Bitni, ali djelomično suvišni ulozi transkripcijskih faktora pou4f1 / brn-3a i pou4f2 / brn-3b u srcu u razvoju | stanična smrt i bolest

Bitni, ali djelomično suvišni ulozi transkripcijskih faktora pou4f1 / brn-3a i pou4f2 / brn-3b u srcu u razvoju | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Razvoj srca
  • Faktori transkripcije

Sažetak

Kongenitalne srčane mane doprinose embrionalnoj ili neonatalnoj letalnosti, ali zbog složenosti srčanog razvoja, molekularne promjene povezane s takvim oštećenjima nisu u potpunosti razumljive. Ovdje izvješćujemo da su faktori transkripcije (TF) Brn-3a (POU4F1) i Brn-3b (POU4F2) važni za normalan srčani razvoj. Brn-3a izravno potiskuje Brn-3b promotor u kardiomiocitima i posljedično, mutantna srca Brn-3a (KO) izražavaju povećana BrN-3b mRNA tijekom sredine gestacije, što je povezano s hiperplastičnim rastom povezanim s povišenim ciklinom D1, poznatim Brn-3b ciljni gen. Međutim, tijekom kasne gestacije, Brn-3b može surađivati ​​s p53 kako bi poboljšao transkripciju pro-apoptotičkih gena, npr. Bax, čime se povećava apoptoza i doprinosi morfološkim oštećenjima kao što su nekompaktiranje, prorjeđivanje stijenke ventrikula i septa i povećani kripti / pukotine, što može izazvati smrtonosnost Brn-3a KO mutananata ubrzo nakon rođenja. Unatoč tome, rana embrionalna letalnost u e9.5 dvostrukim KO (Brn-3a - / - : Brn-3b - / - ) mutantima ukazuje na bitne funkcije s djelomičnom redundancijom tijekom rane embriogeneze. Visoka očuvanost sisavaca i zebra (ZF) Brn-3b (87%) ili Brn-3a (76%) olakšala je upotrebu ZF embrija za proučavanje potencijalnih uloga u razvoju srca. Dvostruki morfijski zameci koji su ciljani morfolino oligonukleotidima na oba TF-a razvijaju značajne srčane mane (nepravilnosti u petlji i defekti ventila) što sugerira ključne uloge za Brn-3a i Brn-3b u srcima u razvoju.

Glavni

Srce je prvi funkcionalni organ koji se razvio tijekom embriogeneze i od presudne je važnosti za održivost organizma jer su prirođene srčane mane jedan od najčešćih uzroka smrtnosti fetusa i novorođenčadi. 1, 2 Srce u razvoju nastaje iz srčane mezoderme da formira primitivnu srčanu cjevčicu koja prolazi složen i visoko reguliran program koji uključuje ekspanziju, diferencijaciju, apoptozu i pregradnja (npr. Petlje i sepciju) kako bi tvorio potpuno funkcionalan četveročlani sisavac srce. 3 Takvi procesi su pod jakim nadzorom staničnih gena izraženih u različitim fazama razvoja srca 4, 5, 6, 7, 8, 9, a deregulacija ovog procesa može doprinijeti srčanim oštećenjima i embrionalnoj smrtonosnosti. 6, 9, 10, 11

Tkivno specifični faktori transkripcije DNA (TFs) su bitni regulatori ekspresije gena, a sudbina stanica i posreduju njihovi učinci aktiviranjem ili potiskivanjem brzine transkripcije ciljnog gena enzimom RNA polimerazom II. 12 TF-a igraju temeljnu ulogu u kontroli ključnih aspekata srčanog razvoja, na primjer, Nkx 2, 5 13 i dHAND potrebni su za diferencijaciju miokarda 14 i Sox4, NF-ATc i Msx1 / 2 za razvoj ventila. 15, 16, 17 U novije vrijeme identificirani su TF-ovi POU4F1 (Brn-3a) i POU4F2 (Brn-3b) u srcima u razvoju, ali njihove uloge nisu u potpunosti poznate. 18, 19

Brn-3a i Brn-3b pripadaju POU (Pit-Oct-Unc) homeodomenskim TF-ovima, karakterizirane visoko očuvanom POU DNA veznom domenom. Visoka homologija između vrsta (76% očuvanje zebrefish (ZF) i čovjeka Brn-3a i 87% za Brn-3b) sugerira važne i očuvane funkcije ovih proteina). Iako su izvorno izolirane iz neuronskih stanica, Brn-3a i Brn-3b su eksprimirani u različitim tkivima, uključujući srce. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Ovi srodni, ali različiti proteini kodirani su različitim genima 27, 28, ali dijele> 95% homologiju u POU domeni i zato prepoznaju i vežu se za slične elemente DNK u ciljani promotori gena. 19, 29, 30, 31, 32 Međutim, ovi TF-ovi mogu imati složene učinke na ekspresiju gena i sudbinu stanica, jer mogu izazvati slične učinke na neke ciljne gene, npr. Aktiviranje Hsp27 gena promotora 19, 33, 34, 35, ali imaju antagonistički učinak učinci na druge npr. apoptotički geni. U vezi s tim, drugi npr. Apoptotički geni. Brn-3a potiče preživljavanje i diferencijaciju neurona aktiviranjem neuronskih gena ( α -internexin, neurofilament, SNAP-25) ili anti-apoptotičkih gena (npr. Bcl-2 / Bcl-X L ), 36, 37, 38 koji su potisnuti ili bez utjecaja Brn-3b. 39, 40, 41, 42 Suprotno tome, Brn-3b pokreće staničnu proliferaciju aktivirajući transkripciju gena staničnog ciklusa, na primjer, ciklin D1 i CDK4. 43, 44 Štoviše, Brn-3a i Brn-3b imaju suprotan učinak na apoptotičke gene kada se koeksprimiraju s p53 TF. Ovaj protein supresor tumora, koji može posredovati različite stanične učinke, uključujući zaustavljanje staničnog ciklusa i apoptozu reguliranjem različitih ciljnih gena i utjecaja na sudbinu stanica, ovisi o interakciji s staničnim proteinima kao što su Brn-3a i Brn-3b koji komuniciraju s p53 putem sačuvana POU domena 45, 46, ali različito regulira ekspresiju gena p53. 47, 48 Na primjer, Brn-3a potiskuje transkripciju pro-apoptotičkih gena, Bax i Noxa s p53 24, 46, 49, ali surađuje s p53 da stimulira inhibitor staničnog ciklusa p21 cip1 / waf1 . 23, 24, 45, 49 Suprotno tome, Brn-3b sam po sebi potiče staničnu proliferaciju, ali ako se koeksprimira s p53, on surađuje s p53 na transaktiviranju pro-apoptotičkih gena kao što je Bax, povećavajući tako apoptozu. 18, 46

