Ključna uloga hcmv deubikvitinaze u promicanju onkogeneze ciljanjem protuvirusne urođene imunološke signalizacije | stanična smrt i bolest

Ključna uloga hcmv deubikvitinaze u promicanju onkogeneze ciljanjem protuvirusne urođene imunološke signalizacije | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Urođeni imunitet
  • onkogcnczom
  • Prijenos signala
  • Virusni proteini

Sažetak

Rak je multifaktorijalna bolest, a karcinogeneza posredovana virusom jedan je od ključnih faktora, koji se slabo razumije. Humani citomegalovirus (HCMV) je herpesvirus i dokazano je da su njegove komponente povezane s karcinomom različitog podrijetla tkiva. Međutim, njegova uloga u raku ostaje nepoznata. Ovdje smo identificirali konzervirani herpesvirusni protein tegument poznat kao pUL48 HCMV, koji kodira enzim deubikvitinazu, kao ključnu ulogu u karcinogenezi. Korištenjem deubikvitinaze dovoljne i manjkave HCMV pokazuje da je HCMV deubikvitinaza ključna u poticanju pojačane metaboličke metaboličke aktivnosti uregulacijom nekoliko anti-apoptotičkih gena i redukcijom ekspresije nekoliko pro-apoptotičkih gena. Nadalje, HCMV deubikvitinaza stječe tumorske funkcije inhibiranjem PRR-posredovanog interferona tipa I deubikvitacijom TRAF6, TRAF3, IRAK1, IRF7 i STING. Uzeto zajedno, naši rezultati sugeriraju da HCMV infekcija može promicati onkogenezu inhibiranjem urođene imunosti domaćina.

Glavni

Rak je multifaktorijska bolest koja uzrokuje smrt širom svijeta i dokazuje se kao teret za zdravlje ljudi. DNA virusi kao što su virus Epstein-Barr, virus hepatitisa B, virus humane papilome i herpesvirus povezan sa Kaposijevim sarkomom uzrokuju širok raspon malignih oboljenja poput karcinoma nazofaringeusa, Burkittovog limfoma, raka glave i vrata i raka vrata maternice u domaćina. 1, 2 Osim toga, RNA virusi poput virusa hepatitisa C, humanog tumora virusa ljudskog mlijeka, virusa torque tenoa i humanog endogenog retrovirusa također nabavljaju različite strategije za onkogenezu. 1 Rastući popis virusa povezanih s rakom ukazuje da virusna infekcija može izravno ili neizravno dovesti do kancerogenog stanja. Ljudski citomegalovirus (HCMV) spada među one DNA viruse za koje je pronađeno da su povezani s karcinomom. 3, 4, HCMV, međutim, nije okarakteriziran kao onkogeni virus. Pronađene su strukturne komponente HCMV u tkivima tumora 3, 4, 5 i prijavljeno je da sudjeluju u promicanju povoljnog mikrookolja za onkogenu transformaciju zaraženih stanica. 6, 7 HCMV inficira 90% svjetske populacije, stoga proučavanje kancerogenog potencijala HCMV-a i razumijevanje njegovog molekularnog mehanizma može pomoći zaustaviti napredovanje različitih vrsta karcinoma. Iako je infekcija HCMV-om uglavnom asimptomatska zbog antivirusnog imuniteta domaćina, može dovesti do onkogene transformacije normalnih stanica i raka, kada je domaćin imunokompromitiran zbog imunosupresivnih lijekova ili infekcije s HIV-om.

Brojna su istraživanja pokazala da interferoni tipa I (I-IFN) imaju ključnu ulogu u inhibiciji karcinoma. 8, 9, 10, 11 Stanice zaražene virusom podvrgavaju se apoptozi kao obrana protiv širenja infekcije. Međutim, HCMV stječe nekoliko strategija za inhibiranje apoptotskog puta i uspostavljanje uspješne infekcije. 3 Ove strategije preživljavanja stečene HCMV-om mogu dovesti do nekontroliranog rasta stanica.

Ovdje smo identificirali novu ulogu HCMV deubikutinaze (DUB) u onkogenezi. HCMV-DUB je kodiran jedinstvenim long48 (UL48) genom, očuvanim proteinima visoke molekularne mase u herpesvirusima. Otkrili smo da HCMV-DUB inhibira ekspresiju različitih pro-apoptotičkih gena i inducira ekspresiju anti-apoptotičkih gena. HCMV-DUB omogućava stanicama da brzo nadiđu G1 fazu i uđu u druge faze staničnog ciklusa potrebne za diobu stanica. Stanični DUB-ovi imaju važnu ulogu u mnogim signalnim putovima, uključujući imunološku signalizaciju, apoptozu, onkogenezu i razvojne puteve. 12, 13, 14 Isto tako, naša otkrića također otkrivaju da nakon infekcije HCMV-DUB inhibira sintezu I-IFN-a, faktora protiv raka, deubikvitiniranjem nekoliko signalnih molekula, kao što je faktor povezan s TNF receptorima (TRAF) -6 i -3, kinaza-1 povezana s receptorom interleukin-1 (IRAK1), interferonski regulatorni faktor (IRF) -7 ili stimulator gena interferona (STING) koji imaju ključnu ulogu u antivirusnoj urođenoj imunosti. Inhibicija I-IFN-a od strane HCMV-DUB korelira sa smanjenom ekspresijom nekoliko pro-apoptotičkih gena i povećanom ekspresijom anti-apoptotičkih gena, što također ukazuje na njegov onkogeni potencijal tijekom infekcije.

Rezultati

HCMV inducira onkogena svojstva

Dobro je poznata povezanost antigena HCMV s različitim vrstama karcinoma. Međutim, hoće li HCMV promovirati rak nakon infekcije, nije poznato. Da bi se istražila uloga HCMV-a u onkogenezi, ne-transformirani humani fibroblasti prepucija (HFF) zaraženi su laboratorijskim sojem divljeg tipa HCMV s oznakom GFP (WT-HCMV), AD169 (MOI 5). Drugog dana nakon infekcije (dpi) zabilježena je virusna infekcija fluorescencijom GFP-a (slika 1a). Na šestom dpi, inficirane stanice su pokazale karakterističan citopatski učinak (CPE), a također i promjenu boje medija za rast (crvena do žuta) (Slika 1b). Promjena boje uslijed barem djelomično oslobađanja markernog GFP-a iz zaraženih stanica, ali također može ukazivati ​​na pojačanu metaboličku aktivnost tijekom infekcije. Da bismo izravnije procijenili mogućnost, napravili smo MTT test uspoređujući zaražene stanice s neinficiranim. Zabilježena je četverostruko veća metabolička aktivnost za stanice inficirane WT-HCMV u usporedbi s neinficiranim stanicama (Slika 1c). Povrh toga, pojačana razina RNA i proteina MKi67 , gena marker stanične proliferacije, uočena je u HFF-om zaraženim WT-HCMV-om u usporedbi s neinficiranim HFF-om (slike 1d i e), što je u skladu s rezultatom testa MTT. To nas je dovelo do daljnjeg istraživanja stadijuma staničnog ciklusa HCMV-stanica inficiranih stanica pomoću protocitometrije, koja je pokazala detektirani uzorak nagiba prema G2-fazi u inficiranim stanicama nego u neinficiranim stanicama (Slika 1f).

