Genetski deficit neuronskog bijesa štiti od sinaptičke ozljede izazvane dobi | stanična smrt i bolest

Genetski deficit neuronskog bijesa štiti od sinaptičke ozljede izazvane dobi | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična signalizacija
  • Kognitivno starenje
  • Neurodegenerativne bolesti
  • patogeneza

Sažetak

Sinaptička disfunkcija i degeneracija rana su patološka značajka starenja i bolesti povezanih sa starenjem, uključujući Alzheimerovu bolest (AD). Starenje je povezano s povećanim stvaranjem i taloženjem naprednih krajnjih produkata glikacije (AGE), što je posljedica nedenzimskih glikacijskih (ili oksidacijskih) proteina i lipida. Ubrzava se stvaranje starosne dobi kod mozga koji je pogođen dijabetesom i AD-om, doprinoseći staničnoj perturbaciji. Trenutno nije poznat opseg uključenosti AGE-a u promjene u sinaptičkoj strukturi i funkciji. Ovdje analiziramo doprinos neuronskog receptora AGEs (RAGE) signalizaciji posredovanom AGE sinaptičkom ozljedom koristeći nove transgenične neuronske RAGE knockout miševe koji su posebno usmjereni na prednji mozak i transgene miševe koji izražavaju neuronski dominantno-negativni RAGE (DN-RAGE). Dodavanje AGE-ova na moždane kriške oslabljene dugoročne potencijale hipokampa (LTP). Slično tome, liječenje hipokampalnih neurona s AGE-om značajno smanjuje sinaptičku gustoću. Takvi štetni učinci uvelike su poništeni genetskim iscrpljivanjem RAGE. Značajno je da su moždani kriški miševa s nedostatkom RAGE neurona ili DN-RAGE otporni na AGE-inducirani deficit LTP. Nadalje, nedostatak RAGE ili DN-RAGE blokira AGE-inducirano aktiviranje p38 signalizacije. Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da neuronski RAGE funkcionira kao pretvornik signala za ANA-induciranu sinaptičku disfunkciju, pružajući nove uvide u mehanizam kojim signalna kaskada ovisna o AGEs-RAGE pridonosi sinaptičkoj ozljedi putem transdukcijskog puta p38 MAP kinaze, Dakle, RAGE blokada može biti meta za razvoj intervencija usmjerenih na sprečavanje napredovanja kognitivnog pada starenja i dobnih neurodegenerativnih bolesti.

Glavni

Krajnji proizvodi naprednog glikacije (AGE) su članovi heterogene klase molekula, koji mijenjaju staničnu funkciju različitim mehanizmima, uključujući ligaciju i aktiviranje receptora transdukcije signala. Proizvodi neenzimske glikacije (ili oksidacije) proteina i lipida, AGE doprinose normalnom procesu starenja i kada se ubrzaju imaju uzročno-važnu ulogu u vaskularnim komplikacijama dijabetes melitusa i nekoliko neurodegenerativnih bolesti, uključujući Alzheimer (AD), Parkinsonove bolesti, i Huntingtonove bolesti. 1, 2, 3, 4, 5 U bolesnika s dijabetesom zabilježena je koncentracija cirkulirajućih AGE (razina AGE u serumu) od 7, 2–22 mU / ml (ekvivalent 30–88 µ g / ml AGE-BSA), što je značajno veći od bolesnika koji nisu dijabetični (3 mU / ml, što odgovara 12 µg / ml AGE-BSA). 6, 7, 8 Razina AGE mozga je također povećana na 5-6 μ M (ekvivalentno 325–390 μg / ml AGE-BSA) kod modela dijabetičkih životinja. 9 Prekomjerno nakupljanje AGE štetno je za neurone i vjeruje se da je ključno za patogenezu kognitivnog pada normalnog starenja i specifičnih kroničnih bolesti starenja. Na primjer, u nedavnom kliničkom istraživanju, periferne razine AGE povezane su s padom kognitiva kod starijih odraslih osoba sa i bez dijabetesa. 10 Komplikacije dijabetesa utječu na mozak, povećavajući rizik od depresije, demencije i AD. U stvari, pacijenti s dijabetesom tipa 2 imaju dvostruko do trostruko povećan relativni rizik za AD 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 i ubrzanu kognitivnu disfunkciju.

Dugovječni proteini poput β- amiloidnog peptida (A β ) i hiperfosforiliranog tau proteina koji se akumuliraju u mozgu AD vrlo su osjetljivi na modifikaciju AGE. 19, 20, 21, 22 A-ili tau-modificirani AGE protein rezultira pojačanim oksidativnim stresom i kroničnom upalom, ubrzavajući AD patologiju i neuronske poremećaje. 19, 20, 22, 23, 24, 25 Štoviše, A ili tau glikacija rezultira povećanom agregacijom i naknadnim stvaranjem senilnih plakova ili neurofibrilarnih zapetlja, što je glavno patološko obilježje AD, 19, 22 što sugerira da je modifikacija AGE-a važan rizik faktor za neurodegenerativne bolesti. Iako povećana akumulacija AGE-a u mozgu, kao što se vidi kod starenja, dijabetesa ili neurodegenerativnih bolesti, ubrzava oksidativno oštećenje neurona doprinoseći sinaptičkoj disfunkciji i padu kognitiva, njegovi temeljni mehanizmi nisu dobro razumljivi.

