Histon demetilaza kdm4b djeluje kao ko-faktor c / ebpβ za promicanje mitotske klonske ekspanzije za vrijeme diferencijacije 3t3-1l preadipocita | stanična smrt i diferencijacija

Histon demetilaza kdm4b djeluje kao ko-faktor c / ebpβ za promicanje mitotske klonske ekspanzije za vrijeme diferencijacije 3t3-1l preadipocita | stanična smrt i diferencijacija

Anonim

teme

  • Diferencijacija
  • oksidoreduktaze

Sažetak

CCAAT / protein-vezujući protein (C / EBP) β potreban je za mitotsku klonalnu ekspanziju (MCE) i terminalnu diferencijaciju adipocita 3T3-L1 preadipocita. Iako je uloga C / EBP β u terminalnoj diferencijaciji adipocita dobro definirana, njegov mehanizam djelovanja tijekom MCE nije. U ovom su izvještaju histon demetilaza Kdm4b, kao i geni staničnog ciklusa Cdc45l (stanični ciklus dijeljenja 45 homolog), Mcm3 (komponenta 3 kompleksa za održavanje mini-kromosoma 3), Gins1 (GINS-kompleksna podjedinica 1) i Cdc25c (stanični ciklus podjele 25 homolog c ), identificirani su kao potencijalni C / EBP β ciljni geni za vrijeme MCE korištenjem imunoprecipitacije kromatinskih imunoprecipitacija (ChIP) -on-chip analiza u kombinaciji s mikroračunatima gena za ekspresiju. Ekspresija Kdm4b inducira se tijekom MCE-a i njena indukcija ovisi o C / EBP β . ChIP, test pomaka elektroforetske pokretljivosti (EMSA) i test luciferaze potvrdili su da je promotor Kdm4b vezan i aktiviran C / EBP β . Srušavanje Kdm4b oslabilo je MCE. Nadalje, Kdm4b je komunicirao s C / EBP β i regrutovao je za promotore gena staničnog ciklusa reguliranih C / EBP P , uključujući Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c , demetilirani H3K9me3 i aktivirao njihovu transkripciju. Ovi nalazi sugeriraju novi mehanizam za usmjeravanje DNA koji uključuje faktor transkripcije koji veže DNA (C / EBP β ) i regulator kromatina (Kdm4b) u regulaciji MCE kontroliranjem ekspresije gena staničnog ciklusa.

Glavni

Pretilost je glavni faktor rizika za dijabetes tipa 2, hipertenziju, hiperlipidemiju i arteriosklerozu. 1 I povećanje veličine adipocita (hipertrofija) i broja (hiperplazija) 2 glavni su doprinos razvoju pretilosti. Hiperplazija adipocita oponaša se tijekom programa adipogene diferencijacije preadipocita 3T3-L1. 3 Neposredno nakon tretmana indukcijskim mehanizmom, preadipociti zaustavljeni na rastu ponovno ulaze u stanični ciklus, postupak koji se naziva mitotička klonska ekspanzija (MCE) u kojoj se broj stanica povećava ∼ četverostruko tijekom diferencijacije. Program ekspresije gena koji vodi do terminalne diferencijacije adipocita pokreće se tijekom i nakon razdoblja MCE. Iako postoje neke kontroverze, 4 brojna eksperimentalna promatranja podupiru stajalište da je MCE neophodan korak za terminalnu diferencijaciju adipocita 3T3-L1 preadipocita. Inhibitor ekstracelularne signale regulirane kinazne kinaze (MEK) U0126 i roskvitin-inhibitor kinaze ovisan o ciklinu, koji inhibiraju stanični ciklus u različitim točkama, blokiraju MCE, kao i adipogenezu. 5 Nadalje, inhibitor sinteze DNA ahidicolin i antiproliferacijski reagens rapamicin također blokiraju diferencijaciju MCE i 3T3-L1 preadipocita. 6, 7

CCAAT / protein-vezujući protein β (C / EBP β ) važan je faktor transkripcije za pokretanje diferencijacije 3T3-L1 preadipocita. C / EBP β induciran je veoma rano u diferencijaciji adipocita. Tada aktivira ekspresiju proteina α koji povezuje pojačivač CCAAT α (C / EBP α ) i receptora aktiviranog peroksisom proliferatorom γ (PPAR y ), dva kritična pro-adipogena faktora transkripcije, vezanjem na njihove promotore. 8 Prethodna ispitivanja pokazala su da su za MCE potrebni ekspresija i aktiviranje C / EBP β . Kada su podvrgnuti istom protokolu diferencijacije kao i preadipociti 3T3-L1, podskup mišjih embrija fibroblasta (MEF) prolazi MCE i terminalnu diferencijaciju u adipocite. MEF iz C / EBP p (- / -) miševa, međutim, ni podliježu MCE niti se diferenciraju u adipocite. 9 Nadalje, pad C / EBP β interferencijom RNA (RNAi) u preadipocitima 3T3-L1 sprječava MCE, kao i diferencijaciju adipocita. 10 Nadalje, prekomjerna ekspresija dominantno-negativnog C / EBP β (AC / EBP) koja blokira vezanje C / EBP β DNA dimerizacijom kroz leucinski zatvarač, također prekida MCE i adipogenezu 3T3-L1 stanica. 11 C / EBP β također ima važnu ulogu u proliferaciji nekih drugih tipova stanica kao što su lobuloalveolarne stanice, osteoblasti, keratinociti i augmentacije Haus-inducirana transformacija NIH 3T3 stanica. 12, 13, 14, 15 Unatoč važnoj ulozi C / EBP β u stimulaciji rasta, mehanizam na kojem se nalazi MCE nije u potpunosti razjašnjen.

