Izvanstanični serglicin nadoknađuje receptor cd44 na autokrin način kako bi održao samoobnavljanje u stanicama karcinoma nazofarinksa recipročnim aktiviranjem osi mapk / β-katenina | stanična smrt i bolest

Izvanstanični serglicin nadoknađuje receptor cd44 na autokrin način kako bi održao samoobnavljanje u stanicama karcinoma nazofarinksa recipročnim aktiviranjem osi mapk / β-katenina | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • Stanična signalizacija
  • Rak glave i vrata
  • Metastaza

Sažetak

Serglicin je proteoglikan za kojeg je prvo otkriveno da ga luče hematopoetske stanice. Kao komponenta izvanstanične matrice (ECM), serglicin potiče metastazu nazofaringealnog karcinoma (NPC) i služi kao neovisan, nepovoljan prognostički pokazatelj NPC. Detaljan mehanizam koji stoji na osnovi uloge serglicina u progresiji raka ostaje da se razjasni. Ovdje izvješćujemo da je pad serglicina u stanicama NPC inhibirao formiranje stanične kugle i sposobnost sejanja tumora. Smanjenje regulacije serglicina pojačalo je osjetljivost stanica NPC na visoke metastaze na kemoterapiju. Objavljeno je da je serglicin novi ligand za marker matičnih stanica CD44. Zanimljivo je da smo pronašli pozitivnu povezanost između ekspresije serglicina i CD44 u nazofaringealnim tkivima i NPC staničnim linijama. Daljnja studija otkrila je da je CD44 bio efektivni efektor serglicinske signalizacije, a serglicin aktivirao je osi MAPK / p- katenina da inducira ekspresiju receptora CD44 u petlji pozitivne povratne informacije. Uzeti zajedno, naša nova otkrića sugeriraju da je ECM serglicin-regulirana ekspresija CD44 receptora za održavanje NPC stabljike interakcijom s CD44 i aktiviranjem MAPK / β- kateninskog puta, što rezultira hemorezistencijom NPC stanica. Ovi nalazi sugeriraju da je intervencija osi serglicina / CD44 i signalnog puta nizvodno je racionalna strategija za ciljanje terapije matičnim stanicama NPC raka.

Glavni

Karcinom nazofaringeusa (NPC) jedno je od najčešćih zloćudnih bolesti u južnoj Kini i jugoistočnoj Aziji. 1, 2 Standardni tretman NPC-a u ranom stadiju je radioterapija, a liječenje naprednog NPC-a je istodobna kemoradioterapija. 3, 4, 5 Međutim, otprilike 30% bolesnika ima značajne stope lokalnog relapsa ili udaljenih metastaza, a prognoza je za ove bolesnike vrlo loša. 6 Metastatske NPC stanice često razvijaju otpornost na kemoterapiju, ali molekularni mehanizmi koji stoje na osnovi metastaziranja na NPC i otpornost na kemoterapiju nisu u potpunosti razumljivi.

Serglicin je proteoglikan ekspresioniran u hematopoetskim ćelijama, endotelnim ćelijama i embrionalnim matičnim stanicama 7, 8, 9, a sadrži jezgrani protein od 17, 6 kDa na koji je vezano glikoaminoglikanske lance osam heparina ili hondroitin sulfata. Jezgre proteina je bogat ponavljanjima serina i glicina. Lanci glikoaminoglikana variraju ovisno o vrsti stanice i imaju važan utjecaj na funkciju serglicina. 10. Iako serglicin ne sadrži transmembransku domenu, konstitutivno ga mogu izlučivati ​​hematopoetske stanice, endotelne stanice, akinarne stanice gušterače i stanice mijeloma. 9, 11, 12, 13

Kao komponenta izvanstanične matrice (ECM), serglicin sudjeluje u pakiranju sekretornih granula i regulira skladištenje ili oslobađanje enzima, serotonina i histamina u stanicama hematopoeze. 14, 15 Prvo smo izvijestili da serglicin potiče NPC epitelnu-mezenhimsku tranziciju (EMT) i metastaze na autokrini način. 16 Nedavni rezultati pokazali su da serglicin potiče agresivni fenotip metastaza stanica karcinoma dojke i povezan je s tumorigenezom mijeloma i akutnom mijeloidnom leukemijom. 12, 17, 18, 19, 20

U našem prethodnom istraživanju obavili smo izražavanje genomske ekspresije visoko-metastičnih i nisko-metastičnih staničnih linija NPC-a i odgovarajućih ksenografskih tumora te otkrili da je serglicin drugi najreguliraniji gen i usko je povezan s metastatskim NPC stanicama in vitro i in vivo . 16 Dalje smo pokazali da je serglicin neovisni marker udaljenih metastaza u NPC. 21 U drugoj studiji koja je uspoređivala profile genomske ekspresije NPC-a u odnosu na nekancerozno tkivo usфаfingela, otkrili smo da je ECM put remodeliranja bio najznačajnije promijenjen signalni put u tkivima NPC-a. Naši nalazi sugeriraju da serglicinski proteoglikan djeluje kao mikroenviroment ECM, gdje matične stanice raka NPC-a (CSC) obitavaju i mogu imati važnu ulogu u preustroju ECM-a odgovornog za napredovanje NPC-a. Serglicin kao ligand prepoznaje CD44 receptor, koji je marker CSC-a. 18, 22, 23 Ovi rezultati sugeriraju da osi serglicina / CD44 imaju važnu ulogu u održavanju samoobnove matičnih stanica. Međutim, signalni put aktivacijom osi serglicin / CD44 zasad je nepoznat u bilo kojem hematološkom i epitelijskom zloćudnom stanju. U ovom istraživanju pokazujemo da je serglicin usko povezan sa svojstvima CSC-a. Serglicin služi kao novi CD44 ligand, koji je nizvodno meta signalizacije β- katenina. Naši nalazi su najprije otkrili da serglicin može održavati staničnu stanicu NPC-a reguliranjem CD44 i aktiviranjem MAPK / β- kateninskog puta za moduliranje NPC metastaza i rezistenciju na kemoterapiju.