Receptor za krajnji produkt glikacije (RAGE) prvo je identificiran kao stanični površinski receptor imunoglobulinske superfamije za AGE. 27, 28 Pojačana ekspresija RAGE javlja se u stanicama neurona i nehieurona u perifernom i središnjem živčanom sustavu kod osoba koje su stare, dijabetesa i AD, a RAGE ligandi su regulirani. 29, 30 Iako se pokazalo da interakcija AGE-RAGE doprinosi staničnoj perturbaciji važnoj za patogenezu kardiovaskularne bolesti i dijabetesne vaskularne komplikacije, 31, 32, 33 malo se zna o ulozi AGE-a i njegovoj interakciji s RAGE-om na sinaptička disfunkcija. Da bi se razumjeli mehanizmi koji sudjeluju u AGE posredovanim sinaptičkim oštećenjima, potrebno je riješiti sljedeća pitanja: (1) 'Izmijenjuju li AGE-ovi sinaptičku strukturu i funkciju? Ako je odgovor da, ovise li ove promjene o RAGE signalizaciji? '; (2) 'Da li RAGE blokada genetskim oštećenjem štiti od AGE-inducirane sinaptičke disfunkcije i gubitka?'; i (3) "Kakav je utjecaj neuronske RAGE na Aberrantnu sinabetičku funkciju uzrokovanu AGE-om?". Stoga je važno procijeniti utjecaj AGEs-RAGE interakcije na sinaptičku disfunkciju i istražiti mehanizam koji stoji na osnovi AGE-RAGE transdukcije signala i njegov doprinos sinaptičkom oštećenju.

Ovdje istražujemo neuronsku RAGE signalizaciju u ANA-induciranoj sinaptičkoj ozljedi koristeći naše nove uvjetne RAGE knockout miševe usmjerene na kortikalne neurone, kao i transgenične miševe koji prekomjerno izražavaju mutante RAGE u neuronima sa nedostatkom transdukcije. S obzirom da neuronske i ne-neuronske stanice u mozgu mogu doprinijeti AGE-induciranom neprestanom neuronalnom i sinaptičkom stresu i disfunkciji, procijenili smo utjecaj globalnog brisanja RAGE-a u ovom okruženju i dodatno razgranili mehanizam kojim RAGE-ovisna aktivacija p38 MAP-a kinaza potencira ANA-uvrijeđene sinaptičke ozljede.

Rezultati

Stvaranje i karakterizacija uvjetnih neuronskih RAGE selektivnih knockout (nRKO) miševa

Razvili smo model modela u kojem se briše neuronska ekspresija RAGE, posebno u području mozga koja je odgovorna za učenje i pamćenje, tako da se posljedice interakcije receptor i ligand mogu procijeniti u okruženju bogatom AGE-om. U tu svrhu nedavno smo stvorili Cre rekombinazne RAGE nulte miševe, nazvane Tg nRKO miševima, križajući Tg miševe koji su ciljani na neurone i ograničeni na regiju, a koji eksprimiraju Cre rekombinazu u cjelokupnom prednjem mozgu pod nadzorom kalcijevog kalmodulina ovisnog o predbračnom mozgu. kinaza II (CAMKIIa, CK2) promotor 34 za stvaranje delecije neurona RAGE u cijelom hipokampusu i korteksu. Koristili smo dva Cre-loxP sustava za generiranje ciljanog vektora i RAGE / flox miševe (izvodi Ozgen Inc., Bentley DC, WA, Australija). Slika 1a prikazuje ciljni vektor koji sadrži 5 'krak homologije, 3' krak homologije i krak loxP. Dva loxP mjesta koja prate RAGE eksone 2–4 omogućuju brisanje posredovano Cre primjenom Cre rekombinaze (Slika 1b). Ekscizija eksona 2–4 ​​pomoću Cre rekombinaze rezultira pomakom okvira i ranim zaustavljanjem kodona iz RAGE sekvence miša, koji blokiraju RAGE ekspresiju. Prvo smo napravili homozigotne RAGE floxed alele miševe ( RAGE flox / flox ); tada su RAGE flox / flox miševi bili ukršteni s neuronskim ciljnim CK2 miševima da bi se stvorili nRKO miševi ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ), koji su potom verificirani analizom repne DNA s PCR amplikcijom pomoću primera za flox (700 bp) i Cre transgena (300 bp) (slika 2a). Imunobloting kortikalnih homogenata sa anti-RAGE antitijelom pokazao je značajno smanjenje nivoa RAGE ekspresije u moždanoj kore nRKO miševa u usporedbi s miševima koji nisu Tg (∼ 80% smanjenje u odnosu na ne-Tg mozak, P <0.01) (Slika 2b). Nepotpuna supresija ekspresije RAGE nastala je zbog homogenata mozga, koji su sadržavali nehieronske stanice. Razine RAGE ekspresije nisu promijenjene u homogenatima cerebeluma (Slika 2c). Konfokalna mikroskopija s dvostrukom imunološkanjem RAGE i MAP2 jasno je pokazala da u korteksu (slike 2d-e) i hipokampusu (slika 2f) nRKO miševa gotovo da nije bilo RAGE signala, a time je potvrđeno i smanjivanje RAGE u kortikalnim neuronima u mozak nRKO miševa.

