Međusobna komunikacija s razmakom potiče apoptozu na način koji ovisi o koneksinu | stanična smrt i bolest

Međusobna komunikacija s razmakom potiče apoptozu na način koji ovisi o koneksinu | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Praznine
  • Membranski proteini

Sažetak

Opisani su prazninski spojevi (GJs) da moduliraju smrt i opstanak stanica. I dalje ostaje nejasno zahtijevaju li ovaj efekt funkcionalne GJ kanale ili ovisi o kanalno neovisnim učincima koneksina (Cx), sastavnih dijelova GJ-a. Stoga smo analizirali apoptotički odgovor na streptonigrin (SN, intrinzični apoptotski put) ili na α -Fas (vanjski apoptotski put) u stanicama HeLa koji eksprimiraju Cx43 u usporedbi s stanicama koje su bile transficirane vektorima (CTL). Apoptoza procijenjena obojenjem annexin V-fluoresceinom izotiocijanatom / propidijevim jodidom bila je značajno veća u HeLa-Cx43 u usporedbi sa stanicama HeLa-CTL. Štoviše, cijepanje kaspaze-7 ili Parpa dogodilo se ranije u HeLa-Cx43 nego u HeLa-CTL stanicama. Usporedna analiza učinka dvaju daljnjih (endotelnih) Cx (Cx37 i Cx40) na apoptozu otkrila je da je apoptoza bila najveća u HeLa-Cx43 i najniža u stanicama HeLa-Cx37, a bila je u korelaciji s propusnošću GJ (procijenjena širenjem GJ- propusna boja i lokalno inducirani Ca2 + signali). Farmakološka inhibicija stvaranja GJ u stanicama HeLa-Cx43 značajno je smanjila apoptozu. Uloga GJ komunikacije dodatno je analizirana ekspresijom skraćenih Cx43 proteina sa i bez kapaciteta za formiranje kanala. Aktivacija kaspaza bila je veća u stanicama koje eksprimiraju samo dio koji gradi kanal (HeLa-Cx43NT-GFP) nego u stanicama koje eksprimiraju kanalno nesposobni C-terminalni dio Cx43 (HeLa-Cx43CT-GFP). Oslobađanje od hemikanela i, prema tome, parakrinski učinak proapoptotskih signala mogu se isključiti budući da dodavanje hemikanala ovisnih o Cx43 (ali ne i GJ) koji ovise o peptidu (Pep) ne smanjuje apoptozu u stanicama HeLa-Cx43. Liječenje SN-om rezultiralo je značajnim povećanjem koncentracije slobodnog Ca2 + unutar stanice u stanicama HeLa-Cx43 i HeLa-Cx43NT-GFP u usporedbi sa stanicama HeLa-CTL ili HeLa-Cx43CT-GFP, što sugerira da Ca 2+ ili Ca2 + sredstvo za oslobađanje može igrati signalnu ulogu. Blokiranje receptora inozitola trifosfata smanjilo je SN-inducirani porast Ca2 + kao i povećanje apoptoze. Naša zapažanja sugeriraju da Cx43 i Cx40, ali ne i Cx37, promiču apoptozu putem prijenosa međusobnog prijenosa pro-apoptotičkih signala između stanica.

Glavni

Sve veći broj dokaza pokazuje da koksksini (Cx) mogu modulirati esencijalne stanične procese poput proliferacije, diferencijacije i migracije. Isto tako, pokazalo se da su preživljavanje i apoptoza djelomično ovisni o Cx. 1, 2, 3 Međutim, ostaje nejasno da li Cx izvršava svoje funkcije na način koji je ovisan o njihovoj sposobnosti da formiraju kanale spajanja praznina (GJ) ili da li svojstva Cx neovisnih o kanalu igraju ulogu poput one koja se opaža u migraciji ćelija i širenje. 4, 5, 6, 7 O ovom se pitanju još uvijek raspravlja. Postoji nekoliko studija koje sugeriraju da Cx, a posebno Cx43, djeluju na staničnu smrt i preživljavanje pomoću mehanizama neovisnih o međusobnoj komunikaciji između jaza. Većina tih učinaka povezana je s potencijalnom ulogom hemikanalima koji mogu omogućiti proapoptotički ili faktor preživljavanja iz unutarćelijskog u izvanćelijski prostor ili obrnuto . 8, 9, 10, 11, 12 Alternativno, regulatorni učinci Cx igraju ulogu u pro- i antiapoptotskim genima. 1 DNK nizovi Cx43-null i divljih vrsta miševa doista su pokazali jasne razlike u ekspresiji gena. 13 Na primjer, u stanicama glioblastoma koje eksprimiraju Cx43 opisana je smanjena ekspresija bcl-2, a opaženo je suzbijanje aktivnosti Src u stanicama malignih mezotelioma koji eksprimiraju Cx43. 14, 15 Nadalje, pokazalo se da unutarćelijska lokalizacija Cx43 na mitohondrijskim membranama 16, 17, 18, 19 ili nuklearnoj 20 ima ulogu u ovom kontekstu. Druga se izvješća odnose na različitu ulogu međusobne komunikacije u promicanju apoptoze. Na primjer, eksperimenti izvedeni s teškim ionima 21 ili citokromom C 22, 23 kao induktorima apoptoze pokazali su staničnu smrt u netretiranim susjednim stanicama, što ukazuje na ulogu GJ-a u modulaciji apoptoze. Predloženi su ne samo signali smrti, već i faktori preživljavanja stanica putem GJ-a. 24, 25, 26 Međutim, u većini slučajeva nije istraženo jesu li GJ kanali ili efekti neovisni o kanalu važni. Stoga ostaje nejasno koji je od dva potencijalna puta povezana sa Cx kvantitativno važniji i da li modulacijski učinak Cx na apoptozu ovisi o vrsti izraženog Cx. Također nije jasno koji bi signali ili male molekule, koje su u stanju proći GJ, mogle sudjelovati u promociji apoptoze.

Da bismo razjasnili ova pitanja, proučavali smo apoptozu u HeLa-transfektiranim stanicama HeLa bez pozadinske ekspresije Cx u stanju divljeg tipa. Naši rezultati pokazuju da pojačanje apoptoze ovisno o Cx zahtijeva komunikaciju između jaza i da taj učinak varira od vrste izražene Cx.

