Er inhibitor stresa smanjuje gubitak sluha i smrt dlakavih stanica kod cdh23erl / erl mutantnih miševa | stanična smrt i bolest

Er inhibitor stresa smanjuje gubitak sluha i smrt dlakavih stanica kod cdh23erl / erl mutantnih miševa | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Stanica kose
  • Neurološke manifestacije

Sažetak

Gubitak sluha jedno je od najčešćih senzornih oštećenja kod ljudi. Modeli mutiranih mišića pomogli su nam da bolje razumijemo mehanizme gubitka sluha. Nedavno smo otkrili da erlong (erl) mutacija gena kadherin23 ( Cdh 23) dovodi do gubitka sluha zbog apoptoze ćelija dlake. U ovoj studiji imali smo za cilj otkriti molekularne puteve uzvodno do apoptoze u stanicama kose kako bi se iskoristili učinkovitiji terapijski lijekovi od strategije anti-apoptoze. Naši rezultati sugeriraju da je stres na endoplazmatskom retikulu (ER) najraniji molekulski događaj koji dovodi do apoptoze stanica kose i gubitka sluha kod erl miševa. Također izvještavamo da bi ER inhibitor stresa, Salubrinal (Sal), mogao odgoditi napredovanje gubitka sluha i sačuvati ćelije dlake. Naši rezultati pružaju dokaz da terapije usmjerene na signalne putove u razvoju naprezanja ER sprečavaju apoptozu ćelija dlake u ranoj fazi i dovode do boljih ishoda od onih koje ciljaju niz čimbenike, poput degeneracije tipne veze i apoptoze.

Glavni

Protein kadherin 23 (CDH23) lokaliziran je u gornjem dijelu veze vrha u stanicama dlake, gdje djeluje kao ključna komponenta. 1, 2, 3 Kod ljudi, mutacije Cdh 23 uzrokuju nesindromnu autosomno recesivnu gluhoću (DFNB12) i Usherov sindrom tipa 1D, USH1D, karakteriziranu gluhoćom povezanu s retinitisom pigmentoze i vestibularnom disfunkcijom. 4, 5, 6 Kod miševa, Cdh 23 mutacije dovode do gubitka sluha sa ili bez vestibularne disfunkcije. 7, 8, 9 Nedavno smo identificirali novu točku mutacije (T208C) Cdh 23 i ovu mutaciju nazvali erlong ( erl ). 10 Cdh23 erl / erl miševi ( erl miševi) pokazali su se životinjskim modelima DFNB12. Prije smo pokazali da je apoptoza staničnih dlačica jedan od patoloških mehanizama koji dovode do gubitka sluha kod ovog mutanta. 10 Ovdje smo htjeli otkriti da je signalizacija ER stresa uzvodno, što vodi do apoptoze ćelija dlake kod miševa s erl mutacijom, te smo pokušali pronaći potencijalne terapeutske lijekove.

Poremećaj homeostaze endoplazmatskog retikuluma (ER) dovodi do nakupljanja nerazvijenih ili pogrešno sabranih proteina u ER lumen, što rezultira ER stresom. Nerazvijeni protein proteina (UPR) pokreće se nakon toga za ublažavanje ovog stresa i za vraćanje homeostaze ER, promičući adaptaciju stanica i preživljavanje. Suprotno tome, ako se stres produžuje ili ako adaptivni odgovor ne uspije, započet će se put apoptoze. 11, 12, 13 UPR se posreduje kroz tri ER transmembranskih receptora: protein kinaza ER-kinaza slična RNA (PERK); aktiviranje transkripcijskog faktora-6 (ATF6); i enzim 1 koji zahtijeva inozitol (IRE1). 11, 12, 13, 14 Uzvodno od ove mreže, protein proteina koji veže imunoglobulin koji povezuje ER kapepen djeluje kao glavni regulator razdvajajući se od luminalnih domena PERK, ATF6 i IRE1 i na taj način aktivira ove reakcijske stresne odgovore. Kao nizvodni signal, CCAAT / pojačivač koji veže protein-homologni protein (CHOP) smatra se vrlo osjetljivim pokazateljem stanja stresa ER, a njegova indukcija uglavnom potiče staničnu smrt. 11, 13

Nedavno istraživanje mutanata zebrefish otkrilo je da su Usher proteini, uključujući CDH23, formirali kompleks i zatim su se ponovno okupili u ER. 15 Defekti u Usher proteinima poremetili su složene tvorbe, inducirali oštećenja u trgovini proteinima i konačno pokrenuli ER stres i apoptozu. Dakle, blokiranje faktora pro-apoptoze stresa kod ER može smanjiti staničnu smrt mutanata zebrafish. 15 Budući da mutacija erl utječe na Cdh 23, isti gen koji uzrokuje USH1D kod ljudi, razumno je nagađati da bi protein ERL-CDH23 mogao pretrpjeti neispravan promet, izazivajući tako ER stres i dovode do apoptoze ćelija dlake i oštećenja sluha kod erl mutanta, U trenutnoj studiji testirali smo ekspresiju ER kapepena BiP i pro-apoptotičkog faktora CHOP u erl i kontrolnoj C57BL / 6 J (B6) mišjoj kohleji. Naši podaci pokazuju da su ER stres i UPR odgovor bili osnovni uzroci apoptoze u erl cochleae-u, a PERK signalizacija je pridonijela. Što je još važnije, ovdje izvješćujemo da mali molekularni spoj inhibitora stresa ER Salubrinal (Sal) može usporiti napredovanje gubitka sluha i smrti ćelija dlake kod erl miševa. Ovi rezultati nude potencijalnu terapiju za ljudski DFNB12 i eventualno štite vizualnu funkciju osoba s Usherovim sindromom.

