalazi pokazuju da miR-149 posreduje ukrštanje između tumorskih stanica i CAF-a u GC-u i ističe potencijal potencijalne interferencije miRNA u stromalnim stanicama za poboljšanje terapije raka.

Uvod

Strome tumora, uključujući GC stromu, sastoje se od izvanstanične matrice i različitih stanica, uključujući fibroblaste i upalne stanice. Među njima, fibroblasti povezani s rakom (CAF) igraju kritičnu ulogu u promicanju rasta tumora, invazije i angiogeneze 1 . CAF se obično smatra podrijetlom iz normalnih fibroblasta (NF) koji su u bliskom kontaktu s tumorskim stanicama 2 . Povišena ekspresija proupalnih gena ključna je za održavanje karakteristika CAF-a 3 . S druge strane, neoplastične stanice mogu inducirati transformaciju fibroblastnih stanica kako bi se prilagodile tumorskom mikrookolju i koevoluirale s tumorskim stanicama kako bi potaknule zloćudnost 2 .

CAF i neoplastične stanice komuniciraju putem faktora rasta i faktora upale 4 . Upalni signalni putovi postaju visoko obećavajući ciljevi za blokiranje komunikacije između tumorskih stanica i CAFs 5 . Među njima, signalizacija ciklooksigenaze-2 (COX-2) / prostaglandina E2 (PGE2), koja je otkrivena u transformiranim epitelnim stanicama 6, jedinstveno doprinosi tumorigenezi povećanjem populacije stanica koje iniciraju tumor (TIC) 7 . Prekomjerna ekspresija COX-2 dovoljna je da inducira stvaranje tumora u transgeničnim mišjim modelima 8, a predloženo je i da iskaže svoje protitumorske učinke proizvodnjom PGE2 9 . PGE2 potiče razvoj tumora stimuliranjem angiogeneze, inhibiranjem apoptoze, povećanjem invazije i modulacijom upalnih i imunoloških odgovora10. Pored tumorskih stanica, povišena razina stromalne PGE2 može se pripisati fibroblastima 11, 12 . Iako je uloga signalizacije COX-2 / PGE2 u tumorigenezi detaljno proučena, mehanizam koji stoji u osnovi komunikacije između tumorskih stanica i fibroblasta ostaje nejasan.

Povećana razina PGE2 inducira ekspresiju upalnog faktora interleukin (IL) -6 u fibroblastima 13, 14 . IL-6 je važan posrednik koji sudjeluje u unakrsnom razgovoru između CAF-a i tumorskih stanica 3, 15 . Suprotno PGE2, IL-6 koji proizvodi CAF vjerojatno će igrati ulogu uglavnom u niši stanica raka 3, 15, 16, 17, 18 . Prisutnost tumorskih stanica povećava oslobađanje IL-6 od strane CAF 16 . Nedavna otkrića pokazuju da IL-6 također može povećati proizvodnju PGE2 19, 20, što sugerira da je signalizacija IL-6 ključna za aktivaciju puta COX-2 / PGE2 u stanicama raka 16 . Stoga je vjerojatno da će pozitivna petlja za povratnu vezu s PGE2-IL-6 biti uključena u presjek između tumora i njegove strome.

Disregulacija mikroRNA (miRNA) povezana je s tumorigenezom 21 i reprogramiranjem fibroblasta kod raka 22 . Većina studija, uključujući i one iz naše skupine, usredotočila se na miRNA u tumorskim stanicama, njihovu aberantnu ekspresiju i ciljne gene 23, 24, dok se miRNA koja se ne mijenjaju u tkivima tumora obično zanemaruju. Nedavna izvješća ukazuju na to da se miRNA abberantno eksprimira u CAF-ima u usporedbi s NF-om u karcinomu endometrija, mjehura, dojke i jajnika 22, 25, 26, 27 . Deregulacija miRNA doprinosi protumorskoj sposobnosti CAF mijenjanjem ekspresije njihovih ciljnih gena. Međutim, tumorska tkiva sastoje se od različitih tipova stanica od kojih CAF zauzimaju samo mali postotak. Deregulacija gena ili proteina u ovim stanicama obično se propusti u analizi cijelog tkiva. Genetske mutacije u CAF-ima su rijetke, što implicira da alternativni način regulacije gena može biti aktivan 28, 29 . Analiza stromalnih stanica na karcinomu dojke koja se širi na genom sugerira da su epigenetske promjene vjerojatno glavni regulatorni mehanizam u CAF-u 30 . Stoga je moguće da izmijenjena ekspresija miRNA u CAF-ovima može precizno prilagoditi PGE2 signalizaciju da orkestrira interakciju između CAF-a i neoplastičnih stanica.

U ovom istraživanju identificiramo miRNA koje su deregulirane u CAF-ima i istražuju mehanizme koji stoje na osnovi njihove disregulacije kao i njihovu ulogu u tumorigenezi.

Rezultati

miR-149 cilja IL-6 mRNA i snižava se u GC CAF-ima

Da bi se identificirale miRNA koja mogu igrati ulogu u tumorigenezi, miRarezom su analizirani miR profili 28 parova želučanog tumora i para-tumora (Dodatne informacije, Slika S1A). Opisane su uloge nekoliko značajno dereguliranih miRNA u želučanim tumorima 20, 21 . Ovdje smo se fokusirali na miRNA čiji se izraz nije razlikovao između tumora i para-tumorskih tkiva. CAF igraju važnu ulogu u tumorigenezi, a miRNA mogu reprogramirati NF u CAF 22 . Konverzija NF-a u CAF-e događa se mehanizmom sličnim onome fibroze 31, u kojem su miRNA, poput miR-21 i miR-29, neophodna 32, 33 . Da bismo identificirali deregulirane miRNA specifične za CAF, pretraživali smo objavljene skupove podataka za miRNA deregulirane u CAF-ima u karcinomu dojke 27 i kardiomiocitnu fibrozu 34, te ih uspoređivali s miRNA-ima nepromijenjenim u našim nizovima podataka (Dodatne informacije, Slika S1B). Tri skupine dijelile su jedan zajednički miR, miR-149, koji je dramatično smanjen kod fibroze i CAF-a.

