Fak se natječe za src za promicanje migracije protiv invazije u stanicama melanoma | stanična smrt i bolest

Fak se natječe za src za promicanje migracije protiv invazije u stanicama melanoma | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Invazija stanica
  • Stanična signalizacija
  • Melanoma

Sažetak

Melanom je jedan od najsmrtonosnijih karcinoma zbog velike sklonosti metastazama, procesa koji zahtijeva migraciju i invaziju tumorskih stanica potaknutih reguliranom tvorbom adhezivnih struktura poput žarišnih adhezija (FA) i invazivnih struktura poput invadopodija. FAK, glavna kinaza FA, uključen je u mnoge stanične procese, uključujući migraciju i invaziju. U ovoj studiji istražili smo ulogu FAK-a u regulaciji invazije. Izvještavamo da je supresija FAK-a u stanicama melanoma B16F10 dovela do povećanog stvaranja invadopodije i invazije kroz Matrigel, ali do poremećaja migracije. Ove efekte je spasila FAK WT, ali ne i ponovna ekspresija FAK Y397F. Formacija invadopodija zahtijeva lokalnu Src aktivaciju nizvodno od FAK-a i na način koji ovisi o FAK fosforilaciji. Brisanje FAK-a korelira s povećanom fosforilacijom Tks-5 (supstrat tirozin kinaze s pet dometa SH3) i stvaranjem reaktivnih kisikovih vrsta. Zaključno, naši podaci pokazuju da FAK može posredovati suprotne učinke na migraciju i invaziju stanica. Prema tome, korisni učinci inhibicije FAK ovise o kontekstu i mogu ovisiti o staničnom odgovoru na okoliš i / ili o primarnim ili sekundarnim promjenama koje je melanom doživio tijekom invazijskog ciklusa.

Glavni

Bolesnici s raširenim bolestima melanoma imaju vrlo lošu prognozu s 5-godišnjim postotkom preživljavanja <5%. Metastatsko širenje melanoma složen je proces koji uključuje nekoliko genetskih promjena. U melanomu 1, kao u mnogim visoko invazivnim vrstama karcinoma glave, kao što su karcinom 2 pločastih stanica glave i vrata ili karcinom dojke, identificirana su 3 specijalizirana organela razgradiva matriksa nazvana invadopodija. Invadopodia se sastoji od dinamičnih izbočenja temeljenih na aktinu promjera 0, 1 do 2 μm koje potiču iz ventralnog ruba tumorskih stanica. 4 Osim aktinskih skela, ove se strukture obogaćuju proteolitičkim enzimima kao što su matrične metaloproteinaze (MMP), koji posreduju razgradnju izvanćelijskog matriksa (ECM). Doista, MMP je reguliran u invazivnom melanomu i postoje opsežni dokazi da oni imaju ulogu u promicanju širenja melanoma. 5, 6, 7 Nekoliko proteina poput integrina, Src i paksilina, koji su pronađeni na mjestima stanične adhezije na matriks, također su prisutni u invadopodiji. 8, 9 S druge strane, ostali proteini poput Src proteina supstrata kortaktin 10 i supstrat tirozin kinaze s pet SH3 domena (Tks-5) 11 specifično su lokalizirani u invadopodiji i nisu pronađeni kod žarišne adhezije (FA). Pored toga, reaktivne vrste kisika (ROS) 12 lokalizirane su u invadopodiji i trebale bi imati istaknutu ulogu u izazivanju funkcije invadopodija. Iako su uloženi značajni napori u karakterizaciji komponenti invadopodija, precizni mehanizmi njihove regulacije, posebno u kontekstu melanoma, ostaju slabo razumljivi.

Invazija tumora je višestupanjski proces koji zahtijeva adheziju stanica na okolišni substrat, migraciju i invaziju. Kod mnogih tipova stanica migracija zahtijeva finu kontrolu prelaska FA. FA se formiraju klasterom do 200 proteina 15 koji osiguravaju sidrenje stanica prema ECM-u. Ciklički proces nastanka i poremećaja FA je ključan za migraciju stanica. Budući da i sidrište i migracija uključuju staničnu interakciju s ECM komponentama, FA su obdareni transmembranskim ECM receptorim proteinima poput integrala koji komuniciraju s ECM molekulama i unutarćelijskih proteina sastavljenih od skeletnih proteina, kao i molekula koje prenose signal. Među njima, fokalna adhezijska kinaza (FAK) je presudni signalni protein koji integrira signale iz integina u aktinske filamente tijekom stanične migracije. 16 Strukturno, FAK je protein od 125 kDa koji sadrži domenu N- terminala 4.1-ezrin-radiksin-moesin, središnju domenu kinaze i C-terminalnu domenu koja sadrži mjesto ciljanja žarišta adhezije. 17 Fosforilacija FAK-a na Y397 stvara mjesto vezanja za Src, koje može fosforilirati druge tirozine u FAK sekvenci, stvarajući tako nova mjesta vezanja za proteine ​​koji sadrže domenu SH2.

FAK je uključen u mnoge aspekte metastatskog procesa, pa su prekomjerna ekspresija, hiperfosforilacija i / ili povišena aktivnost FAK-a zabilježeni kod različitih karcinoma kod ljudi, uključujući sarkome i karcinomi dojke, debelog crijeva, štitnjače, prostate, usne šupljine, jetre, želuca i jajnika. 18 U staničnim linijama ljudskog melanoma, rana ispitivanja izvijestila su o visokoj FAK ekspresiji i potrebi FAK-a za adheziju staničnog supstrata. 19 Kasnije je objavljeno da FAK promiče agresivni fenotip melanoma. 20 Zaista, imunohistokemijske analize otkrile su visoku razinu FAK fosforilacije kod Tyr397 i Tyr576, markera aktivnosti FAK kinaze, u kožnom i uvealnom melanomu u kasnom stadijumu, što je u korelaciji s njihovim povećanim invazivnim i migracijskim svojstvima. 21 Nadalje, prijavljeno je da genom-9 (mda-9) / sintenin povezan sa diferencijacijom melanoma posreduje aktivacija proteina kinaze C α (PKC α ) i FAK u stanicama melanoma, ovisna o adheziji. Dakle, inhibiranjem ili mda-9 / sintenina ili PKC α potisnutog fibronektinom izazvanog stvaranja signalnih kompleksa integrin- P 1 / FAK / c-Src i smanjene migracije i invazije prema fibronektinu. 22 Stoga se čini da je FAK glavni igrač invazije melanoma, ali kako ova kinaza kontrolira stvaranje i proteolitičku aktivnost invadopodija u stanicama melanoma nikada nije istražena.