Rezultati

CDH23 djelomično nije uspio doći do vrha snopa kose te su kokanizirani s BiP u subapskim regijama OHC-a kod erl miševa

Izmjerili smo raspodjelu CDH23 u kohlearnim vanjskim dlačicama (OHC) kod erl miševa i B6 miševa. Kod P4, protein CDH23 bio je specifično lokaliziran na vrhu OHC-a kod miševa B6, što je otkriveno konfokalnim 3D slikama, što ukazuje na lokalizaciju vršnih vrhova u stereociliji snopa kose (slika 1a). Suprotno tome, protein CDH23 lokaliziran iz stereocilije u jezgre OHC-a kod erl miševa. Dijelovi CDH23 proteina nisu uspjeli doći do vrha snopa kose i ostali su u citoplazmi OHC. Imunostanje je pokazalo da je BiP ER kapepena lakše detektiran u gotovo istoj regiji i kokaniziran citoplazmatskim CDH23 u OHC-ima erl miša na P6 (slika 1b), dok u citoplazmi B6 mišjeg OHC-a nije uočena specifična BiP signalizacija., Linijski grafikoni potvrdili su veću ekspresiju BiP-a i njegovu ko-lokalizaciju s CDH23 u erl OHC citoplazmi (slika 1c) u usporedbi s intenzitetom fluorescencije CDH23 i BiP.

Image

CDH23 ekspresija i ko-lokalizacija s BiP u erl mišjem kohleju. ( a ) Gornji i donji konfokalni odjeljci snopa i 3D rekonstrukcija konfokalnih slika (x63) otkrili su položaj CDH23 u B6 (veličina voksela 512 × 512 × 0, 045 µm 3 i ukupna zapremina 23, 2 × 23, 2 × 14, 9 µm 3 ) i erl (veličina voksela 1024 × 1024 × 0, 027 µm 3 i ukupna zapremina 27, 2 × 27, 2 × 27, 2 µm 3 ) OHC na P4. Kod B6 miševa, CDH23 protein je specifično lokaliziran na vrhu stereocilije OHC. OHC-i erl miševa pokazali su širok raspon CDH23 izraza (od stereocilije do jezgre). Oko jezgara nije pronađen CDH23 signal koji se može detektirati kod B6 miševa, dok su kod erl miševa detektirani mnogi spotovi CDH23 signala u ovom području ( n = 3 miševa po skupini). Šipke skale, 5 µm. ( b ) Položaj i ko-lokalizacija BiP i CDH23 u B6 i erl- cohleae na P6. Kohele B6 miševa pokazale su slabe BiP signale i jasne CDH23 signale, posebno na vrhovima OHC-a. BiP je visoko detektiran u OHCs, SG i StV erl miševa, a lokaliziran je s CDH23 u subapskim regijama OHC ( n = 3 miševa po skupini). Šipke skale, 50 μ m (lijevo); 20 μ m (desno). ( c ) Linijski grafikoni prikazuju dvodimenzionalne grafikone sirovih intenziteta fluorescencije bijelih strelica uvučenih u ploče s lijeve strane, kako je analizirao softver Image J. X -os predstavlja udaljenost (piksela) duž linije, a Y -os je intenzitet piksela. BiP signali su visoko eksprimirani u erl miševima i djelomično su se preklopili sa CDH23 signalima ( n = 3 miševa po skupini)

Slika pune veličine

PERK-ova ruka UPR-a aktivirana je u mišićima cohlea

ER-marker BiP bio je reguliran u unutarnjim ušima erl miša, u usporedbi s B6 miševima. U mjerenjima mRNA izolirane iz erl mišjeg cohleae, BiP je reguliran na P12, ali je reguliran na P30 (Slika 2a). Imunološko obojenje pokazalo je ne samo veću ekspresiju BiP-a u OHC-ima, već i da je BiP eksprimiran na višim razinama u stanicama spiralnog gangliona (SG) i u stria vascularis (StV) u erl- cochleae na P6 i P12 (slika 2b i c). U skladu s konfokalnim trodimenzionalnim slikama, BiP signali uglavnom su lokalizirani u citoplazmi OHC-a i tvore oblik šešira iznad jezgara OHC-a (slika 2b i c). ER-efekt naprezanja PERK-ova ciljna kinaza, fosforilirana alfa-podjedinica faktora eukariotske inicijacije (eIF2α), također je pokazala snažnu lokalizaciju u perinuklearnim regijama OHC-a u erl- kohleji (slika 3).

Image

BiP ekspresija u B6 i erl mišem kohleju. ( a ) Razine Bip mRNA u kohlijama B6 i erl miševa na P12 i P30. Razina Bip mRNA bila je značajno viša u erl miševima na P12, ali se smanjila na P30, u usporedbi s B6 cochleae. Stupci pogreške predstavljaju SEM (* P <0, 05, n = 3 miševa, t- test). ( b, c ) BiP je pokazao veće intenzitete u StV, SG i posebno u OHC-ima miševa erl , tvoreći šeširasti uzorak na vrhu jezgra OHC-a na P6 i P12. Analiza intenziteta linija otkrila je da su BiP signali izraženi u OHC području erl cochleae ( n = 4 miševa po grupi). Šipke skale, 50 μ m (lijevo); 20 μ m (desno)

Slika pune veličine

Image

Fosforilacija eIF2α u B6 i erl cohleae kod P30 . Imuno fluorescentno obilježavanje fosfo-eIF2α pokazalo je snažnu citoplazmatsku i perinuklearnu lokalizaciju u cohleae erl miševima. Analiza intenziteta crte duž strelice prikazane na ploči s lijeve strane otkrila je da su p-eIF2α signali izraženi u područjima OHC i stria vascularis (StV) i snažno su otkriveni oko jezgara u erl cochleae ( n = 3 miševa po skupina). Šipke za skaliranje, 50 μ m (gornja); 20 μ m (donja)

Slika pune veličine

Nizvodno od ruke PERK-a, pro-apoptotički faktor CHOP također je izražen na višim razinama u erl- cohleae (Slika 4). Na razini mRNA, Chop je održavao veći izraz u erl- cohleae u usporedbi s B6-cochleae na P12 i P30 (Slika 4a). Imunostanje obavljeno u istoj dobi pokazalo je da je CHOP visoko detektiran u OHC, SG i StV erl miševa i uglavnom je otkriven u perinuklearnim područjima OHC-a (slika 4b i c). Međutim, goli CHOP signal bio je prisutan u mišjim kahli B6.