Image

Ciljana kaseta za konstrukciju. Shematski prikaz strategije koja se koristi za uvjetno rešavanje RAGE gena ekscizijom eksona 2–4 ​​mišjeg RAGE gena. ( a ) Annotirani (MacVector 9.5.3) prikaz lokusa koji identificira regiju koja je ciljana za homolognu rekombinaciju. Ciljni vektor izgrađen je iz tri fragmenta, 5 'kraka homologije, dva mjesta loxP i 3' kraka homologije. Selektivna kaseta PGK-a ubačena je nizvodno od eksona 1. PGK-neo kaseta je povezana sa FRT mjestima, a egzoni 2–4 s dvije loxP. ( b ) RAGE miševi flox / flox su ukršteni s ciljnim CK2 miševima neurona da bi se stvorili nRKO miševi ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ). Dvije loxP stranice s bočne strane RAGE eksona 2 do 4 kako bi se omogućilo brisanje posredovano Cre-om primjenom Cre-rekombinaze. Ekscizija eksona 2–4 ​​od Cre rekombinaze dovodi do pomaka okvira i ranog zaustavljanja kodona iz RAGE slijeda miša kako bi se blokirao RAGE izraz

Slika pune veličine

Image

Karakterizacija transgenih nRKO miševa s RAGE delecijom u kortikalnim neuronima. ( a ) Transgeni nRKO miševi identificirani su iz repne DNA na temelju PCR amplifikacije primjenom primera za flox (700 bp) u gornjoj ploči i CK2-Cre (300 bp) na donjoj ploči. Traka 1 označava RAGE flox / flox (non-Tg) miševe s negativnim Cre transgenom, a staze 2-3 označavaju nRKO miševe nošene s flox i Cre ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ). ( b i c ) Imunobloting kortikalnih homogenata ( b ) i mozak ( c ) od naznačenih Tg miševa za RAGE. Tubulin je korišten kao kontrola punjenja proteina. ( d - f ) Reprezentativne slike dvostrukog imunološkog bojenja na RAGE i MAP2 u korteksu ( d i e ) i hipokampusu ( f ). Konfokalne mikroskopske slike koje pokazuju RAGE deleciju u kortikalnim neuronima označene pozitivnim MAP2 kao neuronskim markerom. Uvećane velike slike neurona izvedene iz odgovarajućih stanica prikazane su u okviru panela ( e ). Linija mjerila = 50 μ m

Slika pune veličine

Imunokemijska karakterizacija Nɛ-karboksimetil-lizina (CML) u AGE pripravku

Od svih oblika AGE-a, CML je glavni proizvod glikacije za koji se zna da je stabilan i nakuplja se postupno in vivo u komplikacijama starenja, AD i dijabetesa. 21, 35 Da bismo potvrdili da li je CML glavni sastojak u našoj pripremi AGE-a, pripremili smo AGE-ove inkubacijom goveđeg serumskog albumina (BSA) s glukoznim 6-fosfatom 6–8 tjedana na 37 ° C i zatim izvršili imunokemijsku karakterizaciju koristeći monoklonalnu antitijela koja ciljaju CML adukte. Koristeći Coomassie plavu boju za brzo reverzibilno bojenje proteinskih traka u gelu, uočili smo ko-migraciju BSA i AGE-modificirane BSA na ∼ 66 i ∼ 70 kD, (respektivno, slika 3a). Povećanje molekulske težine gliciranog BSA je zbog modifikacije AGE, što rezultira intramolekularnim umrežavanjem. Imunoblotiranje istog preparata BSA i AGE-BSA upotrebom specifičnih antitijela na CML pokazalo je istaknutu imunoreaktivnost CML samo u prisutnosti AGE, što sugerira da je BSA gliciran. Suprotno tome, takva imunoreaktivnost nije bila prisutna na BSA bez glukoznog 6-fosfata (slika 3a). Ovi rezultati pokazuju da je CML glavni sastojak naše pripreme za AGE, koja se koristi u svim našim eksperimentima.

Image

Dugotrajno potenciranje s oslabljenom starošću (LTP). ( a ) Određivanje stupnja CML u pripremi AGE. Protein (2 μg) iz BSA inkubiran je glukoznim 6-fosfatom 8 tjedana na 37 ° C, a zatim podvrgnut SDS-PAGE. Proteinske trake obojane su Coomassie Blue (lijevo). Glikacija je otkrivena imunoblotiranjem s antitijelom na CML (desno). Traka 1, BSA; traka 2, BSA-modificirana BSA. ( b ) sama BSA nije utjecala na LTP. Umetci pokazuju reprezentativne tragove fEPSP-a u kriške tretiranim nosačem ili 100 µg / ml BSA prije θ-puknuće stimulacije (crna linija) i na kraju snimanja od 1 h (siva linija). ( c ) Preostalo potenciranje s nagiba fEPSP-a koje se pojavilo tijekom posljednjih 5 minuta LTP snimaka. ( d ) BSA nije utjecao na bazalni sinaptički prijenos (BST). ( e ) Učinak AGE-a na LTP. Kriške hippokamele perfuzirane su AGE (50, 100 i 200 µg / ml) ili BSA (100 µg / ml) 1 sat, a zatim su zabilježene LTP. N = 8–11 kriški od 3 do 5 miševa. ( f ) Preostalo potenciranje s nagiba fEPSP-a koje se pojavilo tijekom posljednjih 5 minuta LTP snimaka. ( g ) BST hipokampnih sinapsi zabilježen je iz naznačenih skupina miševa