U ovom istraživanju otkrili smo iznenađujuće negativnu regulaciju aktivnosti invadopodija u stanicama B16F10 od strane FAK-a. Iscrpljivanje FAK-a povezano je s povećanom proizvodnjom ROS-a i foksforilacijom Tks-5. Koristeći mutaciju FAK-a na Tyr397, veznom mjestu za Src, otkrili smo da su ta mjesta uključena u FAK-posredovanu inhibiciju invadopodijske aktivnosti. Pored toga, izvještavamo da je ova mutacija uzrokovala smanjenu brzinu migracije, ali povećala invazivna svojstva. Uzeti zajedno, naši podaci sugeriraju nadmetanje između supstrata FA i invadopodia zbog Src fosforilacije koja može ovisiti o životnim sredstvima, što dovodi do uključivanja bilo migracijskih ili degradacijskih putova.

Rezultati

Brisanje FAK-a povezano je s povećanom protelotičkom aktivnošću invadopodija

FAK je odavno poznat po promicanju migracije i invazije mnogih tipova staničnog raka, među kojima je i stanična linija mišjeg melanoma B16F10. 23 Međutim, utječe li i kako FAK na aktivnost invadopodije, posebno u kontekstu melanoma, slabo je dokumentirano. Za početak ispitivanja uloge FAK-a u invaziji melanoma B16F10 uspoređivali smo sposobnost invadopodija da razgradi ECM u kontrolnim i FAK-nedostatnim stanicama. U tu svrhu koristili smo siRNA usmjerenu protiv 5'-UTR regije FAK da bi iscrpili stanice iz endogenog FAK-a. Western blot analiza FAK ekspresije otkrila je da je učinkovitost obustave dosegla 85, 33 i 84, 24% nakon 48 i 72 h transfekcije siRNA, (Slika 1a). Aktivnost Invadopodia kvantificirana je njihovom sposobnošću da razgrade ECM koristeći Alexa-405 želatinu kao supstrat. Kao što je prikazano na slici 1b, stanice B16F10 mogu spontano formirati invadopodiju nakon 16 h kulture na fluorescentnoj želatini. Iznenađujuće, kvantifikacija fluorescentne razgradnje želatine otkrila je da je razgradnja matriksa 14 puta veća u stanicama s manjkom FAK-a u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 1b).

Image

Gubitak FAK-a u stanicama B16F10 povećava aktivnost invadopodia. ( a ) B16F10 stanice su prolazno transficirane ili kontrolnom siRNA ili FAK siRNA. Stanični ekstrakti prikupljeni nakon 48 i 72 h analizirani su Western blot-om i ispitivani na FAK i aktin kao kontrolu opterećenja. Inhibicija ekspresije FAK-a na 85% kontrole bila je djelotvorna do 72 h nakon transfekcije. ( b ) B16F10 stanice koje su prolazno transficirane kontrolnom siRNA i FAK siRNA kultivirane su na želatinoznim pokrivačima Alexa fluor 405 (siva) i označene za aktin (crveni) i kortaktin (cijan). Umetci pokazuju uvećane prikaze invadopodija. Zabilježite kolokalizaciju aktina i kortaktina kod točkastih invadopodija (strelica). Linija skale: 20 µ m. Kvantifikacija područja degradacije pokazuje pojačanu aktivnost invadopodija u stanicama iscrpljenim za FAK u usporedbi s transfekcijom kontrolnih stanica ( n = 3, *** P <0, 0001)

Slika pune veličine

Src je neophodan za degradacijsku aktivnost invadopodia nizvodno od FAK-a

Da bi se istražilo je li Src, vezni partner FAK-a, uključen u proces razgradnje matrice, kontrolne i B16F10-manjkave stanice koje su nedostajale FAK tretirane su PP2, inhibitorom Src kinaze. Otkrivamo da je PP2 liječenje potpuno ukinulo aktivnu invadopodiju u kontroli (podaci nisu prikazani) i B16F10 stanice s manjkom FAK-a (slika 2a), uspostavljajući tako bitnu ulogu Src u kontroli razgradnje matriksa. Također treba napomenuti da, iako inhibicija Srca blokira aktivnost invadopodija, daljnjim iscrpljivanjem FAK-a nije bilo moguće vratiti degradaciju matrice, sugerirajući tako da Src djeluje nizvodno od FAK-a u kontroli aktivnosti invadopodija. Tada se postavlja pitanje može li povećana degradacija matriksa zabilježena u stanicama B16F10 sa manjkom FAK-a biti posljedica povećanja aktivnosti Src. U tu svrhu, provedena je analiza Western blot-a upotrebom fosfospecifičnog Ab usmjerenog protiv Src-Tyr416, koji predstavlja marker Src-aktivacije, 12, 24 . Na neočekivan način, nisu primijećene razlike u fosforilaciji Src u Tyr416 između kontrolnih i FAK-deficitarnih B16F10 stanica (Slika 2b). Ovaj rezultat sugerira da FAK ne mijenja aktivnost Src u stanicama melanoma. Prema tome, budući da je Src uključen u aktivnost invadopodija, FAK može utjecati na supstrate nizvodno od Src kinaze koji su uključeni u stvaranje invadopodija i / ili preokret Src-a na određenim staničnim mjestima.

Image

Src aktivnost je neophodna za formiranje invadopodia. ( a ) B16F10 stanice koje su prolazno transficirane kontrolnom siRNA ili FAK siRNA kultivirane su na želatinskim pokrivačima Alexa fluor 405 i tretirane ili nisu Src inhibitorom PP2. Nije opažena degradacija kako u kontroli (podaci nisu prikazani), tako i u stanicama tretiranim FAK siRNA nakon Src inhibicije. Umetci pokazuju uvećane prikaze invadopodija. Strelice označavaju kolokalizaciju aktina i kortaktina kod točkastih invadopodija. Linija skale: 20 µ m. ( b ) Stanični ekstrakti su analizirani Western blot-om i ispitivani na fosfor-Tyr416-Src. Grafikon ne pokazuje povećanje aktivnosti Src nakon iscrpljivanja FAK-a