Image

HCMV infekcija inducira onkogena svojstva u ne-transformiranom HFF-u. ( a ) GFP ekspresija uočena je pod fluorescentnim mikroskopom 24 sata nakon infekcije (hpi) s GFP označenim WT-HCMV (H-WT) u HFFs. ( b ) Promjena boje medija u kulturi (crvena u žuta) vidljivo je uočena 6. dana nakon infekcije (dpi), kod HFF-a zaraženih H-WT. ( c ) Stanična održivost (metabolička aktivnost) ispitnih HFF-zaraženih HFF-ova kvantitativno je određena MTT testom, 6 dpi. ( d ) Transkript i ( e ) proteina MKi67 kvantificiran je qPCR-om i protočnim citometrom, u mocku, H-WT-inficiranim HFF-ima, ( f, lijevo, desno, dno) provedena je protočna citometrija za ismijavanje i H-WT-inficirane HFFs obojeći ih propidijevim jodidom (PI, prikazan u x osi) na 3 dpi, kako bi se otkrili stadiji staničnog ciklusa nakon HCMV infekcije i ( g ) statusa anti-apoptotičkog gena ( bcl2 , birc3 i prkce ) uspoređivali sa qPCR-om u izgledu ili HFF-om zaraženim HFF-om 6 dpi. Prikazani rezultati predstavljaju tri ( a - d, g ) ili dva ( e, f ) neovisna pokusa. ( f ) Statistička analiza izvršena je s podacima dva neovisna pokusa. Razlike su smatrane statistički značajnim s vrijednosti P * vrijednosti <0, 05, ** P- vrijednosti <0, 01 i *** P- vrijednosti <0, 001, ns, neznačajnom razlikom ( P- vrijednost> 0, 05)

Slika pune veličine

Većina virusnih infekcija dovodi do smrti stanice kao zaštitnog urođenog imunološkog odgovora da se smanji opterećenje virusa unutar domaćina. Stanična smrt pokreće se aktiviranjem apoptotskih puteva, međutim HCMV infekcija povećala je preživljavanje stanica značajno poboljšavajući ekspresiju anti-apoptotičkih gena kao što su bcl2 , birc3 i prkce , u usporedbi s mock infekcijom (Slika 1g), što ukazuje da HCMV infekcija štiti stanice iz apoptoze i potiče opstanak stanica. Tijekom progresije raka, ekspresija anti- i pro-apoptotičkih gena modulirana je da podupire progresiju raka. Najčešće povećanje ekspresije anti-apoptotičkih gena i smanjenje ekspresije pro-apoptotičkih gena pogoduju napredovanju raka. Zbirno, ovi rezultati pokazuju da HCMV infekcija inducira onkogena svojstva u ne-transformiranim stanicama uregulacijom anti-apoptotičkih gena, što rezultira pojačanom staničnom proliferacijom.

DUB aktivnost HCMV-pUL48 inducira onkogena svojstva

Ranije je objavljeno da neaktivni DUB herpesvirusa Marekove bolesti ugrožava sposobnost tog virusa da uzrokuje limfom kod pilića. 15 Uz to, izvješća sugeriraju da deregulacija staničnih DUB-ova također može promicati različite vrste raka kod ljudi i miša. 16, 17, 18 Međutim, HCMV-DUB i njegova uloga u onkogenezi nisu poznati. Hipotetirali smo da HCMV-DUB također može imati takvu ulogu. Da bismo to testirali, upotrijebili smo ranije prijavljeni virus HCMV mutanta koji kodira neaktivni DUB. 19 Nakon infekcije HFF-om s jednakom količinom WT i DUB-mutantnih (ΔDUB) HCMV-označenih GFP-om, uočena je jednaka količina infekcije virusom (GFP Fluorescence) na drugom dpi (Slika 2a). Na šestom dpi, stanice zaražene ΔDUB-HCMV pokazale su mnogo manje metaboličke aktivnosti od stanica inficiranih WT-HCMV, međutim, usporedivo s ismijavanjem zaraženih stanica (Slika 2b). Da bi se potvrdili različiti odgovori WT- i ΔDUB-HCMV, provedeni su test MTT i transkripcija MKi 67 i analiza proteina stanica, odnosno metaboličke proliferacije, što ukazuje da ΔDUB-HCMV smanjuje metaboličku aktivnost i proliferaciju stanica u usporedbi s WT- HCMV (slike 2c-e). Nadalje, brojanje stanica HFF i analiza staničnog ciklusa nakon tri dpi s HCMV, otkrili su da WT-HCMV infekcija uzrokuje pojačanu staničnu proliferaciju (slika 2f) i veću akumulaciju stanica u fazi G2 u usporedbi s mockom ili ΔDUB-HCMV infekcijom (Slika 2g),

Image

HCMV deubikvitinaza odgovorna je za indukciju onkogenih svojstava. ( a ) HFF su zaraženi s jednakim MOI GFP-om označenih H-WT i HΔDUB; jednaka količina ekspresije GFP-a mikroskopski je uočena 24 sata nakon infekcije (hpi) s HF-označenim GFP-om i HΔDUB u HFF-u. Kvantifikacija fluorescencije GFP (HCMV infekcija) izvršena je protočnim citometrom; histogram prikazuje postotak HCMV infekcije pri 24 hpi, mjereno protočnometometrijom, a grafikon prikazuje GFP-srednju fluorescentnu intenzitetu (MFI) odgovarajućih histograma. ( b ) Promjena boje medija u kulturi (crvena u žuta) vizualno je primijećena 6 dpi, u HFF-u zaraženom H-WT. ( c ) Stanična vitalnost (metabolička aktivnost) kvantificirana je i uspoređena s ispitnim HTP-om i HFF-om zaraženim HFF-om pomoću MTT testa. ( d ) Transkript gena markera proliferacije MKi67 kvantificiran je qPCR-om u ispitnim HFF-om, H-WT i HΔDUB-om. ( e, lijevo) Analiza proteina MKi67 provedena je u probnoj, H-WT i HDUB-inficiranoj HFFs protočnom metometrijom ( e, desno). MFI je izračunat za odgovarajuće hisigrame MKi67. ( f ) Stopa proliferacije Mock, H-WT i HΔDUB-HCMV inficiranih HFF analizirana je sjemenkama u jednaki broj, skupljajući ih na 3 dpi i brojeći ih za usporedbu ukupnog broja stanica. ( g, lijevo, desno, dno) Stadiji staničnog ciklusa ispitnih HFF-a i HΔDUB-inficiranih HFF analizirani su protočnom metrijom bojenjem ovih HFF-a propidijum-jodidom (PI) (prikazano u x osi) na 3 dpi. ( h, lijevo, desno) Stopa proliferacije stanica IMR32 stanica, koja stabilno eksprimira Vec, UL48N i UL48NΔDUB, uspoređena je tako da ih je prvotno posijao u gustoću od 0, 1 × 106 stanica, nakon čega ih je brojao i ponovno sijao na svaki alternativni dan 6 dana. ( i, lijevo, desno) Stadiji staničnog ciklusa IMR32 stabilno eksprimirajući vektor UL48N ili NΔDUB analizirani su protočnom metometrijom bojenjem stanica s PI. dpi: dana nakon infekcije, Vec: Prazan vektor, NΔDUB: UL48NΔDUB. Prikazani rezultati predstavljaju tri ( a - d, f, h, i ) ili dva ( e, g ) neovisna pokusa. ( g, h ) Statistička analiza izvršena je s podacima dva ( g ) i tri ( h ) neovisna pokusa i razlika je izračunata između mock nasuprot WT-HCMV infekciji ili mock nasuprot HΔDUB-HCMV infekcije ( g ) ili između Vec naspram UL48N ili Vec naspram NΔDUB ( h ). Razlike su smatrane statistički značajnim s vrijednosti P * vrijednosti <0, 05, ** P- vrijednosti <0, 01 i *** P- vrijednosti <0, 001, ns, neznačajnom razlikom ( P- vrijednost> 0, 05)

