Eksperimentalni atopijski dermatitis ovisi o il-33r signalizaciji putem myd88 u dendritičkim stanicama | stanična smrt i bolest

Eksperimentalni atopijski dermatitis ovisi o il-33r signalizaciji putem myd88 u dendritičkim stanicama | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Atopijski dermatitis
  • Stanična signalizacija
  • Dendritičke stanice
  • patogeneza

Sažetak

Atopijski dermatitis (AD) je kronični upalni poremećaj kože tipa Th2. Ovdje izvješćujemo da je signalizacija MyD88 ključna u patogenezi eksperimentalnog AD induciranog vitaminom D3 analogom MC903. Klinički znakovi i upala uzrokovana MC903 drastično su smanjeni kod miševa MyD88 - / - sa smanjenim eozinofilima, infiltracijom neutrofila i ekspresijom citokina Th2. Biološki učinak članova interleukin-1 (IL-1) ovisi o signalizaciji MyD88. Primijetili smo snažnu regulaciju ekspresije citokina iz porodice IL-1, uključujući IL-1 α , IL-1 β , IL-33, IL-18, IL-36 α , IL-36 β , IL-36 γ i IL-36Ra, Stoga smo pitali koji bi citokin iz IL-1 obitelji bio presudan za sindrom izazvan MC903. Pronašli smo značajno smanjenje AD u IL-33 - / - i IL-33R / ST2 - / - miševima, samo manje smanjenje dvostrukih IL-1 αβ - / - miševa i bez razlike u IL-36R - / - i IL-36Ra - / - miševi. IL-33 se eksprimira u keratinocitima, a MyD88 signalizacija u dendritičkim stanicama (DC) je presudna za razvoj AD, jer je upala drastično smanjena za DC-specifične MyD88 - / - miševe (CD11c-cre × MyD88-u floxu). Uzeto zajedno, podaci pokazuju kritičnu ulogu MyD88 u istosmjernim mrežama i IL-33 signalizacijom putem ST2 u AD-induciranoj MC903. Ovi podaci sugeriraju da IL-33 / IL-33R može biti terapijska meta AD.

Glavni

Atopijski dermatitis (AD) je kronična upalna kožna bolest tipa Th2 povezana s kožnom hiperreaktivnošću na okidače okoliša. 1 Utječe najmanje 15% djece i 3% odraslih. 2 Pacijenti pate od relapsih ekzematoznih i povremeno generaliziranih (eritrodermijskih) lezija povezanih s jakim pruritusom. 3 Kronični AD rezultira infiltracijom upalnih dendritičnih stanica (DC), makrofaga i eozinofila u lezijama. 4, 5 Ova je kožna bolest često povezana s drugim alergijskim poremećajima kao što su astma, rinitis ili konjuktivitis. Osim toga, AD koji uzrokuje pruritus utječe na kvalitetu života pacijenata i povećava osjetljivost na mikrobnu kolonizaciju poput infekcije Staphylococcus aureus . 6, 7 Zbog toga AD i danas u mnogim zemljama ostaje ozbiljna briga za zdravlje. Dijagnoza AD temelji se na kliničkim znakovima svrbeža, ekcema lica i ekstenzora u dojenčadi i djece, fleksualnog ekcema u odraslih i kroničnosti dermatitisa. 4 Međutim, temeljni patofiziološki i genetski mehanizmi koji dovode do očitovanja AD-a trebaju daljnja ispitivanja.

Klinički fenotipi koji karakteriziraju AD su disfunkcija barijere kože i imunološka disregulacija. Mutacija gena Filaggrin dovodi do disfunkcije barijere kože i gubitka transepidermalne vode, što rezultira sindromom AD. 8, 9 Najčešća objašnjenja ove alergijske bolesti su porast imunolobulina E (IgE) u serumu kao i imunološki odgovor T pomagača-2 (Th2) s povećanim interleukinom-4 (IL-4), IL-5, IL- 10 i IL-13. 6, 7, 10 Ovi fenomeni dovode do povećanog izlaganja alergenima, koje Langerhansove stanice pokupe do limfnih čvorova i stimuliraju naivne CD4 + T stanice (Th0) da se diferenciraju u Th2 stanice. Poznato je da su povezani citokini koji se proizvode kao što su IL-4 i IL-13 stimuliraju proizvodnju IgE, dok je IL-5 jedan od najvažnijih citokina za stvaranje eozinofila. Dobro uspostavljena funkcija IgE je njegovo posredovanje u aktiviranju mastocita11, što može izazvati ekspresiju protuupalnih citokina keratinocitima, kao i migraciju DC-a. Pregledano je da oštećene funkcije barijere mogu potaknuti signalne kaskade, zahvaćajući epidermalni homeostatski odgovor, kao i upalnu reakciju tipa 2. 12

Obitelj IL-1 je skupina citokina koja ima središnji posrednik urođenog imuniteta i upale. Čine ga tri poddružine: poddružina IL-1 (IL-1 α , IL-1 β i IL-33), poddružina IL-18 (IL-18 i IL-37) i poddružina IL-36 (IL-36 α / β / γ , IL-36Ra i IL-38). 13 Svi članovi IL-1 obitelji koji se vežu za svoje specifične receptore regrutiraju zajednički adaptivni protein MyD88 i IL-1R-kinazu povezanu s IRAK, imaju glavnu patogenu ulogu u autoinflamatornim, autoimunim, zaraznim i degenerativnim bolestima. 13, 14, 15, 16 Za funkciju citokina iz porodice IL-1 u patogenezi AD, nedavni podaci istaknuli su porast IL-33 u koži pacijenata s AD i u eksperimentalnom AD izazvanom ovalbuminom. 17 Osim toga, Konishi i sur. 18 otkriva da je koža posebno prekomjerno izražena IL-18 dovela do spontanog razvoja upalne lezije nalik AD-u. Nadalje, objavljeno je da IL-1 pospješuje razvoj AD. 18 Uloga ostalih članova obitelji IL-1 u indukciji AD, kao što je IL-36 α / β / γ ili njegov antagonist IL-36Ra, slabo je shvaćena. Nema izvještaja koji bi korelirali AD ozbiljnost upale između miševa IL-33 i drugih miševa s manjkom člana IL-1.