Rezultati

Visoko metastatske stanice S18 imaju značajnije karakteristike ćelija koje su slične stablima raka u usporedbi sa slabo metastatskim stanicama S26

Visoko metastatske stanice S18 i slabo metastatske stanice S26 dva su pojedinačna subklona izolirana iz roditeljske CNE2 NPC stanične linije našeg laboratorija. 24 S26 stanice su uglavnom bile kaldrme, dok su S18 stanice imale vretenastu morfologiju u obliku EMT (slika 1a). Nedavna istraživanja pokazala su da su CSC-ovi vrlo metastatski i mogu biti prilično plastični i povezani s EMT-om. 25, 26 Stoga smo pretpostavljali da će stanice S18 imati više karakteristika ćelija sličnih stablima raka. Da bismo potvrdili ovu hipotezu, ispitali smo ekspresiju gena povezanih matičnih stanica, uključujući listopad 4, Bmi-1, Nanog, Sox-2, ABCG2 i CD44. Otkrili smo da S18 stanice eksprimiraju višu razinu ovih gena u usporedbi sa S26 stanicama (Slika 1b).

Image

S18 stanice imaju značajnije karakteristike stanica poput matičnih karcinoma. ( a ) Razlike u staničnoj morfologiji između S18 stanica i S26 stanica. ( b ) razina ekspresije mRNA gena povezanih matičnih stanica (normalizirano na GAPDH) u stanicama S18 i S26. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05. ( c ) Test formiranja sfere. Stanice S18 i S26 prebrojane su i stavljene u ploče s ultra niskim klasterima tijekom 10 dana kako bi se omogućilo formiranje tumorske sfere (gornja ploča). Na donjoj ploči prikazan je broj sfera. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05, Studentov t- test. ( d ) Tumorigenski test. Serijska razrjeđenja stanica S18 i S26 supkutano su ubrizgana u gole miševe i praćena dva puta tjedno u trajanju od 30 dana. IHC obojenje serglicina u tkivima S18 tumora i S26 tumorskim tkivima (dno ploče, 200 ×). ( e ) Stanice S18 i S26 posijane su u ultra-niske nakupinske ploče i fotografirane pri povećanju × 40 nakon 6 h (gornja ploča). Ekspresija cijepljene kaspaze-3 određena je imunoblotingom (dno ploče). ( f ) IC50 cisplatina i 5-fluorouracila u stanicama S18 i S26 nakon 48 h. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3

Slika pune veličine

Sljedeći smo postupak izveli u obliku sfere kako bismo procijenili sposobnost obnavljanja ovih dviju staničnih linija. S18 stanice formirale su veće i obilnije tumorske sfere od S26 stanica (Slika 1c). Još važnije, kada su 8 × 10 2 S18 stanice ubrizgane potkožno golim miševima, 66, 7% miševa (4/6) razvilo je tumore u usporedbi sa samo 16, 7% miševa (1/6) ubrizganih u S26 stanice. Ova opažanja sugeriraju da stanice S18 imaju jači učinak klijanja i pokretanja tumora od S26 stanica. Imunohistokemija (IHC) pokazala je da su tkiva S18 tumora visoko izražena serglicinom u stromi (slika 1d). Visoko metastatske stanice imaju veću vjerojatnost da će izbjeći anoikis. 27 Da bismo ispitali sposobnost stanica da se odupiru anoikisu, prenijeli smo S18 stanice i S26 stanice iz ljepljivih posuda sa stanicama kulture na ploče s ultra niskim klasterima koje inhibiraju stanično vezanje. Otkrili smo da su se S18 stanice skupljale zajedno, dok je većina S26 stanica ostala kao pojedinačne stanice i izrazila je višu razinu cijepljene kaspaze-3 (Slika 1e), što sugerira da S18 stanice izbjegavaju anoikis. Nadalje, uzevši u obzir da su cisplatin i 5-fluorouracil prvi izbor kemoterapijskih lijekova za kliničke bolesnike s NPC-om, utvrdili smo IC50 cisplatina i 5-fluorouracila u svakoj staničnoj liniji i ustanovili da su S18 stanice otpornije na kemoterapeutske lijekove od S26 stanica (Slika 1f). Ovi podaci sugeriraju da stanice S18 imaju više karakteristika staničnih matičnih stanica raka nego S26 stanice, što implicira da je S18 željeni stanični model za NPC CSC istraživanje in vitro i in vivo .

Prekomjerna ekspresija serglicina usko je povezana s svojstvima S18 sličnih CSC-u