Pretragom alata za predviđanje ciljeva (TargetScan, Microrna.org, PicTar i RNAhybrid) 35 potencijalni ciljni geni miR-149 identificirali su IL-6 koji je specifičan za CAF i povezan s tumorigenezom 16, 17, 18 (slika 1A). Da bi se potvrdila predviđena uloga IL-6 kao ciljnog gena miR-149, fragmenti IL-6 divljeg tipa i mutirani 3'-UTR fragmentirani su klonirani u vektor luciferaze pMIR-REPORT (Dodatne informacije, Slika S2). Konstrukti su kofeficirani mimikom miR-149 ili kontrolom u fibroblaste nakon čega je uslijedila analiza reportera luciferaze. Relativna aktivnost luciferaze pMIR / IL-6 -3'-UTR wt, ali ne i ona pMIR / IL-6 -3'-UTR mut, značajno je potisnuta mimikom miR-149. Suprotno tome, anti-miR-149 pojačavao je relativnu aktivnost luciferaze pMIR / IL-6 -3'-UTR wt, ali ne i aktivnosti pMIR / IL-6 -3'-UTR mut (Slika 1B).

Image

miR-149 cilja IL-6 u fibroblastima želučane strome i regulira ekspresiju FAP-a putem IL-6. (A) Shematski graf 3'-UTR IL-6 s pretpostavljenim veznim mjestima miR-149. Minimalna slobodna energija (mfe) potrebna za hibridizaciju RNA predvidjela je softver RNAhybrid (mfe: -19, 5 kcal / mol). (B) Učinak miR-149 mimike i miR-149 inhibitora na IL-6 ekspresiju. Aktivnost luciferaze u fibroblastima kofeficirana s reporterski vektor divljim tipom ili mutantnim IL-6 3'-UTR i miR-149 mimikama ili inhibitorima. (C) Razine ekspresije miR-149 u 5 CAF-a i 5 NF-a utvrđenih iz tkiva želučanog tumora i podudarnih para-tumorskih tkiva kvantificirane su qRT-PCR. (D) Koncentracije IL-6 u mediju uzgojenih CAF i NF staničnih linija analizirane su ELISA. (E) Razine ekspresije miR-149 koreliraju obrnuto s ekspresijom IL-6 u CAF-ima i NF-u. (F) Razine ekspresije FAP u CAF ili NF transfektirane kontrolama, miR-149 ili anti-miR-149 (CAF NC, CAF miR-149, NF anti-miR-149 i NF anti-NC, respektivno) kako je analizirao protočna citometrija. (G) Relativne razine mRNA FAP u CAF NC, CAF miR-149, NF anti-miR-149 i NF anti-NC detektirane su qRT-PCR. (H) Koncentracija IL-6 u medijima kultiviranog CAF NC, CAF miR-149, NF anti-miR-149 i NF anti-NC . (I, J) Relativne razine FAP-a u CAF miR-149 i NF anti-miR-149 u prisutnosti ili odsutnosti IL-6 ili IL-6 Ab analizirane su protočnom citometrijom (I) i qRT-PCR (J) . Svi podaci predstavljaju prosjek ± SD od tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, t- test učenika.

Slika pune veličine

Na temelju rezultata koji ukazuju da miR-149 cilja IL-6 mRNA, istraživali smo odnos između miR-149 i IL-6 i njihove uloge u GC-u. Kako bi se potvrdila silazna regulacija miR-149 u CAF-ima, uspostavljeno je pet primarnih staničnih linija CAF-a i NF-a iz malignih tkiva želuca i odgovarajućeg normalnog tkiva. Kvantitativna analiza pokazala je da su razine ekspresije miR-149 značajno niže u GC CAF-u nego u NF-ima (slika 1C).

Izlučivanje IL-6 uspoređeno je između CAF-a i NF-a, što je pokazalo veću razinu izlučivanja IL-6 iz CAF-a nego iz NF-a (slika 1D). Štoviše, razina sekrecije IL-6 bila je obrnuto povezana s razinama miR-149 (Slika 1E). Uzeto zajedno, ovi rezultati sugeriraju da miR-149 cilja IL-6 mRNA i inhibira proizvodnju IL-6 u CAF-ima.

miR-149 inhibira aktivaciju fibroblasta smanjujući ekspresiju IL-6

IL-6 dobiven iz fibroblasta kritičan je za funkciju CAF 16, 17, što nas je potaknulo da istražimo da li miR-149 modulira CAF kroz IL-6. Za procjenu aktivacije fibroblasta koristili smo aktivacijski protein fibroblastne stanice (FAP). Nakon što je potvrđeno da su razine ekspresije FAP bile veće u CAF-ima nego u NF-ima protočnom citometrijom i kvantifikacijom mRNA (dopunske informacije, slika S3A i S3B), utjecaj miR-149 na ekspresiju FAP-a ispitan je uvođenjem mimike miR-149 i miR-149 inhibitora u CAFs i NFs. Ekspresija FAP-a značajno je regulirana mimikom miR-149 u CAF-ima, a regulirana miR-149 inhibitorima u NF-ima (slika 1F i 1G) slična sekreciji IL-6 (Slika 1H). Dodavanje IL-6 ili IL-6 neutralizirajućeg antitijela poništilo je smanjivanje ekspresije FAP-a mimicima miR-149, a njegovu regulaciju inhibitorom miR-149, respektivno (Slika 1I i 1J). Ovi rezultati snažno podržavaju ideju da miR-149 igra ulogu u održavanju NF-a i potiskivanju funkcije CAF-a regulacijom ekspresije IL-6.