Za vitamin A3 MC903, koji se koristi za liječenje bolesnika s kožnim rakom, objavljeno je da inducira sindrom sličan AD, uključujući upalu tipa Th2 s eozinofilijom i hiper-IgE imunoglobulinemijom. 19, 20, 21 Da bismo razumjeli funkciju citokina iz porodice IL-1 u patogenezi AD-a, koristili smo MC903 da inducira AD kod miševa. Prvo smo istražili ekspresiju različitih IL-1 članova u MC903-induciranom AD-u, a zatim usporedili težinu upale AD u BL6 i kod miševa s nedostatkom gena, uključujući IL-1 αβ - / -, IL-1R1 - / -, IL-36 R - / -, IL-36Ra - / -, IL-33 - / -, IL-33 receptor ST2 - / -, MyD88 - / -, DCD specifičan MyD88 - / - (CD11c-kre × MyD88- u flox) i mD-specifične MyD88 - / - (CD4-kre × MyD88-floxed) miševe. Otkrili smo kritičnu ulogu MyD88 u istosmjernim mrežama i identificirali signalizaciju IL-33 putem ST2 / MyD88 da bismo bili kritično uključeni u razvoj AD.

Rezultati

Analogni vitamin D3 MC903 potiče eksperimentalni AD

Da bismo bolje razumjeli temeljne patofiziološke i genetske mehanizme AD, koristili smo analog vitamina D3 MC903 da induciramo AD u miševa. Svakodnevna lokalna primjena MC903 na uho uzrokovala je oticanje, crvenilo i ljuštenje kože (slike 1a i c). Mikroskopska istraga otkrila je snažnu dermalnu upalnu infiltraciju stanica epidermalnom hiperplazijom i hiperkeratozom (Slika 1d). Obilna infiltracija mijeloidnih stanica i limfocita 9 dana nakon topikalne primjene MC903 u usporedbi s kontrolnim miševima tretiranim etanolom identificirana je protočnom citometrijom (Slika 1e). Regrutovanje i aktiviranje neutrofila izazvanih MC903, o čemu svjedoče povećana mijeloperoksidaza (MPO), lipokalin-2 (LCN-2) i metaloproteinaza-9 (MMP-9), koji se mogu otkriti u dan 3 i dostići maksimum na dan 9 (Slike 1f i h). Ovi su rezultati u skladu s izvještajima o kroničnom AD-u. 4, 5 Kako se smatra da Th2 citokini sudjeluju u patogenezi AD-a, otkrili smo da su ELISA u 3 dana povećali IL-4, IL-5 i IL-13 na upaljenoj koži koji se povećao do 12. dana (Slike 1i i k). Nadalje, bolesnici s AD-om pokazali su povišeni broj eozinofila u krvi i razinu IL-5 u plazmi, što ima važnu ulogu u razvoju i preživljavanju eozinofila. 22 U skladu s ovim izvješćem, otkrili smo pojačanu ekspresiju eotaksina-2 u roku od 6 dana, a maksimum je bio 9 dana, što ukazuje na aktivaciju eozinofila (Slika 1l). Nadalje, ekspresija limfitopoetina timične strome (TSLP), koji je uključen u razvoj AD-a induciranog MC903, 20, 23 također je inducirana vremenski ovisnim načinom (Slike 1m i n). Stoga MC903 izaziva snažan alergijski upalni odgovor sličan AD-u.

Image

Vitamin D3 analog MC903 inducira AD. ( a ) Shema primjene MC903. ( b ) Povećanje debljine uha nakon svakodnevnog liječenja MC903. ( c i d ) Fotografije ( c ) i H&E bojenje ( d ) ušiju tretiranih MC903 i etanolom u 12. danu. Linija skale predstavlja 50 μm. ( e ) infiltracijske stanice CD11b + i CD11b + Ly6G + u koži AD lezija pomoću FACS. ( f - n ) Izraz MPO (f), LCN-2 ( g ), MMP-9 ( h ), IL-4 (i), IL-13 ( j ), IL-5 ( k ), eotaksin- 2 ( l ) i TSLP ( m i n ) u uhu tretiranom etanolom ili MC903. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. P- vrijednosti su analizirane jednosmjernom ANOVA u b i m, dvosmjernim t- testovima u e ili dvosmjernom ANOVA u f - l i n . Svi su podaci reprezentativni za dva do tri neovisna pokusa s n = 5 po grupi i znače ± SEM