Slika pune veličine

Zatim, kako bismo potvrdili da HCMV-DUB može potaknuti staničnu proliferaciju, stvorili smo kao što je ranije prijavljeno plazmid ekspresije sisavaca, 20 koji kodira aminokiselinu 1–1162 od pUL48, funkcionalnu DUB domenu (UL48N) i UL48N kojoj nedostaje DUB funkcija (UL48NΔDUB) HCMV, Stanice IMR32 (neinvazivna stanična linija neuroblastoma) koje stabilno eksprimiraju UL48N, UL48NΔDUB ili prazni vektor (Vec) generirane su i podvrgnute analizi stanične proliferacije od dana 0 do 6 nakon sjetve na gustoći od 0, 1 × 106 stanica i prebrojavanje broja stanica svakog alternativnog dana. Stanice IMR32, stabilno eksprimirajuće WT-UL48N, pokazale su brzu proliferaciju od onih koje stabilno eksprimiraju bilo ΔDUB-UL48N ili Vec (Slika 2h). To je dodatno potvrđeno analizom stanica stanica IMR32 koja pokazuje pojačanu akumulaciju UL48N koje eksprimiraju IMR32 stanice u S- i G2-fazama u usporedbi s Vec i UL48NΔDUB (Slika 2i). Zbirno, ovi rezultati pokazuju da HCMV-DUB može inducirati staničnu proliferaciju, a UL48-DUB presudan je za ovu aktivnost.

HCMV-DUB potiče obilježja raka

Većina virusnih infekcija dovodi do smrti stanica apoptotskim putem, što je zaštitni urođeni imuni odgovor. Da bi se razumjelo da li HCMV-DUB modulira ekspresije pro-apoptotičkih i anti-apoptotičkih gena tijekom infekcije, WT-HCMV i ΔDUB-HCMV-inficirani HFF-i najprije su analizirani na ekspresiju anti- i pro-apoptotičkih gena putem qPCR-a, na 6. dpi. Transkripcija anti-apoptotičkih gena, kao što su bcl2, birc3, prkce , preživin i xiap , značajno se povećala u mnogo navrata, u HFF-om zaraženom WT-HCMV, međutim nivo transkripta ostao je nepromijenjen ili smanjen u HFF-om zaraženim ΔDUB-HCMV ismijavanje (slika 3a). Nadalje, analiza ekspresije proteina anti-apoptotičkih gena - bcl2 , birc3 i preživina - pokazala je pojačanu ekspresiju u HFF-om zaraženim WT-HCMV nego u ispitnim HFF-om ili ΔDUB-HCMV-om (Slika 3c). Razina ekspresije nekoliko drugih anti-apoptotičkih gena, poput ciap1 , cflip i mcl-1, smanjena je u slučaju oboje, WT i ΔDUB-HCMV infekcije u usporedbi s mock infekcijom (dopunske slike S1a-S1c), što sugerira da HCMV-DUB nema specifičnu uloga u regulaciji ovih anti-apoptotičkih gena. Iznenađujuće, razina transkripta bcl-xl anti-apoptotičkog gena smanjena je zahvaljujući WT-HCMV infekciji, dok je ostala nepromijenjena nakon ΔDUB-HCMV infekcije (dopunska slika S1d). Slično tome, transkripcija pro-apoptotičkih gena kao što su trag , Rb , p53 , fadd i tnfα , ostala je nepromijenjena, manje inducirana ili smanjena u stanicama inficiranim WT-HCMV u usporedbi s ismijavanjem, dok je ekspresija ovih pro-apoptotičkih gena bila veća u stanice inficirane ΔDUB-HCMV (Slika 3b). Protein p53 induciran je infekcijom s WT i ΔDUB-HCMV, međutim indukcija je bila relativno manja u HFF-om zaraženim WT-HCMV (Slika 3c). Transkripcija nekoliko drugih pro-apoptotičkih gena, kao što su loš i bax , smanjena je nakon infekcije s oba, WT- i ΔDUB-HCMV, što sugerira da nema posebne uloge HCMV-DUB u regulaciji lošeg i bax , dok je transkripcija kaspaze-8 i p21 reduciran je samo u HFF-om zaraženim WT-HCMV i ostao je nepromijenjen u HFF-om zaraženim ΔDUB-HCMV (dopunske slike S1f-S1i). Nadalje, analiza proteina p21 i kaspaze-3 pokazala je smanjenu ekspresiju u stanicama inficiranim WT-HCMV u usporedbi s lakom (Slika 3c). Ispitivana je ekspresija nekoliko drugih anti-i pro-apoptotičkih gena, bez dokaza o razlikama između stanica inficiranih WT- i ΔDUB-HCMV u usporedbi s ismijavajućim (dopunske slike S1e, S1j-S1l) što sugerira da nije uključenost HCMV infekcije u regulaciju ovih gena. Diferencijalna ekspresija anti- i pro-apoptotičkih gena tijekom WT-HCMV- i ΔDUB-HCMV infekcije ukazuje da aktivnost HCMV-pUL48 DUB interferira s indukcijom apoptoze i tako može izazvati onkogena svojstva. U skladu s ovom interpretacijom, ustanovili smo da je sposobnost etopozida lijekova protiv raka da promiče apoptozu smanjena WT-HCMV infekcijom, ali ne i infekcijom ΔDUB-HCMV (Slika 3d).

Image

HCMV deubikvitinaza inducira obilježja raka: ( a, b ) HFF su zaraženi jednakim MOI GFP-om označenih WT-HCMV (H-WT) i ΔDUB-HCMV (HΔDUB) i analizirani na 6-dpi, povezane gene apoptoze. nivo transkripta anti-apoptotičkih gena bcl2 , birc3 , prkce , preživin i xiap, kao i ( b ) nivo transkripta pro-apoptotičkih gena, Rb , p53 , fadd i tnfα izmjeren je qPCR-om u izgledu, H-WT i HΔDUB -inficirani HFF. ( c ) Razina endogenih proteina BCL2, BIRC3, Survivin, TP53, Caspase-3 i p21 analizirana je u HFFs na 8 dpi s H-WT i HΔDUB ( d ) HFF-inficirane HFF stanice tretirane su s 30 μM etopozida na 3 dpi i analiziran za spašavanje apoptoze 24 sata kasnije kvantificiranjem razine Aneksina V kroz protočni citometar. ( e, lijevo, desno) IMR32 stanice koje stabilno eksprimiraju Vec, UL48N i UL48NΔDUB bile su gladovane glukoze u trajanju od 2 sata i tretirane su FITC-ovom glukozom 10 min, a zatim podvrgnute protočnom citometru kako bi se promatralo unošenje glukoze ( f, na vrhu). Rana je bila stvorena u stanicama IMR32 koja je prolazno transficirana ekspresivnim plazmidima Vec, UL48N i UL48NΔDUB kao što je prikazano i opaženo je zacjeljivanje za 48 h, izmjerena je veličina rane ( f, dno). ( g, lijevo) 5 × 10 5 IMR32 stanice prolazno transficirane ekspresijskim plazmidima Vec, UL48N i UL48NΔDUB resuspendirane su u mediju za rast lišen serumom i inokulirane na matrigelni sloj koji sadrži umetak koji je dalje održavan u kontaktu s medijumima za rast koji sadrži serum. Invazija tkiva ovih IMR32 stanica analizirana je putem invazije matrigela. ( g, desno) Brojene su upadne Matrigelove stanice i grafikon je crtan. Plave točke predstavljaju napadnute stanice. Vec: Prazan vektor, dpi: dana nakon infekcije, NΔDUB: UL48NΔDUB, Etp: Etoposid, FITC-A: FITC-područje. Prikazani rezultati predstavljaju tri ( a, b, d, e, f, g ) ili pojedinačne ( c ) neovisne eksperimente. Razlike su smatrane statistički značajnim s vrijednosti P * vrijednosti <0, 05, ** P- vrijednosti <0, 01 i *** P- vrijednosti <0, 001, ns, neznačajnom razlikom ( P- vrijednost> 0, 05). Vidi također dodatnu sliku S1a-S1l