Slika pune veličine

Zatim smo procijenili je li stanje fosforilacije relevantnih Src supstrata promijenjeno u stanicama s nedostatkom FAK-a. U invadopodiji se nekoliko Src supstrata fosforilira na način kritičan za njihovu funkcionalnu aktivnost, uključujući kortaktin 25 i Tks-5. 26 Tks-5 se čini da je lokaliziran kod invadopodija u stanicama raka i da ima istaknutu ulogu u njihovoj formiranju. 27 Western blotom pokazujemo da je fosforilacija Tks-5 povećana u stanicama sa nedostatkom FAK-a u usporedbi s kontrolom (Slika 3a). Eksperimenti sa co-imunoprecipitacijom potvrđuju globalno povećanje fosforilacije tirozina Tks-5, ali ne i kortaktina u stanicama B16F10 s manjkom FAK-a. Nadalje, prekomjerna ekspresija aktivnog Src ili aktivnog Src-mCherry uvelike povećava razinu fosforilacije Tks-5, što je otkriveno eksperimentom imunoprecipitacije primjenom Tks-5 antitijela (Slika 3b, lijevo; Dodatna slika 1). Ovo sugerira da formiranje FAK-Src kompleksa koči fosforilaciju Tks-5, iako nakon što FAK-Src kompleks bude poremećen zbog ispadanja FAK-a, Src stječe sposobnost fosforilacije Tks-5. Da bi se istražilo je li Src zaista ograničavajući faktor u fosforilaciji Tks-5, stanice B16F10 transficirane su aktiviranim oblikom Src, SrcY530F. Kao što je prikazano na slici 3b, ekspresija aktiviranog oblika Src spojenog s mCherry nije promijenila bazalnu razinu Tks-5 i u stanicama i u nedostatku FAK-a. S druge strane, imunoprecipitacijske studije otkrile su porast stanja fosforilacije Tks-5 u stanicama B16F10 transficiranim aktiviranim Src-om, kao što se očekivalo za Src supstrat. Ovo povećanje fosforilacije Tks-5 nije dalje pojačano u stanicama sa nedostatkom FAK-a, što sugerira da je, u nedostatku FAK-a, fosforilacija posredovana Src-om već postigla visoravan. Ovo sugerira konkurentsku ulogu FAK-a i Tks-5 za fosforilaciju Src-a. Da bismo riješili ovo pitanje, ispitali smo staničnu lokalizaciju aktivnog Src u kontrolnim i FAK stanicama. U kontrolnim ćelijama otkrili smo snažno bojenje fosfo-Src-Tyr416 na FAs identificiranim talinskim označavanjem (slika 4a, vrh) i na citoplazmatskim točkicama, od kojih su neke bile invadopodija kako je otkriveno bojenje aktinom / kortaktinom (slika 4b, vrh). Naprotiv, u stanicama liječenim FAKsi, aktivni Src više nije lokaliziran na FAs (slika 4a, dno), ali pokazuje pojačanu lokalizaciju kod invadopodija (slika 4b, dno). Zajedno s utvrđenom ulogom Src u prethodno prikazanoj fosforilaciji Tks-5, to je u skladu s ulogom FAK-a u kontroli lokalizacije aktivnog Src, što dovodi do diferencijalne regulacije aktivnosti FA i invadopodije.

Image

FAK modulira Tks-5 fosforilaciju uzvodno od Src. ( a ) Stanični ekstrakti stanica B16F10 koji su prolazno transficirani kontrolnom siRNA ili FAK siRNA analizirani su Western blottingom (WB) i imunoprecipitacijom (IP) i ispitivani na fosfotirozine, Tks-5, aktin, kortaktin i FAK. Imajte na umu povećanje stanja fosforilacije Tks-5 nakon brisanja FAK-a. ( b ) Reprezentativni zapadni dio koji pokazuje B16F10 stanice koje su prolazno transficirane Src Y530F- mCherry, imunoprecipitirane primjenom anti-Tks-5 Ab i izbrisane za fosfotirozine i Tks-5. Prikazana je razina ekspresije proteina u odgovarajućim staničnim lizatima. Imajte na umu povećanje stanja fosforilacije Tks-5 na ekspresiji Src Y530F (lijeva ploča). Reprezentativni zapadni blotovi koji pokazuju B16F10 stanice koje su prolazno transficirane kontrolnom siRNA ili FAK siRNA i Src Y530F- mCherry imunoprecipitirane upotrebom antifosfo-Tyr Ab i izbrisane za Tks-5. Zabilježite jednak porast stanja fosforilacije Tks-5 u stanicama iscrpljenim od FAK-a sa ili bez ekspresije Src Y530F . Prikazana je razina ekspresije proteina u odgovarajućem staničnom lizatu (desna ploča)

Slika pune veličine

Image

FAK je potreban za lokalizaciju aktivnog Src u FA, ali ne i kod invadopodija. ( a ) Konfokalne slike fiksnih kontrolnih ili FAK siRNA-tretiranih stanica imunostaniranih za aktin (lijeva ploča), talin (srednja ploča) ili fosforilirani Src na Tyr416 (desna ploča). Imajte na umu nedostatak lokalizacije aktivnog Src na FAs (strelice) identificiranog bojenjem talinom u stanicama tretiranim FAK siRNA u usporedbi s kontrolnim stanicama. ( b ) Konfokalne slike fiksnih kontrolnih stanica ili stanica koje su tretirane FAK siRNA imunostanirane na aktin (lijeva ploča), kortaktin (srednja ploča) ili fosforilirani Src (desni panel). Imajte na umu povećanu razinu aktivnog Src na točkaste invadopodije (strelice) identificirane obojenjem aktinom / kortaktinom u stanicama s nedostatkom FAK-a u usporedbi s kontrolnim stanicama. Ljestvice: 20 μ m

Slika pune veličine

ROS su neophodni za razgradnu aktivnost invadopodija

Nedavno je uspostavljena povezanost između proizvodnje ROS, ekspresije Tks-5 i stvaranja invadopodija. 13 Kao što smo promatrali porast stanja fosforilacije Tks-5 u našim stanicama, izmjerili smo razinu ROS u kontrolnim i FAK manjkavim stanicama B16F10. Kao što se očekivalo, pronašli smo 38% -tni porast proizvodnje ROS-a zbog iscrpljivanja FAK-a (Slika 5a). Štoviše, tretiranje stanica inhibitorom ROS MnTMpyP blokiralo je degradacijsku aktivnost invadopodia i u kontrolnim i u FAK-nedostatnim B16F10 stanicama, potvrđujući tako ključnu ulogu proizvodnje ROS u kontroli aktivnosti invadopodije (Slika 5b). Ovi rezultati sugeriraju da FAK, interakcijom sa Src, smanjuje fosforilaciju Tks-5, mijenjajući tako ROS proizvodnju.