Slika pune veličine

IL-33 je reguliran od strane epitelnih stanica u koži nakon MC903-inducirane AD

Kako citokini iz porodice IL-1 funkcioniraju kao središnji posrednik urođene imunosti i upale, istraživali smo ekspresiju citokina iz porodice IL-1 u koži i otkrili značajnu regulaciju ekspresije IL-33 i na razini gena i na proteinu nakon primjene MC903 ( Slike 2a i b). Imunofluorescentna analiza korištenjem antitijela na IL-33 otkrila je da je IL-33 snažno eksprimiran u jezgri epitelnih stanica u kontrolnim skupinama tretiranim etanolom, što je drastično regulirano nakon 12 dana liječenja MC903. Međutim, IL-33 nije bilo moguće otkriti kod miševa koji su tretirali MC903 sa IL-33 (podaci nisu prikazani). Da bismo odredili koje vrste stanica izražavaju IL-33 u AD-u, koristili smo IL-33 citrin reporter miševe pomoću protočne citometrije. IL-33 + stanice u koži bile su u osnovi epitelne stanice, MC903 je povećao ekspresiju IL-33 + citrina u keratinocitima (Slika 2d), dok je samo mali broj mijeloidnih stanica izrazio IL-33 (podaci nisu prikazani). Nadalje, IL-33 uglavnom je eksprimiran u epitelnim stanicama Epcam +, dok su neutrofili, makrofazi i DC predstavljaju male stanične populacije (Slika 2e). Konačno, osim IL-33, MC903 je također inducirao IL-1 α , IL-1 β , IL-36 α , IL-36 β , IL-36 y , IL-36Ra i IL-18 ekspresiju gena na vremenski ovisan način (Dopunska slika S1). Stoga je ekspresija IL-33 u osnovi inducirana u epitelnim stanicama AD-a, izazvanog MC903.

Image

IL-33 se uglavnom eksprimira epitelnim stanicama i CD11b + stanicama. ( a i b ) Kvantifikacija IL-33 mRNA ( a ) i ekspresije proteina ( b ) u mišjim ušima BL6 za različita vremena. ( c ) Imunofluorescentna analiza IL-33 u koži mišjeg uha nakon 12 dana liječenja MC903. Ova je slika reprezentativna za pet miševa s apscesom. Linija skale predstavlja 50 μm. ( d i e ) Ekspresija ukupnih i citrin Epcam + stanica procijenjena protočnom citometrijom MC903 upravljanih BL6 i IL-33 citrinskih reporterskih miševa na dan 12. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. P- vrijednosti su analizirane jednosmjernom ANOVA u a i e, dvosmjernom ANOVA u b . Svi su podaci reprezentativni za dva neovisna pokusa s n = 3–5 po grupi i znače ± SEM

Slika pune veličine

Razvoj AD-a od strane MC903 ovisi o IL-33 signalizaciji

S obzirom da MC903 inducira visoku ekspresiju citokina iz porodice IL-1, uspoređivali smo AD ozbiljnost upale u BL6, IL-1R1 - / -, IL-1 αβ - / -, IL-36R - / -, IL-36Ra - / -, IL-33 - / - i IL-33 receptor ST2 - / - miševa. Nije utvrđena značajna razlika između miševa BL6, IL-36R - / - i IL-36Ra - / - nakon 12 dana lokalnog davanja MC903, bilo na inflamatornoj infiltraciji ćelije ili izrazu citokina (dopunske slike S2 ​​i S3). Otkriveno je samo manje smanjenje oticanja uha i IL-13 ekspresije u miševima IL-1 αβ - / - i IL-4 u IL-1R1 - / - u usporedbi s miševima BL6 (dopunska slika S4a), ali nema razlike nađeno je na infiltraciji inflamatorne stanice i kliničkom rezultatu između BL6, IL-1 αβ - / - i IL-1R1 - / - (dopunske slike S4b-S4c i S5b-S5c) uz neznatan pad MPO, MMP-9 i eotaksina- 2 (dopunske slike S4e-S4h i S5e-S5h) u IL-1 αβ - / - i IL-1R1 - / - u usporedbi s BL6 miševima.

Nasuprot tome, sindrom AD-induciran MC903 izrazito je smanjen kod IL-33 - / - miševa sa smanjenim oticanjem uha (slika 3a), kliničkim rezultatom (slika 3b), infiltracijom inflamatornih stanica (slika 3c), proteinom eotaksinom povezanim sa aktivacijom eozinofila- Ekspresija citokina 2 i Th2 (slike 3d i g). Zaključno, podaci pokazuju da su MC903 regulirani IL-1 citokini iz porodice, ali čini se da je samo IL-33 neophodan za MC903-inducirani sindrom.

Image

IL-33 je ključan za AD90-induciranu MC903. ( a ) Debljina ušiju miševa BL6 i IL-33 - / - nakon svakodnevnog MC903 tretmana. ( b i c ) Klinički rezultat crvenila i skaliranja uha ( b ) i H&E obojenja ( c ) uha i BL6 i IL-33 - / - miševa tretiranih etanolom ili MC903 na dan 12. Linija skale predstavlja 50 μ m. ( d - g ) Ekspresija proteina eotaksin-2 ( d ), IL-4 ( e ), IL-5 ( f ) i IL-13 ( g ) u uhu liječenih miševa BL6 i IL-33 - / - s etanolom ili MC903 na dan 12. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. P- vrijednosti su analizirane pomoću dvosmjerne ANOVA u jednosmjernoj ANOVA u b - g . Svi su podaci reprezentativni za dva do tri neovisna pokusa s n = 4–8 po skupini i znače ± SEM

Slika pune veličine

IL-33 posreduje MC903-induciranu AD putem ST2-MyD88 signalizacije

Otkrivajući da je IL-33 važan za AD-sindrom izazvan MC903, istražili smo molekularne mehanizme koji su uključeni u razvoj AD-a ovisnog o IL-33.