Slika pune veličine

Zatim smo testirali unos glukoze jer ćelijama raka je potrebna povećana glukoza za metabolizam i diobu stanica. 21 U tu svrhu, stanice IMR32 koje stabilno eksprimiraju Vec, UL48N i UL48NΔDUB bile su gladirane glukozom i tretirane s FITC-om obilježenu glukozom (2-NBDG). Protok citometrijske analize pokazao je da stanice koje eksprimiraju UL48N uzimaju više 2-NBDG od onih koje eksprimiraju Vec ili UL48NΔDUB (Slika 3e). Nadalje, prekomjerna ekspresija UL48N, povećala je staničnu migraciju (slika 3f) i invaziju tkiva (slika 3 g) stanica IMR32 (testirana testom zacjeljivanja rana i invazijom matrigela), dok UL48NΔDUB nije inducirao nijednu od ovih karakteristika raka. Ovi podaci sugeriraju da HCMV-DUB može promovirati nekoliko onkogenih svojstava i eventualno pokrenuti ili promovirati karcinom.

HCMV-DUB inhibira urođenu antivirusnu imunost za onkogenezu

Virusne infekcije mogu inducirati stanične antivirusne imunološke odgovore, uključujući I-IFN, odgovorne na receptore za prepoznavanje obrazaca (PRR). Osim antivirusnog imuniteta, poznato je da I-IFN-i imaju ključnu ulogu u eliminaciji samo izmijenjenih ili tumorskih stanica indukcijom pro-apoptotičkih gena kao što su p53 , 22 Rb , 23, 24, trag 10, 25 i suzbijanje anti-apoptotičkih gena kao što su prkce , 10, 26 birc3 10 i bcl2 . 10, 27 Kada smo testirali ekspresiju I-IFN s (pan- IFNα i IFNβ ) u HFF-ima, zaraženi ili WT ili ΔDUB-HCMV, ili transficirani s poli (I: C), kao poznatim induktorom, ΔDUB- HCMV i poli (I: C) značajno su povećali razinu transkripta pan- IFNα (slika 4a) i IFNβ (slika 4b) u svim ispitanim vremenskim točkama, u usporedbi s WT-HCMV. Zanimljivo je da je obrazac ekspresije mnogih pro-apoptotičkih i anti-apoptotičkih gena usklađen s ekspresijskim uzorkom I-IFN s WT- i ΔDUB-HCMV (npr. Usporedite transkripcijske obrasce na slikama 3a i b i slike 4a i b), što sugerira da bi inhibicija pro-apoptotičke i indukcija anti-apoptotičke ekspresije gena WT-HCMV infekcijom mogla biti posljedica inhibicije sinteze I-IFN.

Image

HCMV deubikvitinaza inhibira urođenu antivirusnu imunost da inducira onkogenezu ( a ) Transkript pan-interferona- α (P -IFNα) i ( b ) IFNβ izmjeren je qPCR-om na WT-HCMV (H-WT) i ΔDUB-HCMV (HΔDUB) ) infekcija ili poli (I: C) transfekcija stanicama HFF, na 3 i 6 dpi ili dpt, kako je naznačeno. ( c, d ) Transkript IFNβ izmjeren je qPCR-om nakon H-WT infekcije myd88 ( c ) ili uboda ( d ) oborenih HFF-a. ( e-g ) Analiza luciferaze napravljena je za IFNa4 i IFNP promotore u stanicama HEK293, kako je prikazano. ( h, i ) Razina transkripta P- IFNα i IP10 izmjerena je u stanicama HeLa transfektiranim s UL48N i stimulirane s CpG. ( j, vrh) Razina NDV transkripta izmjerena je u stanicama IMR32 koje su prolazno transficirane plazmidima ekspresije Vec, UL48N i UL48NΔDUB, kako je prikazano. ( j, dno) Prekomjerna ekspresija UL48N i UL48NΔDUB otkrivena je korištenjem antitijela FLAG. ( k ) Analiza MTT provedena je s HFF-om zaraženim HCMV-om i rIFN- p tretiranim HFF-om, a prikazan je značaj skupine WT- ili HΔDUB infekcije u usporedbi s mockom. ( l, lijevo odozgo) Zabilježeno je zacjeljivanje rana u stanicama IMR32, prolazno transficiranim s povećanom količinom ekspresivnih plazmida Vec, UL48N i UL48NΔDUB i tretirane konstantnom količinom rIFN-β (10 U), kako je prikazano, ( l, desno) izmjerena je veličina rane i ( l, lijevo dno) ekspresija UL48N i UL48NΔDUB analizirana je korištenjem antitijela protiv FLAG. ( m, n ) Transkript IFNβ i MKi67 izmjeren je qPCR-om nakon tretmana anti-IFNAR2 antitijelima i WT-HCMV (H-WT) ili ΔDUB-HCMV (HΔDUB) infekcije HFF stanicama, na 3 dpi kako je naznačeno. ( o ) MTT ispitivanje je provedeno s HFF stanicama nakon tretmana anti-IFNAR2 antitijelima (u trajanju od 4 sata) i infekcije WT-HCMV (H-WT) ili ΔDUB-HCMV (HΔDUB) na HFF stanice, na 3 dpi kako je naznačeno. Vec: Prazan vektor, NΔDUB: UL48NΔDUB, p (I: C) -T: Polinoinozin: policititil-Transfekcija, dpi: dani nakon infekcije, dpt: dani nakon transfekcije, hpt: sati nakon transfekcije, hps: sati poslije stimulacije, hpi : sati nakon infekcije, dptr: dana nakon liječenja, sh: kratka dlaka, rIFN: rekombinantni interferon, IFNAR: interferon tipa I / β receptor tipa I. Prikazani rezultati reprezentativni su za dva ( a - d, h - o ) ili tri ( e – g ) neovisna pokusa. Razlike su smatrane statistički značajnim s vrijednosti P * vrijednosti <0, 05, ** P- vrijednosti <0, 01 i *** P- vrijednosti <0, 001, ns, neznačajnom razlikom ( P- vrijednost> 0, 05). Vidi također dodatnu sliku S2a-S2e

