Funkcionalne uloge sijalilacije u napredovanju raka dojke putem mir-26a / 26b usmjerenih na st8sia4 | stanična smrt i bolest

Funkcionalne uloge sijalilacije u napredovanju raka dojke putem mir-26a / 26b usmjerenih na st8sia4 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Rak dojke
  • glikozilacija
  • miRNAs
  • onkogcnczom

Sažetak

Sijalizacija je jedan od izmijenjenih obrazaca glikozilacije povezane s napredovanjem raka. U ovom istraživanju, istraživali smo N -glikanske profile bolesnika s karcinomom dojke i staničnim linijama kako bismo otkrili sialilaciju povezanu s napredovanjem karcinoma dojke i pružili nove dokaze sijalizacije posredovane miRNA. Analiza MS-MALDI-TOF otkrila je da N- glikani koji se nalaze u tkivima karcinoma dojke i stanici karcinoma dojke MDA-MB-231 pokazuju povišenu razinu sialilacije u usporedbi sa susjednim tkivima i normalnom stanicom epitela dojke MCF-10A. Ekspresijski profili 20 sialiltransferaza gena analizirani su i pronađeni su značajno različiti uspoređujući uzorke karcinoma dojke sa susjednim tkivima i dvije stanične linije raka dojke MDA-MB-231 i MCF-7 s različitim metastatskim potencijalom i stanicama MCF-10A. Tumorsko tkivo i visoko metastazirana stanična linija raka dojke MDA-MB-231 pokazala su više razine ST8SIA4 . Srušavanje ST8SIA4 u staničnoj liniji karcinoma dojke značajno je inhibiralo njihovo zloćudno ponašanje, uključujući staničnu proliferaciju i invaziju na način ovisan o sialiltransferazi. Primjenjujući bioinformatičke pristupe za predviđanje miRNA ciljajući 3'-UTR ST8SIA4 , identificirali smo ST8SIA4 kao jedan od miR-26a / 26b gena usmjerenih. Daljnja analiza podataka pokazala je obrnuto srodnu ekspresiju ST8SIA4 i miR-26a / 26b u stanicama karcinoma dojke, tumorskim tkivima i odgovarajućim susjednim tkivima. Sposobnost miR-26a / 26b da posebno komunicira i regulira 3'-UTR ST8SIA4 demonstrirana je putem izvještaja luciferaze. Prisilna ekspresija miR-26a / 26b mogla je inducirati smanjenje nivoa ST8SIA4 i utjecati na napredovanje stanica karcinoma dojke, dok je promijenjena ekspresija ST8SIA4 u stanicama karcinoma dojke modulirala napredovanje nakon transfekcije mimikom ili inhibitorom miR-26a / 26b. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da promjene u obrascima glikozilacije i razini siijalizacije mogu biti korisni pokazatelji progresije karcinoma dojke, kao i da miR-26a / 26b mogu biti široko uključeni u regulaciju strojeva za sijalizaciju ciljajući ST8SIA4.

Glavni

Rak dojke jedna je od najčešćih malignih bolesti i osnovni uzrok smrti u žena širom svijeta. 1 Stoga je izuzetno važno ne samo liječiti, već i spriječiti da ta bolest postane zloćudna. Maligne transformacije često su povezane s deregulacijom procesa glikozilacije, a posebno s terminalnom sialilacijom u karcinomu dojke. 2 Lin i sur. 3 su pokazali da stanična površina α 2, 6-sijalizacija pridonosi stanjivanju stanica i karcinomu mliječnog karcinoma na stanici i ekstracelularnom matriksu, a inhibicija razine sialytransferaze ST6Gal-I smanjuje metastatsku sposobnost stanica karcinoma mliječne žlijezde. Yuan i sur. 4 su otkrili da desijalacija α 2, 6-sialiliranog integralina povećava adheziju stanice karcinoma dojke MDA-MB-231 na ECM bez promjene integrinske ekspresije. Lee i sur. Slika 5 pokazuje da su visoko sialilirani i fukozilirani složeni N- glikani složenog tipa povišeni u šest stanica epitela dojke u odnosu na normalne stanice epitela mliječnih mlijeka. Kao posljedica toga, sijalizacija i promjene sijaliltransferaze (ST) mogu biti korisni za dijagnozu i progresiju karcinoma dojke, ali mogu biti i ciljevi terapijskih strategija.

Sijalizacijom upravljaju ST i sijalidaze. Sijalne kiseline se STS prenose s donatorskog supstrata na krajnje položaje glikoproteinskih i glikolipidnih ugljikohidratnih skupina. Na osnovu bočnog lanca ugljikohidrata koji sintetiziraju 6 ST-a kategorizirani su u četiri obitelji, i to ST3Gal ( α 2, 3-ST), ST6Gal ( α 2, 6-ST), ST6GalNAc i ST8Sia ( α 2, 8-ST), 7 S druge strane njihovo uklanjanje iz glikonskih lanaca katalizira sialidaze. Smatra se da aktivnost ovih enzima utječe na konformaciju glikoproteina i stoga doprinose povećanju prepoznavanja ili maskiranju biološki relevantnih mjesta u molekulama i stanicama. 8 Visoka ekspresija ST3Gal-II povezana je s lošim kliničkim ishodom u bolesnica s karcinomom dojke liječenih kemoterapijom. 9 Inhibicija ekspresije ST6Gal-I smanjila je metastatski kapacitet stanica karcinoma dojke MDA-MB-435. 3 Ekspresija ST6GalNAcI bila je dovoljna da pojača tumorsku sposobnost MDA-MB-231 stanica. 10 ST6GalNAcV identificiran je kao jedan od gena koji je prekomjerno izražen u populaciji stanica karcinoma dojke odabranim zbog njihove sposobnosti stvaranja metastaza u mozgu. 11 ST8SiaI je također prekomjerno izražen u uzorcima tumora negativnih na receptor estrogena različitih podtipova karcinoma dojke. Iako STS imaju važnu ulogu u progresiji raka dojke, ispitivanje regulacije sialilacije mikroRNA (miRNA) ostaje nepoznato.

MiRNA su male nekodirajuće RNA uključene u modulaciju različitih bioloških procesa kroz mehanizam zasnovan na represiji transformacije proteina ili degradaciji glasnika RNA. 13, 14, 15, 16 Nedavna istraživanja identificirala su nekoliko dereguliranih miRNA (npr. MiR-147, miR-340 i miR-1296) u tkivima ili stanicama karcinoma dojke i otkrila njihovu potencijalnu ulogu u napredovanju raka dojke doprinoseći proliferaciji stanica, preživljavanje i metastaze. 17, 18, 19 Međutim, molekularna osnova ovih inhibicijskih učinaka miR-26a / 26b usmjerena na ST8SIA4 još nije u potpunosti rasvijetljena u raku dojke.