miR-149 je kritičan za sposobnost fibroblasta koji potiču tumor

CAF promiču proliferaciju stanica raka, migraciju i invaziju 1, 31 . Da bismo utvrdili da li miR-149 regulira sposobnost fibroblasta koji potiču tumor, istraživali smo učinke kondicioniranog medija iz CAF-a ili NF-a s manipuliranom razinom miR-149 na GC stanice (Slika 2A). Kao što je prikazano na slici 2B-2E, miR-149 mimika značajno suzbila stimulativni učinak CAF-a na proliferaciju GC stanica, sposobnost formiranja kolonija, migraciju i invaziju; obrnuto, miR-149 inhibitori su dali NF pojačavajuće efekte.

Image

miR-149 utječe na sposobnost fibroblasta koji potiče tumor. (A) Shematski dijagram procjene stanične linije karcinoma želuca SGC-7901 uzgajan u različitim kondicioniranim medijima (CM) kako je naznačeno. (B) Učinak miR-149 na proliferaciju GC stanica izmjeren WST testom. SGC-7901 stanice uzgajaju se u kondicioniranim medijima iz CAF-a transficiranog ili mR-149 mimikom ili NC mimikom, ili NF transficiranim bilo anti-miR-149 ili anti-NC u konačnoj koncentraciji od 100 nM. (C) Učinak miR-149 na proliferaciju GC stanica procijenjen testom formiranja kolonija. Stanice SGC-7901 uzgajane su u naznačenim kondicioniranim medijima, a broj kolonija izbrojan je 14 dana nakon sadnje. (D) Reprezentativne slike migracijskih ili invazivnih stanica na membrani (uvećanje 100 ×). (E) Prosječan broj migracijskih ili invazivnih stanica izbrojanih iz D. (F) Tumori dobiveni iz SGC-7901 stanica pomiješanih s različitim fibroblastima (CAF transficiran agomir-149 ili agomir-NC, NF transfektiran s antagomir-149 ili antagomir-NC) i ubrizgavan potkožno u gole miševe. Tumori su izolirani 28 dana nakon injekcije. (G) Kinetika rasta tumora kod golih miševa. Izmjerljeni su promjeri tumora i izračunate su količine svake 7 dana. (H) Prosječna težina tumora golih miševa. (I) Reprezentativne slike uzoraka tumora obojenih Ki-67 antitijelom golih miševa (uvećanje 200 ×). (J) Relativni indeks proliferacije od I. Svi su podaci ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, t- test učenika.

Slika pune veličine

Da bi se dalje ispitala uloga miR-149 in vivo , goli miševi inokulirani su SGC-7901 GC stanicama zajedno s CAF-om ili NF-om koji su transficirani agomir-149 ili antagomir-149 ili njihovim odgovarajućim kontrolama. Kao što je prikazano na slici 2F-2H, miR-149 oponaša značajno inhibira rast tumora i opterećenje tumora u skupini koja je ubrizgana s GC stanicama i CAFs, dok inhibitori miR-149 značajno povećavaju rast tumora i opterećenje tumora u skupini koja je ubrizgana zajedno s GC stanice i NF. Status proliferacije stanica u tumorima provjeren je analizom markera proliferacije Ki-67. Stopa proliferacije pozitivnih stanica za Ki-67 dramatično je smanjena miR-149, dok je značajno povećana inhibitorom miR-149 (Slike 2I i 2J). Uzeto zajedno, naši rezultati pokazuju da je miR-149 važan negativan regulator aktivnosti pro-tumorigeneze CAF-a i in vitro i in vivo .

CAF-ovi poboljšavaju prijelaz epitela-mezenhima i stanična svojstva GC-stanica na miR-149-IL-6 ovisan način

Budući da CAF-ovi potiču prijelaz epitela u mezenhim (EMT), koji metastatskom i samoobnavljanju daje stanice raka 36, i dijeljenje matičnih stanica tijekom tumorigeneze 37, pretpostavili smo da razina miR-149 u CAF-ima može utjecati na EMT stanica GC, Da bi se dokazala ova hipoteza, GC stanice su tretirane s kondicioniranim medijima iz CAF-a i NF-a, a ekspresija markera epitelijskih stanica E-kadherina i mezenhimalnih staničnih markera N-kadherina, Vimentina i Puža analizirana je u GC stanicama. Kondicionirani medij CAF-a, ali ne onaj iz NF-a, inducirao je promjenu EMT markera na razini mRNA (Slika 3A). IL-6 neutralizirajući antitijelo blokiralo je CAF kondicionirani medij-induciranje promjene ekspresije EMT markera, dok je IL-6 dodijelio NF kondicioniranom mediju sposobnost induciranja EMT, sugerirajući da je IL-6 presudan u ovom procesu (slika 3A), Zatim smo uzgajali stanice SGC-7901 u različitim kondicioniranim medijima iz CAF-a koji su bili transficirani bilo mR-149 mimikom ili kontrolom i ispitivali ekspresiju EMT markera i na razini mRNA i proteina. miR-149 suzbijao je CAF-inducirani EMT stanica GC, a supresiju je spasio IL-6 (slike 3B i 3C). Rezultati kulture stanica SGC-7901 pomoću kondicioniranog medija iz NF-a koji su transficirani bilo miR-149 inhibitorima ili kontrolom, nadalje su podržali ulogu miR-149 i IL-6 u EMT-u induciranom od CAF-a (slika 3D i 3E). Nadalje, ovi rezultati potvrđeni su imunofluorescentnom detekcijom EMT markera u stanicama SGC-7901 kultivirane u različitim kondicioniranim podlogama (slike 3F i 3G).