Rezultati

Ekspresija Cx43 povećava stopu apoptoze

Da bismo ispitali učinak Cx43 ekspresije na apoptozu, koristili smo HeLa stanice stabilno transfektirane CL43 ili Cx nedostatnim praznim vektorima transfektiranim HeLa stanicama (CTL) kao kontrolama. Apoptoza je ili inducirana streptonigrinom (SN; svojstveni put) ili α -Fas (put stimuliran vanjskim receptorima). Tretman s SN (1, 10 µM) ili α- Fas (10, 100 ng / ml) trajao je 5 h, a brzina apoptoze određena je obojenjem aneksin V-fluorescein izotiocijanatom (FITC) / propidium jodidom (PI). U oba su stanja apoptoza bila značajno veća u stanicama HeLa-Cx43 u usporedbi s HeLa-CTL stanicama (Slika 1b). Isto tako, tretiranje s SN (10 µM ) rezultira većim i ranijim produktom cijepanja Parpa (cl. Parp) i kaspaze-7 (kl. Cas7) kada je prisutan Cx43 (Slika 1c). Slično tome, stimulacija s α -Fas (100 ng / ml) rezultirala je cijepanjem Parp-a i kaspaze-7 već nakon 2 sata u stanicama HeLa-Cx43, dok je u stanicama HeLa-CTL započela tek nakon 4 sata (Slika 1c).

Image

Ekspresija Cx43 pojačava apoptozu HeLa stanica. ( a ) Reprezentativne konture plohe neobrađenih i α -Fas (100 ng / ml, 5 h) -obrađenih HeLa-Cx43 stanica. Količina apoptotskih stanica određena je obojenjem aneksinom V-FITC / PI i prikazana je u donjem desnom kvadrantu (siva). ( b ) SN-ili α -Fas-inducirana apoptotska stanična smrt HeLa stanica značajno se povećava ekspresijom Cx43. Apoptoza HeLa-Cx43 i HeLa-CTL stanica neobrađena ili tretirana povećanom koncentracijom SN ili α -Fas u trajanju od 5 h otkrivena je aneksinom V-FITC / PI označavanjem. Srednja vrijednost ± SEM, * P <0, 05 nasuprot netretiranom (NG); # P <0, 05 prema CTL stanici (NG); n ≥8 u najmanje tri različite stanične kulture. ( c ) Reprezentativne zapadne mrlje pokazuju da apoptotičko cijepanje Parpa (kl. Parp) i cijepanje kaspaze-7 (kl. Cas) (inducirano od 10 µM SN i 100 ng / ml α -Fas) ovisi o vremenu i ranije otkriti u stanicama HeLa-Cx43 u usporedbi sa stanicama HeLa-CTL

Slika pune veličine

Učinak Cx na apoptozu varira ovisno o tipu Cx i korelira s međusobnom bojom ili prijenosom kalcija

Da se razjasni učinak drugih Cx proteina i njihovih svojstava kanala na razvoj apoptoze, uspoređene su HeLa stanice koje eksprimiraju Cx37 ili Cx40 ili Cx43. Ekspresija različitih Cx proteina analizirana je Western blotom (slika 2a). Imunocitokemijski, stanice su pokazale tipični uzorak ekspresije s povećanom lokalizacijom u kontaktima stanica-stanica (Slika 2b). Cx-deficitarne HeLa-CTL stanice korištene su kao kontrola. Apoptoza je inducirana SN (1 µM , 3 h) i izmjerena bojom po aneksinu V-FITC / PI. Povećanje apoptotičkih stanica nakon stimulacije SN-om bilo je najmanje u stanicama HeLa-CTL, a najveće u stanicama koje eksprimiraju Cx43 (Slika 2c). Porast apoptotskih stanica izazvanih SN-om bio je značajno veći u stanicama koje eksprimiraju Cx43 u usporedbi sa stanicama HeLa-Cx37.

Image

Stopa apoptoze ovisi o izraženom tipu Cx i korelira s propusnošću GJ-a. ( a ) Western blot analiza za ekspresiju Cx37, Cx40 i Cx43 u stabilno transficiranim HeLa stanicama u usporedbi s HeLa praznom vektorom transfektiranom s HeLa (CTL). ( b ) Imunofluorescentno obojenje Cx proteina u stabilno transficiranim HeLa stanicama pokazuje tipičnu lokalizaciju na membrani susjednih stanica. HeLa-CTL stanice korištene su kao kontrola i nisu pokazale ekspresiju Cx43 bojenjem za Cx43. ( c ) Apoptoza (inducirana od 1 μM SN, 3 h) stabilno transficiranih HeLa stanica ovisi o tipu Cx izraženom i značajno povećanom ekspresijom Cx40 ili Cx43 u usporedbi s HeLa-CTL. Apoptoza je određena s označavanjem aneksina V-FITC / PI i porast porasta apoptotskih stanica je izražen kao srednja vrijednost ± SEM; * P <0, 05 prema CTL; # P <0, 05 nasuprot Cx37; n ≥5 u najmanje tri različite stanične kulture. ( d ) Spajanje staničnih veza između praznine HeLa stanica varira u zavisnosti od tipa Cx i korelira sa stopom apoptoze. Spajanje stanica izmjereno je razmazivanjem boje (Alexa Fluor 488). Broj obojenih stanica prikazan je kao srednja vrijednost ± SEM ( n ≥18 ubrizgavanja boja u ≥3 različite stanične kulture; * P <0, 05 nasuprot CTL; # P <0, 05 nasuprot Cx37; NG). GAPDH, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza

Slika pune veličine

Da bismo utvrdili da li su razlike u povećanju SN-induciranih apoptotskih stanica povezane s različitim propusnostima GJ kanala, procijenili smo spajanje stanica međućelijskim širenjem fluorescentne boje propusne za GJ nakon ubrizgavanja pojedine stanice (slika 2d). Stanice HeLa-CTL nisu pokazale ( n obojene stanice, prosječno ± SEM: 0, 1 ± 0, 1), a HeLa-Cx37 samo mali prijenos boje (2 ± 1). Suprotno tome, stanično spajanje stanica HeLa koje eksprimiraju Cx40 i Cx43 (Cx40: 9 ± 1; Cx43: 17 ± 2) je značajno povišeno u usporedbi sa stanicama HeLa-CTL. Dakle, najveći broj obojenih susjednih stanica zabilježen je u stanicama HeLa-Cx43. Pored toga, analizirali smo međućelijsko širenje Ca2 + signala nakon mehaničke stimulacije pojedine stanice. Opet se signal proširio šire u stanicama HeLa-Cx43 u usporedbi s stanicama HeLa-Cx37 i HeLa-CTL ( n stanice s povišenim Ca2 + ; srednja vrijednost ± SEM - Cx43: 21 ± 3; Cx37: 12 ± 2; CTL: 0 ± 0; P <0, 05; dvije različite stanične kulture, n = 10–14).