Slika pune veličine

HCMV inducira urođeni imunitet kroz nekoliko PRR-a, uključujući endosom lokalizirane TLR9 i citosolne DNA senzore (CDS). 28, 29, 30, 31, 32 TLR9 i CDS prenose svoje signale putem gena primarne reakcije mijeloidne diferencijacije88 (MyD88) i STING za sintezu I-IFN. 33, 34, 35 Da bi se razumjela uloga HCMV-a u sintezi I-IFN-a i njegova ovisnost o MyD88- ili STING-putu, ovi geni su srušeni u HFFs pomoću RNA kratke dlake (shRNA), pri čemu su myd88 i sting transkripti značajno smanjena u usporedbi s kontrolnom shRNA za GFP (dopunske slike S2a - S2b). HFF-i koji su imali ili myd88 ili ubod bili su ismijani ili zaraženi WT-HCMV za analizu sinteze I-IFN. WT-HCMV inducirao je sintezu IFNβ u kontrolnim HFFsima, dok je smanjio sintezu u mydd88 ili ublažio HFFs (slike 4c i d). Ovo opažanje sugerira da u odsustvu bilo MyD88 ili STING, indukcija sinteze I-IFN je ugrožena tijekom HCMV infekcije, što dodatno potvrđuje ovisnost o MyD88 i STING za sintezu I-IFN, tijekom HCMV infekcije. Da bi se razumjela uloga HCMV-DUB (UL48N) u sintezi I-IFN, geni za MyD88 ili STING bili su upareni s UL48N i koeksprimirani u stanicama HEK293, zajedno s genom luciferaze koji je reguliran bilo IFNα4 , IFNα6 ili IFNβ promotorom. Svi I-IFN promotori povećali su proizvodnju luciferaze kada je koeksprimirana bilo s MyD88 ili STING genom, međutim, u svim slučajevima povećanje je inhibirano nakon koekspresije UL48N. (Slike 4e - g i dopunska slika S2c). Prevelika ekspresija UL48N također inhibira CpG (TLR9-ligand) -stimuliranu transkripciju I-IFN i IP10 u HeLa stanice (Slike 4h i i). Nadalje, testirali smo djelotvornost HCMV-DUB u utjecaju na I-IFN ovisnu antivirusnu imunost transfektiranjem IMR32 stanica s UL48N ili UL48NΔDUB konstrukcijama, nakon čega je inficirala stanice virusom New Castle Disease (NDV), 24 sata nakon transfekcije (HPT). Ispitivanje NDV-replikacije kvantitativnim (q) -PCR pokazalo je značajno povećanje NDV-replikacije u stanicama koje su transficirane UL48N, ali ne i sa UL48NΔDUB (Slika 4j). Ovo otkriće sugerira da su UL48N supresirani stanični antivirusni odgovori, što je dodatno dokazano analizom statusa replikacije i WT i ΔDUB-HCMV u HFFs gdje je replikacija WT-HCMV postupno povećavana s vremenom u usporedbi s ΔDUB-HCMV (dopunska slika S2d ).

Nadalje, da bi se istražila uloga HCMV-DUB u antagoniziranju I-IFN-inducirane stanične smrti, HFF-inficirani HFF tretirani su s rekombinantnim-IFNβ (rIFNβ) na trećem dpi. MTT test, napravljen 3 dana nakon rIFNp tretmana, pokazao je antagonizaciju stanične smrti posredovane s rIFNP uzrokovane WT-HCMV inficiranim HFF-om (Slika 4k). Za daljnju analizu I-IFN-antagonizirajuće sposobnosti UL48N za onkogenezu, stanice IMR32 transficirane su različitim količinama plazmida koji kodira UL48N ili UL48NΔDUB i rana je stvorena 24 hpt. Stanični monoplast sa ranama tretiran je rIFNβ i uočen nakon 72 h za zarastanje rana. UL48N-transfektirane stanice IMR32 pokazale su dozu ovisno zacjeljivanje rana u usporedbi sa stanicama koje su transficirane UL48NΔDUB ili Vec, i stanice tretirane samo s rIFNβ (Slika 4l). Količina FLAG označenih UL48N i UL48NΔDUB izmjerena je imunoblotiranjem (Slika 4l). Konačno, za ispitivanje povezanosti inhibicije I-IFN s indukcijom onkogenih svojstava, receptor za I-IFN (IFNAR) na HFF blokiran je korištenjem antitijela anti-IFNAR2 da u konačnici inhibira pozitivnu povratnu signalizaciju. Nakon blokade IFNAR-a, HFF su zaraženi WT- ili ΔDUB-HCMV i 3 dpi, analiziran je status transkripta IFNβ koji pokazuje inhibiciju blokade IFNAR-a (Slika 4m). Stanična proliferacija i status vitalnosti analizirani su s istim stanicama radeći kvantifikaciju MKi67 transkripta i MTT test. Stanice tretirane anti-IFNAR2 antitijelom pokazuju pojačanu proliferaciju (Slika 4n) i vitalnost (Slika 4o) u usporedbi s stanicama koje se ne liječe antitijelom, a koje su obrnuto korelirale s ekspresijom IFNβ u istim stanicama (slike 4m i o). Ovo sugerira da indukcija onkogenih svojstava na WT-HCMV infekciji dolazi zahvaljujući inhibiciji I-IFN. Nadalje, da bi se razumio razlog pojačanog ulaska G2 faze stanica inficiranih WT-HCMV, vrijednost transkripta ciklin-D1 izmjerena je u HFF-om zaraženom HCM-om nakon 2 dpi, jer I-IFN inhibira ekspresiju ciklin-D1 da blokira stanični ciklus na G1-fazi. 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 Zanimljivo je da je ekspresija ciklin-D1 ( ccnd1 ) regulirana nakon WT-HCMV infekcije u usporedbi s mockom ili ΔDUB-HCMV infekcijom s HFFs (dopunska slika S2e), što je obrnuto povezano s rezultatima I-IFN-a uočenim na slikama 4a i b. Ovi podaci kolektivno sugeriraju da HCMV-DUB može inhibirati I-IFN sintezu i I-IFN posredovanu smrt zaraženih stanica i tako promicati onkogena svojstva.

HCMV-DUB deubikvitinira citoplazmatske molekule inhibirajući sintezu I-IFN i potiču kancerogena svojstva

PUL48 sadrži sekvence nuklearne lokalizacije (NLS), što sugerira da diferencijalna lokalizacija pUL48N unutar stanice može biti kritična za njezinu funkciju DUB i inhibiciju I-IFN. Da bi se ovo testiralo stvoren je NLS-mutant UL48N kako je prethodno opisano 46 i nazvan UL48NΔNLS (slika 5a), koji nije mogao ući u jezgro (slika 5b) i bio je jednako učinkovit DUB kao UL48N (slika 5c). Za analizu funkcije UL48N (citoplazmatske ili nuklearne funkcije) u putovima sinteze I-IFN, aktivnost promotora I-IFN mjerena je prekomjernom ekspresijom UL48N i UL48NΔNLS. U tu svrhu, IFNα4 i IFNβ promotor se aktivirao koekspresijom MyD88 ili STING, koji su ključne molekule signalnih putova TLR9 ili CDS. UL48N i UL48NΔNLS, oba inhibiraju MyD88 ili STING posredovanu IFNa4 ili IFNβ promotorsku aktivnost, respektivno (slike 5d i e). Hipotetirali smo da UL48N deubikvitinira citoplazmatske (a ne nuklearne) signalne molekule aktivirane PRR-ovima, čija je sveprisutnost potrebna za indukciju I-IFN-a. Usporedili smo i UL48NΔNLS sa UL48N u testu zacjeljivanja rana i otkrili smo da se rane mono-slojeva IMR32 koji ispoljavaju bilo koji od konstrukata, nakon 48 sati zatvaraju s jednakom efikasnošću (Slika 5f), unatoč skromnoj razlici u svojstvu inhibiranja I-IFN. To ukazuje na to da je NLS od pUL48 neophodan za HCMV-DUB staničnu migraciju promatranu gore (npr., Slika 3f). Ovi rezultati pokazuju da nuklearna lokalizacija UL48N nije potrebna da pokaže inhibitorni učinak na sintezu I-IFN i stanične migracijske aktivnosti.