Image

miR-149 inhibira EMT GC stanica putem IL-6. (A) Relativne mRNA razine EMT markera (E-kadherin, N-kadherin, Vimentin i puž) u SGC-7901 uzgajane u CM iz CAF ili NF u prisutnosti ili odsutnosti IL-6 ili IL-6 antitijela kako je naznačeno kvantificirano je qRT-PCR. (B) Relativne razine mRNA EMT markera u SGC-7901 uzgojenom u CM iz CAF NC ili CAF miR-149 u prisutnosti ili odsutnosti IL-6, kako je naznačeno, kvantificirane su qRT-PCR. (C) Razine proteina EMT markera u SGC-7901 uzgojenom kao u B analizirane su Western blottingom. (D) Relativna mRNA ekspresija EMT markera u SGC-7901 kultivirana u CM iz NF anti-NC ili NF anti-miR-149 u prisutnosti ili odsutnosti IL-6 antitijela kako je naznačeno kvantificirano je qRT-PCR. (E) Razina proteina EMT markera u SGC-7901 uzgojenom kao u D otkrivena je zapadnim blotiranjem. (F, G) Imunofluorescentna analiza provedena je u SGC7901 uzgojenom u CM kao što je naznačeno u B ili D s antitijelima za E-kadherin (zelena), Vimentin (crvena) i DAPI (plava), (uvećanje 400 ×). Svi su podaci ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, t- test učenika.

Slika pune veličine

Matične stanice karcinoma (CSC) smatraju se TIC-ovima koji pokreću stvaranje tumora, a uloga stromalnog tumora IL-6 u promicanju "stabljike" stanica raka je utvrđena 38 . GC TIC obogaćeni su stanicama 40 aldehid dehidrogenaze visoke i bočne populacije (SP) 40 . Stoga smo istražili mogu li CAF-ovi povećati broj stanovnika obogaćenih CSC-om. Kultivirali smo GC stanice s različitim kondicioniranim medijima od CAF-a i NF-a, transficirane miR-149 mimikom, miR-149 inhibitorima ili njihovim odgovarajućim kontrolama, a zatim kvantificirali ALDH-pozitivne ili SP stanice u GC stanicama protočnom citometrijom. Proporcije stanica s visokim razinama ALDH visokih i SP stanica modulirane su različitim uvjetovanima. Kao što je prikazano na slici 4A, uvođenje miR-149 u CAF smanjio je visoki udio ALDH stanica karcinoma uzgajanih u kondicioniranom mediju iz CAF-a, a to je spasilo dodatkom IL-6. Suprotno tome, anti-miR-149 pojačao je visoki udio ALDH stanica karcinoma uzgajanih u kondicioniranom mediju iz NF-a, a to je preokrenulo IL-6 neutralizirajući antitijelo (Slika 4C). Primjećen je sličan učinak na distribuciju stanica karcinoma SP (Slika 4B i 4D). Ispitali smo i učinke kondicioniranog medija iz fibroblasta s manipuliranom razinom miR-149 na formiranje sfere GC stanica. Kao što je prikazano na slikama 4E i 4F, visoke razine miR-149 u CAF-ima negativno su utjecale na formiranje i rast GC staničnih sfera, a to je spašeno suplementacijom IL-6, dok je prisutnost anti-miR-149 u NF-ima pojačan učinak koji se može suzbiti IL-6 neutralizirajućim antitijelom. Ovi rezultati pokazuju da miR-149 u CAF-ima ili NF-u ima neizravan učinak na proliferaciju CSC-a ili CSC-sličnih stanica.

Image

miR-149 inhibira matične karakteristike GC stanica putem IL-6. (A) Aldeflour test protočnom citometrijom ALDH visokih stanica u SGC-7901 stanicama uzgojenim u CM iz CAF NC ili CAF miR-149 u prisutnosti ili odsutnosti IL-6 kako je naznačeno. Prikazana je reprezentativna protočna citometrička analiza. (B) Stanice bočne populacije (SP) u stanicama SGC-7901 kultivirane kao u A izmjerene su protočnom citometrijom. SGC-7901 stanice obojene su Hoechst 33342 bojom u prisutnosti (gornja ploča) ili u odsutnosti (donja ploča) verapamila. Prikazana je reprezentativna protočna citometrička analiza. (C) ALDH visoke stanice u stanicama SGC-7901 uzgajane u CM iz NF anti-NC ili NF anti-miR-149 u prisutnosti ili odsutnosti IL-6 antitijela kako je naznačeno protočnom citometrijskom analizom. (D) SP stanice u SGC-7901 stanicama uzgajane su u CM kao u C i analizirane kao u B. (E) Reprezentativne slike tijela sfere u SGC-7901 stanicama uzgajane kao u A ili C (uvećanje 100 ×). (F) Stope formiranja sfere kvantificirane su. Svi su podaci ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, t- test učenika.