Image

ROS su neophodni za aktivnost invadopodija, a povećani su u stanicama iscrpljenim od FAK-a. ( a ) B16F10 stanice koje su prolazno transficirane kontrolnom siRNA ili FAK siRNA su tretirane s ROS reportorom CM-H2DCF-DA u trajanju od 20 minuta, a zatim je produkcija ROS analizirana protočnom citometrijom. Prikazani su reprezentativni histogrami. Intenzitet fluorescencije crta se prema broju stanica. Kvantifikacija proizvodnje ROS pokazuje porast fluorescencije za 38% u stanicama iscrpljenim za FAK ( n = 4, * P <0, 001). ( b ) B16F10 stanice koje su prolazno transficirane kontrolnom siRNA i FAK siRNA kultivirane su na želatinoznim pokrivačima Alexa fluor 405 (siva) u prisustvu ili ne inhibitora ROS MnTMpyP, a zatim su označene za aktin (crveni) i kortaktin (cijan). Reprezentativna slika pokazuje potpunu inhibiciju aktivnosti invadopodija u prisustvu MnTMpyP. Umetci pokazuju uvećane prikaze invadopodija. Strelice označavaju kolokalizaciju aktina i kortaktina kod točkastih invadopodija. Linija skale: 20 µ m

Slika pune veličine

FAK fosforilacija u Tyr397 negativno regulira aktivnost invadopodia

Zatim smo istražili koje su molekularne determinante odgovorne za smanjenu aktivnost invadopodija posredovanu FAK-om u stanicama B16F10. U tu svrhu, prvo smo istražili ulogu mjesta fosforilacije FAK-Tyr397, jer se za to mjesto ranije pokazalo da je obvezujuće mjesto za SH2 domenu Src. Tako su nastale B16F10 stanice koje eksprimiraju FAK WT ili FAK-Y397F povezane s GFP derivatima i transfektirane siRNA usmjerenom protiv 5'-UTR regije FAK. Kako se ovo područje nalazi isključivo u endogenom FAK-u, ali ne i u konstrukcijama FAK WT ili FAK-Y397F, ciljanje 5'-UTR regije omogućuje gotovo potpuno izumiranje endogenog FAK-a bez utjecaja na ekspresiju egzogenih oblika FAK-a kao što je prikazano na slici 6a. Subcelularna lokalizacija oblika FAK-a otkrila je da, iako su i FAK-GFP i FAK-Y397F-GFP ispravno upućeni na FA, nijedan od konstrukata nije pronađen kod invadopodija, što je dokazano nedostatkom kolokalizacije FAK-a s aktinom i kortaktinom (slika 6b) za koji se zna da se obogaćuje kod invadopodija. 3 Da bismo ispitali učinak FAK i FAK mutantne ponovne ekspresije u FAK-null kontekstu, kvantificirali smo broj invadopodija u svakom kontekstu. Naši rezultati pokazuju da stanice koje ponovo eksprimiraju FAK WT, ali ne i FAK-Y397F, pokazuju značajno manje invadopodija u usporedbi sa stanicama s manjkom FAK-a, na taj način sugerirajući da je fosforilacija FAK u Tyr397 u FAs potrebna za FAK-posredovanu inhibiciju nastajanja invadopodije. Kako FAK potiče smanjenje broja prikazanih invadopodija po stanicama, analizirali smo degradativnu aktivnost FAK-null ćelija nakon ponovne ekspresije FAK WT ili FAK-Y397F. Kao što je prikazano na slici 7a, ekspresija FAK-Y397F, ali ne FAK WT, povećala je razgradnu aktivnost invadopodia dostižući 24, 10 μm 2 / stanicu, što je blizu vrijednosti dobivene deaktiranjem FAK-a (24, 90 µm 2 / stanica). To pokazuje da gubitak fosforilacije kod Tyr397 ima sličan učinak na degradacijsku aktivnost invadopodia kao iscrpljivanje FAK-a, naglašavajući da je fosforilacija u Tyr397 potrebna za FAK da negativno regulira funkciju invadopodije. Štoviše, ovaj FAK mutant također je pokrenuo porast fosforilacije Tks-5 (slika 7b) i ROS proizvodnju (slika 7c), sugerirajući da je poremećaj FAK-Src interakcije omogućio Srcu da promiče aktivnost invadopodija fosforiliranjem Tks-5 i kasnije ROS proizvodnja.

Image

Mutacija FAK-a kod Tyr397 povećava nastajanje invadopodija. ( a ) B16F10 stanice su prolazno transficirane ili kontrolnom siRNA ili FAK siRNA i FAK-GFP ili FAK Y397F -GFP . Reprezentativni zapadni blotovi koji pokazuju izraz FAK u različitim uvjetima. Imajte na umu ponovnu ekspresiju FAK-a u stanicama tretiranim siRNA transfektiranim FAK WT ili FAK Y397F . ( b ) Konfokalne slike fiksnih FAK-tretiranih stanica siRNA koje eksprimiraju divlji tip ili mutirani FAK-GFP (srednja desna ploča) i imunološki obojeni za aktin (lijeva ploča) ili kortaktin (srednja lijeva ploča). Imajte na umu lokalizaciju FAK-a na FAs (strelice) i odsutnost FAK-a kod invadopodia (strelice) identificiranih bojenjem aktina / kortaktina u kortikalnim strukturama u obliku točkica. Ljestvice: 5 μ m. ( c ) Analiza broja invadopodija po stanici u različitim gore navedenim uvjetima. Invadopodija segmentirana pomoću obojenja aktinom i kortaktinom pojavljuje se žutom bojom na FAK slici (desno). Kvantifikacija otkriva značajno smanjenje broja invadopodija u stanicama tretiranim FAK siRNA transfektiranim FAK WT, ali ne FAK Y397F (* P <0, 02, n = 5 sa 65–170 anadodopodija analiziranih po uvjetima)