Image

Sekvenca nuklearne lokalizacije UL48N potrebna je za UL48-DUB aktivnost ( a ) Shematski prikaz UL48N i njegovog NLS-mutanta (UL48NΔNLS). ( b ) Stanična lokalizacija mCherry-označene UL48N i UL48NΔNLS opažena je pod fluorescentnim mikroskopom na × 63. Nukleus je obojen Hoechst-om 33342. ( c ) Uspoređivana je DUB aktivnost UL48N i UL48NΔNLS, promatrajući status ubikvitacije cijele stanice. lizati (WCL), nakon prekomjernog pritiska UL48N i UL48NΔNLS u stanicama HEK293, kako je naznačeno. ( d, e ) Test luciferaze izvršen je za IFNa4 ili IFNP promotor ko-transfekcijom plazmida ekspresije MyD88 ili STING i UL48N ili UL48NΔNLS kao što je prikazano. ( f, lijevo, desno) UL48N ili UL48NΔNLS je prekomjerno izražen u stanicama IMR32, rana je stvorena i zacjeljivanje rana opaženo je u 48 h, a izmjerena je širina rane. Prikazani rezultati predstavljaju jedan pojedinačni ( b, c ) ili dva ( d, e i f ) neovisna eksperimenta. Razlike su smatrane statistički signifikantnim s vrijednosti *** P- vrijednosti <0, 001

Slika pune veličine

HCMV-DUB deubikvitinira PRR-posredovane pretvornike signala da inhibiraju I-IFN sintezu

Kako bi se olakšala sinteza I-IFN-a putem PRR-a, mnogi signalni posrednici dobivaju sveprisutni K63 (lizin-63) (slika 6a). Kako je K63 ubikvitacija citoplazmatskih molekula važan događaj tijekom urođene imunološke signalizacije, naš je sljedeći pristup bio pronaći citoplazmatsku ciljnu molekulu čija je deubikvitacija omogućena UL48N i potrebna je za inhibiciju sinteze I-IFN. U tu svrhu, različite signalne molekule TLR i CDS puteva, podvrgnute K63 ubikvitinaciji za indukciju sinteze I-IFN, koeksprimirane su s UL48N ili UL48NΔDUB u stanicama HEK293 i testirane su na aktivnost IFNβ promotora testom Luciferaze. Koekspresija UL48N s TRAF6, TRAF3, IRAK1, IRF7 ili STING inhibirala je aktivnost promotora IFNβ, dok je UL48NΔDUB potpuno spasio inhibiciju u slučaju TRAF3 i IRAK1, a djelomično spasio u slučaju TRAF6, IRF7 i STING (Slika 6b). Zaključili smo da UL48N može deubikvitinirati više signalnih molekula da inhibira proizvodnju I-IFN. Konačno, aktivnost K63-deubikvitacije UL48N testirana je imunoblotskom analizom koristeći različite konstrukte kao što su myc-označeni TRAF6, TRAF3, IRAK1, IRF7 ili STING i UL48N s oznakom FLAG i UL48NΔDUB kao što je prikazano na slici 6c. Rezultat je pokazao da UL48N snažno deubikvitinira TRAF6, TRAF3 i STING (slika 6d) i blago deubikvitinira IRAK1 (dopunska slika S3a) i IRF7 (dopunska slika S3b). Kolektivno, ovi rezultati sugeriraju da HCMV-DUB cilja različite ključne molekule signalne kaskade za suzbijanje I-IFN i da inducira onkogenezu.

Image

UL48N cilja TRAF6, TRAF3 i STING za deubikutinaciju i inhibiciju sinteze interferona. ( a ) Shematski prikaz signalnih putova TLR, DNA osjetljivosti (DAI i cGAS) i ubikvitacija signalnih molekula. ( b ) Analiza luciferaze učinjena je za promotor IFNβ ko-transfekcijom TRAF6, TRAF3, IRAK1, IRF7 ili STING, s ekspresionim plazmidima UL48N ili UL48NΔDUB, kako je prikazano. ( c, d ) Ubikvitacijski status TRAF6, TRAF3 i STING analiziran je u prisutnosti prekomjerne ekspresije UL48N ili UL48NΔDUB u stanicama HEK293. Kofekcija HA-K63Ub, myc-TRAF6, myc-TRAF3 ili myc-STING s FLAG-UL48N ili FLAG-UL48NΔDUB izvedena je kako je prikazano. ( d, gore) Imunoprecipitirani uzorak je obrisan anti-HA, anti-myc i anti-FLAG antitijelom za otkrivanje odgovarajućih proteina, ( d, dno) Gustoća ubikvitacije TRAF6, TRAF3 ili STING izračunata je i uspoređena za svaki uzorak korištenjem ImageJ softver. Luc: Luciferaza, hpt: sati prije transfekcije, Vec: Prazan vektor. Prikazani rezultati predstavljaju tri ( b ) ili dva ( d ) neovisna pokusa. Razlike su smatrane statistički značajnim s vrijednosti P * vrijednosti <0, 05, ** P- vrijednosti <0, 01 i *** P- vrijednosti <0, 001, ns, neznačajnom razlikom ( P- vrijednost> 0, 05). Vidi također dodatnu sliku S3a-S3b

Slika pune veličine

Rasprava

Povezanost HCMV-a s različitim tkivima raka dobro je uspostavljena, međutim uloga komponenti HCMV-a u onkogenezi je slabo razumljiva. Studije su pokazale neizravnu ulogu proteina neposredne rane HCMV (IE1 i IE2) u onkogenezi, 47, 48, 49, međutim, nedostajalo je podataka o temeljnom molekularnom mehanizmu u onkogenezi. Naše istraživanje sugerira da kao posljedica prevladavanja urođenog antivirusnog imunološkog odgovora, HCMV infekcija i posebno enzimska aktivnost HCMV-DUB mogu pokrenuti rane korake u onkogenezi (Slika 7). Ovaj zaključak temelji se na nalazima koji potiču iz stanica inficiranih HCMV-om i proširuje se na eksperimente transfekcije provedene s HCMV-DUB i specifičnim staničnim molekulama antivirusnog odgovora. Pokazali smo da je WT-HCMV infekcija ne-transformiranim HFF-om, povećana metabolička aktivnost stanica, proliferacija stanica, pospješio brzi ulazak u G2-fazu staničnog ciklusa, otpornost na apoptotičke podražaje, pojačanu anti-apoptotičku ekspresiju gena ( bcl2 , birc3 , prkce , preživin , xiap ) i smanjena ekspresija nekoliko pro-apoptotičkih gena ( fadd , kaspaza-8 , p21 , tnfα ) u usporedbi s ΔDUB-HCMV infekcijom. Razina ekspresije nekoliko drugih anti-apoptotičkih gena ( ciapl , cflip , bcl-xl , mcl-1 i hif1α ) ili je smanjena u HFF-inficiranim WT-HCMV ili je bila usporediva s ΔDUB-HCMV infekcijom. Slično, opazili smo da je razina ekspresije nekoliko drugih pro-apoptotičkih gena ( loše i bax , bak , noxa , puma ) ili smanjena ili je ostala nepromijenjena zbog infekcije s oba, WT- i ΔDUB-HCMV u HFF-u. Ova opažanja sugeriraju da bi se različiti uzorci ekspresije anti- ili pro-apoptotičkih gena mogli povezati sa podražajima, trajanjem podražaja i / i staničnim tipom. Pored toga, moguće je da bi u drugom staničnom tipu različiti drugi anti-ili pro-apoptotički geni mogli biti uključeni u signalizaciju staničnog preživljavanja nakon HCMV infekcije. Skupno, opazili smo da je većina anti-i pro-apoptotičkih gena pogođena zbog HCMV infekcije HFF-om kako bi zaštitila stanice od apoptoze, kao i dovela do onkogeneze cjelokupnim poticanjem preživljavanja stanica i kancerogenih svojstava.