Naše prethodne studije pokazale su da se ekspresija serglicina povećala u visoko metastatskim S18 stanicama i odgovarajućim tumorima ksenografta, ali ne i u slabo metastatskim stanicama S26. 16 Slijedi stabilno smanjenje mRNA i ekspresije proteina u stanicama S18 pomoću dva različita lentivirusna šRNA koja prenose vektor (SG KD1 i SG KD2). Primjetno smo potvrdili da se izlučeni serglicinski protein s molekulskom težinom od oko 300 kDa značajno smanjuje u kondicioniranom mediju (CM), dok citoplazmatski serglicinski protein s molekularnom masom od 130 kDa ne pokazuje različito obilje imunoblotingom, što sugerira da je izlučeni serglicinski ECM bio više visoko glikozilirani i taj serglicin djeluje na autokrini način. S druge strane, u S26 ćelijama koji prekomjerno eksprimiraju serglicin, izlučeni serglicinski protein s molekulskom težinom od oko 300 kDa značajno je porastao u CM. (Slika 2a). Zanimljivo je da se stanična morfologija S18 promijenila iz vretenastog oblika u kaldrmu sličnu S26, što ukazuje na to da su nakon stabilnog rušenja serglicina visoko metastične S18 stanice pretrpjele mesenhimalni-prema-epitelijski prijelaz (MET) (slika 2b). Urušavanje serglicina smanjilo je ekspresiju gena povezanih sa stabljikom, uključujući Oct-4, Bmi-1, Nanog, Sox-2, ABCG2 i CD44 (Slika 2c). Suzbijanje serglicina također je smanjilo veličinu i broj sfera koje generiraju stanice S18, što ukazuje na kapacitet serglicina povećanih S18 samoobnavljanja (Slika 2d). Pored toga, kada su 2 × 10 2 stanice ubrizgane u gole miševe, 50% miševa (3/6) oblikovalo je opipljive tumore u grupi zabrisanih stanica S18 u usporedbi s miševima (0/6) u S18 SG KD2 skupini, sugerirajući da je razina serglicina povezana s tumorigenezom ili kapacitetom iniciranja tumora in vivo . Rezultati IHC-a također su pokazali smanjenu ekspresiju serglicina u tkivima tumora S18 SG KD2 (slika 2e). Međutim, oborenje serglicina nije utjecalo na brzinu staničnog rasta kada su stanice uzgajane u 10% fetalnom goveđem serumu (FBS). Međutim, stanice za obnavljanje serglicina imale su sporiju brzinu rasta u usporedbi sa kontrolnim stanicama za S18 scramble kada su stanice održavane u mediju koji sadrži 0, 1% FBS, što sugerira da je ECM serglicin pospješio preživljavanje sličnog CSC-u u S18 stanicama u mikrookolju koje je oštećeno u serumu (dopunska slika S1A), Ovi rezultati snažno sugeriraju da je serglicin usko povezan s svojstvima S18 stanica sličnih CSC-u.

Image

Supresija serglicina smanjuje CSC-ove osobine S18 stanica in vitro i in vivo . S18 stanice su stabilno transfektirane s jednom od dva serglicinska shRNA (KD1, KD2) ili šifriranom shRNA. ( a ) Ekspresija serglicina otkrivena je kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu i imuno-blotiranjem u S18 i S26 stabilnim staničnim linijama. Razine proteina serglicina nisu promijenjene u cjelovitim staničnim lizatima (WCL), ali izlučeni serglicinski protein značajno je smanjen u CM nakon rušenja serglicina. ( b ) Promjena stanične morfologije stabilno transficiranih stanica (40 ×). ( c ) Otpadanje serglicina značajno je smanjilo ekspresiju gena povezanih matičnih stanica. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05 ( d ) Supresija serglicina smanjila je veličinu i broj sfera generiranih stabilnim stanicama S18. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05 u odnosu na kodirane kontrole. ( e ) S18 kodirane stanice ili S18 SG KD2 stanice supkutano su inkulirane u gole miševe i promatrane su dva puta tjedno tijekom 30 dana. IHC obojenje serglicina u tkivima kod kojih je skenirano S18 i u tkivima tumora S18 SG KD2 (donja ploča, 200 ×)

Slika pune veličine

Smanjenje regulacije serglicina pojačava osjetljivost S18 na kemoterapiju

CSC su obično otporniji na apoptozu izazvanu kemoterapijom u usporedbi s ne-CSC-ima. Stanice S18 bile su rezistentne na kemoterapeutske lijekove (slika 1f), a pokazano je da je serglicin bio više izrazito izražen u stanicama hematopoetskih stanica rezistentnih na lijek. 28 Da bismo dodatno istražili doprinos ECM serglicina kemoresistenciji u stanicama S18, utvrdili smo IC50 cisplatina i 5-fluorouracila i otkrili da su obrubljene stanice serglicina osjetljivije na cisplatin i 5-fluorouracil od kontrolnih stanica. U stanicama S26, stanice sa prekomjernom ekspresijom serglicina bile su rezistentne na cisplatin i 5-fluorouracil u odnosu na kontrolne stanice (slika 3a). Nadalje, stanice za obnavljanje serglicina imale su više cijepljene razine PARP-a u odnosu na kontrolne stanice, što potvrđuje da serglicin daje rezistenciju na apoptozu izazvanu cisplatinom ili 5-fluorouracilom (Slika 3b). Testovi formiranja kolonije otkrili su da pad serglicina smanjuje broj kolonija kolonija s 18 cisplatinom (0, 3, 1, 2 μM) S18 staničnih kolonija (slika 3c), a prekomjerna ekspresija serglicina povećava broj kolonija kolonija tretiranih cisplatinom (0, 15, 0, 6 μM ) Slika 3d). Pored toga, oborenje serglicina inhibira brzinu rasta stanica nakon tretmana cisplatinom (0, 8 µM) ili 5-fluorouracilom (25 µM ), kako je ispitano MTS testom (slika 3e). Ovi podaci ističu važnu ulogu preživljavanja serglicina kao nišne ECM u otpornosti na kemoterapiju CS18-sličnih S18 stanica.

Image

Urušavanje serglicina povećava osjetljivost S18 stanica na cisplatin i 5-fluorouracil. ( a ) Stanice serglicinskih obustava S18 (KD1 i KD2), kodirane kontrolne stanice, stanice serglicininog ekspresije S26 i vektorske stanice tretirane su različitim koncentracijama cisplatina ili 5-fluorouracila tokom 48 sati kako bi se odredilo ICso testovima MTS. ( b ) S18 kodirane stanice ili S18 SG KD2 stanice su tretirane s povećanjem doza cisplatina ili 5-fluorouracila tokom 48 sati, a odcijepljena PARP ekspresija je analizirana imunoblotiranjem. ( c ) Testovi formiranja kolonije stabilno transficiranih S18 stanica tretiranih s nizom doza cisplatina (0, 0, 3, 1, 2 μM ). ( d ) Testovi formiranja kolonije stabilno transficiranih S26 stanica liječenih nizom doza cisplatina (0, 0, 15, 0, 6 µM ). ( e ) Proliferacija stabilno transficiranih S18 stanica liječenih cisplatinom (0, 8 µM ) ili 5-fluorouracilom (25 µM ) tijekom 6 dana. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05 za stanice KD1 ili KD2 u usporedbi s kodiranim kontrolama