Slika pune veličine

Image

FAK mutacija na Tyr397 povećava aktivnost invadopodia, proizvodnju ROS i Tks-5 fosforilaciju. ( a ) B16F10 stanice koje su prolazno transficirane s FAK siRNA i FAK WT ili FAK Y397F kultivirane su na želatinoznim pokrivačima Alexa fluor 405 (siva) i označene za aktin (crveni) i kortaktin (cijan). Ljestvice: 20 μ m. Kvantifikacija područja degradacije pokazuje pojačanu aktivnost invadopodija u stanicama iscrpljenim za FAK, koje je prevladano FAK WT, ali ne i ponovnom ekspresijom FAK Y397F ( n = 3, *** P <0, 0001). ( b ) Ekstrakti iz B16F10 stanica prolazno transficirani s FAK siRNA i FAK Y397F analizirani su imunoblotiranjem i ispitivani na Tks-5 i fosfotirozine. Imajte na umu porast Tks-5 fosforilacije na FAK deleciji ( n = 3, *** P <0, 0001). ( c ) Proizvodnja ROS-a kvantificirana je u stanicama B16F10, koje su prolazno transficirane FAK siRNA i FAK Y397F pomoću CM-H2DCF-DA metode. Rezultati pokazuju porast proizvodnje ROS u stanicama s manjkom FAK-a, koje se ne kompenzira ponovnom ekspresijom mutirajućeg FAK-a ( n = 3, *** P <0, 0001)

Slika pune veličine

Brisanje FAK smanjuje staničnu migraciju, ali povećava invaziju stanica

Sljedeće smo istražili je li brisanje FAK-a oslabilo migraciju stanica. Migracijska svojstva kontrolnih i FAK siRNA-tretiranih stanica reexpresije divljeg tipa FAK ili FAK-Y397F procijenjene su u Boyden komornom testu s 10% FBS-a koji se koristi kao kemoatraktant. To je pokazalo da je brzina migracije stanica tretiranih FAK siRNA smanjena za 58, 4% u usporedbi sa stanicama koje nisu tretirane. Taj je učinak ukinut ponovnom ekspresijom FAK-a divljeg tipa, ali ne i FAK-Y397F (slika 8a). Prema tome, kao što je već pokazano u raznim drugim staničnim linijama raka i ne-kancera, ekspresija FAK-a nužna je za migraciju ćelija melanoma. Kako brisanje FAK-a povećava aktivnost invadopodia, ali smanjuje staničnu migraciju, invazivna svojstva stanica melanoma B16F10 procijenjena su u invazivnim testovima u kojima se stanice degradiraju i migriraju kroz Matrigel. Da bismo procijenili invazivna svojstva, bez računanja svojstava svojstvene migracije, izračunali smo indeks invazije dijeljenjem postotka stanica koji prodire kroz Matrigelove obložene umetke s postotkom stanica koje migriraju kroz neplastični umetak. To je pokazalo da su stanice s manjkom FAK-a bile znatno invazivnije od kontrolnih stanica. Taj je učinak ukinut ponovnom ekspresijom FAK-a divljeg tipa, ali ne i FAK-Y397F (slika 8b).

Image

Brisanje FAK-a smanjuje migraciju, ali povećava invaziju. Stanice B16F10, koje su prolazno transficirane kontrolnom siRNA ili FAK siRNA, posijane su u propusne umetke. Medij s 10% FBS-a korišten je kao kemotaktično sredstvo i stanice su kultivirane tijekom 24 sata. Za ispitivanja invazije, stanice su posijane u Boyden komorama obloženim Matrigelom i ostavljene su da napadaju i migriraju tokom 24 sata. Migracijske / invazivne stanične jezgre obojene su DAPI. Imajte na umu da je smanjena migracija i povećana invazija u stanicama koje su oštećene FAK djelomično obnovljene nakon FAK reekpresije, ali ne i FAK Y397F ( n = 5, * P <0, 05, # P <0, 05)

Slika pune veličine

FAK je fosforiliran i vrlo dinamičan na FA

Kako FAK nije lokaliziran u invadopodiji, ali fosforilirani FAK mijenja aktivnost invadopodije, analizirali smo lokalizaciju FAK fosforiliranog na Tyr397 u stanicama B16F10. Koristeći fosfospecifični Ab usmjeren protiv FAK-Tyr397, otkrili smo da se FAK uglavnom fosforilira u FA-u bez specifičnog bojenja u invadopodiji. Stoga će vrijeme boravka FAK-a kod FA-a odrediti njegovo stanje fosforilacije i samim tim stupanj akumulacije Src u FA-u. Da bi se analizirala dinamika FAK-a kod FA, pokretljivost FAK-a ocijenjena je fluorescentnim oporavkom nakon eksperimenata sa foto-izbjeljivanjem (FRAP). U tu svrhu, GFP dio sadržan u FAK fuzijskom proteinu koji je prisutan u FAs nasumično odabranim na periferiji stanica fotograbiran je kratkim uzbuđenjem 491 nm velike snage uz korištenje Cobolt Calypso lasera i oporavkom fluorescencije u izbjeljenim regijama praćeno je vremenskim snimcima tijekom slijedećih 100 s (slika 9). Budući da su adhezije lokalizirane na tankim staničnim rubovima u blizini sučelja sa staklom, može se postići visok omjer signal / šum pomoću ukupne unutarnje refleksne fluorescencije (TIRF) mikroskopije za snimanje vremenskog odmaka. Pomoću ove metode pronašli smo neočekivano brzu dinamiku FAK-a na Fasu, dajući t 1/2 od 7, 53 ± 1, 7 s, zajedno s visokom mobilnom frakcijom od 92, 03%.

Image

FAK je fosforiliran i vrlo dinamičan na FA. ( a ) Konfokalne slike B16F10 stanica imuno obojenih na aktin (lijeva ploča), kortakktin (srednja ploča) i FAK fosforilirani u Tyr397 (desna ploča). Imajte na umu lokalizaciju fosforiliranog FAK-a na FAs (strelice) i kolokalizaciju aktina / kortaktina u invadopodiji (strelice) Ljestvice: 20 μm. ( b ) B16F10 stanice koje eksprimiraju FAK-GFP snimljene su TIRF mikroskopijom prije fotosvjetljenja (PB) ROI koji sadrže FA (bijeli kvadrat), odmah nakon PB i na kraju vremena oporavka. Umetci prikazuju uvećane prikaze pretovarenog FA. Prikazana je kinetika oporavka FAK-GFP-a na FA