Na temelju ovih ranijih promatranja, naš je cilj ovdje bio procijeniti promjenu N- glikanskih profila i sialiliranih N- glikana u susjednim i tumorskim tkivima od pacijenata s karcinomom dojke i staničnih linija karcinoma dojke. Ekspresivna razina ST gena izmjerena je između tumorskih uzoraka i susjednih tkiva i staničnih linija karcinoma dojke. Pored toga, ST8SIA4 je također bio jedan od gena usmjerenih na miR-26a / 26b. Ovdje smo opisali novi mehanizam za promjene N- glikana i sijaliranja povezanih s karcinomom dojke i suzbijanje ST8SIA4 miR-26a / 26b u progresiji raka dojke.

Rezultati

MALDI-TOF MS analiza za N- glikansko profiliranje tkiva i staničnih linija karcinoma dojke

Cjelokupni N- glikani visoko metastatske stanice karcinoma dojke MDA-MB-231 i besmrtne epitelne stanice dojke MCF-10A analizirani su i identificirani s MALDI-TOF MS spektrometrijom (Slika 1a). Kao što je sažeto u tablici 1, otkrivene su i reproduktivno kvantificirane 33 vrste glikoforma u obje stanične linije. Histogrami N- glikanskih sastava dobivenih iz tri MALDI-TOF MS replike prikazani su na slici 1b. Kad su puni portreti N- glikanske raznolikosti obje stanične linije prikazani kvantitativno, čini se vjerovatnim da su N- glikani tipa visokog manoze (vrhovi 4, 8, 13, 17 i 20; tablica 1) bili glavne komponente. Međutim, također je jasno sugerirano da su razine ekspresije četiri N- glikana (vrhovi 22, 29, 37 i 40) identificirane isključivo u stanicama MDA-MB-231, a sve su to bili siililirani glikoformi (tablica 1). Nadalje, stanice MDA-MB-231 također su pokazale visoko reguliranu ekspresiju glikoformnih oblika (vrhovi 1, 4, 5, 10, 11, 15, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 31, 32, 33, 34, 35, 38 i 39, 2-krat) u usporedbi s MCF-10A stanicama, i osam sijaliranih N- glikanskih sastava (vrhovi 25, 27, 32, 33, 34, 35, 38 i 39). Vrh 24 (koji ne sadrži sialilirani N- glikan) jasno je pokazao značajan porast MCF-10A stanica (> 2 puta).

Image

Diferencijalni N- glikanski sastav tkiva i staničnih linija karcinoma dojke. ( a ) MS spektri MALDI-TOF permetiliranih N- glikana otpuštenih iz MDA-MB-231 i MCF-10A stanica. ( b ) Promatrani su histogrami relativnog intenziteta diferencijalnih N- glikanskih signala iz obje stanične linije. Histogrami su predstavljali samo intenzitet signala, ali ne i količine. ( c ) MALDI-TOF MS spektri N- glikana karcinoma dojke i susjednih tkiva prikazani su. N -glikane je pustila PNGase F i permetilirali. ( d ) Promatrani su histogrami relativnog intenziteta diferencijalnih N- glikanskih signala iz oba slučaja. Vrijednosti su srednje ± SD za tri permetilirana uzorka iz N- glikanskih uzoraka. Signali označeni arapskim brojevima sažeti su u tablici 1

Slika pune veličine

Tablica pune veličine

Zatim smo primijenili gornju metodu za analizu N- glikana iz tkiva karcinoma dojke i odgovarajućih susjednih tkiva. Slika 1c pokazuje MALDI-TOF MS spektre cijelih N- glikana obogaćenih glikoblotom u oba slučaja. Ukupno su identificirana 32 N- glikana i sastav N- glikana sažet je u tablici 1. Primjećeni su visoko-manozni glikani (vrhovi 4, 8, 13, 17 i 20) u oba tkiva (tablica 1). Vrhovi na 3, 5, 6, 7, 11, 12, 14, 15, 16, 28, 35 i 36 ekskluzivno su detektirani samo u grupi tumora, a za vrh 35 pokazalo se da je sialilirani N- glikan (slika 1d i Stol 1). Nadalje, razina ekspresije (vrhovi 13, 17, 18, 23, 32 i 33) povećana je u grupi tumora (> 2 puta) u usporedbi sa susjednom skupinom tkiva, a vrhovi 23 i 32 pokazali su se kao sialilirani N -glikanima (slika 1d i tablica 1). Primjetno je da su vrhovi koji odgovaraju siijaliranim glikoformama često opaženi u tumorskim tkivima i stanicama karcinoma dojke.

Identifikacija ST gena različito izraženih u tkivima i staničnim linijama karcinoma dojke

Svrha ovih eksperimenata bila je identificirati izmijenjene uzorke ekspresije ST gena koji reguliraju sialilirane glikoforme, agnostički analizirajući razine ekspresije 20 ST gena u panelu modela stanica karcinoma dojke. U usporedbi sa stanicama MCF-10A, agresivna stanična linija raka dojke MDA-MB-231 pokazala je povećani broj različito eksprimiranih gena uključujući ST6GALNAC5 (7, 33 puta), ST8SIA4 (14, 81 puta) i ST8SIA5 (3, 11 -struko nabora) (Slike 2c i e). Primijećena je samo mala razlika u razini ST3GAL1 (1, 53 puta), ST3GAL4 (1, 61 puta), ST3GAL6 (1, 66 puta), ST6GAL1 (1, 56 puta), ST6GALNAC1 (1, 53 puta) mRNA u obje stanične linije ( Slike 2a i b). ST6GALNAC6 (2, 16 nabora), ST8SIA2 (10, 86 puta) i ST8SIA6 (2, 14-nabora) također su značajno regulirani u MCF-10A stanicama (Slike 2c i e). Nadalje, podaci su otkrili da su ekspresivne razine ST3GAL6 (12, 34 puta) i ST8SIA4 (5, 71-puta) regulirane u visoko metastatskoj staničnoj liniji karcinoma dojke MDA-MB-231 u usporedbi s blago metastatskom staničnom linijom raka dojke MCF-7 (Slike 2a i e).

Image

Diferencijalna ekspresija ST gena u tkivima i staničnim linijama raka dojke. Razine mRNA ST gena analizirane pomoću qRT-PCR. Relativna količina nivoa mRNA gena normalizirana je na razinu gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). ( a, c i e ) Promatrani su omjer relativnog intenziteta signala gena ST iz MDA-MB-231, MCF-7 i MCF-10A staničnih linija. ( b, d i f ) Primjećen je omjer relativnog intenziteta signala gena ST iz raka dojke i susjednih tkiva. Podaci su prosjek ± SD trostrukih determinanti

Slika pune veličine

Nakon toga tih 20 ST gena izmjereno je u karcinomu dojke i susjednim tkivima. Od toga, tri gena imaju veću ekspresiju u tumorskim tkivima, uključujući ST6GALNAC5 (2, 31 puta), ST8SIA3 (1, 78 puta) i ST8SIA4 (2, 47 puta) (slike 2d i f), što sugerira da je karcinom dojke izrazio visoku razinu α 2, 6- i α 2, 8-vezana sijalizacija. Pored toga, podaci su otkrili da su ekspresivne razine ST8SIA2 (9, 63 puta) i ST8SIA6 (2, 50 puta) regulirane u susjednim tkivima (slika 2f). Nadalje, ekspresija ST mRNA također je normalizirana upotrebom P- aktina (drugog endogenog PCR normalizatora) kao kontrole. Ti su rezultati prikazani na dopunskoj slici 1.

