Metabolizam glukoze i heksozaminski put reguliraju sekoncentraciju onkogena | stanična smrt i bolest

Metabolizam glukoze i heksozaminski put reguliraju sekoncentraciju onkogena | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Rak
  • Metabolizam
  • starenje
  • Ispravljanje ovog članka objavljeno je 14. kolovoza 2014. godine

Ovaj je članak ažuriran

Sažetak

Onkogena senensija izazvana stresom (OIS) sprječava sposobnost onkogenih signala da induciraju tumorigenezu. Sada se u velikoj mjeri priznaje da mitogeni učinak onkogena zahtijeva metaboličke prilagodbe da bi se odgovorilo na nove potrebe za energetskim i biološkim sastojcima. Ipak, utječe li metabolizam glukoze na OIS odgovor uglavnom nije poznato. To je uglavnom zbog činjenice da se većina staničnih modela OIS uzgaja u višku glukoze. U ovom istraživanju koristili smo ljudske stanice epitela, uzgajane bez viška glukoze, kako bismo proučavali promjene i funkcionalnu ulogu metabolizma glukoze tijekom OIS-a. Izvještavamo o usporavanju unosa i metabolizma glukoze tijekom OIS-a. Povećavanje metabolizma glukoze ekspresijom heksokinaze2 (HK2), koja pretvara glukozu u glukoza-6-fosfat (G6P), pogoduje bijegu iz OIS-a. Suprotno tome, ekspresija glukoze-6-fosfataze, farmakološka inhibicija HK2 ili dodavanje glukoze koja se ne može metabolizirati izazvala je prerano starenje. Manipulacije različitih metabolita koji prekrivaju G6P nizvodne puteve (heksosamin, glikoliza i pentoz fosfatni putevi) sugeriraju neočekivanu ulogu heksozaminskog puta u kontroli OIS-a. Sve u svemu, naši rezultati pokazuju da se smanjeni metabolizam glukoze događa tijekom i sudjeluje u OIS-u.

Glavni

Otto Warburg bio je prvi koji je opisao metabolički prekidač koji se događa u tkivima raka. U prisutnosti kisika, umjesto da proizvode adenozin trifosfat (ATP) oksidativnom fosforilacijom, stanice raka pokazuju visoku stopu glikolize. Stanice raka brzo se dijele i trebaju povoljne stope proizvodnje energije. U tim ćelijama glukoza postaje veća bioraspoloživa i metabolizabilna uregulacijom transportera glukoze i metaboličkih enzima. Tumorsko snimanje iskorištava tu činjenicu kako bi otkrilo prisutnost tumora u tijelu: stanice raka označene su s analogom glukoze 18 fluora-fluorodeoksiglukoze. Mehanički, onkogeni kao što su MYC, NF- κB , AKT, HIF i E2F, i proizvodi za supresor tumora kao što su p53 i PTEN, koji se aktiviraju ili inhibiraju u karcinomu, mogu djelovati ili na transportere glukoze, glikolitički enzima, ili oba, a to sugerira da je u stanicama raka regulacija rasta povezana s metabolizmom. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

Čvrsti dokazi koji sugeriraju da povećana glikoliza igra ulogu u održavanju zloćudnog ponašanja tumorskih stanica potaknula je interes za ciljanje metabolizma stanica raka u terapiji raka, 9, 10, 11, ali važnost promjena metabolizma glukoze u ranoj fazi tumorigeneze je slabo poznata. Programi neuspjeha mogu zaštititi stanice od transformacije, a bježanje iz njih potrebno je kako bi se omogućila rana tumorigeneza. Takav program čini starenje, jer uključuje stabilno zaustavljanje staničnog ciklusa i aktivira imunološki nadzor12. Razne studije su pokazale da aktiviranje onkogena poput RAS, RAF, MEK i drugih izaziva starenje in vitro . U novije vrijeme, rad na in vivo modelima pokazao je da premaligne lezije pokazuju visoku razinu senescencije, dok starenje nije prisutno od malignih tumora, čime je potvrđena uloga supresije tumora za senescenciju uzrokovanu onkogenom (OIS). 13

Malo se zna o značajkama metabolizma glukoze u stanicama koje prolaze OIS. Također nije poznato da li se karakteristike opisane u zloćudnim tumorima stječu rano ili kasno u tumorigenezi. Koliko znamo, većina radova proučava starosnu reakciju u kontekstu viška glukoze (25 mM). Ipak, teško je dobiti preciznu predodžbu o koncentraciji glukoze koja se koristi, jer se u većini radova ne spominju, iako utječu na rast i starenje stanica. 14, 15