Slika pune veličine

AGE oslabljuju dugotrajno potenciranje hipokampa (LTP)

Da bismo odredili izravni učinak AGE-a na sinaptičku funkciju, ispitivali smo sinaptički prijenos pod bazalnim stanjem i za vrijeme LTP-a, oblika sinaptičke plastičnosti koji se široko proučava kao stanični model za sinaptičku funkciju, u kriške hipokampa od miševa koji nisu Tg liječeni AGE-om ili BSA kao kontrola. U kriške tretiranim vozilima, BSA sama nije promijenila LTP (228, 8 ± 17, 04% nasuprot 223, 0 ± 7, 95% u kriške tretiranim BSA, P > 0, 05, slike 3b i c) ili bazalni sinaptički prijenos (BST) izmjereno ulazno-izlaznim mjerenje (slika 3d). Tretman AGE-a značajno je smanjio LTP na način ovisan o koncentraciji (180, 9 ± 15, 36%, 139, 1 ± 10, 42% i 124, 9 ± 7, 96% za 50, 100 i 200 µg / ml AGE-a respektivno, u odnosu na 220, 9 ± 20, 75% za 100 μ g / ml BSA, P <0, 01, Slike 3e i f). Nisu bile značajne razlike polja-ekscitacijskog post-sinaptičkog potencijala (fEPSP) u radijalumu CA1 stratuma između kriški liječenih AGE-om i BSA, što ukazuje da AGE-i nisu utjecali na normalan BST u hipokampalnim sinapsama (Slika 3g). Ovi rezultati pokazuju da AGE smanjuju dugotrajnu sinaptičku plastičnost.

Manjak RAGE spašava nedostatak LTP uzrokovanog AGE-om

Da bismo izravno odredili utjecaj RAGE na smanjenje uzrokovano AGE-om, prvo smo zabilježili LTP u kriške hipokampa zbog globalnog iscrpljivanja RAGE (RKO) i ne-Tg miševa tretiranih s AGE. Pronašli smo slične potencijale u kriškama nedostatnim RAGE u usporedbi s križama bez Tg u prisutnosti BSA (224, 3 ± 17, 81% nasuprot 208, 8 ± 19, 50%, P > 0, 05, slike 4a i e). Međutim, manjak RAGE u velikoj mjeri zaštitio kriške hipokampa protiv LTP smanjuje se s izloženošću AGE-ima (184, 5 ± 9, 73% nasuprot 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, slike 4a i e), što sugerira da nedostatak RAGE poboljšava sinaptički prijenos. Budući da se RAGE izražava u neuronskim i neneuronskim stanicama u mozgu, slijedeće smo istražili doprinos RNA-a neurona na AGE-posredovanoj sinaptičkoj funkciji. Tretirali smo neurone od hipokampnih kriški od nRKO miševa (sa iscrpljenjem RAGE) kortiksa s AGEs i BSA najmanje 60 min, a zatim smo zabilježili LTP. Odjeljci oba nRKO ili non-Tg miševa pokazali su sličan LTP u prisutnosti BSA (240, 2 ± 9, 41% nasuprot 208, 8 ± 19, 50%, P > 0, 05, Slike 4b i e). Nasuprot tome, nRKO kriške značajno su suzbile pad LTP-a induciran AGE-om u usporedbi s ne-Tg kriške (191, 6 ± 15, 55% nasuprot 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, Slike 4b i e). Ovi rezultati pokazuju da uspješna blokada neuronskog RAGE štiti od sinaptičke funkcije oslabljene AGE-om.

Image

Učinak smanjenja RAGE na oštećenje LTP uzrokovano AGE-om. ( a - c ) LTP zabilježen je u kriške hipokampa iz miševa koji nisu Tg, RKO ( a ), nRKO ( b ) i DN-RAGE ( c ) nakon 1 sata perfuzije s BSA ili AGE (100 μg / ml). Samo brisanje RAGE nije promijenilo LTP u prisutnosti BSA. Suprotno tome, LTP je povećan u kriške od RKO, nRKO i DN-RAGE miševa u usporedbi s ne-Tg kriškama u prisustvu AGE. ( d ) Reprezentativni tragovi fEPSP-a u kriškama tretiranim nosačem ili 100 µg / ml BSA prije stimulacije θ-pucanja (crna linija) i nakon 1 h (siva linija). ( e ) Preostalo potenciranje s nagiba fEPSP-a koje se pojavilo tijekom posljednjih 5 minuta LTP snimaka. ( f ) Nije bilo značajnih razlika u BST-u među navedenim skupinama. N = 8–11 kriški od 3 do 5 miševa