Prvo smo ustanovili da je MC903-inducirano AD značajno smanjeno kod ST2 - / - miševa. Otekline uha (slika 4a), klinički rezultat (slika 4b) i infiltracija inflamatornih stanica (slika 4c) smanjeni su. Rezultati ELISA-e potvrdili su da su proteini eotaksin-vezani proteini eotaksin-2 povezani sa aktivacijom leukocita izazvani MC903, svi smanjeni kod ST2 - / - miševa u usporedbi s miševima BL6 (slike 4d i f), kao i Th2 citokini IL-4, IL-13 i IL-5 (slike 4g i i).

Image

IL-33 posreduje MC903-induciranu AD putem ST2 putanje. (ac) Povećanje debljine uha ( a ), klinički rezultat crvenila i skaliranja uha ( b ) i H&E bojenje uhova ( c ) BL6 i ST2 - / - miševa nakon 12 dana liječenja MC903. Linija skale predstavlja 50 μm. ( d - i ) Ekspresija proteina MPO ( d ), MMP-9 ( e ), eotaksin-2 ( f ), IL-4 ( g ), IL-13 ( h ) i IL-5 ( i ) u uho s BL6 i ST2 - / - miševima tretiranim etanolom ili MC903 na dan 12. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. P- vrijednosti su analizirane jednosmjernom ANOVA. Svi su podaci reprezentativni za dva do tri neovisna pokusa s n = 4–8 po skupini i znače ± SEM

Slika pune veličine

Drugo, procijenili smo da li će zajednički IL-1R obiteljski protein MyD88 biti uključen u razvoj fenotipa AD. U usporedbi s BL6 miševima, debljina uha smanjena je u MyD88 - / - miševima 12 dana nakon svakodnevnog lokalnog unosa MC903 (Slika 5a). Klinički znakovi upale kože i infiltracijske infiltracije stanica drastično su smanjeni u odsustvu MyD88 (slike 5b i c). Regrutovanje i aktiviranje neutrofila mjereno MPO, LCN-2 i MMP-9, kao i s eozinofilnom aktivacijom proteina eotaksin-2, svi su značajno smanjeni kod miševa MyD88 - / - u usporedbi s BL6 miševima (Slike 5d i g). U skladu s smanjenom upalom, ekspresija Th2 citokina IL-4, IL-13 i IL-5 je smanjena (Slike 5h i j). Prema tome, podaci pokazuju da IL-33 posreduje MC903-induciranu AD putem ST2-MyD88 putanje.

Image

IL-33 posreduje MC903-inducirani AD putem MyD88. ( a ) Debljina ušiju miševa BL6 i MyD88 - / - nakon svakodnevnog liječenja MC903. ( b i c ) Klinički rezultat ( b ) i H&E bojenje ušiju ( c ) BL6 i MyD88 - / - miševima tretiranim etanolom ili MC903 na dan 12. Linija skale predstavlja 50 µm. ( d - j ) Ekspresija proteina MPO ( d ), LCN-2 ( e ), MMP-9 ( f ), eotaksin-2 ( g ), IL-4 ( h ), IL-13 ( i ) i IL -5 ( j ) u uhu BL6 i MyD88 - / - miševima koji su tretirani etanolom ili MC903 na dan 12 * P <0, 05, ** P < 0, 01, *** P <0, 001. P- vrijednosti su analizirane dvosmjernom ANOVA u a jednosmjernom ANOVA u b - j . Svi su podaci reprezentativni za dva do tri neovisna pokusa s n = 4–7 po grupi i znače ± SEM

Slika pune veličine

MyD88 signalizacija DC-om je kritična za razvoj AD-a

IL-33 koji oslobađaju keratinociti, endotelne stanice i ostale imunološke stanice aktivira ST2, nakon čega slijedi aktivacija MyD88 i ekspresija faktora uključenih u nekoliko upalnih putova. 3, 24, 25, 26 Da bismo definirali koji ćelijski tip je uključen u razvoj AD, koristili smo ćelije specifične za MyD88 koji su nedostajali MyD88 koristeći kre-lox sustav 27 i otkrili da je sindrom izazvan MC903 AD sindromom drastično smanjen u DC specifičnom MyD88 (CD11c-cre × MyD88-floxed) miševi s nedostatkom. Protok citometrijom pokazao je povećanu infiltraciju DC stanica u MC903-inducirane kožne lezije u BL6 miševima (Slika 6a). Oteklina uha, klinički rezultat i upalna infiltracija stanica značajno su smanjeni u nedostatku MyD88 u istosmjernim krugovima (slike 6-d). Smanjenje upale kože povezano je sa smanjenim MPO, MMP-9, LCN-2 i eotaksinom-2 (slike 6e i h), kao i ekspresijom citokina Th2 (slike 6i i k). Stoga je signalizacija MyD88 u istosmjernim mrežama kritična za razvoj AD-a izazvanog MC903.