Izmjene u aktivnostima enzima, posebno u glikolitičkim i u stazama trikarboksilne kiseline, prijavljeno je da moduliraju odgovor starenja. Doista, povećane aktivnosti glikolitičkih enzima pogoduju bijegu od starenja u mišjim embrionalnim fiblroblastima. 5 Čini se da smanjeni štetni enzimi trikarboksilne kiseline sudjeluju u starenju izazvanom p53, 16 dok upotreba piruvat dehidrogenaze za poticanje ciklusa trikarboksilne kiseline potiče starenje, 17 izazivajući raspravu o ulozi ciklusa trikarboksilne kiseline u starenju. Ovdje smo koristili ljudske stanice epitela kultivirane na 8 mM glukoze, prilično blizu njezinoj fiziološkoj razini da bismo ispitali ulogu (ako postoji) metabolizma glukoze tijekom OIS-a. Iznenađujuće, otkrili smo da su unos i metabolizacija glukoze promijenjeni nakon onkogenog stresa i ta promjena sudjeluje u starenju.

Rezultati

OIS narušava metabolizam glukoze

Da bismo proučili metabolizam glukoze tijekom OIS-a, fokusirali smo se na epitelne stanice čovjeka uzgajane bez viška glukoze. Prvo smo ovekovečili ljudske stanice epitela ekspresijom hTert-a da bismo prevladali replikativnu starenje. 18 Zatim su stanice inficirane retrovirusnim vektorom koji kodira fuzijski protein (MEK / ER ili RAF / ER) između konstitutivno aktiviranog oblika MEK1 ili delta-BRAF i domene ljudskog estrogenskog receptora (hbER) koji veže hormone. 19, 20 Kao odgovor na 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) i, kao što se očekivalo, ćelije koje eksprimiraju MEK / ER pokazale su fosforilaciju MEK supstrata ERK. MEK indukcija rezultirala je snažnim padom mitotičkog markera Phospho-S10-Histone3 (Slika 1a). Prema tome, aktiviranje MEK-a blokiralo je rast stanica (slika 1b), induciralo pojavu aktivnosti vezane za starenje koja ima β- galaktozidazu (SA- β -Gal) (slika 1c), te pojačano izražavanje skupa markera starenja: Sprouty homolog 2 (SPRY2 ), 21 interleukin-8 (IL-8), 22 i izbrisan u karcinomu jednjaka 1 (DEC1) 23 (slika 1d). Slični rezultati dobiveni su korištenjem stanica koje eksprimiraju RAF / ER, pri čemu je RAF uzvodna kinaza MEK (dopunska slika 1), pokazujući da su RAF ili MEK ekvivalentni sustavi za indukciju OIS.

Image

Metabolizam glukoze smanjuje se tijekom onkogenog starenja izazvanog stresom. Besmrtne ljudske epitelne stanice koje eksprimiraju inducibilni MEK / ER onkogen su tretirane ili nisu sa 4-OHT. ( a ) Stanični ekstrakti su pripremljeni nakon 0, 3 ili 4 dana 4-OHT tretmana i analizirani imunoblotiranjem s naznačenim antitijelima. ( b ) Stanice su sjemenke iste gustine i tretirane ili ne tijekom 3 dana sa 4-OHT. Nakon 5 dana, učvršćene su PFA i obojene kristalno ljubičasto. ( c ) Nakon 3 dana sa ili bez 4-OHT tretmana, stanice su fiksirane i obojene za otkrivanje SA- β -Gal aktivnosti. Izračunati su postoci obojenih ćelija i prikazane su reprezentativne slike. ( d ) Nakon 3 dana sa ili bez 4-OHT tretmana, pripravi se RNA i ekspresija naznačenih markera senescencije analizira se RT-qPCR i normalizira s obzirom na ekspresiju aktina. ( e i f ) Stanice su tretirane ili ne 2 dana sa 4-OHT, prebrojane, sjemenske leđe i podvrgnute ili ne-4-OHT tretmanu. Nakon 24 sata utvrđeni su unos glukoze ( e ) i proizvodnja laktata ( f ). ( g ) Stanice su tretirane sa ili bez 4-OHT 3 dana. Koncentracija ATP-a određena je i normalizirana s obzirom na sadržaj proteina