Budući da relativne razine TF-a Brn-3a i Brn-3b mogu promijeniti učinke p53 na sudbinu stanica u odnosu na preživljavanje i apoptozu, to će biti relevantno u srcu, koje ove TF-ove izražavaju u različitim uvjetima. Na primjer, i Brn-3a i Brn-3b su povećani u srcima odraslih miševa nakon ligacije koronarne arterije, ali pokazuju izrazitu lokalizaciju u odnosu na mjesto ozljede i ekspresiju p53 18, a Brn-3a se primarno izražava u preživjelim kardiomiocitima udaljenim od ozljede, budući da se Brn-3b povećava u cijelom srcu, ali je lokaliziran ekspresijom p53 na mjestu ozljede. Koekspresija Brn-3b s p53 korelira s povećanim pro-apoptotičkim Bax 18 i može biti potrebna za maksimalnu aktivaciju Bax i Noxa u ozlijeđenim kardiomiocitima, jer je shRNA za ciljanje Brn-3b dovoljna da spriječi pojačanu transkripciju nakon simulirane ishemije / reoksigenacije u primarnoj miociti neonatalnih ventrikularnih ventrikula (NRVM), 18 unatoč tome što je ekspresija p53 nepromijenjena.

Farooqui-Kabir i sur. 19 je također pokazao složen odnos između Brn-3a i Brn-3b u srcu u razvoju od povećanja BrN-3b mRNA u mišjim srcima Brn-3a (KO) tijekom sredine gestacije (e14.5) u korelaciji sa jastucima hiperplastičnog ventila i septumom, Srčani učinci tijekom kasne gestacije do danas nisu analizirani, ali zanimljivo je da svi homozigotni mutanti Brn-3a KO umiru do p0.5-p1 (dan nakon rođenja) i to se pripisuje oštećenom sisanju, uzrokovanom selektivnim gubitkom neurona u trigeminalu ganglija i mozak. 50 Međutim, prehrambeni deficit vjerojatno neće uzrokovati tako potpunu smrtnost KO mutanta tako brzo nakon rođenja. Stoga smo istražili mogu li gubici Brn-3a i povećani Brn-3b u mutiranim srcima pridonijeti smrtonosnosti nakon rođenja.

U ovom istraživanju pokazali smo da recipročna ekspresija između Brn-3a i Brn-3b u srcu u razvoju može biti rezultat Brn-3a koja represira Brn-3b promotor posebno u kardiomiocitima. Gubitak Brn-3a i povećanje regulacije Brn-3b mRNA u KO srcima korelira s povećanom transkripcijom poznatih ciljanih gena Brn-3b, ciklin D1 i Bax, iako je p53 ostao nepromijenjen. Mutirana srca su također pokazala pojačanu apoptozu povezanu s oštećenjima zbijanja i prorjeđivanje stijenke / septrije ventrikula neposredno prije rođenja. Ono što je važno, Brn-3a i Brn-3b mogu se djelomično nadoknaditi jedni drugima tijekom embrionalnog razvoja, jer dvostruki miševi koji mutiraju KO pokazuju ranu embrionalnu letalnost. Ispitivanja ZF embrija pokazala su da smanjenje i Brn-3a i Brn-3b upotrebom morfolino oligonukleotida (MO) uzrokuje upečatljive srčane abnormalnosti, uključujući neuspjeh u petlji i nedostatke dotoka u dovodu. Ovi rezultati sugeriraju složene i važne uloge ovih TF-ova u kontroli normalnog srčanog razvoja i funkcije.

Rezultati

Brn-3a potiskuje Brn-3b u kardiomiocite

qRT-PCR analiza korištenjem cDNA pripremljene iz RNA iz srca divljih vrsta (WT) pokazala je da je visoka Brn-3a mRNA u korelaciji s niskim Brn-3b bilo sredinom gestacije ili postnatalnim srcima, dok je smanjen Brn-3a povezan s povećanim Brn- 3b mRNA u fetalnim srcima (e17.5) slika 1a (i). Imunostanje je također potvrdilo lokalizaciju proteina Brn-3a i Brn-3b u dijelovima srca e18.5 WT (slika 1a (ii)), s jakim obojenjem u miokardu ventrikula.

Image

( a ) Rezultati kvantitativnog (q) RT-PCR korištenog za analizu mRNA koja kodira Brn-3a ili Brn-3b u mišjim srcima uzeta iz različitih embrionalnih (E) ili postnatalnih (P) srca. Prikazane vrijednosti su prilagođene za ukupnu varijabilnost RNA pomoću GAPDH generičkog domaćinstva, a slične promjene primijećene su i kod drugih gena za domaćinstvo, B2M i ACTN (nisu prikazani). Podaci predstavljaju srednju vrijednost i vrijednost SD iz vrijednosti od> 4 pojedinačna srca. (ii) Reprezentativne DAB imunološke boje koje prikazuju lokalizaciju proteina Brn-3a (gornja ploča) ili Brn-3b (donja ploča) u sekcijama fetusa (e18.5) WT mišjih srca. ( b ) (i) qRT-PCR podaci koji pokazuju nivo BrN-3b mRNA u srcima uzet iz Brn-3a KO-mutantnih zametaka i WT kontrola prilagođenih dobi na embrionalni dan, e14.5, e16.5 ili e18.5. Podaci predstavljaju srednje i SE5 neovisna srca svakog genotipa u svakoj vremenskoj točki. ** Predstavlja statističku značajnost, određenu t -testom s P <0, 05. (ii) Reprezentativne slike e16.5 embrionalnih presjeka srca uzetih iz WT ili Brn-3a KO zametaka nakon DAB imunološke boje za Brn-3b protein. ( c ) Rezultati novinarskih testova za analizu Brn-3b promotorskih aktivnosti u NRVM kulturama kada je kofeficirana Brn-3a i uspoređena s Brn-3b ili praznom vektorskom kontrolom (LTR). Aktivnost reporterskih gena luciferaze u obliku leptira prikazana je kao RLU, a varijacija u efektivnosti transfekcije podešena je pomoću interne kontrole, TK renila. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost i SE iz tri neovisna pokusa i ** Označava statistički značajne razlike <0, 05. RLU, relativna jedinica luciferaze; WT, divljih vrsta

Slika pune veličine

Analiza cDNA iz WT i KO srca u različitim embrionalnim vremenima pokazala je porast BrN-3b mRNA u Brn-3a KO srcima na e14.5, 19 koji je ostao povišen na e16.5, ali je smanjen u mutiranim srcima na e18.5, u usporedbi s WT kontrole usklađene s dobi (slika 1b (i)). Nije primijećena značajna razlika za Brn-3b u srcima Brn-3a +/− heterozygote i WT (podaci nisu prikazani). Imunološanjem se također potvrdilo povećanje proteina Brn-3b u srcima e16, 5 Brn-3a KO (Slika 1b (ii)).