Slika pune veličine

Rasprava

Unatoč nedavnom napretku u našem znanju o molekularnim mehanizmima uključenim u širenje melanoma, metastatski melanom i dalje predstavlja više od 80% smrti od raka kože. To je uglavnom zbog visoke plastičnosti i visoke otpornosti na postojeće terapije. 28, 29 Stoga je hitno potrebna identifikacija novih terapijskih ciljeva. Danas se smatra da invadopodija promiče invazivna svojstva stanica karcinoma udruživanjem proteaza uključenih u razgradnju ECM-a. 30, 31 Nedavno su ove strukture identificirane u mnogim metastaznim melanomima kako ljudskog tako i mišjeg podrijetla. 31, 32, 33 Iako je postignut značajan napredak u razumijevanju uloge FAK-a u migracijskim procesima, 34 njegova uloga u regulaciji dinamike i aktivnosti invadopodija ostaje slabo dokumentirana. Ipak, kako se FAK nalazi na raskrižju FA i aktinske signalizacije, obično se smatra da ima važnu ulogu u regulaciji invadopodija. Ovdje smo otkrili da je brisanje FAK-a dovelo do neočekivanog povećanja aktivnosti invadopodija zajedno s jasnim povećanjem indeksa invazije u stanicama melanoma. Štoviše, iako pokazujemo da je Src apsolutno potreban za aktivnost invadopodije, kao što je već izviješteno, 35, 36, 37 FAK nema utjecaja na aktivacijsko stanje Src u stanicama B16F10. Daljnjim istraživanjem potencijalnih molekula uključenih u kontrolu aktivnosti invadopodija otkriveno je da su i foksforilacija Tks-5 i produkcija ROS povećani na deleciju FAK, što sugerira da mogu biti dio zajedničkog signalnog puta u kontroli invazije melanoma. To se slaže s prethodnim rezultatom koji pokazuje da se Tks-5 eksprimira u tkivima raka čovjeka, posebno u karcinomu dojke i melanomima. 11 Nadalje, pokazalo se da je Tks-5 izravno povezan sa NoxA1, članom obitelji NADPH oksidaza uključenih u proizvodnju ROS, na Src-ovisan način. 38, 39 U ovom kontekstu također pokazujemo da konstitutivna aktivacija Src-a, ekspresijom mutanta Src Y530F, povećava fosforilaciju Tks-5 u WT stanicama, ali ne daje dodatni učinak u FAK-null kontekstu, sugerirajući da u drugom stanju, Tks-5 je već dostigao maksimalnu razinu fosforilacije. Uzeto zajedno, naša studija sugerira da Src promiče aktivnost invadopodije ovisne o Tks-5 / ROS nizvodno od FAK-a u stanicama melanoma.

Ovo je postavilo pitanje kako FAK može regulirati Src aktivnost. Da bismo odgovorili na to, prvo smo analizirali staničnu lokalizaciju aktivnog Src u stanicama B16F10. Otkrili smo da se aktivni Src nalazi u FA-u, a u invadopodiji u kontrolnim stanicama, dok je u stanicama s manjkom FAK-a aktivni Src gotovo potpuno izostao u FA-ima, dok je pokazao povećanu lokalizaciju u invadopodiji. Zatim smo analizirali staničnu lokalizaciju FAK-a i otkrili da se FAK nalazi u FA-u, ali ne i kod invadopodija u stanicama B16F10. Također pokazujemo da, u nedostatku FAK-a, stanice melanoma pokazuju mnogobrojnije invadopodije. Rezultati konflikta opisani su u vezi sa staničnom lokalizacijom FAK-a kod invadopodija. U stanicama transformiranim v-Src, pokazano je da Src pojačava interakciju između β 1 integrina i FAK-a kod invadopodija. 35 Slično tome, FAK je otkriven i u invadopodijama iz stanica raka karcinoma dojke MCF10A-CA1, gdje se čini da pojačava aktivnost ovih struktura. 40 S druge strane, u stanicama karcinoma dojke kod ljudi, MDA-MB-231 i MTLn3, koji prikazuju i FA i invadopodiju, FAK nije prisutan u invadopodiji, kao ni u stanicama adenokarcinoma mliječnih štakora štakora, što mijenja dinamiku ovih struktura, 36, 41 Zanimljivo je napomenuti da je u jednoj nedavnoj studiji spomenuto da je FAK neophodan za formiranje podosoma u obliku točke, ali je neophodan za sastavljanje struktura u obliku rozete u fibroblastima transformiranim Src-om i adenokarcinomom pluća čovjeka. 42 Konačno, u nekim staničnim linijama raka, poput HT-1080 fibrosarkoma ili PANC-1 stanica karcinoma gušterače, pokazalo se da FAK cilja MT-MMP1 na FA kako bi posredovao razgradnju matriksa. 43 Prema tome, uloga FAK-a u invaziji može ovisiti o invazivnim strukturama koje stvaraju stanice potječu iz različitih vrsta raka. Ipak, u dogovoru s prethodnom studijom, 41, otkrili smo da mutacija FAK-a na Tyr397, ostatak tirozina koji je na fosforilaciju vezivno mjesto za Src, povećava nastajanje i aktivnost invadopodija na način sličan FAK obrani. Ovaj mutirani oblik FAK-a također aktivira Src nizvodne efektore, Tks-5 i NoxA, što je dokazano povećanjem Tks-5 fosforilacije i proizvodnje ROS-a. Štoviše, po prvi put pokazujemo da delecija FAK-a u stanicama melanoma, iako smanjuje migraciju, povećava indeks invazije kroz Matrigel. Ti su efekti oponašali ponovnom ekspresijom FAK Y397F, ali ne divljim tipom FAK-a. Prema tome, naši rezultati sugeriraju da, ovisno o stanju fosforilacije FAK-a na Tyr397, Src može aktivirati ili put migracije pokretanjem FA rastavljanja formiranjem FAK / Src kompleksa na tim mjestima 44, 45, 46 ili invazivnim putem, putem specifično ciljanje Srca na invadopodiju, što dovodi do degradacije matrice. Alternativno, ekspresija FAK-a se također može kontrolirati na okoliš kako bi se odredio koji put treba aktivirati (slika 10).