Slika pune veličine

Da bismo vidjeli je li metabolizam glukoze promijenjen tijekom OIS-a, prvo smo uspoređivali potrošnju glukoze pomoću epitelijskih stanica aktiviranih MEK / ER-a i aktiviranim ljudskim stanicama. Postupkom mjerenja izvanstanične glukoze vidljivo je smanjena potrošnja glukoze u starosnim stanicama (Slika 1e). U skladu s smanjenom potrošnjom glukoze, senescentne stanice pokazuju smanjenu proizvodnju laktata (slika 1f) kao i niže razine ATP-a (slika 1 g). Dodavanje 4-OHT na immortaliziranim stanicama (bez MEK / ER) nije izazvalo starenje i promjene metabolizma glukoze isključujući MEK-neovisan učinak 4-OHT (dopunska slika 2). Ukupno, ovi rezultati pokazuju pad metabolizma glukoze tijekom OIS-a u stanicama humanih epitela.

Inhibicija prvog koraka metabolizma glukoze ima za posljedicu prerano starenje

Metabolizam glukoze je time reguliran tijekom OIS-a. Sljedeći smo željeli ispitati je li nedostatak stanične glukoze u metabolizaciji uključen u onkogeno starenje uzrokovano stresom. Tada smo blokirali nakupljanje glukoza-6-fosfata (G6P) kako bismo vidjeli može li to utjecati na starenje čovječanskih epitelnih stanica. To je učinjeno konstitutivnom ekspresijom glukoze-6-fosfataze (G6PC3) koja katalizira pretvorbu G6P u glukozu (slike 2a i b). Kao što se očekivalo, konstitutivni izraz G6PC3 povezan je sa smanjenjem potrošnje glukoze (slika 2c), proizvodnjom laktata (slika 2d) i nivoom ATP (slika 2e). Zanimljivo je da je ovaj pad metabolizma glukoze izazvan konstitutivnom ekspresijom G6PC3 blokirao rast stanica (slika 2f), smanjio nivo markera proliferacije (slika 2g) i inducirao i SA- β -Gal aktivnost (Slika 2h) i ekspresiju različitih markera starenja ( Slika 2i). Farmakološka inhibicija hekokinaza s lonidaminom 24, 25 (dopunska slika 3) ili upotreba 2-deoksi-D-glukoze (2DG), ne-metabolizirajućeg oblika glukoze (također dodatna slika 4), također je blokirala metabolizam glukoze i izazvala preranu starenje. Blokiranje metabolizma glukoze u stanicama ljudskog epitela rezultira u preranom starenju što podupire njegovu funkcionalnu ulogu u OIS-u.

Image

Glukoza-6-fosfataza blokira metabolizam glukoze i uzrokuje prerano starenje. ( a ) Shematski prikaz aktera uključenih u prvi korak metabolizma glukoze ( b - i ) Besmrtne stanice epitela čovjeka inficirane su kontrolnim ili odabranim vektorom koji kodira G6PC3 i puromicinom. ( b ) RNK su ekstrahirane i analizirane RT-qPCR kako bi se provjerilo konstitutivne G6PC3 ekspresije. ( c - e ) Jednaki broj stanica je posijan i nakon 24 sata analiziran je unos glukoze ( c ) ili proizvodnja laktata ( d ). ( e ) Koncentracije ATP-a određene su i normalizirane s obzirom na udio proteina. ( f ) Stanice su sijane u istoj gustoći. 6 dana nakon sadnje, popravljeni su s PFA i obojeni kristalno ljubičastom bojom. ( g ) Pripremljeni su stanični lizati i ekspresija proteina analizirana imunoblotiranjem naznačenim antitijelima. ( h ) Stanice su fiksirane PFA i testirane na aktivnost SA- p- Gal. ( i ) RNK su ekstrahirane i analizirane RT-qPCR za ekspresiju naznačenih markera starenja