Budući da promotorna sekvenca Brn-3b sadrži mjesta vezivanja oktamera prepoznata od samog Brn-3a ili Brn-3b, 51 testirali smo da li Brn-3a normalno represira Brn-3b u kardiomiocitima kako bi se računala uzajamna ekspresija u WT srcima i povećao Brn-3b u Brn-3a KO srca. Stoga su provedene studije ko-transfekcije u primarnim kulturama NRVM primjenom Brn-3b promotorske konstrukcije promotora i ekspresijskih vektora za Brn-3a, Brn-3b ili prazan vektor (vidi odjeljak Materijali i metode). Nakon 48 sati, za analizu aktivnosti promotora korišteni su dvostruki luciferazni testovi. Slika 1c pokazuje da Brn-3a značajno smanjuje Brn-3b promotorsku aktivnost u NRVM kulturama, u usporedbi s LTR kontrolom, dok Brn-3b nije imao utjecaja na vlastiti promotor, što sugerira da Brn-3a potiskuje Brn-3b u kardiomiocite.

Morfološke promjene u srcima mutiranim Brn-3a KO tijekom kasne gestacije povezane s apoptozom kardiomiocita

Budući da je povećani Brn-3b u srcima Brn-3a KO povezan s hiperplastičnim rastom u e14, 5, 19 analizirali smo mutantna srca u kasnijim razvojnim fazama kako bismo utvrdili mogu li srčane oštećenja pridonijeti neonatalnoj smrti. Analiza dijelova srca e18.5 obojenih hematoksilinom i eozinom (H&E) pokazala je dokaz smanjene zbijenosti miokarda, povećane trabekulacije i pojave kripti / pukotina miokarda u srcima Brn-3a KO u usporedbi s WT kontrolama koje odgovaraju dobi (Slika 2a). Mjerenja srčanih dimenzija u višestrukim, neovisnim odjeljcima e18.5 identificirali su promjene u duljini srca (od baze do vrha), ali ne i u širini (kroz obje komore) u mutiranim srcima u usporedbi s WT kontrolama koje odgovaraju dobi (Slika 2b). Mutantna srca su također pokazala značajno smanjenje debljine stijenke i septrije ventrikula, što sugerira da gubitak Brn-3a i / ili povećani Brn-3b utječu na veličinu srca.

Image

( a ) Reprezentativni bočni dijelovi srca obojeni H + E iz embriona e18.5 uzetih iz (i) WT ili (ii) Brn-3a KO mutanata. Slike su snimljene u × 2, 5 ili × 5 (okvir). ( b ) Srčane dimenzije su izmjerene u srčanim dijelovima uzetim iz Brn-3a KO ili WT kontrolnih srca na e18.5 koji su obojeni s H&E i zatim skenirani pomoću funkcije slikovnog dijapozitiva na Hamamatsu Nanozoomeru. Slike su analizirane pomoću softvera NDP view 2 za mjerenje širine srca (preko lijeve i desne komore), duljine (od baze do vrha), debljine stijenke desne ili lijeve komore (RV ili LV zid) i debljine septalne debljine. Prikazane vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost i SE mjerenja iz najmanje 5 neovisnih srca. H + E, hematoksilin i eozin; IVS, interventrikularni septum; LV, lijeva klijetka; RV, desna klijetka; Wt, divljeg tipa

Slika pune veličine

Povećani ciljni geni Brn-3b, ciklin D1 i Bax, u srcima Brn-3a KO

Poznati Brn-3b ciljni geni, kao što su ciklin D1 i Bax, mogu duboko promijeniti sudbinu stanica ako se ektopično eksprimiraju, pa smo sljedeći testirali je li povećani Brn-3b u srcima Brn-3a KO utjecao na ekspresiju takvih ciljnih gena. Stoga su ciklin D1 i Bax mRNA kvantificirali pomoću qRT-PCR, a lokalizacija proteina procjenjivana je imunološkim dijelovima srca iz Brn-3a KO-mutanta i WT srca koji odgovaraju dobi. Budući da transaktivacija mRNA obično prethodi povećanju funkcionalnog proteina potrebnog za pokretanje staničnih promjena, qRT-PCR je korišten za kvantificiranje nivoa mRNA na e16.5, dok je imunostainiranje za lokalizaciju proteina provedeno na srčanim dijelovima e17.5.

Rezultati qRT-PCR pokazali su značajno povećanu ciklinu D1 mRNA u srcima Brn-3a KO, u usporedbi s WT kontrolama (Slika 3a (i)), dok je imunostainiranje pokazalo široko povećanje ciklin D1 proteina u ventrikularnom miokardu Brn-3a KO odsjeka srca (Slika 3a (ii)) u usporedbi s nižim i ograničenijim izražajem u WT srcima (Slika 3a (iii)).

Image
Image

( a ): (i) Rezultati qRT-PCR koji pokazuju promjene u ciklinima D1 mRNA u srcima e16.5 WT ili Brn-3a KO. Vrijednosti su prilagođene genom za vođenje kućanstva, GAPDH i predstavljaju prosječnu vrijednost i SE od 4 do 4 neovisna uzorka. * Označite statistički značajne promjene pomoću t -test s P  0, 05. (ii) Reprezentativne imunološke boje proteina ciklin D1 u dijelovima srca iz e17.5 Brn-3aKO zametaka ili WT kontrola. Glavne slike srca snimljene su pri povećanju × 2, 5, dok su boksovi prikazani pri većem povećanju (× 10). ( b ): (i) Rezultati qRT-PCR koji pokazuju razine mRNA koja kodira Bax ili Noxa u WT (crna traka) ili Brn-3a KO (siva traka) u srcima e16, 5. Vrijednosti su prilagođene s kućnim genom, GAPDH, koji je amplificiran pomoću istih uzoraka cDNA i predstavljaju srednju vrijednost i SE od 3 do 4 neovisna uzorka. * Označava statistički značajne promjene (< P = 0, 05), koristeći t -test. (ii) Rezultati qRT-PCR koji pokazuju promjene u mRNA Brn-3b ili p53 u srcima uzetim od WT (crna traka) ili Brn-3a KO (stippled bar) na e16.5. Vrijednosti su prilagođene za čuvanje gena kuće, GAPDH i predstavljaju prosječnu vrijednost i SE od 3 do 4 neovisna uzorka. (iii) Reprezentativne slike srčanih sekcija iz e17.5 Brn-3aKO ili WT kontrolnih embrija, imunostaniranih za Bax protein. Slike cijelog srca snimljene su pri povećanju × 2, 5, dok su boksovi prikazani pri većem povećanju (× 10). ( c ) Reprezentativne slike koje prikazuju TUNEL bojenje u srcima e17.5, uzeto iz (i) WT kontrola ili (ii) Brn-3a KO zametaka. Tamno smeđe obojenje označava stanice sa pozitivnošću TUNEL. Slike cijelog srca snimljene su pri povećanju × 2, 5, dok su boksovi prikazani pri većem povećanju (× 10)