Image

CHOP izraz u B6 i erl mišem kohleju. ( a ) Chop mRNA razina u cohleae B6 i erl miševa na P12 i P30. Razina Chop mRNA bila je značajno viša na P12 i P30 u erl- cohleae nego u B6-cohleae. Stupci pogreške predstavljaju SEM (* P <0, 05, n = 3 miševa, t- test). ( b, c ) CHOP je održavao veći intenzitet u stria vascularis (StV), spiralnom ganglionu (SG), posebno u perinuklearnom području između jezgre i snopa kose OHC-a kod erl miševa na P12 i P30 ( n = 3 miševa po skupina). Šipke skale, 50 μ m (lijevo); 20 μ m (desno)

Slika pune veličine

Poremećaj sluha zaštićen genima Chop i OHC u erl miševima

Da bismo dodatno potvrdili uključenost Chopa u apoptozu uzrokovanu ER stresom u erl miševima, koristili smo miševe s dvostrukim mutantima koji sadrže erl mutaciju u Cdh 23 genu i poremećaj u Chop genu. Inbredni miševi dobiveni su križanjem miševa Chop - / - s Cdh23 erl / erl miševima. Generirano je devet genotipova miševa koji imaju istu genetsku pozadinu (C57BL / 6): Cdh23 + / + Chop + / + ; Cdh23 + / + Chop +/– ; Cdh23 + / + sjeckani - / - ; Cdh23 + / erl Chop + / + ; Cdh23 + / erl Chop +/– ; Cdh23 + / erl Chop - / - ; Cdh23 erl / erl Chop + / + ; Cdh23 erl / erl Chop +/– ; i Cdh23 erl / erl Chop - / - . Dopunska slika 1 prikazuje genotipizaciju dvostruko mutantnih Cdh23 erl / erl Chop - / - miševa. Izmjerili smo sluh i citokohleograme Cdh23 erl / erl Chop - / - ; erl ( Cdh23 erl / erl Chop + / + ); i Chop - / - ( Cdh23 + / + Chop - / - ) miševi. U 10 tjedana, pragovi izazvani slušnim reakcijama mozga (ABR) u Cdh23 erl / erl Chop - / - dvostruko mutiranim miševima bili su značajno bolji od onih u erl miševima (slika 5a). Priprema površine obavljena u istoj dobi pokazala je manji gubitak OHC u Cdh23 erl / erl Chop - / - dvostruko mutiranim miševima u usporedbi s Cdh23 erl / erl miševima. Kod erl miševa prikazano je nekoliko mjesta gubitka OHC-a u bazalnom i srednjem zavoju, a nekoliko gubitaka OHC-a prikazano je u apikalnim okretajima kohelija. Međutim, kod Cdh23 erl / erl Chop - / - dvostruko mutiranih miševa, nije nađen gubitak OHC-a u cijeloj dužini kohleje (Slika 5b). Kvantitativno istraživanje pokazalo je da je srednji postotak gubitka OHC u miševima Cdh23 erl / erl Chop - / - bio značajno niži od onog u erl miševa (slika 5c).

Image

Sluh i očuvanje OHC kod Cdh23 erl / erl Chop - / - miševa. ( a ) ABR pragovi kod dvostruko mutantnih Cdh23 erl / erl Chop - / - miševa, Chop - / - miševa (Cdh23 + / + Chop - / - ) i erl miševa ( Cdh23 erl / erl Chop + / + ) na 8, 16 i 32 k Hz podražaja u 10 tjedana. Chop - / - miševi pokazali su normalnu razinu sluha. Miševi erl pokazali su oštećenje sluha tijekom svih podražaja. Cdh23 erl / erl Chop - / - dvostruko mutirani miševi pokazali su niže ABR pragove od erl miševa za vrijeme svih podražaja. Stupci pogreške predstavljaju SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 8 miševa, t- test). ( b ) Pripravci koji se nalaze u bazalnom, srednjem i apikalnom dijelu kohleje obojeni su za F-aktin u Cdh23 erl / erl Chop - / - miševima i erl miševima u 10 tjedana. Erl miševi pokazali su neke gubitke OHC-a u apikalnom skretanju i evidentne gubitke OHC-a u srednjim i bazalnim zavojima. Nije opažen gubitak OHC u cijeloj dužini Cdh23 erl / erl Chop - / - dvostruko mutantnih cohleae. Linija skale, 20 µm. ( c ) Prosječni postoci gubitka OHC-a u apikalnoj, srednjoj i bazalnoj regiji kohleje u Cdh23 erl / erl Chop - / - i erl miševima u 10 tjedana. Erl miševi pokazali su značajno veće postotke gubitka OHC-a od Cdh23 erl / erl Chop - / - miševa. Stupci pogreške predstavljaju SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 5 miševa, t- test)

Slika pune veličine

Sal je spriječio gubitak sluha kod erl miševa

Nakon primanja odgovarajućih tretmana, erl miševi u ispitivanju, vozilu i kontrolnim skupinama prošli su testiranje otoakustičke emisije ABR i izobličenja (DPOAE) u istoj dobi. ABR pragovi u ispitnoj skupini bili su značajno niži od onih u vozilu i kontrolnim skupinama kao odgovor na 16 (slike 6a i b), 8 i 32 kHz podražaji tona i klika (dopunska slika 2). Nije nađena značajna razlika između vozila i upravljačke skupine. Otoprotektivni učinak dodatno je potvrđen većim amplitudama DPOAE. U 8 tjedana, amplitude DPOAE u ispitnoj skupini bile su značajno veće pri visokim frekvencijama (dopunska slika 3a). U 12 tjedana, ispitna skupina pokazala je mnogo veće amplitude DPOAE na gotovo svim frekvencijama (slika 6c). U 16 tjedana, miševi u sve tri skupine pokazali su niže amplitude DPOAE, dok su amplitude test grupe ostale veće pri malim frekvencijama (dopunska slika 3b).