Slika pune veličine

Ekspresija hekokinaze održava metabolizam glukoze i pogoduje bijegu OIS-a

Sljedeće smo željeli ispitati može li povećati metabolizam glukoze poticati bijeg stanica epitela iz OIS-a održavanjem metabolizma glukoze. Hekokinaze igraju glavnu ulogu u ovom metabolizmu, katalizirajući svoj prvi korak (pretvorba glukoze u G6P; slika 2a) i tako određuje i sadržaj glukoze u stanici i razinu metabolizacije glukoze. 11, 26 Stoga smo istražili OIS bijega i metabolizma glukoze u stanicama humanih epitela koji konstitutivno eksprimiraju heksokinazu 2 (HK2), glavnu hekokinazu koja je uključena u povećanje glikolize u stanicama raka. 6, 11 Nakon retrovirusne transdukcije HK2, provjerili smo njegovu konstitutivnu ekspresiju imunofluorescencijom (slika 3a). Kao što se očekivalo, konstitutivnom ekspresijom HK2 održana je potrošnja glukoze (slika 3b), proizvodnja laktata (slika 3c) i proizvodnja ATP (slika 3d) tijekom onkogenog stresa. Održavani metabolizam glukoze izazvan ekspresijom HK2 pogoduje bijegu iz OIS-a, mjereno sposobnošću rasta (slika 3e), održavanjem ekspresije markera proliferacije (slika 3f) i odsutnošću SA- β -Gal aktivnosti (slika 3 g) i razne markere starenja (kao što je određeno RT-qPCR, slika 3h). Svi ovi rezultati podržavaju mišljenje da održavanje metabolizma glukoze ekspresijom HK2 omogućava bijeg iz OIS-a.

Image

Izraz HK2 obnavlja metabolizam glukoze i omogućava bijeg iz OIS-a. ( a - h ) Besmrtne stanice epitela čovjeka koje eksprimiraju inducibilni RAF / ER onkogen zaražene su kontrolnim ili HK2-kodirajućim retrovirusnim vektorom i odabranim neomicinom. ( a ) Izvršena je imunofluorescencija protiv oznake Flag. Nuklei su bili suprotstavljeni Hoechstu. ( b - d ) Stanice su tretirane ili ne tijekom 2 dana sa 4-OHT, broje se i sjeme natrag sa ili bez 4-OHT. Nakon 24 sata utvrđeni su unos glukoze ( b ) i proizvodnja laktata ( c ). ( d ) Stanice su tretirane sa ili bez 4-OHT tijekom 3 dana kako je naznačeno. Koncentracije ATP-a određene su i normalizirane s obzirom na sadržaj proteina. ( e ) Stanice su zasijane i tretirane ili ne tijekom 3 dana sa 4-OHT. Nakon 5 dana, učvršćene su PFA i obojene kristalno ljubičasto. ( f ) Stanice su zasijane i tretirane ili ne tijekom 3 dana sa 4-OHT. Nakon 2 dana, stanični ekstrakti su pripremljeni i analizirani imunoblotingom naznačenim antitijelima. ( g ) Stanice su fiksirane PFA i obojene za detekciju SA- p- Gal. Procenti obojenih stanica izračunati su i prikazati reprezentativne fotografije. ( h ) RNA koje odgovaraju navedenim genima pripremljene su i analizirane pomoću RT-qPCR. Razine ekspresije su normalizirane s obzirom na ekspresiju aktina

Slika pune veličine

Put heksozamina je glavni put koji kontrolira OIS

Kako bismo potvrdili gore opisane rezultate, slijedili smo ispitivanje sposobnosti metabolita glukoze da omoguće OIS zaobilazenje. Prvo smo započeli s liječenjem stanica s G6P, uzlaznim metabolatom glukoze (Slika 4a). Zanimljivo je da svakodnevno liječenje G6P omogućuje stanicama da izbjegnu onkogeni prekid rasta uzrokovan stresom (slika 4b), kao i pojavu SA- β -Gal markera (slika 4d). Dakle, genetska (ektopična ekspresija HK2 i G6PC), farmakološka (HK inhibicija ili 2DG), kao i manipulacija metabolitom kroz G6P, podržavaju mišljenje da održiva metabolizacija glukoze pogoduje bijegu OIS-a.

Image

Put heksozamina pogoduje bijegu od OIS-a. ( a ) Shematski prikaz ključnih putova i metabolita koji su uključeni u metabolizam glukoze. ( b ) Čovječne epitelijske stanice koje eksprimiraju MEK / ER sadne su u istoj gustoći i tretirane ili ne tijekom 3 dana sa 4-OHT, a svaka 2 dana s G6P, na 5 mM. Nakon 5 dana, učvršćene su PFA i obojene kristalno ljubičasto. ( c ) Čovječne epitelijske stanice koje eksprimiraju MEK / ER sadile su se u istoj gustoći i tretirale se svaki dan kao što je naznačeno sa ili bez NAcGluc na 40 mM, piruvat na 5 mM, i NADPH na 100 µM , i s 4-OHT za prvu 3 dana. ( d ) Nakon tretiranja kako je naznačeno u ( b ) i ( c ), stanice su fiksirane PFA i obojene za otkrivanje SA- p- Gal. Procenti obojenih stanica izračunati su i prikazati reprezentativne fotografije