Nadalje smo istražili utječe li liječenje SN-om na spajanje praznine. Prijenos boje putem GJ-a izmjeren je u stanicama HeLa-Cx43, staničnoj populaciji s najvećom količinom apoptoze. Nakon tretiranja s SN-om tijekom 1 ili 3 sata, stanice su još uvijek mogle formirati funkcionalne GJ-ove, iako se brzina spajanja s vremenom smanjivala ( n obojene stanice; srednja ± SEM - neobrađene stanice: 17 ± 2; 1 µM SN za 1 h: 11 ± 2; 1 µM SN tijekom 3 sata: 6 ± 1; n ≥7 u tri različite stanične kulture).

Za poboljšanje apoptoze potrebna je međusobna komunikacija između praznine

Uloga GJ komunikacije za pojačanu apoptozu prvo je ispitivana korištenjem GJ blokatora meklofenamske kiseline (M; 100 µM ) i heptanola (H, 0, 25 mM). Količina SN- ili α -Fas-induciranih apoptotskih HeLa-Cx43 stanica (srednja vrijednost ± SEM - 1 μM SN: 15, 5 ± 4, 7%; 100 ng / ml Fas: 24, 1 ± 3, 6%) značajno je smanjena tijekom liječenja blokatorima GJ (1 μM SN + MH: 7, 1 ± 0, 4%; 100 ng / ml Fas + MH: 11, 8 ± 1, 1%; Slika 3). Sami GJ blokatori nisu utjecali na baznu stopu apoptoze (neliječene stanice: 6, 4 ± 0, 6%; stanice liječene samo blokadama GJ - MH: 6, 0 ± 0, 7%).

Image

Utjecaj spajanja jaza na apoptozu HeLa stanica. Apoptoza izazvana SN (1 µM, 5 h) ili α -Fas (100 ng / ml, 5 h) u HeLa-Cx43 stanicama značajno se smanjuje blokiranjem GJ kanala meklofenamskom kiselinom (M, 100 µM ) i heptanolom (H, 0, 25 mM). Apoptoza je mjerena obojenjem aneksinom V-FITC / PI i kvantificirana protočnom citometrijom. Postotak apoptotičkih stanica od ukupnog broja stanica izražen je kao srednja vrijednost ± SEM * P <0, 05; NG; n ≥3 u najmanje tri različite stanične kulture

Slika pune veličine

Da bismo dodatno analizirali je li funkcija netaknutog kanala između stanica potrebna za pojačanu apoptozu u stanicama koje eksprimiraju Cx43, uspoređivali smo apoptozu u stanicama HeLa koja eksprimira dio Cx43 koji izgrađuje N-terminalni kanal (Cx43NT-GFP) sa stanicama koje izražavaju citoplazmatsku C - terminalni dio (CT) Cx43 (Cx43CT-GFP), koji ne može tvoriti GJ ili hemikanele, ali vrši funkcije kanala Cx43 neovisne o kanalu. 5 Kao kontrole koristili smo HeLa stanice koje izražavaju cijelu dužinu Cx43 (Cx43-GFP). Za određivanje brzine SN-inducirane apoptoze u ovim stanicama izmjerena je količina aktiviranih kaspaza (kaspaza-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9) (vezanje a inhibitor crveno fluorescentno obilježen aktivnim kaspazama), kao što je izraz GFP-a ometen u testu aneksina V-FITC / PI koji se inače koristi. Intenzitet fluorescencije (crvene jedinice fluorescencije (RFU)), što ukazuje na aktivirane kaspaze, bio je značajno veći u HeLa-Cx43-GFP koji tvori kanal (srednja ± SEM: 21 422 ± 1494) i HeLa-Cx43NT-GFP ćelijama (22 546 ± 2031) u usporedbi s kanalno nesposobnim HeLa-Cx43CT-GFP stanicama (14 543 ± 758; Slika 4).

Image

Dio Cx43 koji izgrađuje kanal posreduje u pojačanoj apoptozi. SN-inducirana apoptoza (1 μM , 16 h) HeLa stanica koje eksprimiraju zeleni fluorescentni protein (GFP) označen Cx43 ili skraćeni Cx43 proteini određena je aktivacijom kaspaze. SN-inducirana apoptoza HeLa stanica koja eksprimira Cx43 cijele duljine (Cx43-GFP) ili dio Cx43 koji gradi kanal (Cx43NT-GFP) značajno je poboljšana u usporedbi sa stanicama koje izražavaju citoplazmatski dio Cx43 (Cx43CT-GFP). RFU-ovi koji pokazuju aktiviranje kaspaza u apoptotskim stanicama su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM; * P <0, 05 nasuprot Cx43CT-GFP, NG; n ≥3 u različitim staničnim kulturama