Slika pune veličine

NPC CSC površinski marker CD44 je ERK ovisan silazni serglicin

Iako površinski marker CSC-a do sada nije dobro uspostavljen u NPC stanicama, naša nedavna istraživanja pokazala su da je CD44 vjerojatno bio željeni površinski CSC marker u NPC stanicama. 29, 30, 31 Da bismo potvrdili odnos između ECM serglicin liganda i njegovog receptora CD44, ispitali smo njihovu ekspresiju u 27 nazofaringealnih uzoraka pomoću kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu i otkrili jaku pozitivnu povezanost ( r = 0, 58, P = 0, 002) (Slika 4a). Dodatna analiza ekspresije sedam NPC staničnih linija pokazala je da su razine serglicina (slika 4b, gornja ploča) povezane s višim razinama CD44 (slika 4b, donja ploča). Značajno smo otkrili više razine fosfo-ERK1 / 2 u nekoliko staničnih linija NPC-a s višom ekspresijom serglicina i CD44, uključujući visoko metastatske stanične linije S18 i 5-8 F (slika 4b, donja ploča). Gornji rezultati sugeriraju da ECM serglicinski ligand djeluje u koordinaciji sa svojim receptorjem CD44, praćen aktivacijom MAPK putanje.

Image

Visoko korelirane razine ekspresije između serglicina i CD44. ( a ) Razine mRNA serglicina bile su pozitivno korelirane s ekspresijom CD44 u tkivima nazofarinksa, što je određeno kvantitativnom PCR u stvarnom vremenu (GAPDH je korišten kao referentni gen. Pearsonova analiza, r = 0, 58; P = 0, 002). ( b ) Relativne razine mRNA serglicina (normalizirane na GAPDH) u sedam NPC staničnih linija kako je procijenjeno kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu (gornja ploča). Western blot analiza CD44 ekspresije u sedam NPC staničnih linija. GAPDH korišten je kao kontrola utovara (donja ploča). ( c ) Western blot analiza CD44, p-ERK1 / 2, t-ERK1 / 2, p-AKT i t-AKT u naznačenim staničnim linijama. SG iznad ili vektor predstavljaju S26 stanice koje stabilno prekomjerno eksprimiraju serglicin ili se zaraze praznim vektorom, respektivno. ( d ) Analiza Western blot-a celih staničnih lizata iz S18 stanica tretiranih povećanim dozama selumetiniba (ERK inhibitor) u trajanju od 48 h. ( e ) Učinak selumetiniba (0, 50, 100 nM) na stvaranje sfere tumora od strane S18 ili S26 stanica. Na donjoj ploči prikazan je broj sfera. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05 nasuprot 0 nM-tretiranim stanicama. ( f ) Analiza Western blot-a celih staničnih lizata iz S18 stanica tretiranih povećanim dozama U0126 (ERK inhibitor) 12 h

Slika pune veličine

Da bismo istražili signalne putove izazvane serglicinom, prvo smo ispitali ukupnu i fosforiliranu razinu proteina ERK, AKT i CD44 u stanicama S18 i S26. Stvorili smo S26 stanice stabilno ekspresionirajući serglicin ili transfektirali praznim vektorom i potvrdili ekspresiju serglicina u tim stanicama kvantitativnom PCR analizom u stvarnom vremenu i Western blot analizom (Supplementarna slika S1B). Serglicin je bio prekomjerno ekspresioniran i izlučen u kulturu u S26 SG preko stanica u usporedbi sa S26 vektorskim stanicama bez detektabilnog povećavanja citoplazmatskog proteina Western blottingom (Dopunska slika S1B). S18 stanice izražene su značajno više razine CD44, fosfo-ERK1 / 2 i fosfo-AKT u usporedbi sa S26 stanicama (Slika 4c, lijeva ploča). Naknadno smo utvrdili ekspresiju istih proteina nakon rušenja serglicina ili prekomjerne ekspresije Western blot analizom. Prikazna stanica S18 serglicina pokazala je smanjenu razinu CD44 i fosfo-ERK1 / 2, dok se razine fosfo-AKT nisu promijenile (Slika 4c, srednja ploča). Suprotno tome, prekomjerna ekspresija serglicina u stanicama S26 povećala je ekspresiju CD44 i fosfo-ERK1 / 2, ali nije utjecala na razine fosfo-AKT (slika 4c, desna ploča). Rezultati su pokazali da je ECM serglicin-posredovana modulacija njegovog receptora CD44 bila na ERK-ovisan i AKT-neovisan način.

Specifični ERK inhibitor selumetinib učinkovito je potisnuo fosfo-ERK1 / 2 ekspresiju u S18 stanicama i duboko inhibirao NPC CSC marker CD44 ekspresiju na način ovisan o dozi (Slika 4d). Zanimljivo je da tretman 50 nM selumetinibom nije značajno inhibirao stvaranje S26 staničnih sfera, ali je značajno smanjio broj s18 staničnih sfera (Slika 4e). Nadalje, u S18 stanicama, drugi ERK inhibitor U0126 također inhibira ekspresiju CD44 i stvaranje stanične sfere na način ovisan o dozi (Slika 4f, Dopunska slika S1B). Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazuju da je NPC CSC marker CD44 ovisan o ERK-u nižeg serglicinskog efektora i da je kapacitet samoobnavljanja u NPC CSC-ima moguće održavan ECM-ovim aktivirajućim ERK signalom koji aktivira serglicin.