Kao potencijalni kandidatni cilj, ST8SIA4 je bio izrazito izražen u agresivnim stanicama MDA-MB-231, ali je bio lagano detektiran u stanicama MCF-7 i MCF-10A (Slika 2e). Zanimljivo je da smo također otkrili da je ST8SIA4 jedan od najistaknutijih gena koji pokazuju veće uzorke ekspresije u tkivima karcinoma dojke. U trenutnoj studiji, ST8SIA4 odabran je za daljnju istragu. Skupno, ovi nalazi ukazuju na jasnu povezanost izvedenih osobina N- glikana na temelju MS podataka i odgovarajućih ekspresijskih obrazaca ST koji su uključeni u sintezu sialiliranih glikana.

Izražavanje ST8SIA4 povezano je s metastazama raka dojke

Da bismo utvrdili kliničku važnost ST8SIA4, ispitali smo njegov uzorak ekspresije u uzorcima tumora prikupljenim od pacijenata s karcinomom dojke. Bojenje imunohistokemije (IHC) pokazalo je da je ekspresija ST8SIA4 značajno regulirana u tkivima tumora dojke u usporedbi sa susjednim tkivima (slika 3a). Slično tome, ST8SIA4 ekspresija je također bila veća u MDA-MB-231 u usporedbi s onom u stanicama MCF-7 (Slika 3a). Kao što se vidi na slici 3b, ST8SIA4 je bio izrazito izražen u staničnoj liniji MDA-MB231 s velikom sposobnošću metastaziranja.

Image

Utišavanje ST8SIA4 inhibira napredovanje stanica MDA-MB-231 i in vitro i in vivo . ( a ) ST8SIA4 ekspresija iz tkiva karcinoma dojke i stanica MDA-MB-231 očito je uspoređena s onom u susjednim tkivima i MCF-7 stanicama IHC i imunofluorescentnim bojenjem. Crvena fluorescencija: ST8SIA4; DAPI bojenje za nuklearnu DNK. ( b ) Razina proteina ST8SIA4 značajno je porasla u stanicama MDA-MB-231 u usporedbi s stanicama MCF-7 pomoću Western blot analize. ( c ) Transkript ST8SIA4 smanjen je očigledno u stanicama MDA-MB-231 tretmanom RNA s kratkom dlakom. Zapaženo smanjenje ST8SIA4 uočeno je na razini proteina Western blot analizom. ( d ) Rastne krivulje MDA-MB-231 ST8SIA4 shRNA stanica uspoređene su s kontrolnim stanicama s CCK-8 testom (* P <0, 05). ( e ) Sposobnost migracije i invazije uspoređena je u MDA-MB-231 ST8SIA4 shRNA i kontrolnim shRNA stanicama na temelju zarastanja rana (* P <0, 05). ( f ) In vitro analiza ECMatrix gela provedena je radi usporedbe invazije stanica između MDA-MB-231 ST8SIA4 shRNA stanica i kontrolne skupine (* P <0, 05). ( g ) Zabilježeno je smanjenje prosječnog volumena tumora u miševima s mRN-MB-231 ST8SIA4 shRNA tumorima u usporedbi s kontrolnom skupinom (* P <0, 05). ( h ) Smanjena regulacija ST8SIA4 i Ki67 također je prikazana IHC obojenjem u ksenograft tumorima izvedenim iz MDA-MB-231 ST8SIA4 shRNA stanica (× 400). Prikazane vrijednosti su srednja ± sd iz tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali je li smanjenje razine ST8SIA4 neophodno za inhibiciju progresije karcinoma dojke, a stanice MDA-MB-231 bile su podvrgnute knockdownu ST8SIA4. Kao što je prikazano na slici 3c, ekspresija ST8SIA4 je značajno smanjena u razini proteina u stanicama koje su bile transficirane shRNA u usporedbi s onima na kontrolama (vidi Dopunsku sliku 2a, ST8SIA4 shRNA3 stanice pokazuju nižu razinu ekspresije ST8SIA4, a ST8SIA4 shRNA3 je odabrana za sljedeći eksperimenti). Kao što se očekivalo, testovi za brojanje stanica-8 (CCK-8) pokazali su da je obustava ST8SIA4 potisnula proliferaciju MDA-MB-231 stanica (Slika 3d). Na slici 3e, stanice mR-MDA-MB-231 ST8SIA4 shRNA podvrgnute su ispitivanju zacjeljivanja rana. Uočili smo veću udaljenost u zacjeljivanju rana STRSIA4 shRNA stanica u usporedbi s kontrolnim skupinama. Kako je uznapredovali tumorski stadij često prisutan s metastazama, invazijski kapacitet stanica MDA-MB-231 transfektirane s ST8SIA4 shRNA in vitro uspoređivan je s onim roditeljskih kontrolnih stanica. Kao što je prikazano na slici 3f, stanice STRSIA4 shRNA pokazale su značajno niži potencijal invazije u usporedbi s kontrolnim stanicama, što sugerira ulogu ST8SIA4 u metastazi.

Učinci ST8SIA4 na tumorigenski potencijal stanica MDA-MB-231 ispitivani su in vivo . Rezultati su prikazani na slici 3g. U usporedbi s miševima ubrizganim u MDA-MB-231 stanice transficirane s kontrolnom shRNA, miševi ubrizgani sa ST8SIA4 shRNA stanicama pokazuju manje tumore u istom vremenskom periodu, a srednja količina tumora bila je značajno manja od kontrolne skupine (* P <0, 05). Bojanje IHC-om također je pokazalo smanjenu razinu proteina ST8SIA4 i Ki67 u tkivima tumora (Slika 3h). Sveukupno, naši rezultati pokazali su da ST8SIA4 doista posreduje metastazu tumorskih stanica modificirajući profil sialilacije u stanicama karcinoma dojke.