Slika pune veličine

Hemicikani nisu uključeni u pojačanu apoptozu stanica koje eksprimiraju Cx43

Potencijalno oslobađanje proapoptotskih signala kroz Cx hemikanele, koji mogu djelovati na parakrinski način, istraženo je specifičnom blokadom Cx43 hemikanala pomoću inhibitora Pep (50 µM), 27 koji ne utječe na međusobnu komunikaciju između praznina (stanice HeLa-Cx43; Širenje Ca 2+ zbog mehaničke stimulacije; neobrađeno: 25 ± 2 stanice; kontrolni peptid (ConPep): 28 ± 3 stanice; Pep: 27 ± 2 stanice; n = 9 u tri različite jažice stanične kulture). Količina apoptoze HeLa-Cx43 stanica sa SN (10 µM) ili α -Fas (100 ng / ml) nije promijenjena tijekom liječenja Pep-blokirajućim hemikalom (SN + Pep; Fas + Pep; Slika 5a). Apoptoza stanica inkubiranih samim inhibitorom Pep bila je tako niska kao i neobrađene stanice ili stanice inkubirane ConPepom (slika 5a). Učinkovitost Pep-blokirajućeg hemikanala testirana je mjerenjem unosa PI preko hemikanala u stanicama HeLa-Cx43. I netretirane i SN-tretirane stanice (10 µM ) pokazale su nisko bazalno unošenje PI, koje se značajno povećalo u prisutnosti ATP-a hemikanalnog otvarača (slika 5b). Ovo poboljšanje uzrokovano ATP-om je uklonjeno nakon prethodne obrade sa inhibicijskim Pep (50 μM ). ConPep nije smanjio ATP-inducirani unos PI u stanicama HeLa-Cx43 (srednja fluorescencija pojedinih stanica (srednja siva) neobrađena: 149 ± 1; SN: 155 ± 1; ATP: 194 ± 3; ATP + Pep: 155 ± 1; ATP + ConPep: 207 ± 2; u tri različite kulture, n ≥80–160; P <0, 001 ATP / ATP + ConPep nasuprot netretiranom i SN).

Image

Učinak hemikalija na apoptozu. ( a ) Inhibicija hemikanalima Cx43 s blokirajućim Pepom (50 μM, Pep) ne utječe na brzinu apoptoze izazvane SN (10 µM, 5 h) ili α -Fas (100 ng / ml, 5 h) u stanicama HeLa-Cx43. Kao kontrola upotrijebljena je neinhibicijska ConPep (50 μM). Apoptoza je mjerena obojenjem aneksinom V-FITC / PI i kvantificirana protočnom citometrijom. Postotak apoptotičkih stanica od ukupnog broja stanica izražen je kao srednja vrijednost ± SEM; n ≥6 u najmanje tri različite stanične kulture. ( b ) Primanje PI (prosječna crvena fluorescencija pojedinih stanica) od HeLa-Cx43 stanica iz kultivativnog medija može se potaknuti otvaranjem hemikanala s ATP-om (50 µM) i učinkovito blokirano preinkubacijom s Pep-blokiranjem hemikalija (50 μM ). Liječenje SN-om (10 µM ) nije utjecalo na unos PI. Kao kontrola korišten je neinhibicijski Pep (ConPep). PI unos pojedinih stanica prikazan je kao srednja vrijednost ± SEM; n ≥80–160 stanica u najmanje tri različite stanične kulture * P <0, 001 nasuprot neobrađenim, SN i ATP + ConPep, NG

Slika pune veličine

GJ kanali povećavaju količinu stanica koje reagiraju na SN povećanjem Ca 2+ i

Poznato je da Ca2 + i inozitol trifosfat (IP 3 ) predstavljaju potencijalne molekule proapoptotičkih signala, koje su dovoljno male da mogu proći kroz GJ. Stoga smo analizirali promjene unutarćelijskog slobodnog kalcija (Ca2 + i ) u stanicama bez GJs (CTL i Cx43CT-GFP) i u stanicama s funkcionalnim GJs (Cx43, Cx43NT-GFP) nakon liječenja s SN. SN (10 μM ) povećao je Ca2 + i u 84 ± 5% stanica koje su eksprimirale Cx43 cijele duljine i 59 ± 8% stanica koje su eksprimirale dio Cx43 koji gradi N-terminalni kanal (Cx43NT-GFP; Slika 6a). Suprotno tome, samo 27 ± 7% HeLa stanica koje ne iskazuju Cx (CTL) ili 28 ± 7% HeLa stanica koje izražavaju kanalno nesposobnu citoplazmatsku CT Cx43 (Cx43CT-GFP) reagiralo je na SN s povećanjem Ca 2+ i,

Image

Neposredni odgovor Ca2 + i povećava se u stanicama koje eksprimiraju funkcionalne Cx43 kanale. ( a ) Broj stanica koji su reagirali u roku od 3 minute s porastom Ca2 + i zbog tretmana SN-om (10 µM) značajno je povećan u HeLa ćelijama koje eksprimiraju Cx43- i Cx43NT u usporedbi sa stanicama HeLa-CTL ili HeLa-Cx43CT. Postotak stanica s porastom Ca2 + i od ukupnog broja stanica izražen je kao srednja vrijednost ± SEM; * P <0, 05 nasuprot CTL / Cx43CT, n ≥8 u najmanje tri različite stanične kulture. U drugoj seriji eksperimenata ( b ), porast Ca2 + induciran SN-om (10 µM) blokiran je preinkubacijom (15 min) s ksestosponginom C (xesto, 40 µM). Postotak stanica s porastom Ca2 + i od ukupnog broja stanica izražen je kao srednja vrijednost ± SEM; * P <0, 05, NG; n = 8 u tri različite stanične kulture. ( c ) Inhibicija oslobađanja Ca2 +, posredovanog IP3 (xesto, 40 µM) značajno smanjuje SN (10 µM, 5 h) -induciranu apoptozu stanica HeLa-Cx43, ali ne utječe na kontrolne stanice sa nedostatkom Cx. Apoptoza je određena s označavanjem aneksina V-FITC / PI i porast porasta apoptotskih stanica je izražen kao srednja vrijednost ± SEM; * P <0, 05 nasuprot odgovarajućem neobrađenom; # P <0, 05 nasuprot Cx43 SN; n = 6 u tri različite stanične kulture

Slika pune veličine

Inhibicija oslobađanja Ca 2+ koja je posredovana IP3 receptorima smanjuje apoptozu u stanicama HeLa-Cx43 spojenih s GJ

U drugom setu eksperimenata (slika 6b) preinkubacija (15 min) blokatorom receptora IP3 ksestospongina C (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Njemačka; 40 µM) ograničila je porast Ca2 + izazvanog SN-om na 36 ± 12% stanice (Cx43 + SN: 99 ± 1, P <0, 001, n = 8, u 3–4 različite kulture). Ovaj broj dobro odgovara količini stanica s manjkom GJ-a koje reagiraju na povećanje Ca2 + i na stimulaciju SN-om (slika 6b). Inhibicija IP3 receptora pomoću ksestospongina C smanjila je brzinu SN-inducirane apoptoze samo u HeLa-Cx43, ali ne i u HeLa-CTL stanicama (Slika 6c).