Slika pune veličine

Slične studije provedene su kako bi se analizirale promjene u pro-apoptotičkim Bax i Noxa, koje se mogu koregulirati Brn-3b i p53. Rezultati qRT-PCR pokazali su povećanu ekspresiju oba gena u Brn-3a KO srcima na e16.5, ali samo su promjene Bax-ove mRNA dostigle statistički značaj u usporedbi s WT kontrolama (Slika 3b (i)). Budući da je ekspresija p53 bila slična između Brn-3a KO i WT srca (Slika 3b (ii)), povišena Bax mRNA može biti potaknuta povećanim Brn-3b. Imunološanjem se potvrdilo povećanje proteina Bax u srcima Brn-3a KO, s izraženom lokalizacijom oko trabekuliranog miokarda (slika 3b (iii)).

Zatim smo procijenili apoptotske promjene u mutiranim srcima koristeći TUNEL (terminalno deoksinukleotidil-transferaza dUTP nick end označavanje) obojenje na srčanim dijelovima od e17.5 Brn-3a KO ili WT embriona. Slika 3c (i) prikazuje vrlo malo TUNEL-pozitivnih stanica u WT srcima, dok su Brn-3a KO srca prikazala veći broj TUNEL-pozitivnih stanica u stijenci ventrikula i septuma (Slika 3c (ii)), što sugerira da je veliki broj stanica bili podvrgnuti apoptozi u mutiranim srcima.

Gubitak i Brn-3a i Brn-3b uzrokuje ranu embrionalnu letalnost u miševa

Da bismo ispitali potencijalnu nadoknadu između Brn-3a i Brn-3b u srcu u razvoju, pokušali smo generirati dvostruke KO mutante križanjem heterozigotnih (Brn-3a - / + X Brn-3b - / + ) miševa. Budući da su mutanti Brn-3a KO umrli ubrzo nakon rođenja, dvostruki mutanti se nisu očekivali da prežive nakon rođenja, pa je genotipizacija provedena na leglima u različitim embrionalnim dobima. Tijekom dvostruke mutacije nisu oporavljeni dvostruki mutanti (e14.5), pa su kasnije studije analizirale legla u ranijim vremenima, tj. E9.5 i e8.5. Rezultati genotipizacije pokazali su da su pronađeni dvostruki heterozigoti i pojedinačni embrioni KO u očekivanom Mendelovom omjeru, ali nisu pronađeni dvostruki KO (- / -: - / -) mutanti i preživio je samo jedan mutant koji nedostaje tri alela (+/−: - / -) u ovim dobima (tablica 1). Važno je napomenuti da su veličine legla iz križa het / het na e9.5 također bile manje od prosjeka (4–6 zametaka), što sugerira da se dvostruki homozigotni ili trostruki alelni mutanti mogu izgubiti tijekom rane embriogeneze. Ovi podaci sugeriraju da embrionalni razvoj ne uspije ako su proteini Brn-3a i Brn-3b izgubljeni i ukazuju na bitne i djelomično preklapajuće uloge tih TF-ova tijekom rane embriogeneze.

Tablica pune veličine

Analizirajući Brn-3a i Brn-3b ekspresiju u srcu zebrafish (ZF)

Budući da se dvostruki KO mišji zametci nisu mogli oporaviti, nismo bili u mogućnosti analizirati postojanje srčanih abnormalnosti. Međutim, visoka homologija između ZF i sisavaca Brn-3a i Brn-3b nas dovodi do istraživanja prikladnosti ZF kao modela za proučavanje ovih TF-a. Rezultati qRT-PCR pokazali su porast razine BrN-3a mRNA (i) i Brn-3b mRNA (ii) u ZF embriju na 24–72 hpf (Slika 4a). Western blot analiza potvrdila je ekspresiju pojedinih proteinskih izoforma Brn-3a ili Brn-3b u odraslim srčanim ekstraktima ZF, u usporedbi s dvije izoforme opažene u mišjim srcima (pozitivna kontrola) (Slika 4b). Slični rezultati dobiveni su korištenjem proteinskih ekstrakata iz cijelih ZF embrija (nisu prikazani). Ovi rezultati pokazuju prikladnost antitijela za analizu ovih proteina u ZF.

Image

( a ) Rezultati qRT-PCR koji pokazuju (i) Brn-3a i (ii) Brn-3b razine mRNA u zebri u razvoju kod 24, 48 i 72 hpf. cDNA iz ukupne RNA je amplificirana pomoću prajmera na ZF Brn-3a i Brn-3b i varijacija u razini mRNA ispravljena je korištenjem ZF GAPDH. Vrijednosti su izražene kao kratka indukcija u odnosu na ekspresiju nakon 24 sata (postavljeno na 1). ( b ) Reprezentativna analiza zapadne mrlje koja pokazuje pojedinačni proteinski raspon i za Brn-3a i Brn-3b u ekstraktima odraslog ZF u usporedbi sa odraslim mišjim srcem (M), koja se koristi kao pozitivna kontrola. MW markeri pokazuju veličinu proteina, a gama ( γ ) tubulin korišten je za kontrolu varijacije ukupnog proteina. ( c ) Reprezentativne slike koje prikazuju imunološku sliku cijelog postava za (i) Brn-3a ili (ii) Brn-3b (zelena; gornje ploče) u ZF srcima na 72 hpf. Istodobna obojenja s tropomiozinom (crvena; srednja ploča) ukazuju na kardiomiocite u srcu u razvoju. Donja ploča prikazuje spajanje sa svijetlom slikom polja. V, A, P (označeno strelicom). ( d ) Reprezentativne slike odsječaka ZF koji su imunološki obojeni od DAB sa 72 KSf. Lokalizacija proteina vidi se kao tamno smeđe obojenje u ventrikulama (naznačeno strelicom), identificirano TM, također pokazuje ekspresiju Brn-3a i Brn-3b. × 40 uvećanje. A, atrija; hpf, sati nakon oplodnje; MW, molekulska masa; P, perikardijalna vreća; TM, tropomiozin; V, klijetka; ZF, srce zebrafish

Slika pune veličine

Zatim je poduzet ko-imunofluorescentno bojenje za analizu lokalizacije proteina u ZF embrija (24, 48 i 72 hpf) koristeći Brn-3a ili Brn-3b Ab i tropomiozin Ab za identifikaciju kardiomiocita. Oba su proteina izražena u srcu u razvoju s niskim razinama otkrivenih 24 hpf (nije prikazano), što se značajno povećava za 48 i 72 hpf. Kokalokalizacija s tropomiozinom ukazuje na ekspresiju u klijetku (Slika 4c), ali je ekspresija također uočena oko perikardne sluznice. Kolorimetrijsko bojenje serijskih presjeka iz 72 ZF embrija pokazalo je ekspresiju Brn-3a i Brn-3b u sličnim regijama kao tropomiozin u srcu (slika 4d), potvrđujući tako da je ZF relevantan model za analizu Brn-3a i Brn-3b tijekom razvoja srca.