Slika pune veličine

PGE2 inducira epigenetsko prigušivanje miR-149 u fibroblastima

DNA hipermetilacija mnogih miRNA je u korelaciji sa smanjenom ekspresijom gena u tkivima tumora 41 . Identificirali smo područje H3K27ac obogaćeno 42 u regiji bogatom GC-om unutar −2 500 do 1 500 bp uzvodno od mjesta starta transkripcije miR-149 pomoću MethPrimer-alata i baza podataka (//www.urogene.org/methprimer) i podaci projekta ENCODE u UCSC pregledniku genoma (//goo.gl/6tDJ3v, Dodatne informacije, Slika S4A). Hipotetirali smo da smanjivanje miR-149 u CAF-ovima može biti povezano s hipermetilacijom ovog pojačivačkog područja. Metilacijski specifični PCR (MSP) i PCF (BSP) prajmeri za sekvenciranje bisulfita koji prekrivaju ovo područje dizajnirani su tako da otkriju status metilacije u CAFs i NFs. Analiza MSP pokazala je da je ovo područje hipermetilirano u CAF-ima u usporedbi s NF-om (Dodatne informacije, Slika S4B). Rezultati analize BSP pokazali su da je prosječna brzina metilacije CpG mjesta bila značajno veća u CAF-ima (51, 4% ± 8, 82%) nego u NF-ima (21, 8% ± 6, 11%; Slika 5A i Dodatne informacije, Slika S4C). Ovi rezultati sugeriraju da je hipermetilacija miR-149 promotora povezana s fenotipom CAF-a i može doprinijeti aktiviranju fibroblasta.

Image

Aktiviranje COX-2 / PGE2 H. pylori povećava epigenetsko prigušivanje miR-149. (A) Razine metilacije u području miR-149 bogatom CpG mjestima veće su u CAF-ima. Sekuliranje bisulfita je provedeno u 10 klonova za svaku staničnu liniju. Otvoreni krug: nemetilirano CpG mjesto; ispunjeni krug: metilirano CpG mjesto. Omjer metilacije sažet je u desnoj ploči. (B) razine miR-149 mRNA u CAF ili NF tretirane ili neobrađene PGE2 ili 5-Aza analizirane su qRT-PCR. 5-Aza smanjuje represiju miR-149, izazvanu PGE2. (C) Shematski graf 3'-UTR EP2 s pretpostavljenim mjestom vezanja miR-149. Mfe predviđa RNAhybrid je -16, 3 kcal / mol. (D) Relativna aktivnost luciferaze u fibroblastima koji se kofeficiraju reporterski vektor s divljim tipom ili mutantnim 3'-UTR mimicima EP2 i miR-149, inhibitorima ili kontrolama kako je naznačeno. (E) Skica karte PGE2 koja aktivira IL-6 do EP2 uklanjanjem miR-149, zajedničkog inhibicijskog faktora IL-6 i EP2. miR-149 cilja IL-6 i EP2 za suzbijanje NF-a (lijeva ploča). Vezujući se za EP2, PGE2 inducira hipermetilaciju i supresiju miR-149 što dovodi do derepresije IL-6 i EP2 (desna ploča). (F) PGE2 proizveden od SGC-7901 i GES-1 stanica sa ili bez infekcije H. pylori izmjeren je ELISA. (G, H) COX-2 mRNA i razine proteina u stanicama SGC-7901 i GES-1 kao u F. Razina mRNA i proteina analizirana je qRT-PCR odnosno Western blotting, respektivno. (I) PGE2 proizveden od stanica SGC-7901 i GES-1 sa ili bez infekcije H. pylori i u prisutnosti ili odsutnosti NS-398 (50 µmol / L, inhibitor COX-2) je izmjeren ELISA. (J, K) COX-2 mRNA i razine proteina u stanicama SGC-7901 i GES-1 kao u I. Razina mRNA i proteina analizirana je qRT-PCR odnosno Western blotting, respektivno. Svi su podaci ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, t- test učenika.

Slika pune veličine

PGE2 signalizacija je kritična za stvaranje IL-6 u stromi tumora i igra važnu ulogu u raku i upali 7, 13 . Pored toga, PGE2 promiče globalnu metilaciju u stanicama tumora 43 . Poštili smo da PGE2 može biti signal koji pokreće metilaciju miR-149 u fibroblastima. Da bismo testirali ovu mogućnost, analizirali smo ekspresiju miR-149 u NF-u kao odgovor na tretman PGE2 i potvrdili da PGE2 inducira DNK metilaciju miR-149 (dopunske informacije, slika S5) i dereguliranu miR-149 ekspresiju, dok je inhibitor metilacije DNA, 5-Aza, ukinuo je ovaj efekt (slika 5B).