Image

IL-33-MyD88 signalizacija u istosmjernim mrežama potrebna je za razvoj AD. ( a ) DC infiltracija u kožnim lezijama. ( b - d ) Debljina uha ( b ), klinički rezultat ( c ) i H&E bojenje uha ( d ) BL6 i MyD88-floxed × CD11c-cre miševa nakon 12 dana liječenja MC903. Linija skale predstavlja 50 μm. ( e - i ). Ekspresija proteina MPO ( e ), MMP-9 ( f ), LCN-2 ( g ), eotaksin-2 ( h ), IL-4 ( i ), IL-5 ( j ) i IL-13 ( k ) u uho s BL6 i MyD88-floxed × CD11c-kre miševima tretiranim etanolom ili MC903 na dan 12. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. P- vrijednosti su analizirane dvosmjernim t- testovima u a i jednosmjernom ANOVA u b - k . Svi su podaci reprezentativni za dva do tri neovisna pokusa s n = 7-8 po grupi i znače ± SEM

Slika pune veličine

Rasprava

Poznato je da citokin IL-33 iz porodice IL-1 (IL-F11) potiče Th2 odgovore i može imati važnu ulogu u pokretanju AD jer je epidermalna primjena IL-33 izazvala upalu poput AD. 28 Međutim, funkcija ostalih citokina iz porodice IL-1, poput IL-1 α , IL-1 β , IL-36 α / β / γ i IL-36Ra, u patogenezi MC903 AD nije ranije istražena. Ovdje smo istražili put AD-induciranog MC903 u BL6, IL-33 - / -, IL-33 receptor ST2 - / -, IL-36R - / -, IL-36Ra - / -, IL-1 αβ - / -, IL-1Rl - / - i MyD88 - / - miševe. Izvještavamo o kritičnoj ulozi signalizacije IL-33 / ST2 kao eksperimentalnog AD-a u IL-33- i ST2 - / - miševima je drastično smanjen uz samo manje smanjenje IL-1 αβ - / - miševa, ali nema razlike u IL-36 R- / - i IL-36Ra- / - miševi. Kao što većina članova IL-1 signalizira putem MyD88, koristili smo miševe s nedostatkom MyD88 - / - i DCD specifične za MyD88 - / - (CD11c-cre × MyD88). Izvještavamo da je upalni odgovor uzrokovan MC903 smanjenim na MyD88 - / - miševima i u velikoj mjeri ovisan o DC jer je AD smanjen kod miševa s nedostatkom MyD88 specifičnog za DC. Stoga smo identificirali kritičnu ulogu IL-33 signalizacije putem ST2 i otkrili središnju funkciju MyD88 u DC-u kod upale kože poput AD903 izazvane MC903.

Obitelji IL-1 i IL-1 R impresivno su porasle u veličini, složenosti i podjeli rada. Otkrivanje urođenih limfoidnih stanica (ILC) i disekcija puteva diferencijacije T-stanica otkrili su bitne i razlikovne funkcije IL-1, IL-36, IL-33. 13 IL-l α i IL- 1P kodiraju se različitim genima, signalizirajući kroz isti receptorski kompleks (IL-1R1 i IL-1RAcP), i imaju slična biološka svojstva. IL-1 promiče reakcije T-stanica s ključnom ulogom za diferencijaciju Th17 stanica koje posreduju autoimune i kronične upalne bolesti, poput psorijaze. 29. Unatoč neznatnoj značajnoj razlici u upali, ekspresija MMP-9, eotaksina-2, IL-4 i IL-13 smanjena je u IL-1 αβ - / - i IL-1R1 - / - miševima u usporedbi s BL6 nakon 12 dana primjene MC903, što je ukazivalo da IL-1R1 ima manju ulogu u MC903-induciranoj AD. Ovi su rezultati u skladu s izvješćem da IL-1 može imati promovirajuću ulogu u razvoju atopijskih promjena. 18

Članovi obitelji IL-36 IL-36 α (IL-1F6), IL-36 β (IL-1F8) i IL-36 y (IL-1F9) vežu se na IL-1Rrp2 i koriste IL-1RAcP kao ko-receptor. IL-36Ra (IL-1F5), koji dijeli> 50% homologije s IL-1Ra, antagonist je receptora. 13 IL-36 proizvodi se urođenim imunološkim stanicama i limfocitima koji induciraju proizvodnju proupalnih citokina, hemokina i kostimulacijskih molekula, potičući na taj način polarizaciju Th1 i Th17 stanica. 30, 31 Postoje dokazi da je IL-36 uključen u patološka stanja, uključujući psorijazu 32 i infekciju A. fumigatus , 33 ali malo se zna o funkciji IL-36 kod kožnih bolesti tipa Th2. Za razliku od podataka o eksperimentalnoj psorijazi, IL-36 nije bitan za eksperimentalni AD izazvan MC903.

IL-33 signalizira putem ST2 receptora, koji se pridružuje IL-1RAcP da inducira signalizaciju ovisnu o MyD88. IL-33 je citokin koji je uglavnom uključen u imunitet tipa 2 i upalu. Njegovi glavni učinci na urođene i adaptivne stanice, uključujući ILC2, Th2 stanice i alternativno aktivirane M2 polarizirane makrofage, u skladu su s ovom općom funkcijom. 13, 34 Nadalje, IL-25 i IL-33 pokreću ILC tipa 2 u AD-u. Prije smo izvijestili da DC odgovaraju na IL-33 i doprinose diferencijaciji Th2 u plućima. 36 Naši podaci pokazali su da član IL-33 obitelji IL-1 može biti ključni faktor eksperimentalnog AD-a izazvanog MC903 i aktivirati DC-ove koji favoriziraju Th2 odgovore u patogenezi ove alergijske kožne bolesti.