Image

Indukcija onkogeneze inhibicijom I-IFN sinteze HCMV deubikutinazom (pUL48). Model koji pokazuje ulogu HCMV deubikvitinaze u inhibiciji I-IFN sinteze za promicanje onkogeneze. HCMV-DUB olakšava deubikvitaciju TRAF6, TRAF3, IRAK1, IRF7 i STING da inhibira sintezu I-IFN, što zauzvrat inhibira ekspresiju nekoliko pro-apoptotičkih gena i inducira ekspresiju anti-apoptotičkih gena. Crne strelice pokazuju normalne stanične putove. Maroon strelice pokazuju puteve tijekom HCMV infekcije. Tupi strelice označavaju inhibicijsko djelovanje, a šiljaste strelice označavaju stimulativno djelovanje. Crveni mjehurići označavaju K63 ubikvitaciju signalnih molekula

Slika pune veličine

Da bi se razumio molekularni mehanizam ovih promjena, domena UL48-DUB izražena je u staničnoj liniji IMR32, pri čemu je njezina sposobnost utjecaja na druge karakteristike stanica raka poput proliferacije, migracije, unosa glukoze i invazije tkiva mogla biti proučena izravnije. Prethodne studije također su pokazale da su ljudske stanice inficirane HCMV-om otporne na apoptozu kao i da uzimaju više glukoze, ali s malo dokaza o tumorigenezi ili mehanizmima. 47, 49, 50, 51, 52

Nekoliko studija pokazuje međusobni razgovor između onkogeneze i urođenog imuniteta, pri čemu I-IFN potiču apoptozu ekspresijom pro-apoptotičkih gena 10, 22 i inhibicijom anti-apoptotičkih gena. 10 Ostala istraživanja pokazuju da prekomjerna ekspresija anti-apoptotičkih gena poput bcl2 štiti stanice od I-IFN posredovane stanične smrti. 27, 53 In our study, we show WT-HCMV-infected cells express reduced I-IFNs compared with ΔDUB-HCMV-infected cells, which confirms HCMV-DUB as a key inhibitor of I-IFNs sythesis, that might involve in induction of oncogenic properties in HFFs. We have also shown that UL48-DUB inhibits I-IFN synthesis induced through different PRRs-mediated signaling pathways wherein UL48-DUB deubiquitnates signaling mediators such as TRAF6, TRAF3, IRAK1, IRF7 and STING. Interestingly, in case of TRAF6, IRF7 and STING-mediated induction of I-IFN, NΔDUB-UL48 showed a partial repression, which also suggests a DUB-independent role of UL48N in oncogenesis. As HCMV inhibits I-IFN to counteract host innate immunity, 54, 55 inhibition of I-IFN synthesis by HCMV indicates its potential to establish a pro-cancer microenvironment. In addition, studies suggest that people having a particular SNP in TLR9 (2848GA) are more susceptible to HCMV infection and cancer development. 29, 56 Here, we have found evidence for hypothetical dual role for HCMV-DUB, in defeating host anti-viral responses and also promoting an oncogenic state.

Several viruses encode DUBs and most of these interfere with innate immune signaling pathways. 57, 58, 59 Our findings rationalize that similar to HCMV, other DUB-encoding viruses may perturb normal cell cycle or apoptotic pathways by inhibiting I-IFN synthesis. 58, 60 Hence, our study provides new insight into mechanisms of virus-induced oncogenicity related to inhibition of innate immunity. Collectively, our study suggests that HCMV could be a factor leading to development of cancer through UL48-DUB in immunocompromised or immune-declined aged individuals and HCMV-DUB could be a potential therapeutic target to manage HCMV-associated cancers.

Materijali i metode

Cell lines, plasmids, antibodies and viruses

Human Embryonic Kidney (HEK293) and HeLa cell lines were obtained from American Tissue Culture Collection (ATCC). Neuroblastoma IMR32 cell line was obtained from National Centre for Cell Science (NCCS) Pune, India and HFFs were obtained from Professor Wade Gibson's Lab, Johns Hopkins, School of Medicine. All cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% FBS and 1 × Anti-Biotic Anti-Mycotic, supplied by Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) by Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

N-terminal of UL48 (UL48N, 1–1162 amino acids) was cloned in FLAG-tagged mammalian expression vector pCMV3Tag1a. UL48NΔDUB (a double mutant of C24I and H162A) UL48NΔNLS (a single mutant of K287S) were created by using UL48N as template and cloned in pCMV3Tag1a. IRAK1, TRAF3, TRAF6, MyD88, STING were cloned in myc-tagged mammalian expression vector pCMV3Tag2a. Plasmids containing Firefly Luciferase gene under IFN β , IFN α 4 and IFN α 6, ISRE promoters, and Myc-tagged IRF7 were obtained from Professor Shizuo Akira's (Osaka University, Japan). HCMV genomic DNA, pCMV3Tag1a (FLAG), pCMV3Tag2a (myc) and pRL-TK were kind gifts from Professor Yan Yuan, University of Pensylvania, Philadelphia. The p21promoter-Luciferase construct was obtained from Professor Martin Walsh's Laboratory through Addgene (Cambridge, MA, USA).

Mouse raised anti-FLAG, Rabbit raised anti-myc and Rabbit raised anti-HA antibody were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Mouse raised anti-myc antibody was purchased from Invitrogen by Thermo Fisher Scientific. IR dye labeled anti-Rabbit and anti-Mouse IgG (secondary antibody), were purchased from LI-COR. Rabbit raised anti-p53 were purchased from Invitrogen. Rabbit raised anti-p21, anti-BCL2, anti-Caspase-3, anti-Survivin were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), anti-BIRC3 was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).

GFP-tagged (strain AD169), wild-type (H-WT) and H162A mutant (HΔDUB, or DUB-mutant WT-HCMV and DUB-mutant HCMV were kind gifts from Professor Wade Gibson, The Johns Hopkins University School of Medicine. AD169 is extensively passaged, fibroblast adapted laboratory strain of HCMV, which is non-pathogenic; NDV-GFP was a kind gift from Professor Peter Palese, Icahn School of Medicine at Mount Sinai.

Virus infection

HFFs were grown to full confluence and infected with GFP-tagged HCMV at 5 MOI. At 24 h post infection, virus infection (% infection) was measured through flow cytometer for FITC (GFP-HCMV). Six days post infection, CPE was observed and cells were harvested for RNA isolation. For cell cycle, Ki67 staining and apoptosis study, infection was done for three and four days respectively. IMR32 cells were infected with NDV-GFP (5 MOI) in serum free DMEM for 1 h. Cells were then grown in reduced serum (1% FBS) DMEM for 36 h.

MTT test

MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide] assay was done as described previously. 10

Quantitative RT PCR

Designated cells were either infected with virus or transfected with respectively designated plasmids containing UL48N, UL48NΔDUB (1 μ g/well, 12-well plate), or 1 μ g/well (24-well plate) of p(I:C), or stimulated with CpG (0.5 μ M/well) for indicated times. Total RNA was isolated using Trizol reagent (Ambion/Invitrogen) and cDNA was synthesized using iScript cDNA synthesis kit (BioRad, Hercules, CA, USA) as per the manufacturer's protocol. cDNA was used to analyze the transcript level in samples as indicated. Real time quantification was done using StepOne Plus Real time PCR Systems by Applied BioSystems (Foster City, CA, USA). Primers used for quantitative RT PCR are previously mentioned 10 and also listed in Supplementary Table1.