Slika pune veličine

RAGE funkcionira kao receptor transdukcije signala za AGE i A β , aktivirajući više nizvodnih unutarćelijskih putova. 27, 28 Stoga smo procijenili učinak RAGE signalizacije u neuronima na AGE-induciranom LTP-om primjenom hipokampalnih kriški od DN-RAGE miševa koji izražavaju mutante RAGE-e-nedostatnih signala (koji su ciljani na neurone da odrede signalizaciju ovisnu o RAGE). Značajno je da su DN-RAGE kriške značajno otporne na AGE-posredovanu redukciju LTP-a u usporedbi s ne-Tg kriške (167, 0 ± 12, 66% nasuprot 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, Slike 4c i e). Na slici 4d prikazani su reprezentativni tragovi uzeti 1 min prije (crna linija) i 60 min nakon LTP indukcije (siva linija). Na BST nije utjecao RAGE knockout ili mutirani miševi (Slika 4f). Ovi rezultati pokazali su da signalizacija ovisna o RAGE u neuronima doprinosi sinaptičkoj neispravnosti uzrokovanoj AGE-om.

Aktivacija mitogen-aktivirane proteinske kinaze 38 (MAPK p38) uključena je u ANA-inducirani sinaptički deficit

Da bismo odredili koji molekularni igrači stoje pod utjecajem AGE-a na LTP hipokampala, procijenili smo ulogu p38 i c-Jun N-terminalnih kinaza (JNK) u križama hipokampala nakon izloženosti AGE-ima, jer se ove kinaze aktiviraju (povećana razina fosforilacije) u nekoliko patoloških uvjeti i sinaptička plastičnost; 36, 37 nadalje, p38 je ključni posrednik RGE-posredovane pretvorbe signala. 37 Koristeći antitijela na fosforilirane oblike p38 i JNK s ekstraktima hipokampa nakon izloženosti AGE-ima i visokofrekventnoj stimulaciji, procijenili smo aktiviranje ove dvije kinaze. Dodavanje AGE-ova na ne-Tg kriške hipokampale značajno je povećalo fosforilaciju p38 u usporedbi s dodatkom BSA, ali liječenje AGE-ima nije utjecalo na ukupne razine p38 (Slika 5a). Densitometrijska analiza kombiniranih imunoreaktivnih traka otkrila je značajan porast fosforilacije p38 za 1, 5-1, 7 puta, kada je normaliziran na ukupni p38, u odnosu na kontrole liječene BSA-om (Slika 5b). Liječenje AGE-ova nije utjecalo na fosforilaciju JNK (slika 5c).

Image

Učinak AGE-a na aktivaciju p38. Kriške mozga su bile perfuzirane s BSA ili AGE (100 μg / ml) 1 h, a zatim podvrgnute imunoblotingu za fosforilaciju i ukupni p38 ( a i b ) ili JNK ( c ). ( a ) Imunoblotiranje moždanih homogenata iz kriški tretiranih s AGE ili BSA radi fosforilacije i ukupnog p38. Tubulin je korišten kao kontrola opterećenja proteina neurona. ( b ) Denzitometrija kombiniranih imunoreaktivnih traka fosfo-p38 u odnosu na ukupni p38. ( c ) Denzitometrija imunoreaktivnih traka fosfo-JNK u odnosu na ukupni JNK u kriške tretirane s BSA ili AGE. Podaci su izraženi kao porast puta u odnosu na kontrolnu skupinu liječenu BSA. Donji panel prikazuje reprezentativne imunoblote za navedene proteine. N = 3–5 po skupini liječenja. ( d ) Učinak p38 inhibitora (SB203580) na AGE-induciranu p38 fosforilaciju. Densitometrija imunoreaktivnih traka fosfo-p38 u odnosu na ukupni p38 u kriške bez Tg-a prožetim AGEs sa ili bez SB203580. Reprezentativni imunobloti za navedeni protein prikazani su na donjoj ploči. ( e ) Učinci inhibitora p38 (SB203580) na uzrokovane AGE deficitom LTP-a u kriške hipokampa. Režnjevi su punjeni nosačem, AGE (100 μg / ml), SB203580 (1 μM) ili AGEs plus SB203580 1 sat prije LTP snimanja. n = 8–11 kriški po grupi tretmana. Gornja ploča prikazuje reprezentativne tragove fEPSP-a u kriške s naznačenim tretmanima prije θ-puhačke stimulacije (crna linija) i na kraju 1 h (siva linija). ( f ) Preostalo potenciranje s nagiba fEPSP-a koji se pojavili u posljednjih 5 minuta LTP snimanja

Slika pune veličine

Da bismo dodatno procijenili učinak p38 aktivacije na oštećenje LTP-a posredovanog AGE-om, perfuzirali smo hipokampne slajdove sa SB203580, specifičnim p38 inhibitorom, zajedno s AGE-ovima. Jasno, aplikacija SB203580 značajno je blokirala indukciju p38 fosforilacije u prisutnosti AGE-a u usporedbi s AGE tretmanom bez inhibitora p38 (SB203580) (slika 5d). Kao posljedica toga, LTP hipokampalne oslabljene AGE obnovljen je inhibicijom p38 s SB203580 perfuzijom (Slike 5e i f). Ovi rezultati sugeriraju da AGE-posredovana p38 aktivacija doprinosi sinaptičkim ozljedama.