Rasprava

U ovoj studiji pokazali smo da pojačani učinak ekspresije Cx na apoptozu u HeLa stanicama ovisi o njihovoj sposobnosti formiranja kanala i njihovom utjecaju na propusnost kanala. Suprotno tome, efekti neovisni o kanalu, poput onih za koje je opaženo da imaju ulogu u migraciji u istoj vrsti stanica 5 ili u staničnoj proliferaciji kao što je prikazano u stanicama Neuro2a, 28 nisu se mogli primijetiti. Dakle, naša studija potvrđuje i proširuje prethodna izvješća o odlučujućoj ulozi međusobne komunikacije između jaza u povećanju apoptoze u staničnoj liniji tumora, kao što su BC31 (stanična linija karcinoma karcinoma mjehura štakora) 29 ili C6 gliomskih stanica, 30, kao i u stanicama neurona, na primjer, stanice astrocita 31 i Neuro2a. 32

Naš zaključak da je zajednička komunikacija između jaza kao preduvjet pojačane apoptoze utemeljen na nekoliko dokaza. Prvo, farmakološka inhibicija GJ smanjila je opseg apoptoze izazvane SN- ili α -Fas. U skladu s inhibicijskim djelovanjem meklofenamske kiseline i heptanola na GJ-spajanje, 33 pokazali smo da GJ ostaju otvoreni tijekom razvoja apoptoze i to se podudara s rezultatima drugih skupina. 30, 34 Iako korišteni inhibitori, meklofenamična kiselina i heptanol mogu imati nespecifične učinke, oni nisu izravno ometali procese apoptotičke signalizacije, jer nisu utjecali na brzinu apoptoze u netretiranim stanicama. Drugo, odlučujuću ulogu komunikacije između jaza, ali ne i o kanalu neovisnih učinaka Cx43, mogli bi potvrditi naši rezultati dobiveni u HeLa stanicama koje izražavaju skraćene varijante Cx43. Prije smo pokazali da stanice koje eksprimiraju N-terminalni dio (NT) Cx43 mogu tvoriti funkcionalne GJ, dok stanice koje izražavaju C kraj Cx43 nisu. 5 Prema tome, SN-inducirana apoptoza povećana je samo u stanicama koje eksprimiraju dio koji gradi N-terminalni kanal, ali ne i u stanicama koje eksprimiraju C-terminalni citoplazmatski dio Cx43. Zaključujemo da je za pojačavanje apoptoze potrebna ekspresija funkcionalnih Cx43 GJ kanala.

Daljnji dokaz da komunikacija između rasjeka pojačava apoptozu može se zaključiti iz opažanja da je stopa apoptoze jasno ovisila o propusnosti spojeva jaza, kako je utvrđeno Cx s proučenim ovdje: Cx43≥Cx40≥Cx37> Cx-deficit kontrola. Te razlike ovisne o Cx u GJ propusnosti su u skladu s vlastitim prethodnim opažanjima 35 i još jednom nedavno objavljenom studijom, koja pokazuje najveći prijenos boja za kanale sačinjene od Cx43, a slijede Cx40 kanali i najmanji prijenos za Cx37 kanale. 36 Treba napomenuti da se naši rezultati temelje na korištenju GJ-permeantne boje Alexa Fluor 488. Iako se stanična razmjena GJ-permeantnih boja između stanica može razlikovati s obzirom na njihovu veličinu i površinski naboj i ne može predstavljati propusnost nijedne Potencijalna proapoptotska molekula, 36, 37 podupire tijesnu vezu između spojne propusnosti jaza i povećanja apoptoze u eksperimentima o kojima je ovdje izvješteno. Međutim, nalaz da je širenje Ca2 + signala kroz GJ pokazalo slično ponašanje nego Alexa Fluor 488 sugerira da različite propusnosti nisu jedinstvene za ovu boju.

Naše istraživanje pokazuje ulogu međusobne komunikacije između apopaze i za egzogeni i endogeni put induciranu s dva različita podražaja. Iako naša studija ne dopušta zaključak da postoji opća uloga komunikacije između raskoraka u kontroli apoptoze, ona nije ograničena na jedan poticaj. Nadalje, općenitija uloga spajanja jaza sugerira se opažanjem da su stanice u klasteru osjetljivije na indukciju apoptoze nego pojedine stanice. 29, 31 Međutim, naši eksperimenti također jasno pokazuju da komunikacijska razlika u komunikaciji s jazom nije bitan preduvjet za razvoj apoptoze, već pojačava njezin razvoj.

Nekoliko studija impliciralo je ulogu hemikanala u preživljavanju i smrti stanica. 8, 10, 38, 39 Iako Cx s mogu tvoriti hemikanele koje bi mogle omogućiti oslobađanje pro-apoptotičkih signala neovisno o spojevima jazbina, u našem eksperimentalnom okruženju nismo pronašli dokaze za takav mehanizam. Pepi koji blokira hemikanelom 27, a koji nije utjecao na spajanje između rasjeka, nije mogao umanjiti SN- ili α -Fas-induciranu apoptozu u stanicama koje eksprimiraju Cx43. Činjenica da stanični unos PI u prisutnosti ATP-a, kao što je navedeno drugdje 40, može biti blokiran preinkubacijom s Pep-blokirajućim hemikalijama potvrdio je očekivano inhibicijsko djelovanje u našem eksperimentalnom okruženju.

Očito, zahtjev funkcionalnih GJ-a za povećanje apoptoze sugerira da se neki proapoptotski signali mogu razmjenjivati ​​između apoptotičkih stanica i njihovih susjeda. Takvi signali ne mogu sadržavati kaspaze ili proteaptoptičke regulatore proteina poput bad ili bax, jer su ti molekuli preveliki da bi prolazili GJ, koji omogućuju prolazak samo za molekule do 1, 8 kDa. 41 Kandidati za male molekule za koje se pretpostavlja da su potencijalni posrednici smrti prilikom prenošenja putem GJ-a su Ca 2+, IP 3 i cAMP. 1, 42 Poznato je da nekoliko podražaja koji potiču apoptozu utječu na Ca2 + i . Signali Ca 2+ zauzvrat mogu dovesti do aktiviranja kaspaza, pokretača apoptoze i otvaranja prelaznih pora mitohondrijske propustljivosti (PTP). Formiranje i otvaranje PTP dovodi do oslobađanja citokroma C , koji zauzvrat ima ulogu u aktivaciji kaskade kaspaze i ostalih proapoptotskih proteina. 1, 43 Utjecaj molekule IP 3 propusne za GJ na apoptozu povezan je s oslobađanjem Ca 3+ koji je pokrenut IP 3, čime pridonosi indukciji događaja u apoptotičkim stanicama. 1, 42 Važnost Ca2 + kao proapoptotskog signala pokazana je liječenjem stanica kalcijevim ionoforom ionomicinom ili s thapsigarginom. Takvo inducirano produženo povišenje Ca2 + bilo je dovoljno za pokretanje apoptoze bez drugih podražaja koji izazivaju apoptozu. 44, 45