DC su visoko specijalizirane profesionalne stanice koje predstavljaju antigene i obično se nalaze na nadzornim sučeljima ljudskog tijela kao što su koža ili sluznica, a smatra se da imaju važnu ulogu u pokretanju i regulaciji imunoloških odgovora, uključujući AD. 37, 38, 39 Ovdje smo primijetili da je MC903-inducirani AD smanjen u DC-specifičnim miševima s nedostatkom MyD88 u usporedbi s BL6 miševima, što sugerira da je MyD88 signalizacija u DC-ima kritična za razvoj AD. Interakcija između DC-a opterećenih antigenom i antigen-specifičnih T ćelija dovodi do proliferacije i diferencijacije T-stanica i stvaranja Th1, Th2, Th17 ili T reg ćelija. 2 U AD-u postoji pojačana ekspresija Th2 citokina, razine IgE u serumu i eozinofilija. 40 Nadalje, povećavaju se T-stanice specifične za alergen stvarajući IL-4, IL-5 i IL-13, ali malo IFN- γ u perifernoj krvi pacijenata s AD. 40, 41, 42 Pronašli smo MC903-inducirani eksperimentalni AD samo neznatno smanjen kod miševa s nedostatkom MyD88 signalizacije u T stanicama (miševi MyD88-floxed × CD4-cre) u usporedbi s BL6 miševima (podaci nisu prikazani). Naši podaci sugeriraju da IL-33 djeluje putem MyD88 signalizacije putem istosmjernih izvora uz manji doprinos T stanica tijekom razvoja AD. Za mehanizam IL-33 koji utječe na sposobnost DC-a da polariziraju T stanice, prije smo pokazali da su IL-33 mijeloidni DC aktivirali proizvodnju IL-6, IL-1 β , TNF, CCL17 i eksprimiranje visokih razina CD40, CD80, OX40L i CCR7. Štoviše, IL-33 aktivirani DC primarni su naivni limfociti za proizvodnju Th2 citokina. 36

ILC su obitelj razvojno povezanih stanica koje su uključene u imunitet te u razvoj i pregradnja tkiva. 43 Tri su različita člana ove obitelji identificirana na temelju njihovih različitih razvojnih potreba i ekspresije efektorskih citokina. 44 Među njima, tip 2 ILC2 proizvodi citokine povezane s Th2 da induciraju upalu pluća u određenim modelima alergijske astme. 43 Nadalje, ILC2 su obogaćeni u lezije kože pacijenata s AD 44, a specifična ekspresija IL-33 na koži razvila je spontanu upalu kože sličnu AD, koja je povezana s infiltracijom ILC2. 45 U ovom istraživanju otkrili smo da su i TSLP i IL-33 bili znatno regulirani u upalnim odgovorima nalik koži koji su bili slični AD903. Pojačani upalni odgovori, uključujući ekspresiju citokina Th2, značajno su suzbijeni u miševima IL-33 - / - ili ST2 - / -, što znači da su IL-33 i njegov receptor ST2 bitni za ekspresiju citokina izazvanu MC903. No, ovisi li ovisnost o TH2 odgovoru o ILC2 u daljnjem istraživanju.

Za razliku od sadašnjih rezultata i prethodnih otkrića, IL-33 je bio ključan za razvoj AD-upale kod miševa, 35, 45 Kim i sur. 44 otkrilo je da TSLP izaziva IL-33 neovisne ILC2 reakcije da promiče upalu kože u AD modelu. Razlozi neusklađenosti naših rezultata s nalazima Kim i sur. može biti posljedica veće doze MC903 i ranije vremenske točke za mikroskopsku analizu. Važno je da je ekspresija TSLP-a značajno porasla u ranoj fazi (otkriva se čak ranije nego 3. dan i dosegla je maksimum u 6. danu i brzo pala) kao odgovor na MC903, dok su IL-33 i Th2 citokini, kao i regrutovanje neutrofila i aktiviranje posrednici, poput ekspresije MPO, LCN-2 i MMP-9, otkrili su se u 3. ili 6. danu i dostigli maksimum u 12. danu. Stoga, pretpostavljamo da TSLP može imati središnju funkciju za sindrom sličan AD-sličnom AD90 kod rani stadij, dok je IL-33 neophodan za dugotrajne upale s pojačavanjem u kasnijoj fazi. U skladu s prethodnim izvješćem, 35 otkrili smo da je debljina uha kod IL-33 - / - miševa neznatno smanjena u usporedbi s WT kontrolama nakon 4 dana primjene, ali kontinuirana primjena MC903 povećala je debljinu uha u većoj mjeri kod WT miševa nego u IL-33 - / - miševa.