Serglycin inducira CD44 ekspresiju da potencira svoju sposobnost samoobnove aktiviranjem MAPK putanje

Da bismo dalje potvrdili da ECM ligand proteaglikan serglicina inducira njegovu receptorsku CD44 ekspresiju, prolazno smo transficirali CNE2 stanice serglicinom. Kao što se očekivalo, i razina mRNA CD44 i proteina povećala se nakon prekomjerne ekspresije serglicina na način ovisan o dozi (slika 5a). Nadalje, razina fosfo-ERK1 / 2 također se postupno povećavala. Zanimljivo je da je stimulacija CNE2 stanica, s serglicin-CM iz S18 stanica, inducirala dozno vreteno oblikovanu staničnu morfologiju koja je podvrgnuta EMT (slika 5b, lijeva ploča) i značajno povećala razinu proteina CD44 i fosfo-ERK1 / 2 (slika 5b, desna ploča ). Izvještaj reportera CD44 promotora luciferaze pokazao je smanjenu aktivnost CD44 promotora u stabilnom rušenju S18 stanica serglicina i pojačanu aktivnost u stabilnom serglicinskom prekomjernom pritisku S26 stanica (slika 5c, dopunska slika S2A), što sugerira da je aktivnost promotora CD44 izravno regulirala serglicin- aktiviranje specifičnog signalnog puta u skladu s gore navedenim rezultatima. Nadalje, neutralizacija tretmana anti-serglicin-blokirajućim antitijelom nije utjecala na stvaranje stanične sfere S26, ali je značajno smanjila broj s18 staničnih sfera, što ukazuje da su NPC CSC proizveli obilje ECM serglicin proteoglikana da veže CDP receptor CD44 sa staničnoj površini i zadržao sebe - obnavljanje na autokrini način (slika 5d).

Image

Serglicin-posredovana regulacija CD44 aktiviranjem MAPK putanje. ( a ) CNE2 stanice su prolazne transfekcije serglicinom. Razine mRNA serglicina i CD44 detektirane su kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu (lijeva ploča). Razine proteina CD44, p-ERK1 / 2, t-ERK1 / 2 i GAPDH određene su analizom western blota (desni panel). ( b ) CNE2 stanice su stimulirane serglicin-CM iz S18 stanica. Promjena u staničnoj morfologiji CNE2 (× 40, lijeva ploča). Razine proteina CD44, p-ERK1 / 2, t-ERK1 / 2 i GAPDH procijenjene su analizom western blota (desni panel). ( c ) Analiza aktivnosti luciferaze CD44 u stanicama za obnavljanje serglicina (lijeva ploča) i stanicama za prekompresiranje serglicina (desna ploča). GLuc aktivnosti u puferima sa stabilizatorom. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05 u odnosu na kontrolne stanice. ( d ) Broj sfera koje su tvorile stanice S18 i S26 nakon tretiranja s IgG ili anticerglicin protutijelom. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05 za stanice S26 u usporedbi sa stanicama S18

Slika pune veličine

MAPK / p- katenin put aktiviran je u stanicama S18

Wnt / β- katenin važan je i klasičan razvojni signalni put u embrionalnim i CSC-ima i njegova hiperaktivacija uključena je u pokretanje i napredovanje u većini malignih oboljenja. 32 CD44 uobičajeni je površinski marker CSC u podskupini karcinoma i ima ključnu ulogu u njihovoj tumorigenezi. 33 Prethodna ispitivanja pokazala su da je CD44 bio aktivirani transkripcijski ciljni gen ovisan o p -kateninu. 34, 35 Stoga smo slijedeće istraživali može li serglicin izazvati aktivaciju p- katenina da posreduje transkripciju CD44. Prvo smo procijenili razinu proteina β- katenina u nekoliko staničnih linija (Slika 6a). S26 stanice eksprimirale su značajno više razine β- katenina u usporedbi sa S18 stanicama. Sljedeće smo istražili lokalizaciju p- katenina u stanicama S18 i S26. Ispitali smo nuklearnu (N) i citosolnu / membransku (C + M) frakcije i utvrdili da je više β- katenina premješteno u jezgru u stanicama S18, dok se primarno lokaliziralo na staničnu membranu S26 stanica (slika 6b). Slične rezultate smo primijetili konfokalnom analizom imunofluorescencije (Slika 6c). Rezultati su gore pokazali da je p- katenin očito aktiviran i translociran u stanično jezgro S18, za razliku od S26 stanica.

Image

Lokalizacija β- katenina u stanicama S18 i S26. ( a ) Razina proteina β- katenina u naznačenim stanicama određenom analizom western blota. ( b ) Nuklearna (N) i citosolna / membrana (C + M) frakcije p- katenina u stanicama S18 i S26 utvrđena analizom western blota. Lamin B1 i tubulin korišteni su kao kontrola za odjeljak N i C + M, respektivno. ( c ) Lokalizacija p- katenina u stanicama S18 i S26 konfokalnom imunofluorescentnom analizom (× 400). ( d ) ekspresija mRNA c-Myc ili ciklinDl (normalizirana na GAPDH) u stanicama S18 i S26. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; ** P <0, 01 za stanice S26 u usporedbi sa stanicama S18. ( e ) Western blot analiza cjelovitih lizata iz stanica S18. ( f i g ) c-Myc ili ciklinDl mRNA ekspresija (normalizirana na GAPDH) u stanicama S18 i S26 tretiranim selumetinibom (ERK inhibitor) 48 h. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05, ** P <0, 01 u odnosu na 0 nM-tretirane stanice

Slika pune veličine

Za ispitivanje uzvodne signalizacije za posredovanje aktivacije p- katenina korišten je MAPK-specifični inhibitor selumetinib, a rezultati su pokazali da je inhibitor učinkovito potisnuo fosfo-ERK1 / 2 ekspresiju u S18 stanicama, a zatim duboko povećao N-terminalni fosfo- β -kateninski izraz, inaktivirani oblik (Slika 6e). Nadalje, ispitali smo c-Myc i ciklinDl mRNA ekspresiju, a obojica su dobro potvrđeni izravni ciljni geni o p -kateninu. 36 Ova su dva gena bila izrazito eksprimirana u S18 stanicama u usporedbi sa S26 stanicama (Slika 6d). Liječenje selumetinibom nije utjecalo na c-Myc i ciklinD1 ekspresiju u S26 stanicama, ali je smanjilo njihovu ekspresiju u S18 stanicama (Slike 6f i g). Pored toga, rezultati IHC-a pokazali su da je fosfo-ERK1 / 2 bio visoko izražen u tumorskim tkivima S18, a nuklearna lokalizacija β- katenina povećana je u usporedbi s tumorskim tkivima S26 (dopunska slika S2B). Stoga je put MAPK / p- katenina visoko aktiviran u stanicama S18 sličnih CSC-u u usporedbi sa stanicama koje nisu CSC S26.