Analizirali smo mogu li promjene Ca 2+ i biti uključene u pojačanu brzinu apoptoze opaženu u stanicama zajedno s razmacima. Doista, liječenje SN-om rezultira brzim porastom Ca 2+ i . Prethodno je opisano povećanje Ca 2+ i nakon liječenja SN-om u stanicama limfoblastoida. 46 Međutim, u stanicama bez međusobnog spajanja, samo je manji dio odgovorio porastom Ca2 + i, dok su gotovo sve stanice reagirale kad su stanice bile spojene. Zanimljivo je da je prethodna obrada inhibitorom IP3 receptora ksestosponginom C 47 ograničila odgovor kalcija na dio stanica, koji je bio numerički identičan frakciji stanica koji su reagirali u odsutnosti praznina. Prije smo pokazali da je ksestospongin C pouzdano ukinuo IP3-posredovane Ca2 + odgovore. 33 Prema tome, naša su otkrića u skladu s gledištem da je SN inducirao povećanje ovisnosti Ca3 + i za IP3 u stanicama osjetljivim na SN. Ovaj Ca2 + signal mogao se proširiti na susjedne stanice putem GJ, što je također u skladu s našim nalazima da je dio stanica reagirao s kašnjenjem povećanja Ca 2+ i (do 30 s) nakon tretiranja SN-om (podaci nisu prikazani). Kao što je prije prikazano, povećanje Ca 2+ i može izazvati sekundarno otpuštanje kalcija putem IP 3 receptora, 48 koji se u našem okruženju može proširiti putem GJ-a na susjedne stanice koje ne reagiraju na SN i izazvati povećanje Ca 2+ i kao dobro. Stoga, i odsutnost međusobne komunikacije i inhibicija IP3 receptora može ograničiti apoptozu na istu količinu kao što je ovdje promatrano. Nedavno smo opisali da sličan mehanizam igra ključnu ulogu u Ca2 + odgovoru endotelnih stanica na stimulaciju histaminom ili ATP-om. Zabilježeno je i povećanje Ca 2+ i za apoptozu pokrenutu Fas-om, a kontinuirano povećanje Ca2 + i počelo je između 1 i 2 sata nakon liječenja. 50, 51

U skladu s našom studijom, objavljeno je da je blokada međućelijske komunikacije putem GJ ublažila opseg apoptoze, na primjer, u stanicama BC31, 29 stanica granuloze 52 ili astrocitima. 53 Opisana je takozvana smrt promatrača izazvana širenjem međusobnog širenja signala ubijanja stanica iz stanica podvrgnutih apoptozi u zdrave stanice u okruženju za nekoliko stanja koja izazivaju apoptozu. 21, 22 Iako fiziološka uloga širenja signala apoptoze na potencijalno zdrave susjedne stanice ostaje predmet rasprave, čini se da će prolaz 'signala smrti' iz smrtonosno ozračenih ćelija do njihovih susjeda putem GJs 54, 55 vrlo obećavajuće za terapije protiv raka. 56 Slučajni efekti posredovani GJ-om opisani su i za nekoliko bolesti, na primjer, retinitis pigmentosa 57 ili HIV-1 infekcija, 58 i mogu predstavljati potencijalno važan terapijski princip u tim bolestima.

Zaključno, naša je studija pokazala da ekspresija Cx pojačava indukciju apoptoze. To nije klasni učinak, ali značajno varira ovisno o vrsti Cx kao što je ovdje ispitano za Cx koji se izražava u vaskularnom tkivu. Naši rezultati sugeriraju da je taj učinak posljedica prijenosa proapoptotskih signala, među kojima IP 3 može igrati značajnu ulogu. Stoga, komunikacija između rasjeka i kontrola propusnosti spoja varijacijom Cx ekspresijom mogu biti potencijalni cilj terapijske kontrole apoptoze.

Materijali i metode

Stanične kulture

Stanice HeLa stabilno transficirane mišjim Cx37, mišjim Cx40 ili štakorom Cx43 ljubazno je osigurao dr. Klaus Willecke (Sveučilište u Bonnu, Bonn, Njemačka). HeLa stanice transficirane su praznim vektorom pBEHpac18 (CTL; ​​ljubazno osigurao dr. Willecke, Bonn, Njemačka) koristeći SuperFect (Qiagen, Hilden, Njemačka), koji je služio kao kontrola. Stvaranje stabilno transficiranih HeLa stanica koje eksprimiraju NT (aminokiseline (aa) 1–257, Cx43NT-GFP) ili CT Cx43 (aa 257–382, Cx43CT-GFP) prethodno je opisano. 5 Stanice su kultivirane u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (DMEM; Invitrogen, Life Technologies, Darmstadt, Njemačka) s 10% novorođenim telećim serumom (Biochrom, Berlin, Njemačka), penicilinom (100 U / ml; Sigma Aldrich) i streptomicinom (100 μg / ml; Sigma Aldrich) na 37 ° C i 5% C02. Sredstvo za rast stabilno transficiranog HeLa-CTL, HeLa-Cx37, HeLa-Cx40 i HeLa-Cx43 je dopunjeno puromicinom (1 μg / ml; Sigma Aldrich) i HeLa-Cx43NT-GFP i HeLa-Cx43CT-GFP sa zeocinom ( 200 μg / ml; Invitrogen, Life Technologies). Apoptoza je inducirana SN (Sigma Aldrich) ili α -Fas antitijelom (Millipore Merck, Schwalbach, Njemačka) kao što je naznačeno.