Image

Sal je poboljšao sluh kod erl miševa. ( a ) U 12 tjedana, miševi tretirani nosačem pokazali su mnogo više pragove ABR nego miševi koji su tretirani Salom kod 16-kHz podražaja. Obojene linije i strelice predstavljaju valne oblike praga. ( b ) 16-kHz-stimulirani ABR pragovi kod miševa tretiranih Salom bili su značajno niži od onih u DMSO i neobrađenih miševa od 4 (W) do 16 tjedana. Nije utvrđena značajna razlika između netretirane i DMSO skupine. ( c ) Amplitude DPOAE kod miševa tretiranih Salom bile su mnogo veće nego kod neobrađenih i miševa tretiranih sa DMSO u 12 tjedana. Nije utvrđena značajna razlika između netretirane i DMSO skupine. Stupci pogreške predstavljaju SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 5 po grupi, jednosmjerna ANOVA)

Slika pune veličine

Sal je zaštitio od OHC smrti kod erl miševa

Priprema kohlearne površine provedena je na erl miševima u ispitivanju, nosaču i kontrolnim skupinama u 12 tjedana. Umanjenje OHC-a bilo je očito u vozilu i kontrolnim skupinama, dok je gubitak OHC-a u testnoj skupini bio vrlo minimalan (slika 7a). U vozilu i kontrolnim skupinama uočeno je nekoliko značajnih uzastopnih mjesta gubitka OHC-a u bazalnim i srednjim zavojima, a neki gubici OHC-a zabilježeni su u vršnim okretima. Suprotno tome, miševi u ispitnoj skupini pokazali su samo male količine gubitka OHC-a u bazalnom krugu i rijetke gubitke OHC-a u srednjem zavoju. Srednji postotak gubitka OHC-a u ispitnoj skupini bio je značajno niži od onog u vozilu i kontrolnim skupinama (slika 7b). Nije nađena značajna razlika između vozila i upravljačke skupine.

Image

Sal je spriječio gubitak OHC u erl miševima. ( a ) Pripreme za cijelu montažu iz bazalnih, srednjih i apikalnih zavoja kohleje u neobrađenih, miševima tretiranim sa DMSO i Salima u 12 tjedana. U vozilu i kontrolnim skupinama opažen je gubitak OHC-a u bazalnom i srednjem zavoju, a takvi su gubici bili izraženiji u bazalnom zavoju. U apikalnom krugu, vozilo i kontrolne skupine pokazali su neorganizirane uzorke OHC-a, ali gotovo da nisu imali gubitka stanica. Ispitna skupina pokazala je male količine gubitka OHC-a u bazalnom i srednjem zavoju i normalan raspored u apikalnom zavoju. Linija skale, 20 µm. ( b ) Prosječni postoci gubitka OHC-a u apikalnoj, srednjoj i bazalnoj regiji kohleje kod miševa tretiranih Salom bili su značajno niži nego u neobrađenih i miševima tretiranih sa DMSO u 12 tjedana. Nisu primijećene značajne razlike između DMSO i netretiranih skupina. Stupci pogreške predstavljaju SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 4 po grupi, jednosmjerna ANOVA). ( c ) morfologija i subcelularne strukture OHC-om skeniranjem elektronskog mikroskopa iz bazalnih okreta kohleja neobrađenih i miševa koji su bili tretirani sa soli 12 tjedana. Neobrađeni miševi pokazali su gotovo potpuni gubitak OHC-a i blagi gubitak ćelija unutarnje dlake u bazalnom smjeru. Miševi tretirani Sal-om pokazali su mali gubitak OHC-a i gotovo normalan raspored snopova kose. Zvijezde obilježavaju gubitke OHC-a. Šipke skale, 10 μ m (lijevo); 1 μ m (desno)

Slika pune veličine

Skenirajući elektronski mikroskop korišten je za analizu OHC morfologije i subcelularnih struktura u 12 tjedana (Slika 7c). Slike su pokazale da neobrađeni erl miševi pokazuju gotovo potpuni gubitak OHC-a i ne primjećuju potkoničnu strukturu vlasi kose u bazalnom zavoju. Suprotno tome, miševi koji su tretirani Salom pokazali su male količine gubitka OHC-a i približno normalne rasporede snopova kose.

Sal supresirana ER stres izazvana apoptozom kod erl miševa

Geni i proteini koji su povezani sa stresom i apoptozom smanjeni su nakon Sal tretmana. Razine mRNA ekspresije gena BiP , Chop, kaspaza-3 i kaspaza-12 testirane su na P30 i 12 tjedana. Rezultati su pokazali da su Bip i Chop smanjeni u grupi Sal u odnosu na skupinu vozila na P30, a kaspaza-3 je smanjena u 12 tjedana (slike 8a i b). Međutim, nije utvrđena značajna razlika u ekspresiji gena kaspaza-12 (dopunska slika 4). BiP i cijepljeni protein kaspaza-3, izdvojen iz erl mišjeg kohleja u nosaču i ispitnim skupinama, izmjeren je Western blotom na P30. Rezultati su pokazali da su BiP i cijepljena kaspaza-3 mnogo manje obilni u cohlea tretiranom Sal-om nego u cohlea-tretiranom nosačem (Slike 8c). Nadalje, CHOP je imunološki označen u nosaču i ispitnim skupinama na P30. Rezultati su pokazali da su CHOP signali u OHCs, SG i StV u kohelama tretiranim DMSO izrazito oslabljeni tretmanom soli, a najznačajnija razlika u ekspresiji CHOP uočena je u perinuklearnim regijama OHC-a (slike 8d).