Izravna regulacija ST8SIA4 od strane miR-26a i miR-26b

Bilo je poznato da su miR-26a i miR-26b značajno smanjeni u tkivima raka dojke u usporedbi s normalnim tkivima, što implicira njihovu potencijalnu ulogu u proliferaciji i pokretljivosti MDA-MB-231 i MCF-7 staničnih linija karcinoma dojke. 20, 21 Da bismo bolje istražili i potvrdili nalaze, ispitali smo ekspresivne razine miR-26a / 26b u uzorcima raka dojke i staničnim linijama kvantitativnom PCR analizom u stvarnom vremenu (qRT-PCR). Ekspresija MiR-26a / 26b se značajno smanjila u 29 tkiva karcinoma dojke u usporedbi s 29 susjednih tkiva (slika 4a). Slični značajni nalazi identificirani su usporedbom stanica MDA-MB-231 s onima MCF-7 i MCF-10A stanica (Slika 4b). Pored toga, ekspresija miR-26a / 26b je normalizirana pomoću RNU48 (drugog endogenog PCR normalizatora) kao kontrole. Ti su rezultati prikazani na dodatnoj slici 3. Zatim smo ispitali odnos između miR-26a / 26b i ST8SIA4 ekspresije u 29 tkiva dojke i 29 susjednih tkiva. Kao što je prikazano na slici 4c, čini se da je ekspresija mRNA ST8SIA4 obrnuto povezana s razinama miR-26a / 26b ( P <0, 05), što je u skladu s staničnim linijama karcinoma dojke.

Image

MiR-26a i miR-26b kao negativni regulatori ST8SIA4. ( a ) Prikazane su uparene usporedbe između 29 tkiva raka dojke i susjednih tkiva. MiR-26a i miR-26b ekspresija su značajno smanjena u tkivima raka u usporedbi s odgovarajućim susjednim tkivima primjenom qRT-PCR analize. * P <0, 05 od uparenih t- testova. ( b ) Ekspresija miR-26a i miR-26b ispitana je qRT-PCR u staničnim linijama MDA-MB-231, MCF-7 i MCF-10A. ( c ) Odnos između miR-26a i miR-26b i ST8SIA4 mRNA ekspresije u 29 tkiva raka dojke i 29 susjednih tkiva. ( d ) ST8SIA4 analiziran je qRT-PCR i Western blot u stanicama MDA-MB-231 tretiranim s miR-26a i miR-26b mimikom (* P <0, 05). ( e ) ST8SIA4 je analiziran qRT-PCR i Western blot u MCF-7 stanicama tretiranim miR-26a i miR-26b inhibitorom (* P <0, 05). ( f ) Prikazan je nukleotidni slijed ciljnog mjesta miRNA u ST8SIA4 3'-UTR; test luciferaze za izravno ciljanje 3'-UTR ST8SIA4 pomoću miR-26a i miR-26b. Divlji tip i mutirani ciljni nizi miRNA T8SIA4 spojeni su s luciferaznim izvještačem i transfektirani u stanice HEK 293T, transfektirane s miRNA mimikom i NC mimikom. Srednja vrijednost rezultata stanica transficiranih s mimikom NC postavljena je na 100. Svaka traka predstavlja relativnu aktivnost luciferaze (* P <0, 05). Prikazane vrijednosti su srednja ± sd iz tri neovisna pokusa. Ekspresija miR-26a / 26b normalizirana je korištenjem U6 snRNA

Slika pune veličine

Nadalje smo istražili je li ekspresija ST8SIA4 regulirana endogenim miR-26a i miR-26b u staničnim linijama karcinoma dojke. MDA-MB-231 stanice su transficirane mimikom miR-26a ili miR-26b, stanice MCF-7 transficirane su inhibitorima i izmjerene su razine ekspresije ST8SIA4. Prekomjerna ekspresija miR-26a i miR-26b izrazito je smanjila ekspresiju ST8SIA4 i na razini mRNA i proteina u stanicama MDA-MB231 (Slika 4d). Suprotno tome, inhibicija miR-26a i miR-26b značajno je povećala razinu ST8SIA4 u stanicama MCF-7 (Slika 4e).

Zatim smo tražili da miR-26a / 26b potencijalno cilja ciljanje ST8SIA4 koristeći baze podataka za predviđanje miRNA da bismo identificirali vrlo očuvana sumnjiva mjesta za vezanje miRNA u ST8SIA4 3′-UTR. Kako bismo potvrdili da miR-26a i miR-26b izravno ciljaju 3'-UTR ST8SIA4, konstruirali smo reporterski gen luciferaze koji je povezan sa ST8SIA4 3'-UTR (WT 3′-UTR) i obavili ispitivanja dualne luciferaze. Stanice HEK 293T kofeficirane su ST8SIA4 3'-UTR luciferaznom konstrukcijom reportera i miR-26a / 26b ili NC mimikom. Kao što se očekivalo, miR-26a / 26b inhibira ekspresiju luciferaze ST8SIA4 WT 3'-UTR konstrukta ( P <0, 05), koja je uklonjena mutiranjem mutiranja sekvence miR-26a / 26b unutar ST8SIA4 3'-UTR ( Slika 4f). Naši rezultati potvrđuju da miR-26a i miR-26b negativno reguliraju ST8SIA4 izravno usmjeravajući ST8SIA4 3′-UTR.

MiR-26a / 26b utječe na metastaze stanica MDA-MB-231 i MCF-7 ciljajući ST8SIA4

Da bismo odredili utjecaj mirenski posredovane regulacije ST8SIA4 na razvoj tumora dojke, procijenili smo staničnu proliferaciju i invaziju u staničnim linijama karcinoma dojke transficiranim ili kontrolnim ili miR-26a / 26b mimikama. Kao što je prikazano na slici 5a, mimika miR-26a / 26b je transfektirana u stanice MDA-MB-231, koje su pokazale više razine ekspresije miR-26a / 26b. Imunofluorescentna analiza pokazala je da se ekspresija antigena ST8SIA4 značajno smanjila u stanicama MDA-MB-231 tretirane mimikom miR-26a / 26b (Slika 5b). Potom smo procijenili proliferaciju i otkrivanjem ekspresije antigena Ki67, koji je široko korišten marker za mjerenje udjela rasta određene populacije stanica. Ki67 ekspresija je također smanjena u miR-26a / 26b mimičkim skupinama (Slika 5b). Prekomjerna ekspresija miR-26a / 26b značajno je smanjila učinkovitost proliferacije stanica MD-MB-231 u usporedbi s negativnom kontrolom (Slika 5c). Analiza zacjeljivanja rana pokazala je da je razmak između scorings veći u skupini koja je tretirana mimikom u usporedbi s onom u kontrolnoj skupini u 48 h (Slika 5d). U ispitivanju stanične invazije, egzogena regulacija miR-26a / 26b značajno je inhibirala broj invazivnih stanica (Slika 5e). S druge strane, otkrili smo da prekomjerna ekspresija ST8SIA4 u stanicama MDA-MB-231 dovodi do značajnog smanjenja invazivnih stanica i ekspresije ST8SIA4 nakon transfekcije mimikom miR-26a / 26b (slike 5f i g).