Slika pune veličine

Uzlazni metabolizam glukoze, G6P, potiče tri glavna puta: glikolitički put, heksosaminski put i put pentoznog fosfata (PPP) (slika 4a). Ovi putevi sudjeluju u proizvodnji osnovnih staničnih komponenti, energije i u kontroli redox stanja stanice. Tada smo odlučili istražiti ta tri puta. Već je predloženo da smanjeni glikolitički put sudjeluje u starosnoj dobi 5 i tako je očigledan put kandidata. Kao što se očekivalo, blokiranje glikolize bromopiruvatom, GAPDH inhibitorom, izazvalo je prerano starenje i rezultiralo snažnom aktivacijom energetskog senzora AMPK (dopunska slika 5). Unatoč tome, metabolit glikolize piruvata nije bio u stanju izazvati bijeg iz OIS-a (slike 4c i d), a AMPK je nađen samo neznatno aktiviran tijekom OIS-a (dopunska slika 5), ​​što sugerira da glikoliza, čak i ako je direktno inhibirana, može izazvati prerano starenje izravno uključeni u OIS koji smo promatrali.

Zatim smo istražili pretpostavljenu ulogu JPP-a u OIS-u. Srušavanje G6P dehidrogenaze (G6PDH), enzima koji ograničava brzinu PPP, nije modificiralo rast stanica (dopunska slika 5), ​​a NADPH PPP metabolit nije mogao izazvati bijeg iz OIS-a (slike 4c i d), sugerirajući da JPP nije sudjelovalo u OIS-u u našem modelu.

Zaključno, istražili smo potencijalnu ulogu puta heksozamina u OIS-u. Inhibicija glutamin fruktoza-6-fosfat amidotransferaze (GFAT), azaserinom, prvim enzimom heksozaminskog puta, izazvala je prerano starenje (Dodatna slika 5). Važno je da je pronađeno da N-acetilGlukozamin (NAcGluc) omogućuje stanicama da zaobiđu zaustavljanje rasta i izgled markera starenja SA- β- Gal (Slike 4c i d) bez promjene potrošnje glukoze ili proizvodnje laktata (dopunska slika 6). Pored toga, kao i tijekom OIS-a, i za razliku od učinka inhibicije puta glikolize, inhibicija heksozaminskog puta samo je blago aktivirana AMPK (dopunska slika 5). Zajedno ovi rezultati ukazuju na važnost puta heksozamina u odgovoru na OIS.

Rasprava

Nedavno je porastao interes za metabolizam glukoze u istraživačkom području raka, pa je već uveliko poznato da su metaboličke promjene dio onkogenog programa. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17 Onkogeni signal, u normalnim stanicama, izaziva starenje, kako bi se izbjegla tumorigeneza; 13 uloga metabolizma glukoze u ovom procesu je prilično nepoznata. Iako je objavljeno da razina glukoze utječe na starenje, većina eksperimenata provedenih za dešifriranje događaja uključenih u OIS provodi se s viškom glukoze (obično 25 mM). Glavni problem je što je većina korištenog staničnog modela (IMR-90, WI38, MEF stanice i tako dalje) prilagođeni da rastu s ovom visokom razinom glukoze, a smanjenje te razine može utjecati na rast stanica. 14 Ovdje koristimo primarne stanice epitela čovjeka koje rastu na 8 mM glukoze, gotovo normalnu razinu glukoze, kako bismo istražili funkciju metabolizma glukoze tijekom OIS-a. Naši rezultati pokazuju da je metabolizam glukoze poremećen tijekom OIS-a, dijelom i zbog smanjenog unosa glukoze. Čini se da ovo smanjenje unosa glukoze nije posljedica smanjenja Glut1 ili Glut3 ekspresije, izraženog Glut-a u našim stanicama (Dopunska slika 7). Daljnji rad na pregledu aktivnosti transportera glukoze i aktivnosti enzima u metabolizmu glukoze bit će potreban za razumijevanje molekularnih mehanizama koji potiču promjene metabolizma glukoze tijekom OIS-a. Obnavljanje metabolizma glukoze konstitutivnom ekspresijom HK2 i tretiranjem stanica s G6P omogućava zaobići OIS, a inhibiranje metabolizacije glukoze blokiranjem HK aktivnosti, konstitutivnim izražavanjem glukoze-6-fsfataze ili tretiranjem stanica s 2DG izaziva prerano starenje, Na prvi pogled nedavno objavljeni rad Dorr i sur. , 27 pokazuju da se humani i mišji fibroblasti nakon RAS-a izazvanog starenja pokazuju povećanu potrošnju glukoze i proizvodnju laktata, mogu pojaviti suprotno našim rezultatima. Ipak, stvarno smo primijetili da MEF stanice (u klasičnom stanju kulture, a samim tim i u 25 mM glukoze) nakon konstitutivnog RAS ekspresije ulaze u starenje s povećanom potrošnjom glukoze i proizvodnjom laktata (dopunska slika 8). Ovi očigledno suprotni rezultati mogu biti zbog visoke koncentracije glukoze koja se koristi u MEF i / ili unutarnjih razlika između fibroblasta i epitelnih stanica i / ili intrinzičnih razlika između RAS i RAF / MEK. Uistinu, RAS aktivira put RAF / MEK i također aktivira put PI3K koji može aktivirati transport glukoze i metabolizam, 28 na kraju objašnjavajući razlike između metabolizma glukoze primijećene u ovim različitim modelima OIS-a. Zanimljivo je da je u nekim modelima zapisano da je put PI3K inhibirao starenje izazvano putem RAS / RAF / MEK, 29, 30, sugerirajući, s našim rezultatima, da bi anti-OIS efekt PI3K staze dijelom mogao posredovati njegova sposobnost da poveća unos i metabolizam glukoze.