Image

Geni i proteini povezani sa stresom i apoptozom povezani sa stresom i apoptozom. ( a ) BiR i Chop mRNA sniženi su u miševima tretiranim Salom na P30. Međutim, nije utvrđena značajna razlika u razinama mRNA Caspase-3 (** P <0, 01, * P <0, 05, NS, nije značajno, n = 3, t- test). ( b ) U 12 tjedana, razine mRNA Caspase-3 bile su znatno snižene u miševima tretiranim Salom u usporedbi s miševima tretiranim sa DMSO; međutim, nisu utvrđene značajne razlike u nivoima mRNA BiP i Chop (** P <0, 01, * P <0, 05, NS, nije značajno, n = 3, t- test). ( c ) BiP i razgrađena proteinska kapaza-3 razina proteina u kohleji kod miševa tretiranih Salom bila je mnogo niža od one kod miševa tretiranih DMSO na P30. Pronađene su značajne razlike između DMSO i Sal-tretiranih miševa u njihovoj količini BiP i cijepljenoj kaspazi-3. Stupci pogreške predstavljaju SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, NS, nije značajno, n = 3, t- test). ( d ) CHOP signali su snažnije detektirani u OHCs, SG i StV miševa tretiranih DMSO, pokazujući visoku koncentraciju u perinuklearnom području između nukleusa i dlakavih snopova OHC-a, ali atenuiranu od Sal ( n = 3 miševa po skupini), Šipke skale, 50 μ m (lijevo); 20 μ m (desno)

Slika pune veličine

Rasprava

Kao nova mutacija gena Cdh 23, miševi erl mutirani pokazali su postnatalni početak gubitka sluha počevši od P27, koji je napredovao do potpune gluhoće od ~ P100. Ovo se smatra životinjskim modelom za ljudski DFNB12. 10 S obzirom na vremenski period od početnog pokretanja gubitka sluha do potpune gluhoće, ovi mutirani miševi idealni su alati za testiranje novih otoprotektivnih lijekova. Prethodno smo otkrili da erl miševi liječeni eritropoetinom i Z-VAD-FMK mogu biti značajno zaštićeni od smrti OHC-a i izbačeni od gubitka sluha blokiranjem puta apoptoze u erl miševima. 10, 16 U trenutnoj studiji, otkriveno je da je uzlazni odgovor apoptoze u erl- cochleae značajan za ER stres i UPR.

Pod nadzorom kontrole kvalitete ER, Golgijev kompleks može prenijeti samo pravilno presavijene proteine ​​i poslati ih do krajnjih odredišta, dok se rastvoreni ili pogrešno razgrađeni proteini zadržavaju u ER i na kraju razgrađuju proteolitičkim putem ili autofagijom ovisnim o ubikvitinu., 17, 18 Akumulacija i zgrušanih neiskrivljenih proteina u ER lumen povećava opterećenje ER i remeti ER homeostazu, što u konačnici dovodi do ER stresa. 19, 20 Pod blagom do umjerenom stimulacijom, ER stres je adaptivni i restorativni odgovor koji dovodi do adaptacije stanica. Suprotno tome, ako je stres izvan prilagodljive sposobnosti ER-a, zaštitna signalizacija prebacit će se na pro-apoptotičke odgovore. ER stres povezan je s patogenezom neurodegenerativnih bolesti, poput Alzheimerove bolesti i Parkinsonove bolesti, kao i s patogenezom stanične smrti, poput oštećenja bubrežnih tubula kod dijabetesa. 21, 22, 23 Kod mutanata zebrafish, neispravni CDH23 proteini u stanicama dlake nisu uspjeli prenijeti i pridonijeli stvaranju Usher proteinskih kompleksa, što dovodi do ER stresa. 15 Uzeto zajedno, ovi su nam rezultati pružili novi uvid u patološke mehanizme i potencijalne terapije senzorneuralne gluhoće. Koristeći životinjski model sisavaca, ispitivali smo da li se slični nedostaci u nakupljanju proteina i aktiviranje ER stresa događaju kod miševa s mutacijom Cdh 23.

Pružili smo dokaze da je dio proteina ERL-CDH23 pokazao nenormalnu lokalizaciju u OHC-u (od stereocilije do jezgre, slika 1a), ne uspijevajući doći do vrha snopa kose i tako doveo do smanjene migracije na vrhove vrhova. Nadalje, protein ERL-CDH23 u subapskom dijelu OHC ko-lokaliziran je s ER-kapepenom BiP (slike 1b i c). Pokazalo se da je BiP protein izrazito ekspresioniran u OHCs, SG i StV u erl cochleae na P6 i P12, a BiP mRNA je bila regulirana na P12, ali je regulirana na P30 (Slika 2). Uzimajući u obzir put UPR-a, ovi rezultati sugeriraju da je BiP disociran s ER transmembranskim receptorom, a zatim kombiniran s neispravnim CDH23 u ranoj fazi ovog odgovora. Nizvodno od ovog puta otkrivena je fosforilacija eIF2α u erl- cochleae (slika 3), a Chop mRNA i protein su regulirani na P12 i P30 (Slika 4). Ovi rezultati pokazuju da je aktivirana PERK ruka UPR-a. CHOP je bio ključni posrednik u trenutku kada je ER-stres izazvan UPR signalizacijom napredovao do apoptoze. 24, 25 Rezultati slušnog testa, površinske pripreme i brojanja OHC kod naših dvostruko mutiranih Cdh23 erl / erl Chop - / - miševa nadalje potvrđuju da bi brisanje Chop gena moglo djelomično zaštititi sluh i sačuvati OHC u miševa Mutacija Cdh23 erl / erl (slika 5). Uzimajući ove podatke zajedno s prethodnom studijom o indukciji gena povezanih s apoptozom u mišjim cohleae 10, predlažemo da je apoptoza događaj iza indukcije UPR-a, pri čemu je doprinos signalni put efektor PERK. Stoga smo odabrali PERK krak UPR-a kao terapeutski cilj.

Zanimljivo je primijetiti da CHOP ne predstavlja nuklearnu lokalizaciju u OHC-ima, kao što se očekivalo za faktor transkripcije (slike 4 i 8). Međutim, CHOP nema signal za nuklearnu lokalizaciju. Njegova interakcija s drugim faktorima transkripcije uzrokovanih stresom posreduje njenu nuklearnu lokalizaciju. 26 Stoga je moguće da je u OHC-u CHOP isključen iz jezgre zbog nepostojanja interaktivnih partnera transkripcijskih faktora. Također je objavljeno da stanice sa citoplazmatskom i nuklearno lokaliziranom CHOP daju različite profile ekspresije gena. Pokazano je da taj citoplazmatski CHOP inhibira migraciju, dok nuklearni CHOP uzrokuje zaustavljanje staničnog ciklusa G1. 27 U ovom erl modelu, posebno u OHC-ima, CHOP je lokaliziran u perinuklearnim regijama između nukleusa i vlasi kose OHC-a. OHC razvija polarizirani snop stereocilije koji je važan za mehanotransdukciju. 28 Mnogi proteini snopa kose prelaze prema snopu kose; stoga, spekuliramo da citoplazmatski CHOP može regulirati ekspresiju gena povezanih sa migracijom proteina. Daljnje je ispitivanje opravdano za CHOP-ove uloge, osim izazivanja apoptoze na degeneraciji i funkcionalnosti OHC-a.