Serglicin aktivira signalnu os MAPK / β- katenina za održavanje debljine S18 stanica u petlji s pozitivnim povratnim informacijama

ECM, kao bitan sastavni dio CSC mikrookoline, ima ključnu ulogu u održavanju karakteristika CSC-a. 37, 38 Da bi se dodatno istražila povezanost ECM serglicina s aktiviranjem signala β- katenina, analizom frakcioniranja i konfokalne imunofluorescencije stabilnih srčanih stanica serglicina otkriveno je da je dio β- katenina premješten iz jezgre u odjeljak membrane (slike 7a i b), što ukazuje da je ECM serglicin kao CD44 ligand specifično inducirao nuklearnu translokaciju β- katenina i pokrenuo β -katenin posredovanu transkripcijsku aktivaciju gena povezanih sa stabljikom. Važno je da smo otkrili da se c-Myc i cyclinD1 ekspresija mijenjaju nizvodno od β- katenina u stanicama za razbijanje serglicina ili u stanicama za prekompresiranje serglicina (Slika 7c, Dopunska slika S2D). IHC analiza pokazala je da je S18 kodirano tumorsko tkivo visoko eksprimiralo fosfo-ERK1 / 2, a β- katenin snažnije se lokalizirao u jezgru u usporedbi s tumorskim tkivima S18 SG KD2 (slika 7d). Ukratko, autokrinski serglicin, kao ECM komponenta i CD44 ligand, aktivira signalni put β- katenina za održavanje samoponovnog kapaciteta NPC CSC-a u petlji s pozitivnim povratnim informacijama.

Image

Aktivacija p- katenina uzrokovana serglicinom. ( a ) Nuklearne (N) i citosolne / membranske (C + M) frakcije P- katenina u S18 skupiranim, S18 SG KD1 i S18 SG KD2 ćelijama utvrđenim Western blot analizom. ( b ) Lokalizacija p- katenina u skeniranim S18, S18 SG KD1 i S18 SG KD2 stanicama konfokalnom analizom imunofluorescencije (× 400). ( c ) c-Myc mRNA ekspresija (normalizirana na GAPDH) u naznačenim staničnim linijama. Podaci predstavljaju prosjek ± SD, n = 3; * P <0, 05, ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane DMSO-om. ( d ) obojenje IHC p- kateninom i p-ERK1 / 2 u tumorskim tkivima kodiranim u S18 i tumorskim tkivima S18 SG KD2 (200 ×)

Slika pune veličine

Rasprava

Smatra se da su CSC-ovi pokretači pokretanja i progresije tumora i usko povezani s rezistencijom na kemoradioterapiju, recidivom i metastazama. 39 Mikrookolje tumora bitno je za samo obnovu CSC-a. ECM je sastavljen od složenog i dinamičnog niza izlučenih molekula, poput glikoproteina, proteoglikana, glikozaminoglikana i kolagena. 40 To je glavna komponenta mikroko okruženja tumora i uzajamno utječe na sposobnost stanice da modulira rast stanica, preživljavanje, pokretljivost i diferencijaciju vezanjem na specifične receptore, poput sindcana, integina i diskoidinskih receptora. 41, 42, 43 Jasno je da genetske modifikacije tumorskih stanica pokreću i pokreću zloćudnost, ali ECM-povezan s tumorom također je uključen u progresiju raka i modulira gotovo svako ponašanje stromalnih stanica povezanih sa tumorom. 44 Nadalje, nedavne sve veće studije pokazale su da je doprinos ECM-a u održavanju samoobnove CSC-a prijavljen na autokrini način kod mnogih karcinoma. 45, 46 Slično, ova studija je pokazala da su se GeneGo Metacore analizom putevi remodeliranja ECM-a najviše promijenili između NPC tkiva i ne-kanceroznih tkiva. Štoviše, ranije smo primijetili da je serglicin drugi najreguliraniji gen u S18 uzgojenim stanicama i S18 ksenografta izvođenjem profilacije gena, a visoka serglicinska ekspresija značajno je povezana s EMT i nepovoljnim rezultatima bolesnika s NPC-om. Ova ispitivanja snažno pokazuju da serglicin ima kritičnu ulogu u napredovanju NPC-a i neovisan je pokazatelj udaljenih metastaza u NPC-u. 21

Kao tipična komponenta ECM-a, serglicin je proteoglikan konstitutivno izlučen visoko metastatskim NPC stanicama. Na temelju Weinbergovog učinka, EMT stvara stanice sa svojstvima matičnih stanica. 25, 47 Međutim, do sada nije provedeno istraživanje koje bi razjasnilo mehanizam aktiviranja serglicina posredovanog signalnim putem u stanicama sličnim CSC-u. U ovom istraživanju koristili smo dva pojedinačna klona (S18 i S26) izvedena iz reprezentativne CNE2 NPC stanične linije uspostavljene u našem laboratoriju, 16, 24 s visoko metastatskim S18 stanicama koje posjeduju više staničnih karakteristika u obliku matičnih stanica (Slika 1). Druga su istraživanja pokazala da stanice S18 imaju visoka svojstva CSC-a. 48, 49 Iako konvencionalno liječenje ubija većinu stanica raka, smatra se da ostavljaju CSC iza sebe, omogućavajući razvoj kemoresistencije tumora, relapsa i metastaza. 50, 51 Kako ECM ima ključnu ulogu u uspostavljanju i održavanju niša matičnih stanica, 30, 42 istraživali smo ulogu serglicina u održavanju matične stanice S18. Prvi put smo otkrili da je serglicin usko povezan s CSC svojstvima S18 stanica (Slika 2). Osim toga, snižavanje regulacije serglicina povećava osjetljivost S18 stanica na kemoterapiju (Slika 3), sugerirajući da je serglicin obećavajući kandidat za ciljanje CSC-a. Ipak, tek treba istražiti buduća istraživanja drugih gena povezanih s CSC-om.