Ispitivanje puteva nizvodno od G6P uključenih u OIS iznenađujuće sugerira da je put heksozamina ključni put u odgovoru na onkogeni stres. Taj put kontrolira N - i O- glikozilaciju proteina i uključen je u brojne biološke procese kao što su ER stres, ekspresija gena, signalizacija i trgovina, a time i poremećaji na tom putu mogu imati patofiziološke posljedice. 31, 32, 33, 34 To ne isključuje da bi za druge induktore starenja mogli biti uključeni i drugi putovi. Na primjer, pokazalo se da je ektopična ekspresija nekih glikoliznih enzima koja omogućuju MEF-ovima da zaobiđu starenje povećavajući glikolitički tok, dok inhibicija ovih enzima dovodi do indukcije starenja. 5

Pokazano je da poboljšanje metabolizma glukoze, detaljno proučeno u malignim stanicama, sudjeluje u zloćudnom ponašanju. Čini se da 2 HK2, najviše kinoza koja metabolizira glukozu u tijeku, igra važnu ulogu u rastu zloćudnih stanica, jer onkogeni transkripcijski faktori Myc i HIF mogu povećati transkripciju HK2, a kako se čini da je HK2 ekspresija potrebna za stvaranje zloćudnog fenotipa stanica. 6, 11, 35, 36 Povećani unos glukoze i metabolizam koji se opažaju u malignim stanicama mogu se, barem dijelom, steći tijekom evazije u sekoncentraciju onkogenog stresa. Možda ne čudi uzimajući u obzir činjenicu da se bijeg od OIS-a često smatra korakom koji sudjeluje u zloćudnoj pretvorbi benignog tumora. 13, 37 Podržavajući ovu pretpostavku, ekspresija HK2 značajno je povećana u 32% (15, 9 puta, P = 0, 00018) testiranih zloćudnih melanoma u usporedbi s melanocitnim nevijima, njihovim benignim, starosnim kolegama (dopunska slika 9). 38 Uz to i u skladu s našim rezultatima, nedavni rad pokazao je da je potreban HK2 za inicijaciju tumora izazvane KRas ili ErbB2. 39

Sve u svemu, naši rezultati podržavaju gledište da su razina metabolizacije glukoze i put heksozamina ključna odrednica OIS odgovora u ljudskim stanicama. Ova studija prirodno otvara nove načine istraživanja povezanosti OIS i metabolizma glukoze.

Materijali i metode

Stanična kultura

Čovječne epitelne stanice mlijeka (Lonza, Barcelona, ​​Španjolska) uzgajane su u mediju za rast epitela mliječnih stanica koje sadrže 8 mM glukoze (Promocell, Heidelberg, Njemačka) i 100 U / ml penicilina / streptomicina (Life Technologies, Saint Aubin, Francuska). GP293 ćelije za pakiranje virusa (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Francuska) uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (DMEM, Life Technologies) sa 10% FBS (Life Technologies) i penicilinom / streptomicinom. Stanice su održavane na 37 ° C u atmosferi 5% C02.