Sal je mali molekularni spoj (480 Da) koji sprječava smrt stanica uslijed ER uzrokovane apoptozom stresa selektivnim inhibiranjem dephosforilacije eIF2α. 29 Studije pokazuju da Sal odolijeva staničnoj smrti uzrokovanoj stresom, poboljšava opstanak stanica i odgađa bolesti. 30, 31, 32, 33, 34 Naši testovi sluha potvrdili su našu hipotezu da Sal može zaštititi sluh inhibirajući ER-stres izazvanu apoptozu ćelija dlake u erl miševima. U prethodnom radu izvijestili smo da je progresivni gubitak sluha počeo kod P27 kod erl miševa. 10 U ovom istraživanju, već nakon 4 tjedna nakon rođenja, pragovi ABR izazvane poticanjem od 32 kHz u ispitnoj skupini bili su 10 dB bolji nego u kontrolnoj skupini i vozilu (dopunska slika 1b). U svim sljedećim vremenskim točkama, miševi koji su tretirani Salom pokazali su bolje ABR pragove pod svim podražajima. Pozivajući se na podudarnost između visokih i niskih frekvencija i na bazalno-apikalni gradijent bazilarne membrane, 35, 36, slušni testovi pokazuju da je smrt OHC-a specifično započela u bazalnim okretima, a zatim se proširila kroz cijelu kohleju, koja bi se mogla otkloniti tretmanom soli. Naše prethodne studije usmjerene na liječenje anti-apoptozom također su pokazale otoprotektivne učinke, 10, 16, ali Sal je pokazao produljeno trajanje (do 16 tjedana). Tijekom našeg histološkog pregleda primijetili smo značajne kontinuirane i izolirane gubitke OHC-a u vozilu i kontrolnim skupinama; za razliku od toga, miševi koji su tretirani Salom pokazali su samo male količine gubitka OHC-a (Slika 7). Ovaj rezultat daje dobru povezanost između naših anatomskih promatranja i funkcionalnih testova.

Nakon tretmana Sal-om, regulirana BIP i Chop mRNA smanjena je na P30, a kaspaza-3 smanjena je u 12 tjedana (Slika 8a), što ukazuje da su Bip i Chop bili pod utjecajem tretmana salom u ranoj dobi i da je kaspaza- Kasnije je utjecala 3 mRNA. Međutim, nađeno je da je cijepljeni protein kaspaza-3 (detektiran Western blot-om) Sal smanjen na P30. Naše cijepano antitijelo kaspaza-3 (Asp175) uspjelo je prepoznati veliki fragment (17 kDa) aktivirane kaspaze-3 koji je nastao uslijed cijepanja uz Asp175, ali nije bio u stanju da otkrije proteine ​​kaspaze-3 pune duljine. Ovi rezultati sugeriraju da je cijepanje kaspaze-3 blokirano na P30 tretmanom Sal. MRNA kaspaze-12 ostala je nepromijenjena na P30 i 12 tjedana (dopunska slika 4), što ukazuje da kaspaza-12 možda nije uključena u povratne informacije o tretmanu Sal. BiP proteini (detektirani Western blot) i CHOP proteini (detektirani imunološkanjem) također su bili regulirani nakon tretmana Salom (Slika 8). Ovi rezultati, zajedno s prethodnim podacima, 10 sugeriraju da se neispravni CDH23 akumulirao u ER, a zatim povećao opterećenje ER i uništio ER homeostazu, što dovodi do disocijacije BiP od PERK. Nizvodno regulirani CHOP doveo je do aktivacije kaspaze i apoptoze. Ako adaptivni UPR smanji opterećenje proteina u ER, tada će obnova sinteze proteina potaknuti opstanak stanica. U protivnom, ako sinteza proteina nadvlada obnovu proteostaze, doći će do smrti stanica. 37 Sal inhibira defosforilaciju eIF2α, koja inhibira sintezu proteina kada ga fosforilira PERK. Ova povećana fosforilacija eIF2α ograničava sintezu proteina (uključujući onu CDH23 i CHOP), ublažava opterećenje ER i potiče opstanak stanica. Nedavno su opisani potencijalni mehanizmi pro-apoptotičke funkcije nekontrolirane sinteze proteina tijekom ER stresa. 37, 38

Kao životinjski model DFNB12, erl miševi sa Sal tretmanom započeli su u ranoj dobi (počevši od P7) i pokazali su značajnu zaštitu sluha tijekom dugog trajanja (do 16 tjedana). Razmišljajući o signalnom putu apoptoze izazvane stresom, predlažemo da terapije koje ciljaju ovaj specifični signalni put mogu spriječiti gubitak ćelija dlake u ranoj fazi i postići učinkovitije i održive rezultate. Pacijenti s USH1D koji nose različite mutacije istog gena ( Cdh23 ) kao DFNB12 pokazuju kongenitalnu gluhoću i sljepoću nakon posta. Prema tome, pretpostavljamo da bi rano liječenje Salom moglo spriječiti oftalmičku disfunkciju u Usherovom sindromu, te tako istaknemo Salinu primjenu kao terapijskog sredstva u liječenju životinjskih modela Usher sindroma.

Zaključak

Ukratko, ova je studija prva koja je uzela u obzir da apoptoza izazvana stresom uzrokovana ER stresom ima ključnu ulogu u gubitku sluha i smrti dlakavih miševa s mutacijom Cdh23 . Sinteza proteina i povezani procesi sakupljanja proteina rani su molekularni događaji u ER stresu i apoptozi. Stoga se pogreške u sakupljanju proteina potaknute genetskim mutacijama trebaju smatrati najranijim terapijskim ciljem. Mnogo lijekova protiv stresa koji su odobreni od FDA (odobrenja za primanje hrane i lijekova) trenutno su dostupni na tržištu i stoga ih se može zamijeniti radi zaštite.