PGE2 receptor, PTGER2, također je potencijalna meta miR-149

Otkrili smo da PGE2 receptor, prostaglandin E receptor 2 (PTGER2, podtip EP2), također sadrži sjeme podudaranja za miR-149 na svom 3'-UTR (slika 5C), a PGE2 može inducirati IL-6 ekspresiju u fibroblastima kroz EP2 44 . Stoga smo klonirali EP-div ili mutirani 3'-UTR fragment EP2 u vektor luciferaze pMIR-REPORT (Dodatne informacije, slika S6) i transficirali konstrukte zajedno s mimikom miR-149 ili miR-149 inhibitorom u fibroblaste, nakon čega slijedi test izvješća luciferaze. Relativna aktivnost luciferaze pMIR / EP2 -3'-UTR wt, ali ne i pMIR / EP2 -3'-UTR mut, značajno je potisnuta mimikom miR-149 u usporedbi s mimikom NC. Suprotno tome, miR-149 inhibitori pojačavaju aktivnost divljeg tipa, ali ne i aktivnost mutirajućeg izvještača (Slika 5D). Ovo ukazuje da bi EP2 mogao biti još jedna potencijalna meta miR-149. Stoga smo usporedili razinu ekspresije EP2 u CAF-ima i NF-u i otkrili da je ona veća u CAF-ima nego u NF-ima (dopunske informacije, slika S7A), a izraz EP2 može se regulirati miR-149 (dopunske informacije, slika S7B). Nadalje, primijetili smo i veću razinu ekspresije EP2 u stromi tumora u usporedbi s normalnom stromom para-tumora u kliničkim uzorcima (dopunske informacije, slika S8).

Uzeti zajedno, naši podaci sugeriraju pro-tumorski signalni mehanizam pomoću kojeg stromalni PGE2 inducira IL-6 ekspresiju kroz EP2 potiskujući zajednički inhibitorni faktor, miR-149 (Slika 5E). miR-149 cilja IL-6 i EP2, smanjujući njihovu ekspresiju u fibroblastima. PGE2 se veže na EP2 i inducira hipermetilaciju i supresiju miR-149, preokrenuvši depresiju IL-6 i EP2 ekspresije.

Infekcija H. pylori aktivira signalizaciju COX-2 / PGE2 u stanicama epitela želuca

Infekcija H. pylori može uzrokovati gastritis s kronično upalnom stromom, a infekcija je prepoznata kao glavni uzrok raka želuca 45 . Pored toga, put COX-2 / PGE2 aktivira se nakon infekcije H. pylori 46, 47 . Stoga smo hipotetirali da infekcija H. pylori može izazvati zloćudnu transformaciju stanica epitela želuca, što dovodi do protuupalnog odgovora i posljedično disfunkcije miRNA u fibroblastima, što zauzvrat potiče razvoj tumora. Inficirali smo stanice H. pylori i otkrili da ona inducira lučenje PGE2 značajno više u stanicama GES-1 želučanog epitela nego u stanicama SGC-7901 (Slika 5F). Slično tome, infekcija H. pylori inducirala je ekspresiju COX-2 i na razini proteina i mRNA u GES-1 (Slika 5G i 5H). Koristili smo inhibitor COX-2, NS-398 i potvrdili da on može blokirati lučenje PGE2 u obje stanične linije (Slika 5I). Pored toga, ekspresija COX-2 na razini mRNA i proteina također je inhibirana NS-398 i u stanicama GES-1 i SGC-7901 sa ili bez infekcije H. pylori (Slike 5J i 5K). Ovi rezultati pokazuju da infekcija H. pylori može aktivirati put COX-2 / PGE2 u većoj mjeri u stanicama epitela želuca nego u stanicama GC.

Infekcija H. pylori inducira hipermetilaciju i smanjivanje mmu-miR-149 u mišjim fibroblastima in vivo

Pokazalo se da je infekcija H. pylori sposobna inducirati metilaciju prigušivanjem metilacije što može biti faktor rizika za GC 48, 49 . Naši gornji rezultati povećali su mogućnost da infekcija H. pylori može aktivirati COX-2 / PGE2 signalizaciju, što zauzvrat potiskuje miR-149 ekspresiju putem aberantne metilacije DNA. Da rekapituliramo razvoj ljudskog GC na životinjskom modelu i da istražimo utječe li H. pylori na hipermetilaciju i ekspresiju miR-149 gena in vivo , izveli smo intragastričnu primjenu H. pylori u miševa. Razvoj gastritisa i GC kod miševa potvrđen je obojenjem hematoksilinom i eozinom (Dodatne informacije, Slika S9B). Budući da mišji IL-6 gen također sadrži sjemensku šibicu za Mir-149 (mmu-miR-149; Slika 6A), izveli smo slično ispitivanje opisano na slici 1 da potvrdimo da miR-149 također cilja IL-6 u miša (Slika 6B i Dodatne informacije, slika S9A). Fibroblasti iz želuca kontrolnih i H. pylori inficiranih miševa su izolirani i uzgojeni (Slika 6C). U tim stanicama, razina ekspresije Fap bila je viša u mišjim CAF-ovima (mCAFs) i mišjim gastritisom povezanim fibroblastima (mGAFs) nego u mišjim NF-ima (mNFs; Dodatne informacije, Slika S9C). Pored toga, razine miR-149 bile su niže, a razine sekrecije IL-6 veće u mCAFs i mGAFs nego u mNFs (Slika 6D i 6E).

Image

miR-149 se epigenetički utišava u fibroblastima iz mišjeg želuca koji je inficiran H. pylori . (A) Shematski graf 3'-UTR IL-6 sa pretpostavljenim veznim mjestima mmu-miR-149. Mfe predviđa RNAhybrid je -16, 5 kcal / mol. (B) Aktivnost luciferaze u stanicama kofeficirana reporterski vektor s divljim tipom ili mutantnim IL-6 3'-UTR i mmu-miR-149 mimikom ili inhibitorima kako je naznačeno. (C) Shema za miševe zaražene H. pylori . Mišji normalni fibroblasti (mNFs), mišji gastritis povezani fibroblasti (mGAFs) i fibroblasti povezani s rakom miša (mCAFs) izolirani su iz kontrolnog i H. pylori- inficiranog želuca miševa i uzgajani. (D) Razine ekspresije mmu-miR-149 u mNFs, mGAFs i mCAF su određene qRT-PCR. (E) IL-6 izlučen u medij mNFs, mGAFs i mCAF je izmjeren ELISA. (F, G) Razine metilacije u CpG mjestima miR-149 veće su u mCAF i mGAF nego u mNF. Sekuliranje bisulfita je provedeno u 5 klonova iz svake stanične linije. Stope metilacije sumirane su u G. Svi su podaci ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, t- test učenika.