Retrovirusna infekcija

Stanice GP293 transficirane su PEI reagensom (Euromedex, Souffelweyersheim, Francuska) prema preporukama proizvođača. 2 dana nakon transfekcije, virusni supernatant pomiješan je sa svježim medijem (1/2) i polibrenom u 8 µg / ml (Sigma, Lyon, Francuska) da se inficiraju ciljne stanice. Humane epitelne stanice odabrane su s G418 (Life Technologies) sa 100 µg / ml ili / i puromicinom (InvivoGen, Toulouse, Francuska) pri 500 ng / ml.

Plazmidi i reagensi

Plazmidi su bili pNLCΔMEK1 (ΔN3, S218E, S222D) / ER (Neo R) i pBabe-puro-BRAF / ER. 20 pWZL Neo Myr Flag HK2 dobiveno je od Addgenea (Cambridge, MA, SAD) (Plasmid 20501). 40 humane G6PC3 cDNA (humana MGC verificirana FL cDNA, klon ID 3050476; Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD) izrezana je s Eco RI- Xho I i ubačena u pLPC-puro vektor.

4-OHT (H7904, Sigma) koristio se svakodnevno tijekom 3 dana pri 500 nM. Inhibitor hekokinaze Lonidamin (L4900, Sigma) svakodnevno se koristio pri 25 μM. G6P (G7772, Sigma) koristio se svaki drugi dan u 5 mM, NADPH (N5130, Sigma) koristio se svakodnevno u 100 μM, natrijev piruvat (11360039, Life Technologies) korištena je na 5 mM dnevno, a NAcGluc (A3286, Sigma) korišten je svakodnevno pri 40 mM.

Imunobloting i imunofluorescencija

Imunoblotske i imunofluorescentne analize izvedene su kako je opisano u Bernard i sur. 41 Primarna protutijela koja su korištena su: antifosfo-ERK (9101, stanična signalizacija, Danvers, MA, SAD), anti-zastava (200472, Stratagene, Agilent Technologies, Les Ulis, Francuska), anti-fosfo-histon3Ser10 (ab14955, Abcam, Pariz, Francuska), anticiklin A (H432, sc-751, Santa Cruz Technology, Heidelberg, Njemačka) i anti-tubulin (T6199, Sigma). Kvantifikacija signala imunoblota provedena je korištenjem ImageJ softvera (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, MD, SAD) i normaliziranog na normalizatorski signal (tubulin ili aktin).

Obrnuta transkripcija i kvantitativni PCR u realnom vremenu

TriReagent (Sigma-Aldrich) i PhaseLockGel epruvete (Eppendorf, Hamburg, Njemačka) korištene su za ukupnu pripremu RNA. Komplet za sintezu cdNA prvog lanca (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Velika Britanija) korišten je za sintezu cDNA iz 2 μg ukupne RNA. RT reakcijska smjesa je razrijeđena 1/60 i korištena kao cDNA predložak za kvantitativni PCR. TaqMan kvantitativni PCR je proveden na LightCycler 2.0 sustavu (Roche Applied Science, Meylan, Francuska). PCR smjesa je sadržavala 1, 33 µl LightCycler TaqMan smjese (Roche Applied Science), 0.201 µl pre-smjese prajmera i UPL sonde i 1, 67 µl cDNA predloška u reakcijskom volumenu od 6, 67 µl. Relativna količina mRNA izračunata je komparativnom Cp metodom nakon normalizacije u odnosu na β- aktin. Korišteni primeri su: aktin (UPL sonda br. 11) prema naprijed 5 '-ATTGGCAATGAGCGGTTC-3' i natrag 5 '-GGATGCCACAGGACTCCAT-3', IL8 (UPL sonda # 72) prema naprijed 5 '-ATGGTTCCTT CCGGTGGT-3' i natrag 5 -AGACAGCAGAGCACACAAGC-3 ′, Sprouty2 (UPL sonda # 40) prema naprijed 5′- TCAGGTCTTGGAAGTGTGGTC-3 ′ i natrag 5′-TTTGCACATCGCAGAAAGAA-3 ′, DEC-1 (UPL sonda # 84) naprijed i 5TC-TTC CTC TTC-TTC 5C-TTC-TTC-TTC-TTC-TTC-TTC 5′-TGAAAGCACTAACAAACCTAATTGA-3 ′ i G6PC3 (UPL sonda br. 19) naprijed 5′-TGGCTCAACCTCATCTTCAA i natrag 5′-AGAAGAGGGGAACTGGTGAAC-3 ′.