RAGE nedostatak blokira AGE-induciranu p38 aktivaciju

Da bismo utvrdili je li RAGE ključni igrač u aktivaciji p38 posredovane AGE-om, procijenili smo učinak brisanja RAGE na p38 fosforilaciju induciranu AGE-ovima. Odjeljci RKO miševa pokazali su potpuno potisnutu aktivaciju p38, što pokazuje smanjena p38 fosforilacija u usporedbi s ne-Tg kriškama s AGEs (slike 6a i b). Nadalje, RAGE iscrpljivanje posebno usmjereno na kortikalne / hipokampalne neurone ili na neuronski ciljani izraz mutanta RDP-a s nedostatkom transdukcije ukinulo je fosforilaciju uzrokovanu AGE-om. Kvantificiranje svih imunoreaktivnih pojasa za fosfo-p38 normaliziranih na ukupni p38 potvrdio je značajno smanjenu imunoreaktivnu traku fosfo-p38 u kriške od RKO, nRKO i DN-RAGE u usporedbi s ne-Tg odrezima s AGE tretmanom (slike 6a i b). Ovi podaci pokazuju da nedostatak RAGE sprečava AGE-induciranu p38 aktivaciju. p38 aktiviranje transdukcije signala posljedica je interakcije AGEs-RAGE na neuronima, doprinoseći neuronskim i sinaptičkim poremećajima u okruženju obogaćenom AGE-om.

Image

Učinak nedostatka RAGE na AGE-induciranu p38 aktivaciju. Kriške hippokampa iz navedenih Tg miševa i ne-Tg miševa perfuzirane su AGEs 1 sat, a zatim podvrgnute imunoblotingu za fosfo- i total-p38. ( a ) Imunoblots za fosfo- i total-p38 s tubulinom koji se koristi kao kontrola punjenja proteina. ( b ) Denzitometrija imunoreaktivnih pojasa fosfo-p38 normalizirana ukupnim p38 korištenjem NIH Image J softvera. N = 3–5 miševa po grupi

Slika pune veličine

Učinak AGEs-RAGE interakcije na sinaptičku gustoću

Da bismo odredili opseg AGE-induciranog sinaptičkog oštećenja u AGE-uvrijeđenim neuronima, prvo smo analizirali učinak AGE-a na sinaptičku gustoću. Sinapse su identificirane kao sinaptofizin-pozitivni klasteri koji se vežu za dendrite označene s MAP2 markerom. Zapošljavanje presinaptičkog proteina, sinaptofizina, radi stvaranja klastera pozitivnih na sinaptofizin, je brzo i ovisi o sinaptičkoj aktivnosti. 38 Dva sata nakon liječenja AGEsom, gustoća sinaptofizina u neuronima hipokampusa nije promijenjena u usporedbi s kontrolnim stanicama liječenim BSA, dok su hipokampalni neuroni izloženi AGEs 48 sati pokazali da je klaster pozitivan na sinaptofizin smanjen za 50–60% (Slika 7a). Važno je da su neuroni s nedostatkom RAGE uglavnom smanjili sinaptičku gustoću uzrokovanu AGE-om (Slika 7b). Ovi podaci pokazuju da RAGE iscrpljivanje sprječava ANA-inducirani gubitak sinapse.

Image

Učinak nedostatka RAGE na sinaptički gubitak izazvan AGE-om. ( a ) Non-Tg neuroni su tretirani sa 100 µg / ml AGE-a ili BSA u trajanju od 2 do 48 h, a zatim podvrgnuti imunološkanju sa sinaptofizinom i MAP2. Kvantifikacija pozitivnih klastera sinaptofizina po mikronu dendrita značajno je smanjena u stanicama tretiranim AGE-om u usporedbi sa stanicama tretiranim BSA. ( b ) neuroni s nedostatkom RAGE u velikoj su mjeri zaštitili uzrokovane AGE gubitkom klastera pozitivnih na sinaptofizin u usporedbi s ne-Tg neuronima u prisutnosti AGE. Donja ploča prikazuje reprezentativne slike sinaptičkog bojenja. Sinapsi su vizualizirani bojom sinaptofizinom (zelena), a dendriti bojom MAP2 (crvena). Linija mjerila = 50 μ m

Slika pune veličine

Rasprava

Pored njegove sposobnosti da izravno mijenja strukturu i funkciju ciljanih proteina unutar stanica koje uzrokuju oštećenje stanica ili tkiva, novi dokazi su također pokazali da su AGE kao signalni ligand u interakciji s RAGE; AGE uzrokuju promjene transdukcije signala koje nepovoljno utječu na brojne periferne organe. 39, 40, 41 Iako se akumulacija AGE povećava u kortikalnim neuronima, hipokampalnim piramidalnim neuronima, astrocitima i ostalim glialnim stanicama u starenju i AD mozga, 4, 42, 43, izravan je učinak interakcije AGE-RAGE na rad mozga, posebno na promjene u sinaptičkoj strukturi i funkciji, uglavnom su nepoznate. Koristeći naš novi transgenični model miša s neuronskom ekspresijom RAGE signalizacije i nedostatkom neuronskog RAGE-a u prednjem mozgu za procjenu sinaptičke transmisije i plastičnosti (gotovo svaki mozak funkcionira na sinaptičkom prijenosu), pružamo uvjerljive dokaze koji podupiru ključnu ulogu neuronskih AGE-a - RAGE interakcija na aktivaciji MAPK P38, deficitu plastičnosti hipokampala i sinaptičkoj ozljedi.