Image

Teorijski model regulacije degradacije matrice posredovane FAK-om. (lijevo) Active Src je u ravnoteži između dva odjeljka: invadopodia i FA. FAK se nalazi na FAS-u, ali ne i kod invadopodia. Kad se fosforilira u Tyr397, FAK regrutira Src da posreduje fosforilaciju supstrata nizvodno poput paksilina, promovirajući tako preokret FA-a i migraciju stanica. (desno) Iscrpljivanje FAK-a ili inhibicija vezanja Src na FAK oslobađa Src iz FA-a, tako posredujući fosforilaciju Tks-5 kod invadopodije kako bi se potaknula aktivnost invadopodije i invazija stanica dok inhibira staničnu migraciju

Slika pune veličine

Zabilježeno je da je životni vijek invadopodija razmjerno visok, u rasponu od minuta do sata31, što omogućava značajnu degradaciju matriksa 3–4 sata nakon presadanja stanica. Stoga, za učinkovitu ECM proteolizu koja dovodi do širenja stanica melanoma, treba izbjegavati visoku migracijsku brzinu ili preusmjeriti prema području degradacije. U tom pogledu, naši rezultati pokazuju da je smanjivanje regulacije FAK-a dovoljno za promicanje povećane degradacije matrice i smanjenje brzine migracije. To dovodi do pitanja može li se ekspresija FAK-a regulirati između različitih stadija progresije melanoma. U svojoj ranoj fazi pokazalo se da melanom stanice eksprimiraju uglavnom proliferativne gene koji se nakon nepoznate signalizacije mijenjaju u skup gena invazivnog potpisa. 47 Ova promjena može biti potaknuta suptilnim izmjenama mikro okruženja. Na primjer, hipoksija potiče metastatsku progresiju promičući tako prebacivanje u potpisu gena za melanom. 48 Moguća transformacija FA-a u invadopodiju mogao bi predstavljati još jedan primjer plastičnosti melanoma usmjerenog na pojačanu invaziju. Doista, kako FA i invadopodija dijele mnoge strukturne komponente, nekoliko je studija sugeriralo da invadopodija može proizaći iz FA. Thus, in Src-transformed fibroblasts, invadopodia formation is initiated at adhesions in response to the focal generation of phosphatidylinositol-3, 4-bisphosphate. Therefore, approaches to identify key molecules that drive the transition between FAs and invadopodia have been used and led to the recent discovery that the combination of increased PI3K with low PKCα activity promotes an invasive state characterized by enhanced formation and activity of invadopodia along with changes in the organization of adhesions. 49 On the other hand, our FRAP studies revealed that FAK is highly dynamic at melanoma cell adhesions. As FAK is mainly phosphorylated at Y397 at FAs, and therefore targets Src to these sites, a low FAK residence time at FAs would allow high Src availability at invadopodia. Indeed, it is well known that Src trafficking is a fundamental aspect of Src-mediated cell transformation, resulting in Src localization in subcellular structures where both its SH2 domain and its kinase activity are needed for actin rearrangements. 50 Moreover, increased stroma rigidity due to fibrosis and ECM remodeling is a hallmark of many cancer cell disseminations. Experimentally, such change in ECM composition could be mimicked, at least in part, by increasing collagen density, which has been recently shown to alter the residence time of FAK, but not that of paxillin, at FA. 51 Therefore, dynamic regulation of Src/FAK trafficking controlled by the microenvironment may be another means for melanoma cells to choose between invasion or migration pathways.

In conclusion, our results identify FAK as a key molecule at the crossroad between invasion and migration pathways in melanoma cells. How FAK is environmentally regulated during melanoma progression and whether FAK expression, phosphorylation and/or dynamics represent the key determinants of this transition will need further investigation.

Materijali i metode

Antibodies and other reagents

The following mouse monoclonal antibodies were used: anti-FAK (BD Transduction Laboratories, Le Pont de Claix, France), anti-cortactin (Millipore, Molsheim, France), anti-Tks-5 (Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, France), anti-Tks-5 PX domain, anti-Tks-5 SH3 domain, anti-phosphotyrosine (Millipore), anti-talin, anti-paxillin, anti-phospho-Y397 FAK (Invitrogen, Camarillo, CA, USA) and anti- β -actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Anti-Src and anti-phospho-Src anti-bodies were from Cell Signalling (Danvers, MA, USA) or Invitrogen (Grand Island, NY, USA). Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse was from Promega (Madison, WI, USA). Actin antibody conjugated to Alexa fluor 647 was from Santa Cruz (Heidelberg, Germany). PP2 was from Calbiochem (Billerica, MA, USA) and MnTMPyP from MERCK Biosciences (Darmstadt, Germany). G-sepharose beads and ECL plus kit were from GE healthcare (Freiburg, Germany). MnPyP, CM-H2DCF-DA, Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse, Alexa-405-labelling kit and Lipofectamine 2000 were from Invitrogen. Gelatin from porcine skin and mouse monoclonal Ab was from Sigma-Aldrich.

Cell culture, DNA constructs and stable transfection

The B16F10 melanoma cell line was from ATCC (Manassas, VA, USA). Cells were maintained in DMEM (Lonza, Basel, Switzerland) supplemented with 10% fetal bovine serum, 1 mM L-glutamine and 1% penicillin/streptomycin antibiotics. Plasmid pAcGFP1-Hyg-C1-FAK was obtained as previously described. 52 Punctual mutations were performed on the FAK coding sequence through directed mutagenesis (QuickchangeII XL site-directed mutagenesis, Agilent Technologies, Massy, France). Y397 was replaced by phenylalanine and the FAK mutation was verified by sequencing. B16F10 cells were transfected with 4 μ g DNA using lipofectamine 2000 (Invitrogen), according to the manufacturer instructions.

transfekcije siRNA

B16F10 cells were plated at 1.5 × 10 5 cells in six-well plates. Cells, 18 h later, were transfected with 50 pmol of siRNA for 5 μ l lipofectamine 2000 in 500 μ l Opti-MEM (Gibco, Grand Island, NY, USA). Stealth siRNA oligonucleotides (Invitrogen) used were control siRNA 5′-GAAUCUCAUCUAUUUCGUAACGGAC-3′ and FAK siRNA 5′-UGACAGAUACCUAGCAUCUAGCAAA-3′. These sequences have already been described to target the 5′-UTR region of FAK in rat MTLn3 cells, 41 however, a sequence alignment was performed using the link //www.ba.itb.cnr.it/BIG/Blast/BlastUTR.html to check out sequence homology in Mus musculus as B16F10 cell line stems from murine lineage. Transfected cells were incubated for 48 h (unless otherwise indicated) at 37 °C before use.

Cell treatment with PP2, MnTMPyP

One hour after seeding on fluorescent gelatin, B16F10 cells were treated with PP2 [5-(4-chlorophenyl)-7-(dimethylethyl)pyrazolo[3, 4-d]pyrimidine] for 3 h at 10 μ M to inhibit Src activity, and with MnTMPyP [manganese (III) tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porphyrin] for 1 h at 37 °C at the concentration of 300 μ M to inhibit ROS formation.