Smanjenje i Brn-3a i Brn-3b u ZF embrija rezultiralo je srčanim oštećenjima

I Brn-3a i Brn-3b kodiraju se jednim genima u ZF genomu, pa je MO dizajniran za smanjenje ekspresije proteina ubrizgan u oplođene embrije. 52, 53, 54, 55 Preliminarne studije za optimizaciju doze i vremena liječenja pokazale su da je kombiniranje 2ng Brn-3a i 2ng Brn-3b (ukupno 4 ng) dovoljno za smanjenje oba proteina kod dvostrukih morfata, u usporedbi s ne-ušutjivanjem ( NS) morfanti, bez gubitka vitalnosti kako je utvrđeno invarijantnim proteinom γ -tubulinom (slika 5a). Stoga se Brn-3a i Brn-3b MO ubrizgavaju sami ili zajedno u oplođena jajašca i uspoređuju s pojedinačnim MO ubrizganim embrijima ili NS MO, koji se koriste kao kontrola za nespecifične ili van ciljne učinke (vidjeti odjeljak Materijali i metode).

Image

( a ) Analiza Western blot-a koja pokazuje promjene u Brn-3a ili Brn-3b proteinskim ekstraktima pripremljenim iz zametaka pri 72 KSf nakon ubrizgavanja s različitim količinama oligonukleotida MO korištenim za ciljanje i Brn-3a i Brn-3b, u oplođenim jajima. Gama ( γ ) tubulin korišten je za kontrolu varijacije ukupnog proteina. ( b ) Fotomikrografije koje prikazuju svijetle polja polja srca zebra u visini od 48 KSf nakon ubrizgavanja samo kontrolnog ubrizgavanja MO, Brn-3a MO, samo Brn-3b MO ili oba Brn-3a i Brn-3b (dvostruka MO). Neuspjeh u petlji, što rezultira linearnim dvostrukim mrtvačkim srcem, označeno je strelicom. ( c ) Reprezentativne slike koje pokazuju rezultate sličnih studija provedenih u CMLC2-GFP, u kojima je srce označeno zelenim fluorescentnim proteinima. Lijevi paneli prikazuju spajanje svijetlog polja i GFP, a desni prikazuju GFP samo u embrionalnim srcima koja su uzeta iz zametaka nakon ubrizgavanja s kontrolnim MO, pojedinačnim MO ili dvostrukim MO da bi ciljali i na Brn-3a i Brn-3b. ( d ) Prikazane su reprezentativne slike srca sa ZF embrija na 72 KSf nakon ubrizgavanja s kontrolnim MO ili dvostrukim MO kako bi se istaknule značajne promjene u dovodnom traktu kada su ciljani i Brn-3a i Brn-3b. A = atrija; hpf, sati nakon oplodnje; IFT, dotok trakta; MO, morfolini; V, klijetka

Slika pune veličine

Učinci na rani razvoj srca vizualizirani su u prozirnim, živim embrionima pomoću svjetlosne mikroskopije. Reprezentativne slike srca iz ZF embrija na 48 hpf (slika 5b) pokazale su upečatljive promjene u srčanoj morfologiji kod dvostrukih morfata ubrizganih Brn-3a i Brn-3b MO za 48 h, s neuspjehom da se petlja što rezultira linearnom morfologijom srca u usporedbi s kontrolom (NS) MO ili pojedinačni MO (samo Brn-3a ili Brn-3b). Ti su efekti također primijećeni kada su izvedeni slični eksperimenti pomoću transgeničnog CMLC2-GFP ZF modela gdje GFP ekspresija u srcu omogućava jednostavnu vizualizaciju (Slika 5c). Kontraktilna disfunkcija u srcima s dvostrukim morfantima također je dokazana promatranjem retrogradnog protoka krvi viđenog kao valiranje krvi između komora 52 (Dopunska datoteka s podacima o video snimci S1). Sa 72 hpf, dvostruki mornati su također prikazali nedostatke dotoka, što je bilo znatno uže od NS kontrole ili pojedinačnih morfata (slika 5d). Ovi nalazi snažno ukazuju na to da Brn-3a i Brn-3b imaju važnu ulogu, s nekim preklapanjem, tijekom ranog srčanog razvoja.

Rasprava

Normalnim srčanim razvojem upravlja složen i strogo reguliran program ekspresije gena koji mora biti orkestriran na strogi vremenski / prostorni način radi kontrole različitih staničnih procesa. TF-ovi poput NKX2.5, HAND2 i GATA4 mogu regulirati gene potrebne za normalan srčani razvoj 1, a gubitak takvih TF-a može prouzročiti letalnu embrionalnost ili pridonijeti prirođenim srčanim manama. 56, 57, 58, 59 Važno je da TF djeluju kao dio kompleksa za inicijaciju više proteina transkripcije, tako da interakcije između različitih TF-a mogu značajno utjecati na sudbinu stanica. Na primjer, NKX2.5 surađuje s GATA4 kako bi pokrenuo specifikacije stanica kardiološkog potomka, ali surađuje s HAND2 na promicanju razvoja srca u kasnijim fazama. 56, 60

Izvještavamo o potencijalno novim i važnim funkcijama povezanih, ali različitih proteina, Brn-3a i Brn-3b, u srcu u razvoju, koje mogu utjecati na ekspresiju gena i sudbinu stanica izravno ili neizravno interakcijom s regulatorima kao što je p53. Uzajamni odnos između Brn-3a i Brn-3b u mišjem srcu u razvoju može biti rezultat Brn-3a koja represira Brn-3b gen promotor posebno u kardiomiocitima. Derepresija nakon gubitka Brn-3a također će objasniti porast Brn-3b uočen u srcima Brn-3a KO tijekom sredine gestacije. Međutim, takvi recipročni učinci jedinstveni su za srce jer senzorni neuroni iz Brn-3a KO miševa izražavaju smanjene Brn-3b, 61 što sugerira složen i tkivno specifičan odnos između tih povezanih TF-a.