Dodatak V-FITC / PI bojenje

Aneksin V-FITC komplet za otkrivanje apoptoze (BD Biosciences, Heidelberg, Njemačka) korišten je prema preporukama proizvođača. Stanice su tretirane kako je naznačeno, odvojile su se Accutase (PAA Laboratories, Coelbe, Njemačka) i sakupile centrifugiranjem (1500 okr / min, 5 min). Stanične pelete su isprane fiziološkom otopinom fosfata (PBS), resuspendirane u puferu od 1 × (0, 01 M HEPES / NaOH, pH 7, 4, 140 mM NaCl i 2, 5 mM CaCl2) i obojene s aneksinom V-FITC i PI 15 min na sobnoj temperaturi u mraku. Ukupno 10 000 stanica svakog uzorka analizirano je fluorescentno razvrstavanjem stanica (FACSort; BD Bioscience). Apoptotičke stanice su definirane kao V-FITC-pozitivne aneksine i PI-negativne stanice.

Western blot analiza

Prazne HeLa stanice transficirane vektorom (CTL) ili HeLa stanice koje stabilno eksprimiraju Cx37, Cx40 ili Cx43, posijane su u pločice sa 6 jažica i idućeg dana lizirane u Laemmli puferu 59 . Uzorci su kuhani 5 minuta i razdvojeni veličinom pomoću SDS-PAGE pomoću 8–16% Tris-glicinskih gelova (Thermo Scientific, Bonn, Njemačka). Proteini su elektroforetski preneseni na Hybond-P membranu (Amersham, GE Healthcare, Freiburg, Njemačka) pri 0, 8 mA / cm 2 u trajanju od 1 h, a nespecifično vezivanje antitijela bilo je blokirano 5% obranog mlijeka u prahu (AppliChem, Darmstadt, Njemačka) u PBS otopina koja je sadržavala 0, 1% Tween-20 (Sigma Aldrich) 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su inkubirane zečem α -Cx37 (1: 1000; Alpha Diagnostic, Biotrend, Koeln, Njemačka), zečem α -Cx40 (1: 1000; Alpha Diagnostic) ili kunićem α -Cx43 (1: 1000; Sigma Aldrich) preko noći na 4 ° C. Nakon ispiranja s PBS-0, 1% Tween, mrlje su se inkubirale 2 sata sa sekundarnim antitijelom vezanim sa hrenovom peroksidazom (1: 1000; Calbiochem, Merck, Darmstadt, Njemačka). Primarna antitijela su razrijeđena u 5% goveđeg serumskog albumina (BSA; AppliChem) u PBS-0, 1% Tween-a, a sekundarna antitijela u 5% obranog mlijeka u prahu u PBS-0, 1% Tween. Mrljice su isprane četiri puta po 10 min svako, a vezana antitijela detektirana su korištenjem kita za hemiluminiscenciju za peroksidazu hrenu (AppliChem).

Za analizu apoptotičkog cijepanja kaspaze-7 i Parpa u stanicama HeLa-Cx43 i HeLa-CTL, stanice su posijane u ploče sa 6 jažica do 80% -tnog upajanja. Sljedećeg dana stanice su tretirane s 10 µM SN (Sigma Aldrich) ili 100 ng / ml α -Fas (Millipore) naznačene vremenske točke i lizirane u Laemmli puferu. 59 Za otkrivanje cijepanog Parpa, protutijelo na α- Parp (1: 500; Stanična signalizacija, NEB, Frankfurt na Majni, Njemačka), a za cijepanu kaspazu-7, protutijelo na α -kapapazu-7 (1: 500; Stanična signalizacija ), korišten. Detekcija GAPDH ( a -GAPDH, 1: 10000; Chemicon, Merck Chemicals, Schwalbach, Njemačka) korištena je za demonstriranje jednakog opterećenja.

Imunofluorescentno bojenje

Stanice HeLa koje eksprimiraju Cx37, Cx40 ili Cx43 ili HeLa-CTL stanice posijane su na staklene pokrivače. Sljedećeg dana stanice su fiksirane s 3, 7% formaldehida u PBS-u tijekom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su propusne za 0, 1 min Triton X-100 (AppliChem) u PBS-u. Nespecifično vezanje antitijela bilo je blokirano s PBS-om koji je sadržavao 0, 5% BSA tijekom 1 sata. Stanice se inkubiraju sa zečevima α -Cx37 (Alpha Diagnostic; 1: 100), kunićem α -Cx40 (Alpha Diagnostic; 1: 100) ili zečem α -Cx43 (Sigma Aldrich; 1: 100) preko noći na 4 ° C. Stanice su isprane i inkubirane sa sekundarnim antitijelom (1: 200) vezanim s fluokrokrom Alexa Fluor 488 (Invitrogen) 1 sat na sobnoj temperaturi. Poklopi su montirani, a ekspresija i lokalizacija Cx proteina analizirani su pomoću konfokalne mikroskopije (Leica, Wetzlar, Njemačka).

Detekcija apoptoze u stanicama s inhibiranim spajanjem rasjeka

Za ispitivanje utjecaja GJ-a na brzinu apoptoze, stanice HeLa-Cx43 inkubirane su meklofenamskom kiselinom (M; 100 µM; Sigma Aldrich) i heptanolom (H; 0, 25 mM; Sigma Aldrich), što je gotovo ukinulo spajanje praznine te minimizirana nuspojava lijekova. 33 Da bi se inducirala apoptoza, stanice su dodatno tretirane s 1 μM SN ili 100 ng / ml α -Fas tijekom 5 sati, a količina apoptotskih stanica kvantificirana je protočnom citometrijom bojenjem aneksinom V-FITC kao što je gore opisano.

FLICA bojenje

Apoptoza je mjerena kitom za otkrivanje apoptoze sulfohodamina FLICA (Immunochemistry Technologies, Biomol, Hamburg, Njemačka). Crveni fluorescentni inhibitor kaspaza SR-VAD-FMK detektira aktivirane kaspaze (kaspaza-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9) apoptotskih stanica. Neobrađene ili SN-obrađene (1 µM, 16 h) HeLa stanice koje eksprimiraju Cx43-GFP, Cx43NT-GFP cijele dužine ili Cx43CT-GFP odvojene su tripsinom-EDTA (Sigma Aldrich) i staničnom suspenzijom od 300 µl (5 × 10 6 stanica po ml) obojeno je s FLICA reagensom prema uputama proizvođača. Nakon bojenja, stanice su isprane tri puta s 1 × puferom za ispiranje i ponovno su određene koncentracije stanica neobrađenih i SN-tretiranih stanica. Nakon ravnoteže staničnih koncentracija, stanice su ponovo suspendirane u PBS-u i izmjeren je intenzitet crvene fluorescencije sulforhodamina (RFU) u čitaču fluorescentnih ploča pri valnim duljinama pobuđenja / emisije 550/595 nm.