Cell cycle flowcytometry

HFFs were grown to 100% confluence and infected with wild-type and DUB-mutant HCMV. After 3 days of infection cells were harvested and fixed with 70% chilled ethanol. RNaseA (5 μ l of 10 mg/ml stock) was added to ethanol and incubated at 4 °C for 30 mins. Cells were washed with 1 × PBS and propidium iodide (PI, 10 μ l of 100 mg/ml stock) was added to cells and incubated Overnight at 4 °C. PI-based cell cycle flow cytometric analysis was done using FACS Aria III (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) and data were analyzed by using FlowJo software version 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA).

Annexin-PE flowcytometry

HFFs were grown to 100% confluence and infected with wild-type and DUB-mutant HCMV. On second dpi, cells were treated with etoposide (30 μ M) and incubated for 24 h. On third dpi cell were trypsinised, harvested, washed with 1 × PBS and processed for Annexin-PE Flow Cytometery using the BD Biosciences (Haryana, India) Annexin V apoptosis kit (Cat No# 556422) as per the manufacturer's protocol. Flowcytometric analysis was done using FACS Aria III (Becton Dickinson) and data were analyzed by using FlowJo software version 10 (FlowJo).

MKi67 staining

HCMV-infected HFFs were harvested on 3 dpi, washed with 1 × PBS, fixed with 70% chilled ethanol at −20 o C for 2 h. Cells were washed with staining buffer (1%FBS and 0.09% NaN3 made in 1 × PBS). 1:200 dilution of APC labeled Ki67 antibody (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA, Cat No.# NB110-89717APC) was used for staining the fixed cells at room temperature. Stained cells were analyzed for MKi67 nuclear staining using FACS Aria III (Becton Dickinson) and data were analyzed by using FlowJo software version 10 (FlowJo).

MKi67 stable cell generation and HFF knockdown

UL48N and UL48NΔDUB constructs were prepared by subcloning into pMSCV-puro vector. Transduction of IMR32 cells was performed as described earlier (Tailor et al. 2007). In brief, viral supernatants were prepared in BOSC23 packaging cell line using construct for VSV-G. Cells were spinoculated (2400 rpm, 33 °C, 1 h) with viral supernatants and selected using 0.2 μ g/ml of Puromycin for 48 h.

Knockdown experiment: HFFs were transfected with shRNA of MyD88 (Clone D1) or STING (Clone A8), obtained from Sigma Aldrich and selected on puromycin. The transcript level of myd88 and sting was analyzed through qPCR. HCMV infection (5 MOI) was done to knockdown cells for 3 days and on 3 dpi cells were harvested to isolate RNA for real time analysis of IFNβ transcripts. The shRNA against GFP (sh005) was taken as knockdown control.

Transfekcija

Transfection was done using Lipofectamine 2000 or 3000 (Invitrogen) as per the manufacturer's protocol. For transfection related to immunoprecipitation, after 6–7 h post transfection, MG132 was added to the transfected cells to a final concentration of 0.5 μ M and incubated for further 30–40 h.

Glucose uptake assay

Glucose uptake assay was done as previously described. 61 Cells were seeded at a density of 0.1 x 10 6 cells/well into 48-well plates in 200 μ l culture medium and incubated for 24 h. Cells were then incubated in serum and glucose free DMEM for 2 h. Serum and Glucose starved cells were treated with 10 μ M 2-NBDG (Invitrogen) for 10 min at 37 °C and then analyzed on BD FACS CantoII flow cytometer. 2-NBDG fluorescence was detected on FITC channel. 2-NBDG: (2-(N-(7-Nitrobenz-2 oxa-1, 3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose.

Luciferase based promoter Assay

HEK293 cells were transfected with empty vector, expression plasmids containing genes for either, MyD88, STING, TRAF6, TRAF3, IRAK1 or IRF7 (250 ng/well, 24-well plate), UL48N (250 ng/well, 24-well plate), UL48NΔDUB or UL48NΔNLS (250 ng/well, 24-well plate), along with 100 ng of IFN α 4, IFN α 6, IFN β and ISRE promoter containing Firefly luciferase expression plasmid and Renilla Luciferase containing plasmids (pRL-TK, 5 ng/well) as depicted. Luciferase assay was done with total cell lysate containing above-mentioned promoters and gene constructs by using Dual-Glo, Luciferase assay system (Promega, Madison, WI, USA) as per the manufacturer's protocol. Luminescence of each sample was measured by the Glomax (Promega).

Wound-healing assay

IMR32 Cells were grown at 100% confluence and transfected with designated plasmids (1 μ g/well, 12-well plate, or as indicated). A sharp wound was created using 200 μl pipette tips, 6 h post transfection. Wounds were visualized at × 10 Sigma Aldrich objective lens under the bright field microscope and three random images were captured for few days as indicated. Wound width was measured and plotted as a line graph using GraphPad Prism Version 5.

Matrigel invasion assay

Matrigel invasion assay was done as demonstrated at //www.abnova.com

Immunoprecipitation (IP) and Immunoblotting

For deubiquitination studies, each plasmid was taken 2 μ g in concentration for transfection into cells grown in 35 mm culture dish. Cells were treated with 0.5 μ M MG132, 6 h post transfection. Cells were harvested after 36 h. of transfection with standard cell lysis buffer supplemented with 1 × protease inhibitor cocktail (obtained from Sigma Aldrich) and 10 mM NEM ( N -Ethyl Maleimide). Immunoprecipitation and Immunoblotting were done as described previously. 62 Immunoblotted nitrocellulose membrane was imaged with LI-COR system.

For endogenous protein detection, mock or HCMV-infected HFFs (grown in six-well plate) were lysed in 30 μ l of standard cell cell lysis buffer and ~8 μ g of protein was loaded to each well.

ImageJ image analysis

Western blot densitometry: an area of interest was selected on the smeary part above the protein bands shown in the immunoblots. Mean density of the selected area was then calculated.

Mikroskopija

The mCherry-tagged UL48N and UL48NΔNLS were transfected in the HeLa cells. After 24 h of transfection, cells were fixed and stained with DNA staining reagent Hoechst 33342. Localization of pUL48 and pUL48NΔNLS was visualized at × 63 with Apotome-AXIO fluorescence microscope by Zeiss. HCMV infection (GFP fluorescence) was visualized with Inverted microscope Vert.A1 (AXIO) by Zeiss.

I-IFN receptor blocking

The IFNAR α/β receptor was blocked as described previously, 63 using anti-IFNAR chain2 antibody (Clone#MMHAR2, Cat# MAB1155) from Merck. Upon blocking for 4 h, HFFs were infected with HCMV.

Statistička analiza

Statsitical analysis was done with the help of GraphPad Prism, version 5. In the bar graph, differences between two groups were compared using an unpaired two-tailed Student's t -test, whereas the differences between three or more groups was calculated by using one-way analysis of variance by Newman–Keuls test. Differences were considered statistically significant with a * P -value<0.05, ** P -value<0.01 and *** P -value<0.001, ns, non-significant difference ( P -value>0.05).

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska tablica 1

  2. 2.

    Dopunske slikovne legende

Datoteke Powerpoint

  1. 1.

    Dopunske brojke

    Bilješka izdavača

    Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)