TSLP koji potiče iz keratinocita ključan je za upalne reakcije nalik vitaminu D3 i analogima izazvane AD. 20, 23 Naši rezultati pokazali su da nivo gena i proteina TSLP uzrokovane vitaminom D3, koji je izazvao MC903, ovisi o vremenu (Slike 1m i n). Inicirajući AD model u BL6 i TSLPR - / - miševima, ustanovili smo da je MC903-inducirani AD bio značajno smanjen u TSLPR - / - miševima 20 u usporedbi s BL6 miševima, uključujući upalnu infiltraciju stanica i ekspresiju citokina Th2, što sugerira da je TSLP esencijalni za MC903-inducirani AD, a IL-33 ima komplementarnu funkciju. Za mehanizme ekspresije TSLP pokazano je da RXR receptor vitamina D i heterodimeri receptora retinoične kiseline RXR i njihov ligand autonomno upravljaju ekspresijom TSLP u epidermalnim keratinocitima. Pronašli smo ekspresiju IL-33 koja ovisi o vremenu i u genu i u proteinu nakon MC903 tretmana. Ekspresija IL-33 primarno je lokalizirana u ne-hematopoetskim ćelijama, posebno keratinocitima, 46. a ovaj regulirani IL-33 je ključan za urođenu sluznicu i sustav, a ne za stečene imunološke odgovore. 47 Prema dosadašnjim izvještajima, imunofluorescentna analiza pokazala je da je ekspresija bazne razine IL-33 uglavnom u epidermalnim ćelijama u etanolnoj grupi, međutim nakon 12 dana liječenja MC903 ekspresija IL-33 je regulirana u epidermalnim stanicama i u manjoj mjeri u infiltraciji dermalnih mijeloidnih stanica.

Zaključno, otkrili smo da IL-33 u velikoj mjeri proizvodi keratinociti nakon višekratnog kožnog davanja MC903, a AD ovisi o IL-33 / ST2 signalizaciji. Nadalje, otkrili smo kritičnu ulogu MyD88 u istosmjernim mrežama za IL-33 signalizaciju putem ST2 u razvoju AD. Podaci sugeriraju da IL-33 / ST2 može predstavljati terapeutski cilj za ovu kroničnu upalnu bolest kože.

Materijali i metode

Miševi

C57BL / 6 miševa i IL-33 - / - 47, ST2 - / - 48, IL-36R - / - / IL-36Ra - / - 31, IL-lαβ - / - 49 / IL-1R1 - / - 50, MyD88 - / - 51, MyD88-floxed × CD11c-cre i MyD88-floxed × CD4-Cre 27 i IL-33 citrin reporter 52 miševa (stari 7–9 tjedana) bili su smješteni u našem specifičnom objektu bez patogena. na CNRS-u (UPS 44, Transgenose Institute, Orleans, Francuska). Miševi su održavani u postrojenju pod kontrolom temperature sa strogim 12-satnim ciklusima svjetlo / tamno, a njima je omogućen besplatan pristup hrani i vodi.

Izjava o etičnosti

Svi eksperimentalni protokoli na životinjama bili su u skladu s francuskim propisima o etičkim eksperimentima i pokusima na životinjama (vidi Charte Nationale, kodeks Rural R 214-122, 214-124 i Direktivu Europske unije 86/609 / EEZ), a odobrio ih je "Etički odbor za eksperimentiranje na životinjama CNRS Campus Orleans '(CCO), registriran od strane Francuskog nacionalnog odbora za etičku refleksiju na eksperimentima na životinjama (N ° 3) (CLE CCO 2012-042).

MC903-inducirani AD model

Kako bi se izazvala AD lezija, 1 nmol MC903 u 10 µl etanola ili etanola (nosač) naslikano je na oba uha dnevno 12 dana. 20, 35 Dvadeset i četiri sata nakon posljednjeg izazova, miševi su ubijeni, debljina uha mjerena je digitalnim kalibrom (Decimal Caliper, Asa Dental spa, Lucca, Italija), slike uha su se uzimale svakodnevno i klinički rezultat je ocjenjivan kao nema (0), blago (1), umjereno (2) ili teško (3) u skladu s crvenilom uha i skaliranjem.

Histologija

Parafinski dijelovi uha ugrađeni hematoksilin-eozinom za histopatološku dijagnozu, a klinička histološka ocjena ocijenjena je kao nijedna (0), blaga (1), umjerena (2) ili teška (3) prema dermalnoj ćelijskoj infiltraciji, epidermalne hiperplazije i izrade skalusa, analiza je provedena korištenjem konvencionalne optičke mikroskopije (Leica, Wetzlar, Njemačka).

Kvantitativni RT-PCR u stvarnom vremenu

Ukupna RNA pripremljena je pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) slijedeći upute proizvođača. RNA je kvantificirana pomoću spektrofotometra Thermo NANODROP 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), ukupna RNA (1 μg) prepisana je reverznim transkripcijama pomoću GoScript sustava za obrnutu transkripciju (Promega, Madison, WI, USA, mačka: A5001) prema proizvođaču upute. Q-PCR je proveden na Mx3005P (Stratagene, La Jolla, CA, SAD) koristeći GoTaq q-PCR Master Mix (Promega, mačka: A6001 / 2). Sljedeći testovi genske ekspresije kupljeni su od Qiagen (Hilden, Njemačka): GAPDH (NM_001289726.1; mačka: QT01658692), IL-33 (NM_133775.2; mačka: QT00135170) , IL-1α (NM_010554.4; mačka: QT00113505 ) , IL-lp (NM_008361.4; mačka: QT01048355), IL-36α (NM_019450.3; mačka: QT00136745), IL-36γ (NM_153511.3; mačka: QT00146734), IL-36Ra (mačka: QT00252931). Primer za IL-36β _ (NM_027163.4) kupljen je od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD) s slijedećim redoslijedom: 5′-ACAAAAAGCCTTTCTGTTCT-3 ′ (naprijed) i 5′-CCATGTTGGATTTACTTCTC-3 ′ ( reverse). Kvantifikacija ekspresije gena određena je usporednom 2 ΔΔ CT metodom. Relativne razine ekspresije određene su normalizacijom ekspresije gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazom (GAPDH). Sva su ispitivanja obavljena u triput i ponovljena su najmanje dva puta.