In vitro fluorescent matrix digestion assay and immunofluorescence

Cells transfected or not with siRNA were plated at 5000 cells/cm 2 in a two-well lab-tek and incubated overnight at 37 °C on fluorescent-labeled Alexa-405 gelatin as described elsewhere. 53 Cells, 18 h later, were fixed using 4% paraformaldehyde solution for 15 min, and permeabilized using triton X-100 at 0.05%. Unspecific sites were blocked by incubating cells in 1% of bovine serum albumin (BSA) at room temperature. Cells were then labeled for 1 h with anti-cortactin Ab (1/1000), anti-talin Ab (1/500), anti-FAK Ab (1/1000), anti-paxillin Ab (1 μ g/ml), anti P-Tyr416-Src Ab (1/250) or Alexa-647-conjugated phalloidin. After three washes with PBS, cells were incubated with Alexa-488-conjugated goat anti-rabbit Ab (1/500), rhodamine-conjugated donkey anti-mouse Ab (1/400), Alexa-555-conjugated goat anti-mouse Ab (1/250) or CY 5-conjugated donkey anti-rabbit Ab (1/250) for 1 h, washed three times with PBS and then observed using either a Leica confocal microscope TSC SPE ( × 63 HCX Pl Apo 1.32 NA objective, Wetzlar, Germany) or a Leica DMIRE2 microscope ( × 40 HCX Pl Apo 1.25 NA and × 63 HCX Pl Apo 1.32 NA objectives). Areas of degradation were identified as black holes on fluorescent gelatin and quantified using ImageJ software downloaded from the NIH website.

Western blot and immunoprecipitation

Total cell proteins were obtained by lysing cells for 30 min at 4 °C in RIPA buffer for western blot (1 M Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 2 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 5 mM Na pyrophosphate) or IP buffer for immunoprecipitation (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4 ) both supplemented with Protease Inhibitor Cocktail (complete Mini, Roche, Mannheim, Germany). Lysates were clarified by centrifuging at 14 000 × g for 10 min at 4 °C. Protein concentration was determined using a Biorad kit (Hercules, CA, USA) based on the Lowry colorimetric method. For immunoprecipitation, 500 μ g of proteins were incubated with precipitating antibody at 1/500 dilution for 3 h at 4 °C under rotational shaking following manufacturer instructions. Then, G-sepharose beads (GE Healthcare) were added and incubated a 4 °C. Beads were then washed five times with RIPA buffer, and later suspended in Laemmli buffer. For western blotting, 10 μ g of proteins were suspended in Leammli buffer and loaded on a 8% polyacrylamide gel, then transferred to a PVDF membrane. Nonspecific sites were blocked for 1 h at room temperature using 5% BSA in TBS-T ((pH 7.4): 10 mM Tris, 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20). Then, membranes were incubated with primary antibody diluted in TBS-T containing 5% BSA or 5% non-fat milk overnight at 4 °C. After washing membranes three times in TBS-T for 10 min, specific horseradish peroxidase-labeled secondary antibodies (Promega) were incubated with membranes for 1 h at room temperature. Signals were detected using en ECL plus kit.

ROS measurement

Cells were plated at subconfluency in complete medium. Cells, 18 h later, were incubated with 25 μ M of the fluorescent ROS probe CM-H2-DCF-DA (the 5-(and 6)-carboxy-2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate) in HBSS supplemented with 10% FBS for 20 min at 37 °C in the dark. Cells were then washed carefully three times with HBSS, collected with EDTA for 1 min and resuspended in HBSS 10% FBS, then centrifuged for 5 min at 1000 rpm Cells were subsequently suspended in 300 μ l HBSS and analyzed by flow cytometry at 545 nm. Quantification of fluorescence was performed using the FACS Aria software (San Jose, CA, USA).

Cell invasion and migration assay

Invasion was assessed using 24-well plates having Matrigel-coated inserts (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and migration was assessed using uncoated inserts. Transfected B16F10 cells (1 × 10 5 ) were seeded on the inner part of the insert (8 μ m pore size) in 500 μl serum-free DMEM and placed in wells containing 500 μl DMEM supplemented with 10% FBS as chemoattractant. After 24 h at 37 °C, the inserts' inner surfaces were swabbed to remove noninvasive cells. Cells from the outer side of the membrane were fixed in 4% paraformaldehyde and stained with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Invading and migrating cells were counted using an epifluorescence microscope. The percent invasion was determined as the ratio of the mean number of cells invading through Matrigel insert membrane over the mean number of cells migrating through non-coated insert membrane. The invasion index is expressed as the ratio of the percent invasion of test cells over the percent invasion of control cells.

Dual FRAP/TIRF experiments

FRAP experiments were done on an iMIC microscope (Till Photonics, Munchen, Germany) equipped with a Cobolt Dual Calypso Laser 491/532 nm (Solna, Sweden) and an Olympus (Rungis, France) × 60 TIRFM (1.45 NA) objective. During acquisition, cells were maintained at 37 °C in a 5% CO 2 humidified atmosphere using an environmental control system (Life Imaging Services, Basel, Switzerland). Images recorded before and after bleaching were acquired in TIRF mode every 2 min on an EMCCD camera (Andor Technology, Belfast, Ireland). To avoid possible artifacts of overexpression, only cells expressing low but detectable amounts of protein were chosen for further analysis. Photobleaching was done using a diffraction-limited spot centered at FAs. High-intensity illumination was performed with 50% of the 491-nm line for 10 ms. Recovery was followed in TIRF mode at various time intervals until the intensity had reached a steady plateau. For each time point, the intensity of the bleached area was normalized to that of a corresponding unbleached area. Fluorescence during recovery was normalized to the prebleached intensity. FRAP recovery curves were generated using GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, USA).

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

Word dokumenti

  1. 1.

    Supplementary Figure S1 Legends

Glosar

MMP

matrix metalloproteinases

FA

focal adhesion

FAK

kinaza žarišne adhezije

ECM

izvanstanični matriks

Tks-5

tyrosine kinase substrate with five SH3 domain

mda-9

melanoma differentiation-associated gene-9

PKC α

protein kinase C α

ROS

reaktivne vrste kisika

DAPI

4′, 6-diamidino-2-phenylindole

FRAP

fluorescence recovery after photobleaching

TIRF

total internal reflection fluorescence

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)