Image

Učinak miR-26a i miR-26b oponaša na progresiju stanica u stanicama MDA-MB-231. ( a ) Ekspresija miR-26a i miR-26b je ispitivana qRT-PCR u stanicama MDA-MB-231 transficiranim mimikama (* P <0, 05). ( b ) ST8SIA4 i Ki67 ekspresija su detektirani imunofluorescentnim bojenjem u stanicama MDA-MB-231 tretirane mimikom miR-26a ili miR-26b. Crvena fluorescencija: ST8SIA4, Ki67; DAPI bojenje za nuklearnu DNK. ( c ) Transfekcija miR-26a i miR-26b mimika u stanicama MDA-MB-231 inhibira staničnu vitalnost kako je otkriveno testom CCK-8 (* P <0, 05). ( d i e ) Sposobnost migracije i invazije uspoređena je u stanicama MDA-MB-231 s miR-26a mimikom, miR-26b mimikom ili NC mimikom zasnovanom na zacjeljivanju rana ( d ) i ispitivanju transwella ( e ). Podaci su bili prosječni ± SD tri odvojene transfekcije (* P <0, 05). ( f i g ) MDA-MB-231 stanice kofeficirane su ciljanom mRNA (ST8SIA4 mock ili ST8SIA4) i miRNA mimikom (NC mimic, miR-26a mimikom ili miR-26b mimikom). Povišenost ST8SIA4 inhibira učinke izazvane prekompresijom miR-26a ili miR-26b u stanicama MDA-MB-231. Prikazani su reprezentativni rezultati Western blot ( f ) i testa transvalne invazije ( g ) u stanicama MDA-MB-231 (* P <0, 05). Prikazane vrijednosti su prosjek ± SD iz tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Anti-miRNA su transfektirani u MCF-7 stanice nakon čega slijedi qRT-PCR analiza. Kao što je prikazano na slici 6a, inhibitor miR-26a / 26b smanjio je ekspresiju miR-26a i miR-26b u MCF-7 stanicama. ST8SIA4 i Ki67 ekspresija su također povećane u skupinama inhibitora miRNA (Slika 6b). Analiza CCK-8 otkrila je da MCF-7 stanice u skupinama inhibitora miRNA imaju veću proliferativnu sposobnost u odnosu na kontrole (Slika 6c). Pored toga, primijetili smo kraću udaljenost u zacjeljivanju rana skupina inhibitora miRNA u usporedbi s kontrolnim skupinama (Slika 6d). Dalje smo pitali hoće li inhibicija endogenog miR-26a / 26b u MCF-7 stanicama utjecati na njihovu pokretljivost. Doista, ekspresija antisenskog oligonukleotida miR-26a / 26b značajno je povećala invaziju MCF-7 stanica (Slika 6e). Nadalje, rezultati su pokazali da iscrpljivanje ST8SIA4 u MCF-7 stanicama RNAi posredovanim načinom prigušivanja (vidi Dodatnu sliku 2b, ST8SIA4 siRNA2 je odabran za sljedeće eksperimente) dovelo je do značajnog porasta invazivnih stanica i razine ST8SIA4 nakon transfekcije s inhibitor miR-26a / 26b (slike 6f i g). S tim u vezi, zamislivo je da izmijenjena ekspresija miR-26a / 26b usmjerena na ST8SIA4 može smanjiti razinu ST8SIA4 za promicanje progresije karcinoma dojke, dok genetska pozadina mutirane ST8SIA4 favorizira utjecaj progresije progresivnog karcinoma posredovanja miR-26a / 26b.

Image

Učinak miR-26a i miR-26b inhibitora na staničnu progresiju u stanicama MCF-7. ( a ) Ekspresija miR-26a i miR-26b je proučavana qRT-PCR u MCF-7 stanicama transfektiranim inhibitorom (* P <0, 05). ( b ) ST8SIA4 i Ki67 ekspresija su detektirani imunofluorescentnim bojenjem u stanicama MDA-MB-231 tretiranim miR-26a ili miR-26b inhibitorom. Crvena fluorescencija: ST8SIA4, Ki67; DAPI bojenje za nuklearnu DNK. ( c ) Rastne krivulje transficiranih stanica inhibitorom miRNA uspoređene su s NC inhibitornim stanicama s testom CCK-8 (* P <0, 05). ( d i e ) Propadanje miR-26a i miR-26b značajno je povećalo migraciju i invaziju MCF-7 stanica pomoću zacjeljivanja rana ( d ) i transvaluma ( e ). ( f i g ) MCF-7 stanice su kofeficirane ciljanom mRNA (kontrolna siRNA ili ST8SIA4 siRNA) i anti-miRNA (NC inhibitor, miR-26a inhibitor ili miR-26b inhibitor). Utjecaj miR-26a ili miR-26b inhibitora obrnuto je smanjivanjem ekspresije ST8SIA4 u MCF-7 stanicama. Prikazani su reprezentativni rezultati Western blot ( f ) i testa transwell invazije ( g ) u MCF-7 stanicama. Podaci su bili prosječni ± SD tri odvojene transfekcije (* P <0, 05)

Slika pune veličine

Rasprava

Kako se MALDI-TOP MS koristio za učinkovit profil glikana u raku, 22 očekujemo da bi ova metoda trebala biti prilagodljiva za analizu N- glikana u tkivima i stanicama raka dojke. U ovom istraživanju otkrili smo izrazite razlike N- glikana u tkivima raka dojke, susjednim tkivima i stanicama MDA-MB-231 i MCF-10A MS analizom. Ovaj rezultat odgovarao je trenutnim nalazima varijacija glikona vezanih uz N tijekom progresije raka dojke u mišjem modelu, kao i N- glikana iz ukupnog humanog serumskog glikoproteina pacijenata s karcinomom dojke, a kontrole su također profilisane analizom MALDI-TOF-MS. 23 Nadalje, sve veće promjene intenziteta sialiliranog glikana u stanicama MDA-MB231 (> 2-puta u vrhovima 22, 25, 27, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 39 i 40) i tkivima raka dojke ( > Dva puta u vrhovima 23, 32 i 35) bili su u skladu s ostalim izvještajima iz literature u kojima su sialilirani glikani uključeni u invaziju raka i metastaze. 24, 25 Stoga vjerujemo da će ova sposobnost profiliranja N- glikana i sialiliranih glikoforma prostorno na staničnoj liniji i tkivima karcinoma dojke imati značajnu primjenu u progresiji tumora.

Dobro je poznato da promjene u glikozilaciji glikoproteina uzrokuju promjenu u njihovoj funkciji i takva pojava je povezana s kanceroznom transformacijom. 26, 27 Aberantna glikozilacija jedno je od glavnih obilježja karcinoma s promijenjenim potpisima gena ST-a. Dokazani dokazi pokazali su da su promjene sialilacije i razine ST aktivnosti izvedene iz stanica karcinoma relevantne za invaziju i metastazu karcinoma dojke. 28, 29 Ovdje smo naznačili da se obrasci profiliranja ST značajno razlikovali u tkivima raka dojke u susjednim tkivima. Među njima, ekspresija ST6GALNAC5 , ST8SIA3 i ST8SIA4 bila je značajno regulirana u tkivima karcinoma dojke u usporedbi s susjednim tkivima, a ST8SIA2 i ST8SIA6 su regulirani u susjednim tkivima. Povrh toga, pokazalo se da su ekspresijski profili porodice gena ST prepravljeni u staničnim linijama karcinoma dojke.