FACS analiza

Kako bi se karakterizirale stanice regrutovane na modelu AD izazvanih MC903, uši i limfni čvorovi četiri BL6 miševa tretirana etanolom ili MC903 sakupljeni su i digestirani u 3 ml reagensa (RPMI) koji sadrži 2 mg / ml kolagenaze tipa IV i 1 mg / ml DN-aze (Sigma) 60 minuta na 37 ° C. Suspenzija je zatim propuštena kroz stanični cjedilo (100 μm) i isprana s FACS puferom. Konačno, pripravljen je pripravak od oko 10 6 stanica i obojen antitijelima protiv mišjeg CD8 APC (53-6.7), CD4 V500 (RM4-5), CD11b Percp (M1 / 70), CD11c V450 (HL3) i Ly6G FITC (1A8 ) (sve BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD). Stanice su isprane s PBS EDTA, dodan je 7-AAD (BD Biosciences) 5 minuta prije analize za isključenje mrtvih stanica i analiziran pomoću FACS Canto II mašine (BD Biosciences). Podaci FACS analizirani su pomoću FlowJo softvera (TreeStar, Ashland, OR, SAD).

Otkrivanje proteina u uhu

Uzorci uha homogenizirani su u 1 ml PBS-a primjenom Ultra Turraxa (IKA-Werke, Staufen, Njemačka), supernatant je skupljen i testiran na sadržaj citokina koristeći komercijalno dostupne reagense za ispitivanje imunosorbanata za MPO, MMP-9, LCN-2, eotaksin-2, IL-33, IL-10, IL-1 y , IL-4, IL-13 i IL-5. (Duoset R&D Systems, Abingdon, Velika Britanija).

Stanična kultura i stimulacija

Neonatalni humani epidermalni keratinociti (Cascade Biologics, Portland, OR, SAD) uzgajani su u serumu bez EpiLife medija (Cascade Biologics) bez seruma koji sadrži 0, 6 mM Ca 2+, 1 × Epilife dodatak za rast, 50 U / ml penicilina i 50 μg / ml streptomicina u standardnim uvjetima kulture. Miševi primarni keratinociti izolirani su iz kože novorođenčeta kako koriste dispazu II i uzgajani u mediju 154CF uz dodatak HKGS, 0, 2 mM CaCl 2 (Invitrogen) i Pen Strep (100 jedinica / ml penicilina i 100 ug / ml sreptomicina) (Invitrogen). Primarni dermalni fibroblasti izolirani su od novorođenih miševa primjenom dispaze Σ. Nakon probave kože, izolirane stanice su centrifugirane nakon filtriranja i posute s DMEM-om (GIBCO, Carlsbad, CA, SAD) koji sadrži 10% FBS-a i 1% penicilina / streptomicina. Primarni peritonealni neutrofili izolirani su iz šest BL6 miševa ip ubrizgavanjem 3 ml tioglikolatnog medija (Sigma). Stanice su skupljene 4 sata kasnije peritonealnim ispiranjem hladnim PBS-om, a zatim ispiranjem s RPMI1640 medijem (GIBCO). Makrofazi dobiveni iz koštane srži i DC sa četiri BL6 miševa uzgojeni su kao što je ranije izvješteno. 27, 36 staničnih linija RAW264.7 i staničnih linija ljudskog fibroblasta (MEF) (Kineska akademija znanosti, Šangaj, Kina) uzgajane su u mediju DMEM (Invitrogen) koji sadrži 10% FBS (GIBCO), 50 U / ml penicilina i 50 ug / ml streptomicina (GIBCO) u standardnim uvjetima kulture. Za sve eksperimente stanične stimulacije, 2 x 105 stanica posijano je u svaku jažicu s 24 jamice ili 8 × 105 stanica koje su posijane u svaku jažicu sa 6 jažica. Kad su stanice uzgajane do 80% konfluencije, navedene doze MC903 korištene su za stimulaciju stanica za različita vremena. Nakon tretmana, stanice su sabrane u Trizolu za ekstrakciju RNA, a stanični lizati su sakupljeni u RIPA puferu za zapadnu analizu.

Imunofluorescentno bojenje

Koža s MC903 tretiranih miševa bila je smrznuta, sječena na 7 μm na kriotomu, montirana na staklene tobogane, fiksirana u 4% PFA u trajanju od 10 minuta i naknadno je tretirana s otopinom za traženje antigena 10 min na 95 ° C. Odjeljci su zatim obojeni kozjim protutijela protiv miša IL-33 (mačka: AF3626, R&D Systems), inkubirana na 4 ° C preko noći. Odjeljci su se 1 sat inkubirali s FITC-konjugiranim magarećim anti-kozjim antitijelima (R&D Systems) i zatim se postavili u ProLong Gold antifadni reagens s DAPI (Invitrogen) i vizualizirali ih mikroskopom (Leica). Otkrivanje proteina IL-33 u koži IL-33 citrinskih miševa reporter urađeno je prema našem prethodnom izvješću. 52

Statistička analiza

Svi su podaci prisutni kao srednja vrijednost ± SEM Koristili smo dvostrane t- testove za određivanje vrijednosti između dvije skupine. Analizirali smo više grupa jednosmjernom ili dvosmjernom ANOVA s Bonferroni post testom GraphPad prizme verzije 5 (Graphpad Software, La Jolla, CA, SAD). Za sve statističke testove smatrali smo da je P- vrijednost <0, 05 statistički značajna.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)