Slika pune veličine

Nakon toga, analizirali smo mišje ENCODE podatke i identificirali područje bogato CpG mjestima između -2 200 i -1 750 bp uzvodno od mmu-miR-149 koji se čuva u ljudima (//goo.gl/mqQu79, Dodatne informacije, Slika S9D). BSP analiza pokazala je da su razine metilacije DNA oko te lokacije bile značajno veće u mCAFs (45% ± 3, 7%) i mGAFs (47, 3% 2, 1%) nego u mNFs (8, 3% ± 2, 9%; Slika 6F i 6G, Dodatne informacije, Slika S9E). Ovi rezultati sugeriraju da će infekcija H. pylori vjerovatno potaknuti pro-tumorska svojstva stromalnih fibroblasta in vivo prigušivanjem mmu-mir-149 i stimuliranjem proizvodnje IL-6.

Rasprava

Iako CAF-ovi sami po sebi nisu zloćudni, oni igraju ključnu ulogu u unakrsnom razgovoru između tumorskih stanica i njihovog mikrookoline kako bi podržali rast tumora 1, 37 . U ovom smo istraživanju identificirali miR-149 kao kritični faktor za transformaciju NF-a u CAF u GC. Pokazali smo da infekcija H. pylori aktivira COX-2 / PGE2 put, što dovodi do hipermetilacije miR-149 promotora i represije miR-149 u fibroblastima čovjeka i miša in vitro i in vivo . Regulacijom ekspresije IL-6, supresija miR-149 potiče protumorsku aktivnost CAF-a inducirajući EMT i stabljike u GC stanicama.

miRNA su uključene u aktivaciju fibroblasta, pa su predložene kao most u nastajanju koji povezuje infekciju H. pylori s GC 25, 50 . Povećavanje i smanjivanje ekspresije miR-149 povezano je s nekoliko vrsta karcinoma 51, 52, 53, 54, 55 . Moguće je postojanje profila miRNA specifičnih za različite karcinome, pa čak i za određene subpopulacije stanica istog karcinoma. Pokazali smo da je miR-149 značajno smanjen u CAF-ovima iz humanih GC tkiva i miševima inficiranim H. pylori (Slike 1 i 6), slično razinama prijavljenim u CAF-u dojke 27 . Ovo upućuje na postojanje zajedničkog mehanizma koji je temeljio na regulaciji CAF-a kod različitih vrsta karcinoma, što je dodatno podržano povećanjem proizvodnje IL-6 od strane CAF-a pokazano u ovoj studiji (Slika 2) i u drugim izvještajima 17, 18, 19, 20, 21 .

Citokin IL-6 potreban je za razvoj karcinoma povezanih s upalom 16, 56 . Sve veći dokazi snažno ukazuju na činjenicu da je IL-6 uobičajeni upalni faktor koji izlučuju CAF iz različitih izvora 3, 15, 16, 17, 18, 56, 57, 58 . Nedavna studija pokazala je da se CAF aktiviraju u početnoj neoplaziji i doprinose upali koja potiče tumor na način ovisan o NF-kB3. U ovom procesu, NFκB djeluje kao bitni pozitivni regulator IL-6. U ovom istraživanju pokazali smo da je miR-149 snižen u CAF-ima i da djeluje kao negativni regulator ekspresije IL-6 (Slika 1). Blokiranje signala IL-6 upotrebom neutralizirajućih antitijela ima sličan negativan učinak na reguliranje miR-149 na aktivaciju fibroblasta i sposobnost CAF-a koji potiče tumor, dok se inhibicijski učinak miR-149 može preokrenuti dodatkom IL- 6 (slike 1 i 2). Naši rezultati pokazuju da miR-149 igra važnu ulogu u aktiviranju NF-a i održavanju CAF-a regulacijom ekspresije IL-6, sugerirajući da epigenetske promjene mogu voditi koevoluciju malignih stanica i CAF-a. Tijekom pripreme ovog rukopisa, pronađeno je i da se miR-149 u regulaciji hondrocita s osteoartritisom smanjuje i on je povezan s povećanom ekspresijom upalnih citokina, uključujući IL-6 59 . Štoviše, IL-6 je važan regulator ekspresije miRNA 60 . Prema tome, IL-6 može biti oslonac miR-posredovane upale u mikrookolju tumora.

Tumorske stanice utječu na izlučivanje IL-6 stromalnim stanicama u mikrookolju tumora putem mezenhimskih matičnih stanica (MSCs) izvedenih PGE2 7 . PGE2 koji vodi MSC djeluje na autokrini način da inducira proizvodnju IL-6, koji zajedno s PGE2 djeluje na parakrinski način na tumorske stanice kako bi izazvao EMT i povećao CSC populaciju 7 . U ovom istraživanju, proizvodnja PGE2 izazvana je infekcijom H. pylori u stanicama epitela želuca (Slika 5F-5I). Priroda H. pylori -pozitivnog GC sugerira da tumorske stanice potječu iz malignih transformiranih stanica želučanog epitela, a pokazalo se da infekcija H. pylori inducira stvaranje CAF-a kod miševa 15 . Stoga naši rezultati podržavaju ideju da bi neoplastični PGE2 mogao biti okidač ili rani signal za započinjanje transformacije NF-a u CAF-ove 10 .