Brn-3a KO srca eksprimiraju povećani ciklin D1 mRNA i pokazuju široku ekspresiju proteina po zidovima ventrikula, u usporedbi s ekspresijom u WT srcima. Ciklin D1 je poznati ciljni gen Brn-3b, 43 tako da pojačana ekspresija u mutiranim srcima može odražavati funkcionalne učinke povišenog Brn-3b, ali će također pridonijeti hiperplastičnom rastu zabilježenom u srcima Brn-3a KO tijekom sredine gestacije. 19 Ciklin D proteini pokreću progresiju staničnog ciklusa i podržavaju proliferaciju miokarda tijekom srčanog razvoja, ali su regulirani jer stanice podliježu terminalnoj diferencijaciji 43 i trajna ekspresija u post-mitotičkim stanicama (kardiomiociti i neuroni) u korelaciji su s indukcijom apoptoze, što je možda povezano s mitotskom krizom. 62, 63 Povišeni ciklin D1 također je uključen u srčane patologije, uključujući srčanu hipertrofiju i kardiomiopatije, 64, 65, tako da je li povećani ciklin D1 u srcima Brn-3a KO samo efekt „slučajnog“ ili sredstvo u pokretanju mitotske krize i kardiomiocitne apoptoze / miopatije u kasnijim fazama ostaje da se utvrdi.

Zanimljivo je da dok je Brn-3b maksimalno izražen u srcima e18.5 WT, razina mRNA značajno je smanjena u srčanim Brn-3a KO srcima. Iako bi takve promjene mogle proizaći iz aktivne smanjene regulacije, vjerojatnije je da je to povezano s gubitkom kardiomiocita koji normalno eksprimiraju Brn-3b u srcu Brn-3a KO što dokazuju morfološkim promjenama poput staničnog ventrikularnog zida i septalnog stanjivanja, smanjenim zbijanjem miokarda, povećanom trabekulacijom i prisutnost kripti / fisura miokarda 66 u mutiranim srcima. Takve promjene mogu nastati indukcijom pro-apoptotičkog Baxa i povećanom apoptozom (TUNEL obojenje) uzrokovanom gubitkom Brn-3a i / ili pojačanim Brn-3b, jer Brn-3a inhibira aktiviranje pro-apoptotičkih gena posredovanih p53, 23, 24, 45, 49, 67 dok Brn-3b surađuje s p53 za indukciju pro-apoptotičkih gena, na primjer, Bax i Noxa, povećavajući tako apoptozu. Zapravo, čini se da je Brn-3b potreban za maksimalnu indukciju Baxa p53, jer su senzorni neuroni iz Brn-3b KO-mutantnih miševa vrlo otporni na apoptotičke podražaje i izražavaju reducirani Bax, unatoč tome što je ekspresija p53 netaknuta. 46, 68 Slično tome, prigušivanje Brn-3b dovoljno je za blokiranje indukcije pro-apoptotičkog Baxa u neonatalnim kardiomiocitima, iako je p53 bio nepromijenjen. 18

Zbog toga Brn-3a može promovirati diferencijaciju kardiomiocita tijekom srčanog razvoja suzbijanjem Brn-3b dok blokira p53 posredovanu apoptozu i surađujući s p53 na povećanju inhibitora staničnog ciklusa p21 cip1 / waf1 . 24, 49, 67 Gubitak Brn-3a i istodobno povećani Brn-3b potaknut će proliferaciju stanica tijekom sredine gestacije, ali promovirati apoptozu u kardiomiocitima u kasnijim fazama kada se p53 poveća, 18, 46, 49, pridonoseći tako morfološkim promjenama, ali mogu i računaju za smanjeni Brn-3b koji se vidi u e18.5 Brn-3a KO srca. Stoga će ravnoteža Brn-3a i Brn-3b biti važna za normalan srčani razvoj.

Unatoč antagonističkim učincima na neke ciljne gene, Brn-3a i Brn-3b mogu se djelomično nadoknaditi jedni drugima tijekom ranog embrionalnog razvoja jer iako Brn-3a KO zametak opstaje do rođenja, pokušava generirati dvostruke mutante KO iz Brn-3a +/− : Krstovi Brn-3b +/− heterozigota rezultirali su ranom embrionalnom letalnošću dvostrukih mutanata ( - / -: Brn-3b +/− ). Takvi kompenzacijski učinci primijećeni su za srodne Msx1 i Msx2 homeobox TF tijekom srčane morfogeneze, budući da dvostruki mutanti razvijaju grubu malformaciju u atrioventrikularnim ventilima koji nisu viđeni kod pojedinih mutanta. 69 Takva kompenzacija nastaje ako TF imaju slične učinke na ključne ciljne gene i budući da i Brn-3a i Brn-3b aktiviraju mali protein toplinskog udara, HSP27, koji je potreban za diferencijaciju kardiomiocita; 19, 33, 34, 35 vjerojatno je ovaj i ostali još nepoznati ciljni geni, ko-regulirani Brn-3a i Brn-3b, bitni za preživljavanje tijekom rane embriogeneze.

Dok je rana smrtonosnost dvostrukih KO embrija onemogućila daljnja istraživanja za otkrivanje srčanih oštećenja na mišjim modelima, ZF je pružio koristan model za analizu potencijalnih uloga tih TF-a tijekom rane embriogeneze zbog vrlo visoke homologije između sisavaca i ZF Brn-3b i Brn- 3a proteini (87% i 76%, respektivno). Štoviše, budući da su Brn-3a i Brn-3b kodirani pojedinačnim genima u ZF genomu (kromosom 6 i 1, respektivno), morfolini su dizajnirani za injekciju u vanjsko oplođena jajašca kako bi se smanjila ekspresija proteina. 70 Nadalje, tijekom ranog razvoja, ZF embriji difuzijom izdvajaju kisik i hranjive tvari, tako da mogu preživjeti sa srčanim manama, 71 koje se mogu realno vizualizirati u živim embrionima zbog transparentnosti ranih zametaka. Još je važnije, iako ZF embriji razvijaju dvodijelno srce u usporedbi s četveročlanim kralježnjacima, osnovni procesi ostali su slični, na primjer, razvoj srca i u ZF i u viših kralježnjaka započinje iz mesoderme lateralne ploče i srca se podvrgavaju udruživanju udesno da bi se postavili pretkomorne i ventrikularne komore. 72, 73 Osim toga, takvi procesi pokreću sačuvani TF-ovi poput Nkx2.5 / GATA4, koji su neophodni za srčani razvoj sisavaca i ZF. 74, 75, 76