Analiza prijenosa proapoptotskih signala neovisnih o GJ preko hemikanela

Učinak hemikanala na brzinu apoptoze analiziran je s Pepom koji blokira hemikane. HeLa-Cx43 stanice su inkubirane sa Cp43 specifičnim Pep-om (H-Val-Asp-Cys-Phe-Leu-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Lys-Thr-OH; 50 μM; Biosyntan, Berlin, Njemačka ), koji navodno inhibira hemikane u koncentraciji od 50 µM utječući na izvanćelijsku petlju Cx43. 27 Za kontrolne eksperimente, stanice su inkubirane sa 50 μM ConPep (H-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Ala-Phe-Arg-Cys-Asn-Thr-Gln-OH). Apoptoza je inducirana dodatkom SN (10 μM) ili α- Fas (100 ng / ml) tokom 5 sati, a količina apoptotskih stanica izmjerena je obojenjem aneksinom V-FITC / PI.

PI unos preko hemichannela

Za analizu aktivnosti hemikanala, stanice HeLa-Cx43 inkubirane su s PI (20 µg / ml, 10 min) i fluorescentnim slikama (pobuda: 546 nm; emisija: 570 nm; vrijeme izlaganja 1000 ms; eksperimentalno postavljanje: vidi mjerenja kalcija) su uzeti odmah nakon ispiranja PI. Srednja fluorescencija (srednja vrijednost sive) pojedinih stanica izračunata je softverom Till Vision (Till Photonics, Gräfelfing, Njemačka). Da bi potvrdili da unos PI nije posljedica smrti stanice, stanice su nakon toga obojene Trypan plavim, a plave obojene stanice isključene su iz izračuna. Hemikanal se aktivira ATP (50 μM).

Mjerenje Ca 2+ i

Unutarćelijske promjene slobodnog Ca2 + otkrivene su pomoću Ca2 + osjetljivog bojila Fura2 (Invitrogen). Nakon inkubacije s 4 μM Fura2 otopljenom u DMEM-u (30 min na 37 ° C i 5% C02), HeLa stanice (uzgajane na pokrivačima) su isprane dva puta, premještene u eksperimentalnu komoru (koja je imala široki otvor na vrhu ) i inkubira se u HEPES (pH 7, 4; 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1, 25 mM NaH2P04, 2, 5 mM CaCl2, 1, 5 mM MgCl, 10 mM glukoze). Komora napunjena s 200 µl HEPES-a postavljena je na obrnuti mikroskop (Axiovert S100; Zeiss, Göttingen, Njemačka).

Boja osjetljiva na Ca 2+ bila je alternativno pobuđena na 340 i 380 nm, a signal je detektiran na 505 nm pomoću računalnog sustava (Till Photonics). Okviri na 340 i 380 nm analiziranih područja (640 nm × 480 nm) pohranjeni su na svakih 500 ms tijekom 3 minute, a korekcijski omjer signala za pozadinu određen je za svaki piksel nakon eksperimenta. Na temelju promjena srednjeg omjera pojedinih stanica tijekom vremena, izračunao se postotak stanica koje pokazuju porast Ca2 + i zbog stimulacije (reakcija stanica po stanicama na vidljivom području). Nije pokušao izračunati točnu koncentraciju Ca 2+ i iz omjera.

Cells were stimulated mechanically or by the addition of SN (10 μ M). Mechanical stimulation of single cells by touching with glass pipettes (tip diameter 1 μ m) increased the Ca 2+ i of the stimulated cell. In the presence of apyrase (Sigma Aldrich; 50 U/ml), which degraded the ATP released due to the stimulation, the Ca 2+ signal spread to neighbouring cells via gap junctions. The number of cells showing an elevated Ca 2+ level (except of the stimulated cell) was counted. In another set of experiments, SN was solved in double concentration (20 μ M) in HEPES and 200 μ l of this solution was rapidly added to the cells (120±14 cells per visual field were counted). Addition of the solution without stimuli did not change the Ca 2+ i signals. SN did not change the pH of the HEPES solution. IP 3 receptors were inhibited by preincubation (15 min) with xestospongin C (40 μ M).

Dye coupling

Gap junctional coupling was detected by injecting a GJ-permeable, membrane-impermeable fluorescent dye (3.5 mM Alexa Fluor 488 dissolved in 150 mM KCl; Invitrogen) into single cells and analysing the dye spreading within 5 min. The cell incubation unit and experimental settings were the same as for the Ca 2+ i measurement. The dye was injected using a dye-filled borosilicate micropipette (at a tip pressure of 60 mm Hg for 0.6 s, tip diameter <1 μ m) connected to an injecting system (FemtoJet; Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany). The fluorescent dye was excited at 488 nm and fluorescence signals were detected using a long-pass emission filter λ em ≥515 nm. Following dye injection, images were captured using a digital camera (Imago; Till Photonics) that was mounted on the inverted microscope (Axiovert S100; Zeiss). To assess cellular coupling, the total number of dye-stained cells at the 5-min postinjection timepoint was counted.

statistika

Gaussian distributed data were analysed for statistically significant differences by the Student's t -test (two groups, unpaired data). Differences between more than two groups were determined by one-way ANOVA, followed by Student–Newman–Keuls method for multiple comparisons. Error probabilities of P ≤0.05 were considered significant. All values are expressed as means±SEM Non-Gaussian distributed data (indicated as 'NG' in the figure legends) were analysed by the non-parametric Mann–Whitney rank-sum test. For multiple comparisons, the Kruskal–Wallis test on ranks followed by pairwise multiple comparisons with Dunn's method was used. Although these tests do not allow analysing differences of mean values, for descriptive reasons mean values are presented throughout the manuscript. Medians are not displayed as they did not differ from the means more than 20%.

Glosar

GJ

gap junction

Cx

connexin/s

NT

N-terminal part

CT

C-terminal part

S N

streptonigrin

Ca 2+ i

intracellular free calcium

FITC

fluorescein isothiocyanate

PI

propidium iodide

aa

amino acids

IP 3

inositol triphosphate

α

anti