Materijali i metode

Eksperimentalni dizajn

Ovo istraživanje imalo je za cilj procjenu ER stresa izazvanog apoptozom ćelija dlake u mehanizmu gubitka sluha i smrti dlakavih stanica kod Cdh23 erl / erl mutantnih miševa. Mjerenja ER pokazatelja stresa provedena su između Cdh23 erl / erl mutantnih miševa, kontrolnih B6 miševa, kao i Chop gen knockout (C57BL / 6 pozadina) miševa. ER inhibitor stresa Salubrinal (Sal) sustavno se daje md mutiranima Cdh23 erl / erl intraperitonealnom injekcijom. Pokazatelji otpornosti na sluh, OHC rezervacija i ER testirani su između miševa koji su bili tretirani salom , vozilom i neobrađenim Cdh23 erl / erl miševima.

Miševi

Sve postupke koji uključuju miševe odobrio je Odbor za istraživanje životinja na Medicinskom fakultetu Sveučilišta Case Western Reserve (protokol R01DC009246). Svi su miševi eksperimentirani u istom okruženju i u svijetlo-mračnom krugu. Erl miševi prvo su smješteni u laboratoriju Jackson (Bar Harbour, ME, USA) prije nego je ovaj mutirani soj premješten na sveučilište Case Western Reserve. Miševi s Chop gen gena (C57BL / 6 pozadina) su uvedeni iz Jackson Laboratorija (broj dionice 005530). Homozigotni erl miševi ( Cdh23 erl / erl ) ukršteni su s mutantima homozigotnog Chop gena ( Chop - / - ), generirajući F1 s genotipom Cdh23 + / erl Chop +/– . Zatim je F1 ( Cdh23 + / erl Chop +/– ) ukršten sa F1 ( Cdh23 + / erl Chop +/– ) da bi se stvorilo devet genotipova miševa: Cdh23 + / + Chop + / + ; Cdh23 + / + Chop +/– ; Cdh23 + / + sjeckani - / - ; Cdh23 + / erl Chop + / + ; Cdh23 + / erl Chop +/– ; Cdh23 + / erl Chop - / - ; Cdh23 erl / erl Chop + / + ; Cdh23 erl / erl Chop +/– ; i Cdh23 erl / erl Chop - / - . Zatim smo odabrali homozigotni Cdh23 erl / erl Chop - / - , koji su presijecani i održavani kao inbred miša linija. Budući da su nokaut gena Chop i miševi mutacije erl potječu iz pozadine C57BL / 6, odabrali smo Cdh23 erl / erl Chop - / - , Cdh23 erl / erl Chop + / + ( erl miševi) i Cdh23 + / + Chop - / - ( Chop - / - miševi) za naše eksperimente.

Genotipiziranje za erl miševe prethodno je opisano. 10. Genotip za Chop - / - određen je polukvantitativnim PCR upotrebom sljedećih primera: oIMR3884-5′-ATGCCCTTACCTATCGTG-3 ′ (uobičajeno); oIMR3885 - 5'-AACGCCAGGGTTTTC CCAGTCA-3 '(mutantna naličje); i oIMR3886 - 5′-GCAGGGTCAAGAGTAGTG-3 ′ (divlji tip reversa). Reakcija toplinskog ciklusa izvedena je na sljedeći način: 94 ° C tijekom 3 minute, nakon čega slijedi 35 ciklusa na 94 ° C tokom 30 s, 61 ° C tijekom 1 minute, 72 ° C tijekom 1 minute i 72 ° C tijekom 2 minute. Divlji tip je pokazao jednu traku (544 bp), dok su heterozigoti pokazali dva pojasa (320 i 544 bp), a mutanti jednu traku (320 bp). Genotip za Cdh23 erl / erl Chop - / - određen je genotipiziranjem Cdh23 erl / erl i genotipizacijom Chop - / - .

Tretman soli

Erl miševi primili su različite tretmane intraperitonealnom injekcijom. Ukupno je 70 erl miševa podijeljeno u tri skupine bilo kojeg spola: ispitna skupina (tretirana sa Salom, 0, 5 mg kg -1, R&D ng Cat # 2347), skupina sa nosačima (tretirana jednakom količinom dimetilsulfoksida, DMSO) i kontrolne skupine (neobrađeno). Svi tretmani započeli su od postnatalnog (P) dana 7, s naknadnim injekcijama koje su se javljale svaki drugi dan prvih 12 tjedana, svaka 3 dana tijekom 2 dodatna tjedna, a zatim jednom tjedno tijekom trajanja pokusa. Doziranje soli odabrano je iz dvije skupine preliminarnih pokusa, koje su pokazale da je sigurna i slušno zaštitna. Početna dob liječenja odabrana je radi sprječavanja unošenja regulacije apoptotskog gena kod erl miševa otkrivenih u našem prethodnom radu. 10

PCR

Kohleje su brzo izolirane, a zatim je TRIzol (Invitrogen, Eugene, OR, SAD) korišten za ukupnu ekstrakciju RNA. Super-Skripta III sustav prvog sinteze (Invitrogen) korišten je za sintezu cDNA. Kvantitativni PCR izveden je s reagensom SYBR Green FAST Mastermix (QIAGEN, Germantown, MD, USA) na ABI 7300 sekvencijalnom sustavu za detekciju (Foster City, CA, USA). Sekvence temeljnih premaza navedene su u tablici. S1. Reakcija ciklusa izvedena je na sljedeći način: 95 ° C 10 min, 40 ciklusa 95 ° C tokom 15 s i 60 ° C 1 min, i konačno krivulja disocijacije od 95 ° C tokom 15 s i 60 ° C 15 a. Ekspresija gena izračunana je u odnosu na domaćinstvo gena GAPDH, a zatim je analizirana primjenom metode 2 -ΔΔCT . Polkvantitativna PCR provedena je korištenjem DNA motora (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) s gore opisanom reakcijom ciklusa.