Nadalje, ZF su pogodni za proučavanje Brn-3a i Brn-3b, jer se transkripti mRNA lako otkrivaju u embrionalnim ZF ekstraktima, dok zapadno mrljanje proteinskim ekstraktima iz ZF odraslih srca detektira pojedinačne trake za proteine ​​ZF Brn-3a i Brn-3b u usporedbi s dvije izoforme svakog proteina otkrivene u mišjim srcima. Cjelovita imunološka boja također pokazuje ekspresiju proteina u razvoju ZF srca već sa 24 hpf, najranije proučeno vremensko razdoblje. Do 48–72 hpf, protein Brn-3a ili Brn-3b pokazao je jasnu kokalokaciju s tropomiozinom u ventrikularnom miokardu, ali i u stanicama koje obložavaju srce, možda u epicardnim ili perikardnim stanicama. Smanjenje i Brn-3a i Brn-3b morfolino oligonukleotidima uzrokuje izražene nedostatke u petlji u duplim srcima morfata za 48 KSf, pri čemu rezultirajuće linearno srce pokazuje kontraktilnu disfunkciju i defekte AV ventila koji se vide kao retrogradni protok krvi, 52 dok se sužava i sužava dotok. trakt kod dvostrukih mornata od 72 hpf također podržava funkcionalne srčane mane u srcima dvostrukih morfanata. Iako se rezultati na ZF srcima moraju tumačiti s oprezom, takve promjene mogu pridonijeti prirođenim srčanim nepravilnostima u srcima sisavaca, što je dokazano nepravilnostima u petljama i usporavanjem rasta kod miševa Nkx2.5 KO koje su uzrokovale ranu smrtonosnost mutanata. 77, 78

Podaci iz mišjih i ZF studija snažno podržavaju ključne uloge za Brn-3a i Brn-3b s ograničenom viškom tijekom srčanog razvoja i zahtijevaju daljnja istraživanja kako bi se utvrdila potencijalna uloga tih regulatora u srcu u razvoju. Nadalje, gubitak Brn-3a i porast Brn-3b koji je povezan s kardiomiocitnom apoptozom mogu uzrokovati srčanu insuficijenciju i smrtonosnost nakon rođenja u mutantima Brn-3a KO, pružajući uvjerljivije objašnjenje za potpuni gubitak mutanata u roku od 0, 5 dana nakon rođenja a ne defekte u ponašanju i dojilje, što su predložile ranije studije. 50, 61 Takve promjene mogu biti relevantne i u kontekstu ljudskih bolesti u kojima su gubitak ventrikularnih kardiomiocita i hiper-trabekulacija povezani s urođenim srčanim manama ili kardiomiopatijom, na primjer, sindromom nekompaktiranja lijeve komore, 79, 80, 81, 82 što ukazuje na potencijalnu ulogu ovih regulatora u ljudskim bolestima.

Materijali i metode

Opći laboratorijski reagensi - Merck (Nottingham, Velika Britanija); Sigma (Dorset, Velika Britanija), osim ako nije drugačije navedeno. Reagensi / plastika za kulturu tkiva: Gibco / Life Technologies (Paisley, Velika Britanija); Nunc (Paisley, Velika Britanija); Greiner (Stonehouse, Gloucester, Velika Britanija) ili Corning (Znanstveni laboratorijski materijal, Nottingham, Velika Britanija). Primarna antitijela su dobivena kako slijedi: zec-Brn-3b pAb (Abcam, Cambridge, Velika Britanija); koza-Brn-3b pAB i kozji aktin pAb (Santa Cruz Biotechnology Inc, Dallas, TX, SAD); β -tubulin mAb, (Merck Millipore, Darmstad, Njemačka); svi sekundarni Ab (Dako, Cambridgeshire, UK): zečji pAb Bax, (Cell Signaling, Danvers, MA, SAD). Brn-3b promotor je kloniran u luciferazu pGL3.

životinje

Modeli miša

Studije korištenjem modela miša provedene su u skladu sa smjernicama matičnog ureda (Zakon o znanstvenim postupcima za životinje iz 1986.) i odobrenim od strane lokalnog odbora za reviziju etike. Za studije je korišten soj C57BL / 6J, a neraspoloženi C57BL6 miševi dobiveni od Harlan UK i Brn-3a heterozygote miševi korišteni su za generiranje legla s Brn-3a KO mutantima, hetsom i WT-om usklađenim s dobi. Srca iz starijih zametaka su sesecirana ili je odmah smrznuta za naknadnu ekstrakciju RNA ili su fiksirana u 4% paraformaldehidu (PFA) (pH 7, 4) i ugrađena u parafinski vosak za kasnije presjek.

ZF ( Danio rerio ) modeli

Odrasli ZF održavani su u skladu sa standardnim protokolima, a svi eksperimenti na ZF izvedeni su u skladu sa smjernicama matičnog ureda (Zakon o znanstvenim postupcima za životinje iz 1986.) i odobrenim od lokalnog Odbora za etičku provjeru. Transgeni model CMLC2-GFP ZF, u kojem promotor CMLC2 pokreće ekspresiju GFP-a u kardiomiocitima, također je korišten za studije za identificiranje strukturnih promjena u srcu u razvoju.

Histološka analiza i imunološka boja

H&E bojenje poduzet je radi procjene morfoloških promjena na WT i Brn-3a KO srcima. Srčani odsječci s ugrađenim parafinom 5–10 μm odstranili su vodu i rehidrirali nakon čega slijedi bojenje H&E primjenom automatskog uređaja SAKURA Tissue-Tek DRS 2000. Odjeci su snimljeni pomoću Hamamatsu Nanozoomer funkcije cjelovitog dijapozitiva i analizirani pomoću NDP view 2 softvera (Hamamatsu, Japan).

TUNEL bojenje je korišteno za analizu apoptotskih stanica u WT i Brn-3a KO embrionalnim dijelovima srca. DeadEnd kolorimetrični sustav TUNEL (Promega, Southampton, Velika Britanija) korišten je prema protokolu proizvođača.