Prvo smo pokazali štetan utjecaj AGE-a na sinaptičku strukturu i funkciju. Dodavanje AGE značajno je oslabilo sinaptičku plastičnost smanjenjem LTP i sinaptičke morfologije. LTP je važan za dugotrajnu sinaptičku plastičnost i izmijenjenu sinaptičku morfologiju (sinaptički gubitak), što vjerojatno doprinosi nedostatku učenja i pamćenja koji se javlja u padu kognitivnog sustava vezanom za dob. Starenje karakterizira anatomski i funkcionalni pad u sustavima više organa. AGE se nalaze u serumu i nakupljaju se u tkivu tijekom starenja; 5, 44, 45 ovo nakupljanje se ubrzava u patološkim stanjima kao što su dijabetes i neurodegenerativne bolesti, uključujući AD. Zabilježene su povećane razine AGE-a u kortikalnim neuronima starijih odraslih osoba i pozitivno su povezane s težinom oštećenja kognitivnih funkcija. 46 Razina AGE u serumu značajno je porasla u bolesnika s dijabetesom (ekvivalentno 30–88 µg / ml AGE-BSA u odnosu na 12 µg / ml AGE-BSA u bolesnika koji nisu dijabetični). 6, 7, 8 Naše prethodne studije pokazale su da je AGE albumin (1 μM , što odgovara 66, 5 µg / ml) rezultiralo oksidacijskim stresom i aktiviranjem transkripcijskog faktora NF-kB in vitro i in vivo , proces koji uključuje AGE-vezivanje protein RAGE. Značajno, stanična perturbacija i oksidacijski stres uzrokovani AGE-om blokirali su antitijela na RAGE. 47 Dakle, povećana razina AGE-a i njihovog receptora, RAGE, igraju važnu ulogu u staničnoj perturbaciji koja posreduje AGE tijekom patogeneze procesa povezanih s dobi i dijabetesa. Koncentracija AGE-ova korištena u ovom istraživanju korelira s koncentracijom patološkog stanja utvrđenog u bolesti čovjeka.

U našoj studiji, perfuzija s AGE-ima na križcima hipokamera oslabila je LTP na način ovisan o koncentraciji, što je u skladu s nalazima opaženim u modelu štakora da je egzogeni tretman AGE-a stereotaksičnom injekcijom u mozak doveo do sinapsi i oštećenja pamćenja. 48 Međutim, utjecaj neuronske RAGE na sinaptičko oštećenje uzrokovano AGE-om nije jasan. S obzirom da se ubrzava stvaranje i akumulacija AGE-a u mozgu dijabetičara i osoba s AD-om, interakcija AGE-RAGE može biti važan cilj u potrazi za agensima koji zaustavljaju ubrzanje ili pogoršanje bolesti relevantne za pad kognitivne bolesti i demenciju u vezi s dijabetesom i AD.

Zatim smo pomoću našeg mišjeg modela za iscrpljivanje RAGE istraživali učinak signalizacije ovisne o RAGE na sinaptičku ozljedu uvrijeđenu od AGE-a. AGE perfuzijom uzrokovano smanjenje LTP može biti uzrokovano različitim čimbenicima; na primjer, jedan uzrok uključuje vezanje na AGE na RAGE receptore, a drugi je putem stanične oštećenja uzrokovane umrežavanjem proteina. Genetsko brisanje RAGE pruža nam mogućnost prepoznavanja interakcije AGEs-RAGE u sinaptičkim poremećajima uzrokovanim AGE-om. Zabilježili smo normalna očitavanja LTP-a na dijelovima mozga naših globalnih RAGE nultih miševa liječenih nosačem u usporedbi s ne-transgenim legloma, što ukazuje da genetska RAGE delecija ne mijenja značajno sinaptičke strukture važne za indukciju i ekspresiju LTP-a u normalnim fiziološkim uvjetima. Značajno je da nedostatak RAGE štiti od AGE uzrokovanog LTP deficitom. Slično tome, naši podaci pokazuju zaštitni učinak smanjenja RAGE na sinaptički gubitak izazvan AGE-om. Iako naši rezultati ne isključuju druge učinke AGE-a, poput umrežavanja proteina, jasno smo pokazali da je AGEs-RAGE interakcija uključena u AGE-inducirane sinaptičke ozljede.