MDA-MB-231 stanice su karakterizirane višom razinom ST6GALNAC5 , ST8SIA4 i ST8SIA5 , dok MCF-10A stanice izražavaju više ST6GALNAC6, ST8SIA2 i ST8SIA6 . Nadalje, ekspresivne razine ST3GAL6 i ST8SIA4 su povišene u stanicama MDA-MB-231 u usporedbi sa stanicama MCF-7. Studije Cui i sur. 29 su pokazali da je MDA-MB-231 imala višu ekspresiju ostataka α 2, 3-sialne kiseline u usporedbi s T-47D i MCF-7, ovisno o mRNA razinama α 2, 3-ST gena. Osobito smo ovdje pokazali da je ST8SIA4 posebno reguliran u tkivima karcinoma dojke i stanicama MDA-MB-231, pa smo tako nagađali da je ST8SIA4 ključni faktor u promicanju malignog napredovanja raka dojke. Naši nalazi ovdje da je prešutjavanje ST8SIA4 značajno inhibiralo proliferaciju i invaziju MDA-MB-231 i in vitro i in vivo ukazalo na važnu ulogu ST8SIA4 u stimulaciji napredovanja stanica karcinoma dojke. U skladu s našim opažanjima, velik dio literature pokazao je da je ST8SIA4 bio impliciran kao potencijalni pokazatelj glikonskog karcinoma. 30 Pored toga, pokazano je i da ST8SIA4 daje višestruku rezistenciju u hroničnoj mijeloidnoj leukemiji kod čovjeka. 31 Ova istraživanja pokazuju da je regulacija ST8SIA4 bila povezana s napredovanjem karcinoma dojke. Jasno je da je potrebno daljnje istraživanje kako bi se rasvijetlile mehaničke uloge ST8SIA4 u zloćudnosti raka dojke.

Do sada je identificirano nekoliko miRNA koje ciljaju enzime glikozilacije. MiR-424 ciljala je N- acetilglukozaminiltransferazu koja je predviđala ulogu za β -1, 4 razgranatu glikozilaciju u napredovanju staničnog ciklusa u više staničnih linija epitela mliječnih mlijeka. 32 MiR-199a ciljao je ST ST6GAL1 koji je dodao 2, 6-povezanu sialnu kiselinu u terminije N -vezanih glikana i smanjio njegovu ekspresiju i sialiliranje Necl-2. 33 MiR-200a ciljane razine mRNA ST ST3GAL3 i ST3GAL4, koje potencijalno sudjeluju u antitrombinskoj siilaciji. 34 Naši nedavni rezultati također su pokazali da miR-224-3p izravno cilja 3'-UTR fukoziltransferaze FUT4 mRNA i senzibilizira stanice koje su rezistentne na lijekove na kemoterapeutske lijekove te smanjuje stopu rasta ksenografta karcinoma dojke in vivo . 35

U našem istraživanju izmjerene su razine miR-26a / 26b u tkivima karcinoma dojke i bile su značajno niže nego u susjednim tkivima. Prema tome, također smo otkrili da je ekspresija miR-26a / 26b smanjena u stanicama MDA-MB-231 u usporedbi s stanicama MCF-7 i MCF-10A. Daljnji eksperimenti pokazali su da su regulirane razine miR-26a / 26b povezane s napredovanjem stanica karcinoma dojke i in vitro i in vivo . Opisana su slična zapažanja. Ekspresija MiR-26a / 26b se značajno smanjila u tkivima karcinoma dojke u usporedbi s normalnim tkivima, a pronađeno je da je povezana sa proliferacijom i pokretljivošću u staničnim linijama MDA-MB-231 i MCF-7, što ukazuje na dijagnostički potencijal miR-26a / 26b kod raka dojke. 20, 21 Nadalje, otkrili smo da smanjene razine miR-26a / 26b koreliraju s pojačanom regulacijom ekspresije ST8SIA4 u bolesnika, kao i u staničnim linijama. Štoviše, utišavanje gena ST8SIA4 u stanicama MCF-7 rezultiralo je malignim promjenama ponašanja nakon uvođenja miR-26a / 26b inhibitora. Koliko znamo, neke studije su istraživale ulogu miR-26a / 26b u stanicama karcinoma dojke. Objavljeno je da miR-26a negativno regulira ekspresiju PTEN-a u stanicama MDA-MB-231 i MCF-7, koji sudjeluje u regulaciji stanične migracije staničnih linija karcinoma dojke. 36 Prekomjerna ekspresija miR-26b inhibirala je rast stanica MDA-MB-231 ciljajući prostaglandin-endoperoksid sintaza-2, što sugerira njegovu uporabu kao potencijalni terapeutski cilj raka dojke. 37 Naši rezultati dodatno su pokazali da funkcija miR-26a / 26b u regulaciji napredovanja stanica karcinoma dojke može biti djelomično posredovana ciljanjem ST8SIA4, jer je ST8SIA4 bio u velikoj korelaciji sa zloćudnošću raka reguliranjem različitih bioloških procesa. 31

Zaključno, analizom sialiliranih N- glikana i ekspresivnih obrazaca ST gena kod pacijenata s karcinomom dojke i staničnim linijama, regulacija ST8SIA4 razjasnila je neobična svojstva biološkog ponašanja raka dojke. Pored toga, pokazali smo da je miR-26a / 26b smanjen u regulaciji pacijenata s karcinomom dojke i invazivnim stanicama i da je povezan sa ST8SIA4 ekspresijom. Štoviše, rekonstitucija miR-26a / 26b pridonijela je poboljšanju sposobnosti napredovanja stanica karcinoma dojke reguliranjem ST8SIA4. Prospektivne studije na većim skupinama pacijenata potrebne su kako bi potvrdile njihovu dijagnostičku ulogu.

Materijali i metode

Uzorci bolesnika i tkiva

Studiju je odobrilo Etičko povjerenstvo Prve pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta Dalian. Pismeni informirani pristanak dali su pacijenti prije bilo kojeg postupka probira i bio je potreban za studije. Svi su uzorci obrađeni anonimno prema etičkim i zakonskim propisima. U ovom istraživanju, 29 parova svježeg karcinoma dojke i susjednih tkiva (> 2 cm od tkiva tumora) dobiveno je iz Prve pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta Dalian (Dalian, Kina). Bolesnici su činili 29 žena, u dobi od 31 do 74 godine (prosječna dob od 48, 6 godina). Nitko od pacijenata nije primio kemoterapiju ili radioterapiju prije operacije. Svi su uzorci potvrđeni patološkom dijagnozom i nakon skupljanja bili su brzo zamrznuti i pohranjeni u tekućem dušiku. Kliničke karakteristike karcinoma dojke prikazane su u Dodatnoj tablici 1.