SA- β -Gal analiza

Na 6–10 dana nakon početnog liječenja stanice su fiksirane s 4% PFA i obrađene su kako je opisano u Augert i sur. 42

Mjerenje razine ATP-a

Humane epitelne stanice zasijane su u posude od 10 cm po 2, 10 5 stanica / posudi i tretirane s 500 nM 4-OHT dnevno tijekom 3 dana. Razine ATP-a izmjerene su jedan dan nakon trećeg 4-OHT tretmana za ljudske stanice epitela. Stanice su isprane ledeno hladnim 1 × PBS i ekstrahirane u puferu koji oslobađa ATP koji sadrži 100 nM kalij fosfatnog pufera pri pH 7, 8, 2 mM EDTA, 1 mM ditiotreititola i 1% Triton X-100. 43 Zatim je 2 μl lizata upotrebljeno za određivanje proteina Bio-Rad proteinskim testom (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD). To uključuje dodavanje kiselog obojenja lizatu koji sadrži proteine ​​i mjerenje apsorbancije na 595 nm spektrofotometrom. Usporedba sa standardnom krivuljom goveđeg serumskog albumina (BSA, Sigma) daje relativno mjerenje koncentracije proteina. Uzorci su razrijeđeni kako bi se procijenio sadržaj ATP-a po 10 µg proteina u svakom stanju. ATP je određen prema uputama proizvođača (ATP set Kit, Life Technologies). Razine ATP-a prvo su izražene u nM ATP po 10 µg proteina, a zatim normalizirane s obzirom na razinu u kontrolnim uzorcima.

Analiza glukoze i laktata

Nakon indukcije starenja dva dana 500 nM 4-OHT tretmanom, 9, 10 4 stanice su zasijane u ploče sa šest jažica i tretirane ili ne sa 4-OHT. Nakon 24 sata, supernatanti su sakupljeni i filtrirani, a zatim su analizirani mliječni šećer i glukoza. Ispitivanja glukoze i mliječne kiseline izvedena su automatiziranim analizatorom, Architect C16000 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SAD).

Mliječna kiselina kvantificirana je na osnovi pretvorbe katalizirane laktat oksidazom u piruvat i vodikov peroksid (H202), nakon čega je uslijedila peroksidaza-katalizirana pretvorba prekursora kromogena ABTS (2, 2'-azino-di- (3- etilbenztiazolin sulfonat)) na njegov kromogen u prisustvu H20. Kromogen je kvantificiran spektrofotometrijski na 548 nm, a njegov je izgled bio strogo proporcionalan koncentraciji mliječne kiseline. Ovo ispitivanje je linearno između 0, 020 i 13, 32 mmol / l. Ručno razrjeđivanje izvršeno je prije kvantifikacije u slučaju najviših koncentracija. Proizvodnja laktata izračunata je kao koncentracija laktata izmjerena u staničnim supernatantima minus koncentracija laktata izmjerena u staničnom mediju.

Glukoza je kvantificirana enzimski spajanjem djelovanja hekokinaze (HK) i G6P dehidrogenaze. U prisutnosti ATP-a i Mg2 +, glukoza se fosforilira u G6P hekokinazom, i nastaje ADP. G6P se pretvara u 6-fosfoglukonat G6P dehidrogenazom. Ova reakcija zahtijeva pretvorbu nikotinamid adenin dinukleotida iz oksidiranog oblika (NAD +) u smanjeni oblik (NADH). Koncentracija glukoze izravno je proporcionalna generiranoj koncentraciji NADH koja se spektrofotometrijski mjeri na 340 nm. Ovo ispitivanje je linearno između 0, 28 i 44, 40 mmol / l. Uzorci koji sadrže veće koncentracije razrijeđeni su ručno prije kvantifikacije. Unos glukoze je izračunat kao koncentracija glukoze u mediju umanjena za koncentraciju glukoze izmjerenu u staničnom supernatantu.

Statistička analiza

Vrijednosti su predstavljene kao srednje ± SD, osim ako nije navedeno drugačije. Statističke analize provedene su korištenjem Student- t- testa (srednja * P <0, 05, srednja ** P <0, 01, srednja *** P <0, 001). Svako je iskustvo barem ponovljeno.

Promjena povijesti

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske brojke

Glosar

2DG

2-deoksi-D-glukoza

4-OHT

4-hidroksitamoksifen

ATP

adenozin trifosfat

HK2

heksokinaze 2

G6P

glukoza-6-fosfata

OIS

onkogena izazvana senescencija

PPP

put pentose fosfata

SA- β -Gal

senescencija povezana β- galaktozidaza

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)