Stanična adhezivna molekula CD44 uobičajena je CSC marker u nekoliko tumora, a također je i trans-transkripcijski cilj posredovan β -kateninom. 33, 34, 35 Naše prethodne studije i druge studije pokazale su da je CD44 potencijalni NPC CSC marker. 30, 31, 38, 52 CD44 receptor veže se prvenstveno na hijaluronsku kiselinu, ali služi i kao serglicinski receptor. 18, 22, 23 Međutim, zasad je nejasno koji se signalni putevi nizvodno aktiviraju interakcijom serglicin-CD44. Istraživanje 27 nazofaringealnih uzoraka i 7 NPC staničnih linija otkrilo je da su razine ekspresije CD44 i serglicina snažno i izravno povezane (slike 4a i b). Važno je da smo otkrili da serglicin inducira CD44 ekspresiju da potencira sposobnost samo-obnove stanica aktiviranjem MAPK / β- kateninskog puta (slike 4 i 5). Wnt / β- katenin je ključni CSC signalni put i zanimljivo, NPC CSC-slične S18 stanice s visokim metastičkim potencijalom izražavaju nedetektabilni Wnt (podaci nisu prikazani), što sugerira da autokrini ECM serglicin, CD44 ligand, može funkcionirati kao Wnt za aktiviranje β- kateninskog puta u NPC CSC-sličnim S18 stanicama. Iznenađujuće, naša nedavna otkrića pokazuju da je Wnt5a sposobna aktivirati signalni put neovisan o β -kateninu da promiče karakteristike stabljike putem PKC-a u stanicama S18. 29 Drugim riječima, i β -kateninski neovisni (ne-kanonski) i-ovisni (kanonski) putevi istovremeno se i komplementarno aktiviraju autokrini wnt5a i serglicin u NPC CSC-sličnoj S18 staničnoj liniji s izrazito metastičkim potencijalom.

Zaključno, naša su otkrića prvi put pokazala da ECM serglicin kao CD44 ligand ima ključnu ulogu u održavanju stabljike NPC stanica i doprinosi metastaziranju i kemoresistenciji NPC stanica. Konkretno, serglicin regulira ekspresiju receptora CD44 recipročno aktiviranjem osi MAPK / p- katenina. Naši novi nalazi sažeti su na slici 8. Ovi značajni nalazi otkrivaju temeljnu pozitivnu povratnu vezu o ovisnosti o serglicinu i promiču put signalizacije osi serglicina / CD44 i nizvodno kao ključne ciljeve CSC-a u NPC-u.

Image

Model signalnog puta serglicin-CD44 u NPC-u. Serglicin se veže za CD44 i aktivira MAPK signalizaciju da naknadno promovira translokaciju p- katenina iz odjeljka membrane u jezgru. Imajte na umu petlju pozitivne povratne sprege u kojoj je CD44 uzlazni aktivator i nizvodni transkripcijski cilj puta MAPK / β- katenina

Slika pune veličine

Materijali i metode

Stanična kultura i tkiva

Ljudska stanična linija CNE2 NPC i njegov visoko metastatski klon S18 i slabo metastazijski klon S26 održavani su u Dulbecco modificiranom mediju orao (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA) sa 10% FBS-a (Gibco) u vlažnoj atmosferi s 5 % CO 2 pri 37 ° C. 16, 24 Primarni uzorci biopsije NPC-a prikupljeni su na Odjelu za nazofaringealni karcinom, Centar za rak Sveučilišta Sun Yat-Sen, uz informirani pristanak pacijenta, a svi NPC uzorci su patološki potvrđeni.

Lentivirusna transdukcija

BLOCK-iT Lentiviral Pol II miR RNAi sustav (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) korišten je za uspostavljanje S18 stabilnih staničnih linija. Ciljevi serglicin shRNA-1 i shRNA-2 bili su 5'-CTGGTTCTGGAATCCTCAGTT-3 'i 5'-CGCTGCAATCCAGACAGTAAT-3 '. Provjereni PCR u realnom vremenu i imunobloting provedeni su za procjenu učinkovitosti rušenja serglicina.

ViraPower Lentiviralni usmjereni TOPO ekspresijski komplet (Invitrogen) korišten je za generiranje serglicinsko stabilne prekomjerne ekspresije S26. Provedena je PCR u stvarnom vremenu i imunobloting kako bi se procijenila učinkovitost prekomjerne ekspresije serglicina.

Transfekcija plazmida

Uzgoj CNE2 stanica zasađenih u 1, 5 × 10 5 po jažici šarke sa kulturom u šest jažica prolazno je transficirano različitim količinama ekspresionog plazmida serglicina (0, 1, 2 ili 4 μ g) ili kontrolnog vektorskog plazmida pomoću X-treme GENE HP reagens za transfekciju DNA (Roche, Mannheim, Njemačka) prema uputama proizvođača.

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qPCR)

Ukupna RNA ekstrahirana je iz kultiviranih staničnih linija pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen) i podvrgnuta reverznoj transkripciji pomoću RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, Waltham, MA, USA). QPCR u stvarnom vremenu izveden je korištenjem SYBR zelenog qPCR Kit (kapa) na CFX96 sustavu za detekciju PCR u stvarnom vremenu (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). GAPDH gen za održavanje korišten je kao unutarnja kontrola za normalizaciju razine mRNA različitih gena. Relativne promjene u ekspresiji izračunane su primjenom metode 2 -ΔΔCt (gdje je Ct granični ciklus). Sekvence primera za sve ispitivane gene navedeni su u Dodatnoj tablici S1.