Kako se RAGE izražava u neuronima i ne-neuronskim stanicama (tj. Glijalnim, endotelnim ćelijama i periciktima krvno-moždane barijere), 49, 50, rezultati dobiveni od globalnih RAGE miševa sa nokautom ne označavaju koja ćelija (tipove) je (važni su) kod oštećenja sinaptičke plastičnosti uzrokovane AGE-om. Stoga smo stvorili transgene miševe s nRKO i mutantom RAGE (DN-RAGE) s nedostatkom transdukcije, posebno u prednjem mozgu, uključujući hipokampus, da bismo odgovorili na pitanje je li aktivnost neuronskog RAGE odgovorna za hipokampalni LTP inducirani hipokampama. smanjenje. Zaista, naša otkrića jasno su pokazala da su nRKO i DN-RAGE moždani odsjeci uglavnom otporni na poremećaj LTP putem izloženosti AGE, implicirajući uključivanje neuronskog RAGE u mehanizme koji stoje na osnovi AGE-inducirane sinaptičke disfunkcije. Nadalje, uvođenje neuronskog DN-RAGE ili RAGE nedostatka u kortikalnim neuronima (nRKO) nije uspjelo u potpunosti spriječiti LTP s oštećenjem AGE-a u usporedbi s perfuzijom s BSA. Ovi rezultati sugeriraju da ne-neuronska RAGE (tj. RAGE ekspresija u mikroglijama, astrocitima ili endotelnim stanicama) može biti uključena u AGE-induciranu sinaptičku disfunkciju. Buduće studije će biti potrebne da se istraži uloga ne-neuronskog RAGE u sinaptičkom zatajenju izazvanom AGE-ima. Bez obzira na to, naše studije opisuju mehanizme koji uključuju neuronsku RAGE posredovanu signalnu transdukciju u AGE-induciranoj sinaptičkoj disfunkciji i degeneraciji. Neuroni su osjetljivi na AGE uvrede izravnim interakcijama AGEs-RAGE što pridonosi sinaptičkoj disfunkciji i degeneraciji.

Konačno, naši rezultati sugeriraju da je signalni put MAPK P38 kritičan za sinagetičko oštećenje uzrokovano AGEs-RAGE-om. AGE-inducirani pad LTP-a prigušen je u DN-RAGE odsječenima s mutantom RAGE-a s nedostatkom transdukcije, što ukazuje na doprinos signala ovisnog o RAGE-u sinaptičkom oštećenju uzrokovanom AGE-om. Kaskade signala aktivirane nakon interakcije ligand-RAGE uključuju putove p21ras, izvanćelijsku signalno reguliranu kinazu 1/2 (ERK1 / 2), p38, i JNK, Rho GTPaze, fosfoinozitol-3 kinazu, GSK-3 β i JAK / STAT (pretvornik signala i aktivator transkripcije). 51, 52 Aktivacija različitih kaskada proteina kinaza može predstavljati glavni cilj RAGE aktivacije za kontrolu sinaptičke plastičnosti. 37, 53

Konkretno, razmotrili smo potencijalnu uključenost dvije različite kinaze, JNK i p38 u inhibiciju LTP-a na temelju naše prethodne studije koja pokazuje da su p38 i JNK aktiviranje potrebne za LTP inhibiciju izazvanu interakcijom P- RAGE. 37, 54 kriške hippocampala perfuzirane s AGE pokazale su povećanu aktivnost p38, ali nije bilo promjene u JNK, što sugerira uključenost p38 aktivacije u p38 signalizaciju i ANA-inducirani deficit sinaptičke plastičnosti. Doista, dodavanje p38 inhibitora sprječavalo je AGE-inducirano aktiviranje p38 i oštećenje LTP-a. Napomena, RAGE osiromašenje blokira indukciju fosforilacije p38 i obnavlja nedostatke sinaptičke plastičnosti i gustoće pri izloženosti AGE-u. Naši rezultati pokazuju da interakcija neurona AGE-RAGE aktivira p38 MAK kinazu, što zauzvrat dovodi do sinaptičke disfunkcije.

We further observed that if AGEs level remained chronically high, synapses become structurally damaged. Using hippocampal neuronal cultures, we showed that short-term AGEs exposure (for 2 h treatment) barely affected synaptic structure, whereas long-term treatment of AGEs (for 48 h) caused significant changes in synaptic density. Importantly, RAGE deletion rescues AGE-induced synapse loss. These data indicate that neuronal AGEs–RAGE interaction has functional (long-term plasticity) as well as structural effects on synapses, which may be important in the learning and memory deficit present in age-related dementia and age-associated neurodegenerative disease.

In summary, we provide substantial evidence of the protective effect of RAGE depletion on AGE-induced alterations in synaptic plasticity and density. Genetic depletion of RAGE and RAGE signaling in cortical neurons blocks AGE-mediated activation of p38 MAP kinase signal transduction with LTP deficits. We propose that AGEs-RAGE-dependent activation of p38 MAP kinase is responsible for AGE-induced synaptic damage. Blockade of AGEs-RAGE axis may protect against the impaired cognitive function in aged subjects with and without neurodegenerative diseases, including those with diabetes and AD.

Glosar

aCSF

artificial cerebrospinal fluid

OGLAS

Alzheimerova bolest

AGEs

advanced glycation endproducts

CK2

calcium-calmodulin-dependent kinase II

CML

Nɛ-carboxymethyl-lysine

DN-RAGE

dominant-negative RAGE

fEPSP

field-excitatory post-synaptic potential

JNK

c-jun N-terminalna kinaza

LTP

long-term potentiation

nRKO

neuronal RAGE selective knockout

p38 MAPK

p38 mitogen-activated protein kinase

RAGE

receptor for advanced glycation endproduct

RKO

global RAGE knockout