Imunostanje je provedeno radi procjene promjene ekspresije gena u WT i Brn-3a KO embrionalnim odjeljcima srca, koristeći uspostavljene protokole. Ukratko, srčani dijelovi ugrađeni u parafin odmašćivaju se i rehidriraju prije pronalaska antigena (mikrovalna 10 minuta u 0, 01 M natrijevom citratu (pH 6, 0)). Za kolorimetrično imuno obojenje koristeći 3, 3'-diaminobenzidin (DAB), endogene peroksidaze su blokirane inkubacijom slajdova u 0, 3% otopini vodikovog peroksida (30 min, RT). Za sve imunološke boje, odsjeci su se inkubirali s blokirajućom otopinom (0, 1% TBS / T / 10% kozji serum; 30 min, RT), nakon čega je slijedila inkubacija s primarnim antitijelom (Ab °) bilo preko noći na 4 ° C ili 1-2 sata na RT. Negativna kontrola (samo drugi Ab °) uključena je u svaki eksperiment sa imunološkom bojom. Svi su tobogani održavani u hermetički zatvorenoj komori da se spriječi sušenje. Ispiranja (4 × 5 min) su provedena korištenjem fiziološke otopine puferirane fosfatom + 1% tritona X-100 (PBST). Odgovarani razrijeđeni sekundarni Ab inkubirao se 1 sat, RT. Kolorimetrijska detekcija provedena je pomoću DAB supstrata (Vectastain Elite ABC Kit (Vectorlabs, Peterborough, Velika Britanija), prema protokolu proizvođača. Nakon imunotamnjenja svi su tobogani dehidrirani u stupnjevanoj etanolnoj seriji, isprani dva puta u ksilenu, zatim montirani i obrađeni pomoću NDP nanozoomer.

Djelovanje ko-transfekcije i luciferaze

NRVM kulture pripravljene su kao što je prethodno opisano 18 i održavane su u 4: 1 iz Dulbeccova Modificiranog orlova medijuma (DMEM) / medijuma 199, dopunjenog 1% fetalnim telećim serumom (FCS) i 1% olovkom / strepom. Da bi se analizirali učinci Brn-3a na aktivnost promotora Brn-3b, stanice su kofeficirane s Brn-3b reporter konstruktom i Brn-3a ekspresijskim vektorom ili praznom vektorskom kontrolom (LTR) u kardiomiocite koristeći lipofektin-integrin ciljajući peptid – DNK ( LID) protokol kako je prethodno opisano. 83 Stanice su sakupljene nakon 24 sata, a aktivnost promotora izmjerena je primjenom dvostrukog luciferaznog izvještajnog kompleta (Promega, Southampton, Velika Britanija) i luminometrom TD-20/20 (Turner Designs, Madison, SAD). Interna kontrola, TK renila korištena je za podešavanje razlika u učinkovitosti transfekcije, a vrijednosti su izražene kao relativna jedinica luciferaze prilagođena aktivnosti renilla luciferaze. Statistička analiza izvršena je korištenjem Microsoft Excel-a ili GraphPad Prism-a 6 (San Diego, Kalifornija, SAD).

Ekstrakcija RNA, sinteza cDNA i kvantitativna PCR reverzne transkriptaze

Snažno smrznuta cijela srca homogenizirana su u tekućem dušiku prije ponovnog suspendiranja u TRIZOL reagensu (Invitrogen, Paisley, Paisley, Velika Britanija) i obrađena u skladu s protokolom proizvođača. Tretman DNAse1 proveden je korištenjem DNA-1 bez RNAse (Promega) nakon čega je izvršena ekstrakcija fenola-kloroforma i taloženje etanola. RNA je kvantificirana (NanoDrop 1000 spektrofotometar, Thermo Fisher Scientific, Paisley, Velika Britanija) i sinteza cDNA (reakcija 20–50 μl) provedena je primjenom reverzne transkriptaze RNA Superscript II (Invitrogen). Kvantitativna PCR reverzna transkriptaza u stvarnom vremenu izvedena je na termičkom cikličkom motoru Opticon 2 DNA (BioRad, Velika Britanija) koristeći SYBR kemiju (SYBR Green master mix (Qiagen, Manchester, UK)). Reakcije su izvedene korištenjem 1–2 μl cDNA i jedinstvenih prajmera za svaki gen. GAPDH geni za domaćinstvo korišteni su kako bi se utvrdila varijabilnost između uzoraka, a relativne razine mRNA izračunale su se pomoću ΔΔCT metode (25). Srednja vrijednost ± SD od 3 neovisna uzorka korištena je za statističku analizu koristeći odgovarajuće pakete, uključujući Studentov t- test (značajnost P <0, 05).

Injekcija morfolinosa

Studije su provedene pomoću ZF modela. Oplodna jajašca su inkubirana i WT embriji sakupljeni u 24, 48 i 72 hpf. Antisense morfolino sekvence dizajnirane da blokiraju translaciju i time smanje ekspresiju Brn-3a i Brn-3b proteina bile su sljedeće: Brn-3b-5'-AGACATCATCATCATATTTGCGACC-3 '; Brn-3a - 5′-AG CGTCTCATCCAGACTGGCGAAGA-3 ′. Standard Control oligo was used as a non-specific control. All morpholinos were obtained from Gene Tools, LLC (www.gene-tools.com). During preliminary studies, 1 ng, 2 ng and 4 ng of the control, Brn-3a and Brn-3b (mix) morpholinos were injected into fertilised embryos and effects on embryonic viability were analysed at different times (24, 48, 72 h) and the morphological and functional effects on the heart were analysed using live image capture, for example, Zeiss Axiovert 135 live imaging scope (Jena, Germany) with motorised stage Hamamatsu Orca R2 monochrome camera (Hamamatsu, Japan).

Whole-mount ZF immunofluorescent staining

For whole-mount immunostaining, ZF embryos taken at appropriate ages were fixed in 4% PFA for 1 h at room temperature then washed (4 × 5 min) in PBST with 1% triton X-100 (PSBT). While still in PBST, embryos were carefully dechorionated, then permeabilized in ice-cold acetone for 8 min. Following washes (4 × 5 min in PBST), the embryos were incubated in blocking buffer (PBS-T+10% FCS) for 1 h (RT) after which the buffer was changed and then repeated for another 1 h. Embryos were then incubated for 3 days at 4 °C in primary antibodies diluted in blocking buffer (1:200 and 1:500 for Brn-3a and Brn-3b rabbit polyclonal Ab; 1:500 of tropomyosin mAb and 1:200 of α -actinin mAb) with gentle rotation. Embryos were washed (3 × 1 h) in blocking buffer followed by 3 × 10 min in PBS. Fluorescent-tagged secondary antibodies (AlexaFluor 555 for tropomyosin or α -actinin mAb or AlexaFluor 488 for Brn-3a or Brn-3b rabbit pAb) were diluted 1:2000 in blocking buffer and incubated with embryos for 3 days at 4 °C, under sealed darkened conditions with gentle rotation. Embryos were then washed (3 × 10 min in PBST), mounted in 1% low melting point agarose on glass bottom culture dishes (MatTek, Peterborough, UK) and stored at 4 °C in the dark until confocal imaging could be undertaken (Leica TCS SPE inverted confocal microscope (× 20 magnification)).

Dodatna informacija

Datoteke Powerpoint

  1. 1.

    Dopunske brojke

    Supplementary Information accompanies this paper on Cell Death and Disease website (//www.nature.com/cddis)