Stanična kultura

Stanične stanice karcinoma dojke MDA-MB-231, MCF-7 i humana epitelijska linija dojke MCF-10A kupljene su od tvrtke KeyGEN (Nanjing, Kina). MDA-MB-231 i MCF-7 stanice održavane su u 90% Dulbecco modificiranom medu orla (DMEM; Gibco) uz dodatak antibiotika (1 × penicilin / streptomicin 100 U / ml; Gibco) i 10% termalno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma ( FBS; Gibco). MCF-10A se, s druge strane, održavao u DMEM-F12 medijumu nadopunjenom hidrokortizonom (0, 5 µg / ml), inzulinom (10 µg / ml), hEGF (20 ng / ml) i 10% (v / v) ) FBS. Sve stanice su zadržane u 37 ° C inkubatoru sa 5% C02.

Ekstrakt membranskog proteina i priprema N- glikana

Za MALDI-TOF-MS analizu, membranski proteini su ekstrahirani iz uzorka tumora, susjednog tkiva i MDA-MB-231 i MCF-10A stanica pomoću CelLytic MEM protekcijskog kompleta za ekstrakciju (Sigma, St. Louis, MO, USA). Koncentracija proteina u membrani mjerena je Micro BCA Kit za ispitivanje proteina (Pierce, Rockford, IL, SAD). Za oslobađanje N- glikana, tri 100 µg alikvota liofiliziranih staničnih membrana proteina najprije su digestirani tripsinom (10 µg) i kimotripsinom (10 µg) otopljenim u 25 mM bikarbonatu amonijaka (25 µl), pri 37 ° C za 18 h. Oporavak je ostavljen u vodenoj kupelji (85 ° C tokom 5 minuta), a nakon hlađenja N- glikani su oslobođeni peptida liječenjem enzimom PNGase F (2 μl; 6U) na 37 ° C tijekom 18 sati, nakon čega slijedi probava pronasea (10 μg) na 37 ° C 8 h. Tijekom vremena inkubacije, reakcijski uzorak povremeno se miješao. Oslobođeni N- glikani pročišćeni su korištenjem Oasis HLB uloška (60 mg / 3 ml; Waters, Miford, Delaware, SAD) i zatim liofilizirani. Permetilacija je izvedena korištenjem čvrste NaOH tehnike.

MALDI-TOF-MS analiza permetiliranih N- glikana

Permetilirani N- glikani analizirani su s MALDI-TOF masenim spektrometrom u pozitivnom modu, pod kontrolom softvera FlexControl 3.4 (Bruker Daltonics, Karlsruhe, Njemačka). Za MS analizu, osušeni permetilirani uzorak ponovo je suspendiran u 10 μl acetonitrila. Ukupno 0, 5 μl otopine matriksa (10 mg 2, 5, 5-DHB otopljenog u 1 ml 30% -tnog etanola) i 0, 5 μl razrijeđene otopine analita uočeno je na ciljnoj ploči MALDI (Bruker Daltonics). Zatim je ploču analizirala MS, čiji su spektri dobiveni iz Na + aduktnih iona. MALDI-TOF-MS spektri stečeni su korištenjem masenog spektrometra UltrafleXtreme (Bruker Corporation, Karlsruhe, Njemačka) u reflektoru s pozitivnim ionima, koji kontrolira FlexControl 3.4 softver Build 119 (Bruker Daltonics). Monovaharidni sastavi određeni su eksplozijom na bazu podataka GlycoMod: //www.expasy.ch/tools/glycomod/.

Proizvodnja i infekcija lentivirusa

ST8SIA4 shRNA sekvence su umetnute pGLV3 / H1 / GFP + Puro lentivirusni plazmid. Lentivirusni plazmidi pripremljeni su prema uputama proizvođača. Za infekciju lentivirusom stanice su uzgajane u pločicama sa kulturom tkiva sa šest jažica i inficirali su lentivirusni vektori pri mnoštvu infekcije od 40 tokom 24 sata. Medij je zamijenjen svježim kompletnim medijem. Nakon 2 dana, stanice su opažene fluorescentnom mikroskopijom kako bi se potvrdilo da je> 90% stanica bilo pozitivno na GFP. Nakon toga, GFP-pozitivne stanice su pregledane dodatkom 5 mg / l puromicina.

miR-26a / miR-26b / normalna kontrola (NC) mimika i miR-26a / miR-26b / NC inhibitori kemijski su sintetizirani od strane tvrtke Shanghai GenePharma Co. Ltd (Shanghai, Kina). MDA-MB231 stanice su transficirane miRNA (100 nM) koristeći Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, SAD). Ukupna RNA i protein pripremljeni su nakon transfekcije i dalje korišteni za kvantitativnu PCR analizu u stvarnom vremenu ili Western blot analizu.

Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz smrznutih tkiva i staničnih linija karcinoma dojke, koristeći RNeasy Mini Kit (Qiagen, valencia, CA, SAD), a čistoća pripravka je provjerena omjerom apsorpcije na 260 i 280 nm. CDNA je sintetizirana s 2 μg RNA koristeći QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Ekspresija miR-26a / 26b određena je korištenjem mirVanaTM qRT-PCR mikroRNA Kit za detekciju (Ambion Inc., Austin, TX, USA) i normalizirana pomoću U6 snRNA i RNU48 kao kontrole. ST mRNA kvantificirana je sa SYBR Green Quantitative Real-Time PCR Master Mix kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) i normalizirana na GAPDH, odnosno P- djelovanje. Razina ekspresije ST ciljnih gena određena je korištenjem Biosystems 7300 PCR sustava u stvarnom vremenu (ABI, Foster City, CA, SAD). Sekvence primera prikazane su u Tablici 2. Svaka tri neovisna pokusa izvedena su u tri primjerka.

Tablica pune veličine

Ekstrakcija proteina i Western blot

Stanice su isprane dva puta hladnom fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS). Ukupni protein ekstrahiran je puferom za liziranje stanica i koncentracijom proteina određenom BCA Kitom za analizu proteina (Pierce). Dvadeset mikrograma za svaki uzorak razdvojeno je u 10% SDS-PAGE, a zatim je prenesena polivinililiden difluoridna membrana (Pall Corporation, New York, USA). Membrana je blokirana s 5% nemasnog suhog mlijeka u PBS-u koji je sadržavao 0, 1% Tween 20 (PBST) tijekom 1 sata, a zatim je ispitivana monoklonskim antitijelom ST8SIA4 (Abcam, Cambridge, Velika Britanija; razrjeđivanje 1: 1000) Detekcija je postignuta korištenjem sekundarni IgG konjugirani protiv zečeva HRG (Santa Cruz Biotechnology; razrjeđivanje 1: 1000). GAPDH korišten je kao kontrola. Imunoreaktivni proteini vizualizirani su korištenjem ECL Western bloting kit (Amersham Biosciences, Peking, Kina). Membrane su inkubirane anti-GAPDH razrijeđenom 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology) kao endogena kontrola.