Detekcija serglicina u CM-u

Ukupno je 1 × 106 stanica posađeno u posude od 100 mm i uzgajano u redovnom mediju. Nakon 24 sata u kulturi, stanice su gladile 24 sata. Supernatanti kulture sakupljani su, centrifugirani pri 3000 o / min tijekom 5 minuta i koncentrirani s Amicon Ultracentrifuge filtrima (veličina pore od 10 kDa molekulske mase; Millipore, Boston, MA, USA). Serglicin je otkriven u koncentriranom CM-om imunoblotiranjem.

Test formiranja kolonija

Stanice su odbrojane i postavljene na 500 stanica po jažici u pločicu sa šest jažica i inkubirane su 24 sata da se omogući taloženje. Stanice su tretirane s nizom doza cisplatina (0, 0, 3, 1, 2 μM ). Kad je većina kolonija narasla na> 50 stanica, jažice su isprane, fiksirane u metanolu tijekom 15 minuta i obojene kristalno ljubičastom bojom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Svi su pokusi neovisno ponovljeni najmanje tri puta.

MTS test

Za određivanje ICso, stanice su izbrojene, posađene u trostruko po 2000 stanica po jažici (200 μl) u pločicama s 96 jažica i ostavljene su da narastu preko noći. Za pojedinačne skupine, jažici su dodani cisplatin ili 5-fluorouracil u koncentracijskom gradijentu. Stanična vitalnost mjerena je 48 sati kasnije MTS metodom (Promega, Madison, WI, USA, G5421). Za ispitivanja stanične proliferacije, stanice su posijane u pločice s 96 jažica po 1000 stanica po jažici i tretirane sa 10% FBS, 0, 1% FBS, cisplatinom (Sigma, Šangaj, Kina; 0, 8 µM ) ili 5-fluorouracilom (Sigma) (25 μM ). Paralelne ploče sakupljane su u različito vrijeme nakon sjetve. Stanična vitalnost mjerena je MTS metodom (Promega, G5421), a optička gustoća (OD) je izmjerena na 490 nm.

imunoblatin

Lizati s celim stanicama ekstrahirani su s RIPA puferom sa 1: 100 inhibitorom proteaze (Roche). Nuklearni ili citoplazmatski ekstrakti pripremljeni su s Nucl-cito preparatom (Applygn, Šangaj, Kina) prema uputama proizvođača. Protutijela koja su korištena za Western blot su sljedeća: serglicin (Abnova, H00005552-M03, Taibei, Kina), CD44 (Proteintech, Wuhan, Kina, 15675-1-AP) i nekoliko antitijela iz Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD, uključujući cijepljeni PARP (6525), t-ERK (4780), fosfo-ERK1 / 2 (5726), t-AKT (4691), fosfo-AKT (Ser473; 4051), β- katenin (9562), i GAPDH ( 2118). Sekundarna antitijela konjugirana protiv miševa (W4021) i zečja (W4011) peroksidaza dobivena su iz Promega. Selumetinib je kupljen od Sellecka (Šangaj, Kina) (S1008), U0126 je kupljen od Sellecka (S1102).

Analiza formiranja sfere

Cells were seeded in ultra-low attachment six-well plates (Corning, NY, USA) at a density of 1000 cells per well, and cultured in DMEM/F12 medium (Gibco) with 20 ng/ml epidermal growth factor and 20 ng/ml basic fibroblast growth factor and B-27 supplement for approximately 10 days. The spheres were counted under a light microscope. Three independent experiments were performed.

Imunofluorescentna mikroskopija

Cells were fixed with 4% paraformaldehyde (Tiengene, Guangzhou, China) before being permeabilized in 0.1% Triton X-100, then blocked for 1 h with 5% bovine serum albumin and incubated with primary rabbit β -catenin antibody (1:200, Cell Signaling Technology) overnight at 4 °C. Cells were rinsed in PBS and incubated with Alexa Fluor 594-conjugated anti-rabbit IgG (Beyotime, Beijing, China) for 1 h at room temperature. Cells were then stained with DAPI (Invitrogen) before mounting. Images were analyzed using an Olympus immunofluorescence microscope (Tokyo, Japan).

IHC staining

IHC analysis was performed on three sections. Primary antibodies against β -catenin, serglycin and P-ERK were diluted 1 : 100 and were incubated at 4 °C overnight in a humidified container. After washing with PBS three times, tissue slides were treated with a non-biotin horseradish peroxidase detection system according to the manufacturer's instructions (Dako, Glostrup, Denmark).

Analiza luciferaze

Cells were plated into 96-well plates and transfected with CD44 luciferase reporter plasmid the next day (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA, HPRM10479-PG04). After 2 days, luciferase assays were performed using the Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit (GeneCopoeia) according to the manufacturer's protocol. The CD44 promoter sequence is listed in Supplementary Figure S3.

Pokusi na životinjama

Athymic nude mice were purchased from Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangzhou, China) at 4 weeks of age. Tumor cells were suspended in 100 μ l PBS containing 50% Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), then injected into the left or right axillary area. The mice were monitored twice per week for palpable tumor formation. All animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the Sun Yat-Sen University Cancer Center.

Statističke analize

All statistical analyses were performed using the SPSS (IBM, NY, USA) (version 17) package. Data are represented as the mean±SD, and a Student's t -test (two-tailed) was used to evaluate the significance between any two groups of data. The correlation ( r ) between serglycin and CD44 levels in nasopharyngeal tissues was evaluated using Pearson's correlation analysis (two-tailed). P <0, 05 se smatra statistički značajnim.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunski materijal

Word dokumenti

  1. 1.

    Supplemental Table and Figure Legend

Glosar

NPC

nasopharyngeal carcinoma

eksplozivnim dizanjem utega

matične stanice raka

ECM

izvanstanični matriks

EMT

epithelial-to-mesenchymal transition

MET

mesenchymal-to-epithelial transition

CM

kondicionirani medij

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)