Western blotting

Kohlije su lizirane pomoću ledeno hladnog RIPA pufera. Jednake količine proteina podvrgnute su SDS-PAGE i prenesene na PVDF (Bio-Rad) membranu. Nakon toga, PVDF membrana je blokirana 1 sat u 5% -tnom ECL-ovom osnovnom blokirajućem agentu, a zatim je inkubirana preko noći na 4 ° C s 1: 1000 razrijeđenim primarnim antitijelima: anti-BiP (Cell Signaling 3177, Danvers, MA, USA), anti- kaspaza-3 (stanična signalizacija 9661) i anti-β-aktin (Santa Cruz sc-130657). Nakon ispiranja s TBST-om, membrana se inkubira u sekundarnim antitijelima (1: 5000, kozji protu-zečji IgG, Santa Cruz sc-2054). Proteinske trake vizualizirane su korištenjem ChemiDoc MPImaging sustava (Bio-Rad) koji potiče od hemiluminiscencije.

Imunofluorescentno bojenje

Unutarnje uši su fiksirane u 4% paraformaldehidu (PFA) preko noći, a zatim dekalcificirane u 10% etilendiaminetetraoctenoj kiselini (EDTA). Nakon dehidracije u saharozi i ugrađivanja u tkivo OCT smrzavanog medija na -20 ° C, rezani su kontinuirani odsjeci od 6 µm. Ti se dijelovi permeabiliziraju u 0, 5% Triton X-100 u trajanju od 30 minuta, blokiraju u 3% BSA na sobnoj temperaturi, a zatim inkubiraju preko noći na 4 ° C s 1: 200 razrijeđenim primarnim antitijelima: anti-CDH23 (Santa Cruz sc -26338), anti-BiP (stanična signalizacija 3177), anti-CHOP (Santa Cruz sc-575), anti-eIF2a (stanična signalizacija 9722) i anti-fosfo-eIF2a (stanična signalizacija 3597). Sekundarna antitijela s razrjeđivanjem 1: 400 (magarac protiv zečjeg IgG, Invitrogen A31573; zečji anti-kozji IgG, Invitrogen A11078) dodani su u trajanju od 1 sata; presjeci su zatim obojeni s DAPI. Negativne kontrole (bez dodavanja primarnih antitijela) nisu pokazale obojenje.

ABR i DPOAE testiranje

Računalni sustav sa potencijalom sluha (Intelligent Hearing Systems, Smart-EP softver 3.30, Miami, FL, SAD) korišten je kao prethodno objavljen. 39 Ukratko, miševi su anestezirani, a njihova tjelesna temperatura održavana je na 37 ° C. Korištene su subdermalne elektrode za iglice. Elektroda za snimanje umetnuta je u vrh verzije lubanje; uzemljena elektroda je umetnuta u vrh nosa; a referentne elektrode bile su fiksirane u blizini svakog uha. Klik i pragovi tonova od 8, 16 i 32 kHz usmjereni su putem umetnute slušalice. ABR prag je identificiran kao najniža razina podražaja na kojoj su prepoznati jasni i ponovljivi valni oblici (slika 2a). Mjerenje DPOAE provodilo se za čiste tonove na frekvencijama u rasponu od 4, 4 do 20, 3 kHz pomoću Inteligentnog slušnog sustava (Smart EP 3.30 softvera). Učestalosti su dobivene s odnosom F2: F1 od 1, 22 i primarnim poticajem SPL od 65/55 dB.

Priprema površine i brojanje ćelija kose

Kao što smo prethodno opisali, 40 temporalnih kosti bilo je fiksirano u 4% PFA, a bazilarna membrana je zatim pažljivo secirana i izrezana u tri odvojena fragmenta: apikalni, srednji i bazalni okret. Fragmenti su permealizirani u 2% Triton X-100, obojeni u F-aktin s faloidinom (Invitrogen), i opaženi s fluorescentnim mikroskopom (Leica DM4500 B). Stanice kose računaju se kao prisutne ako su stanična tijela i snopovi kose u obliku slova V netaknuti.

Konfokalno 3D snimanje

Da bi se utvrdila lokalizacija CDH23 u OHC-ima, provedena je cijelokupna imuno obojanost bazilarnih membrana unutarnjeg uha 4-dnevnih miševa pomoću primarnog antitijela anti-CDH23 (Santa Cruz, sc-26338), sekundarnog zečjeg protu-kozjeg IgG, Invitrogen A11078, Alexa 488 (razrjeđivanje 1: 1000) i tada je obojen DAPI. Konfokalne slike snimljene su korištenjem konfokalnog mikroskopa Leica (Njemačka) SP8 s ciljanim uljem × 63 / 1, 4 NA i laserskom linijom 488 nm. Slikovni snimci stečeni veličinom voksela 512 × 512 × 0, 045 µm 3 i 1024 × 1024 × 0, 027 µm 3, ovisno o veličinama OHC-a, sve dekonvolucije su obrađene pomoću softvera Leica Application Suite X (LAS X, LASX).

Skenirajući elektronski mikroskop

Miševi su fiksirani s 2, 5% glutaraldehida, a zatim su cijele kohleje razdijeljene. Koštana kapsula, spiralni ligament i Reissnerova membrana pažljivo su uklonjeni kako bi se izložio čitav Cortijev organ. Nakon toga, uzorci su fiksirani u 1% osmijum tetroksidu (OsO4) 1 h tri puta i u 1% tiokarbohidrazidu (TCH) 1 sat dva puta (tehnika OTOTO). Uzorci su dehidrirani u nizu gradijentnih etanola, osušeni na kritičnoj tački pomoću CO 2, i na kraju presvučeni paladijom. Zatim su uzorci pregledani pod skenirajućim elektronskim mikroskopom visoke rezolucije (FEI Helios NanoLab 650, Njemačka).

Statistička analiza

Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Analiza je izvršena korištenjem softvera SPSS 18.0. Podaci su statistički analizirani koristeći jednosmjerne ANOVA i Studentove t- testove. P- vrijednosti <0, 05 smatrane su značajnim.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunski materijal

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)