CCK-8 ispitivanja

Stanična proliferacija izmjerena je primjenom CCK-8 (KeyGen, Nanjing, Kina) prema uputama proizvođača. Stanice (1 × 10 3 / jažici) su zasijane u pločice s 96 jažica sa 100 μl medija DMEM koja sadrži 10% FBS i uzgajane u vlažnom inkubatoru (na 37 ° C sa 5% C02) 24, 48 i 72 h. Potom se u svaku jažicu dodalo 2 ul otopine CCK-8 na 37 ° C tijekom 2 sata. Apsorbancija na 450 nm odmah je izmjerena pomoću čitača mikroploča (iMark; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, SAD). Svaki je eksperiment izveden najmanje tri puta.

Analiza zacjeljivanja rana

Provedeno je zacjeljivanje rana da bi se utvrdila protruzija stanica i sposobnost migracije tumorskih stanica. Ukratko, 1 × 10 4 stanice posijane su u posude s 12 jažica i narastale do 70 - 80% ušća. Sterilizirani vršak pipete P200 korišten je za nanošenje rana preko staničnog jednosloja i krhotine su isprane s PBS-om. Migacija stanica u ranu tada je opažena u različito vrijeme. Stanice su migrirale u ranjeno područje ili stršale iz granice rane u različitom su vremenu vizualizirane i fotografirane pod invertiranim mikroskopom. Najmanje osam polja za svako stanje uzeto je nasumično u svaku jažicu povećanjem × 100, a stanice u tri jažice svake skupine kvantificirane su u svakom pokusu. Eksperimenti su provedeni u tri primjerka najmanje tri puta.

Analiza stanične invazije

Invazija stanica mjerena je korištenjem 8 μm neprevaziranih pora ili ECMatrix gelom (Chemicon) obloženim probojnim ulošcima (Trevigen, Grad Gaithersburg, MD, USA). Ukratko, stanice (1x105) su sabrane u DMEM bez seruma i dodane u gornju komoru. Medij koji sadrži 10% FCS je dodan u donju komoru i stanicama je ostavljeno da napadaju 24 sata na 37 ° C, a stanicama je ostavljeno da napadaju 24 sata na 37 ° C. Na kraju inkubacije, invadirane stanice na naličju umetka su fiksirane u metanolu i obojene s Wright-Giemsa. Broj invadiranih ćelija na donjoj strani membrane računao se na × 400 uvećanja iz 10 različitih polja svakog filtra. Svaki je eksperiment izveden u tri primjerka i ponovljen je tri puta.

Imunofluorescentna analiza

Stanice su transficirane miRNA mimikom ili miRNA inhibitorima kako je gore opisano i uzgajane u staklenim pokrivačima. Stanice su zatim isprane s PBS-om i potom fiksirane hladnim 4% formaldehidom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon fiksacije, stanice su permealizirane s PBS-om koji je sadržavao 0, 3% Triton X-100 i 2% BSA tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Primarno antitijelo Ki67 (Abcam, Cambridge, MA, SAD) ili ST8SIA4 je razrijeđeno 1: 200 u 5% BSA u PBS-u i inkubirano na dijapozitivima preko noći na 4 ° C. Slajdovi su tada isprani tri puta s PBS-om i inkubirani 1 sat sa sekundarnim antitijelom. Nakon dva ispiranja s PBS-om, klizači su se inkubirali 10 minuta s 4, 6-diamino-2-fenilindolom (DAPI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u PBS-u radi nuklearnog bojenja. Slike su snimljene pomoću Carl Zeiss fluorescentne mikroskopije (Carl Zeiss, Hallbergmoos, Njemačka).

Testiranje tumora u golim miševima

Ženski atimični goli miševi, stari od 4 do 6 tjedana, dobiveni su iz Animal Facility Medicinskog sveučilišta Dalian i korišteni su za implantaciju potkožnog tumora. Otprilike 1 × 10 7 stanica ubrizgano je supkutano u desni bok svakog golog miša. Mjerenja nodula započela su u prvom tjednu postinokulacije, a pratila su se tjedno mjerenjem okomitih promjera tumora, duljine ( L ) i širine ( W ) vrhom kalibra. Svi su miševi ubijeni u skladu s humanim krajnjim točkama pod anestezijom 4 weeka nakon injekcije. Tumori miša su izolirani, fotografirani i vagani. Tkanine su fiksirane u 10% puferiranom formalinu, obrađene i ugrađene u parafin. Veličina tumora izmjerena je pomoću čeljusti, a volumen tumora (mm 3 ) je procijenjen za 1/2 (dužina × širina 2 ).

imunohistokemija

Tkivo karcinoma dojke pacijenata i ksenograft tumor mišića fiksirano je u 4% paraformaldehidu, dehidrirano u stupnjevanoj seriji alkohola i zatim ugrađeno u parafin. Sekcije (debljine 4 μm) su deparafinisane, rehidrirane i potom uronjene u 3% vodikov peroksid u trajanju od 10 minuta kako bi se blokirala endogena peroksidaza. Nakon uzastopnog pranja s PBS-om, kriške su inkubirane s primarnim antitijelom ST8SIA4 ili Ki67 (1: 200; Abcam, Cambridge, Velika Britanija) na 4 ° C preko noći. Bojenje sekundarnog streptavidin-HRP-konjugiranog antitijela (1: 1000; Biotehnologija Santa Cruz) izvedeno je na sobnoj temperaturi 60 min. Slajdovi su zatim isprani u PBS-u i razvijeni primjenom DAB tijekom 5 minuta. Konačno, presjeci su suprotstavljeni hematoksilinom i prekriveni pokrovima. Negativne kontrole, bez antitijela su uključene. Sve obojene dijelove pregledali su svjetlosnom mikroskopijom i pregledala ih tri promatrača.

Analiza dvostruke luciferaze

Za eksperimente reportera luciferaze odabran je pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega, Madison, WI, USA). Plazmidi koji sadrže WT ST8SIA4 i mutant ST8SIA4 3′-UTR specifično su sintetizirani (Promega). Firefly luciferaza i Renilla luciferaza funkcionirali su kao gen za praćenje u tim plazmidima. For the reporter assays, 5 × 10 4 HEK 293 T cells were seeded in 24-well plates at 80% confluence and cultured for 24 h. The mimics of miRNA or miR-NC along with firefly luciferase reporter gene construct and a Renilla luciferase construct were co-transfected per well. After 48 h, the activities of firefly and Renilla luciferases were measured using the Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) and normalized to those of Renilla luciferase activities. The mean of relative luciferase activities from the cells transfected with the miR-control was set at 100. All experiments were performed in triplicate. The results were statistically analyzed using Student's t -test.

Statistička analiza

Data are mean±SD of at least three independent experiments. Student's t -test was applied to determine differences between samples. The paired t -test was used for comparison between cancer and adjacent tissues. All analyses were performed using SPSS 17.0 statistical packages (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). A value of * P <0.05 was considered to be statistically significant.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska tablica 1

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)