DNA hipermetilacija mnogih miRNA korelirana je sa smanjenom ekspresijom gena u tkivima tumora 61 . DNK hipermetilacija miR-149 otkrivena je u kolorektalnom karcinomu 62 . U ovom istraživanju pokazali smo hipermetilaciju regije koja je bogata GC-om uzvodno od mjesta miR-149 transkripcije u CAF-u iz GC tkiva, ali ne i iz NF-a (slika 5). Slučajno, PGE2 može inducirati hipermetilaciju miR-149 u fibroblastima (Slika S5) 43 . Iznenađujuće smo također otkrili da je PGE2 receptor, EP2, meta miR-149. Ovo ukazuje na postojanje petlje pozitivne povratne sprege u CAF-u u kojoj PGE2 pokreće hipermetilaciju miR-149 . Posljedično prigušivanje ekspresije miR-149 potiče PGE2 signalizaciju kroz derepresiju EP2. U ovoj studiji odnos između metilacije PGE2 i miR-149 (Slika 7) pojačava argument da je epigenetska modifikacija ključna za stvaranje i održavanje fenotipa CAF 30 .

Image

Shematski grafikon prikazuje uključenost miR-149 u interakciju između H. pylori- inficiranih stanica želučanog epitela i fibroblasta povezanih sa karcinomom želuca. Infekcija H. pylori inducira izlučivanje PGE2 staničnim epitelnim stanicama. Stromal PGE2 utišava miR-149 vjerojatno hipermetilacijom miR-149 . Tišina miR-149 uklanja suzbijanje njegovih ciljnih gena, IL-6 i EP2 , što dovodi do povišene razine IL-6 koji djeluje na fibroblaste da stimulira transformaciju NF u CAF. U međuvremenu, IL-6 izaziva agresivnija ponašanja malignih stanica želučanog epitela.

Slika pune veličine

Istražili smo ulogu infekcije H. pylori i miR-149 u mišjem modelu gastritisa i GC-a. Otkrivene su značajno niže razine miR-149 i odgovarajuće veće razine sekrecije IL-6 i u mCAF i mGAFs nego u mNFs (Slika 6). Nadalje, pokazali smo da infekcija H. pylori može aktivirati put COX-2 / PGE2 u stanicama epitela želuca. Izlučivanje PGE2 i ekspresija COX-2 nisu očigledno inducirane infekcijom H. pylori u stanicama GC SGC-7901, a mogu ih suzbiti COX-2 inhibitorom NS-398. To se može objasniti konstitutivnom aktivacijom COX-2 / PGE2 signalnog puta u zloćudnim epitelnim stanicama.

Razvoj tumora ovisi o presjeku između tumorskih stanica i strome tumora. Razumijevanje načina na koji tumorske stanice komuniciraju sa stromom dovest će do otkrića inovativnih načina terapijske intervencije. U ovom istraživanju pokazali smo da miR-149 modulira PGE2 i IL-6 signalizaciju u unakrsnom razgovoru između tumorskih stanica i strome tumora. Ovi nalazi osvjetljavaju mehanizam djelovanja aktivacijske petlje PGE2-IL-6 i dodatno ističu značaj ove petlje u tumorigenezi. Predlažemo da izlučivanje PGE2 uzrokovano infekcijom H. pylori iz epitelnih stanica ili iz tumorskih stanica potiče metilaciju miR-149 i naknadnu indukciju ekspresije ciljanog gena (IL-6) u stromalnim fibroblastima. Predložena je uloga miRNA kao senzornog signala pokrenutog infekcijom H. pylori na sluznici i epitelu 49 . Međutim, naši rezultati podržavaju ulogu miR-149 u stromalnim stanicama kao potencijalni signal pojačala koji je aktivirao H. pylori infekcijom. Prema tome, otkrivanje ili intervencija ekspresije miR-149 u stromi tumora može imati prognostičku ili terapijsku vrijednost u GC-u.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatne informacije, slika S1

    Identifikacija potencijalnih miRNA-ova specifičnih za želudac.

  2. 2.

    Dodatne informacije, slika S2

    Luciferazne konstrukcije repotera za divlji tip ili mutantni IL6 3′UTR.

  3. 3.

    Dodatne informacije, slika S3

    Oružani zrakoplovni organi imaju višu razinu FAP-a od NF-a.

  4. 4.

    Dodatne informacije, slika S4

    Otoci CpG oko promotorne regije miR-149 hipermetilirani su u CAF-u.

  5. 5.

    Dodatne informacije, slika S5

    PGE2 inducira DNA metilaciju miR-149 u fibroblastu.

  6. 6.

    Dodatne informacije, slika S6

    Luciferazni reporterski konstrukti za divlji tip ili mutant 3'UTR EP2 .

  7. 7.

    Dodatne informacije, slika S7

    Razine ekspresije EP2 u kliničkim uzorcima te u CAF-ima i NF-u.

  8. 8.

    Dodatne informacije, slika S8

    Razine ekspresije IL6 i EP2 u uzorcima kliničkih bolesnika.

  9. 9.

    Dodatne informacije, slika S9

    Otok CpG oko promotorske regije mmu-miR-149 hipermetiliran je u mGAFs i mCAFs razvijen od miševa zaraženih H. pylori .

    ( Dodatne informacije povezane su s internetskom verzijom rada na web mjestu Cell Research .)