Metilacija ostataka lizina u histonima središnja je epigenetska modifikacija u regulaciji ekspresije gena eukariota. Dok metilacija u H3K4 i H3K36 pretežno preuzima aktivirajuće signale, metilacija u H3K9, H3K27 i H4K20 povezana je ponajprije s potisnutim kromatinom. Kdm4b je Jmjc-domena koja sadrži histon demetilazu za H3K9me3. Nedavna istraživanja pokazala su da je Kdm4b potreban za progresiju estrogenskih receptora α (ER α ) regulisanih progresije karcinoma dojke i proliferaciju mliječnih epitelijskih stanica (MEC). 16, 17, 18 U ovom istraživanju, Kdm4b je identificiran kao ciljni gen C / EBP β koji djeluje kao ko-faktor C / EBP β za demetilaciju H3K9me3 u regulatornim regijama C / EBP β- reguliranog staničnog ciklusa geni Cdc45l (ciklus dijeljenja stanica 45 homolog) , Mcm3 (komponenta 3 kompleksa za održavanje mini-kromosoma) , Gins1 (GINS-kompleksna podjedinica 1) i Cdc25c (stanični ciklus dijeljenja 25 homolog c), promovirajući na taj način njihovu ekspresiju i MCE. To objašnjava zašto je C / EBP β potreban za MCE tijekom diferencijacije adipocita.

Rezultati

Identifikacija mjesta vezanja C / EBP β tijekom MCE diferencijacije preadipocita 3T3-L1

Promjena imunoprecipitacije kromatinskih imunoprecipitacija (ChIP) na čipu primjenjena je na 3T3-L1 stanicama prikupljenim u 20 h nakon hormonske indukcije kada su stanice u srednjoj S fazi tijekom prvog kruga MCE. 5, 19 Identificirano je devetsto četrdeset i jedna značajna područja vezivanja C / EBP β (Dodatna tablica S1). Za vrednovanje podataka ChIP-na-čipu, obogaćivanje C / EBP β mjereno je kvantitativnim PCR-om ChIP (ChIP-qPCR) u 30 novih regija vezivanja, a 29 od tih mjesta je pozitivno (dopunska slika S1a). Petnaest ovih mjesta također je testirano ChIP-qPCR s drugim C / EBP p antitijelom i dobiven je sličan rezultat kao s originalnim antitijelom korištenim za ChIP-on-chip test (Dodatna slika S1b).

Analiza raspodjele mjesta vezanja u odnosu na TSS pokazala je da se većina regija za vezanje C / EBP β nalazi na udaljenosti unutar 2 kb od najbližih označenih početnih mjesta transkripcije (TSS) (slika 1a). Daljnja analiza otkrila je da je ∼ 30% mjesta vezanja za C / EBP β na proksimalnim promotorima (Slika 1b, TSS do -1 kb), a ∼ 30% mjesta spadalo je u udaljene promotore, definirano kao> 1 kb uzvodno od TSS ( Slika 1b, > 1 kb), dok su mnoga druga mjesta (26, 84%) smještena u introne (Slika 1b). Ispitivana je evolucijska očuvanost C / EBP β vežućih regija kako bi se pokazalo da postoji visok stupanj očuvanosti C / EBP β mjesta vezivanja među višim eukariotima (slika 1c), što sugerira da su ta mjesta vezivanja vjerojatno funkcionalna regulatorna područja transkripcije preko vrsta.

Image

Bioinformacijske analize podataka ChIP-on-chip. Post-konfliktni preadipociti zaustavljeni zbog rasta 3T3-L1 inducirani su u diferencijaciju kako je opisano. U 20 h provedena je i analizirana ChIP-on-chip. ( a ) Distribucija u intervalima od 200 bp C / EBP β vežućih regija u odnosu na TSS najbližih RefSeq gena. ( b ) Kartiranje C / EBP β mjesta vezivanja u odnosu na najbliže RefSeq gene. > 1 kb: više od 1 kb uzvodno od TSS; Nizvodno: nizvodno od 3 ′ kraja gena; UTR: neprevedena regija. ( c ) Prosječni plan za očuvanje C / EBP β obvezujućih regija među višim eukariotima. ( d ) Logotip slijeda koji ilustrira vrhunski novi motiv za regije povezane s C / EBP β . ( e ) TRANSFAC matrice obogaćene oko C / EBP β- vezanih područja. ( f ) Preklapanje između gena koje cilja C / EBP β (1039 gena) i gena čija je indukcija ovisila o C / EBP β (481 gena)

Slika pune veličine

Sekvence regije vezane za C / EBP p su minirane kako bi se dalje identificirali potencijalni motivi vezivanja faktora transkripcije. De novo motiv pretraživanja identificirao je niz koji snažno podsjeća na C / EBP element prepoznavanja kao motiv s najvišim ocjenama (Slika 1d). Dosljedno tome, motivi najviše ocjene iz baze podataka TRANSFAC predstavljali su različite matrice za C / EBP proteine ​​(Slika 1e i Dodatna tablica S2). Mikroračuni genske ekspresije nadalje su provedeni i za stanice koje su tretirane s RNAi i za stanice tretirane sa C / EBP β RNAi kako bi se potvrdio funkcionalni odnos između vezanja C / EBP p i transkripcije gena. Identificirano je da se četiri stotine osamdeset i jedan gen inducira (20 h nasuprot 0 h) na C / EBP P- ovisan način (dopunske tablice S3 i S4). Prilikom preklapanja podataka ChIP na čipu i podataka iz mikroračuna, identificirano je 68 potencijalnih C / EBP β ciljnih gena (Slika 1f i Dodatna tablica S5).

Histon demetilaza Kdm4b identificirana je kao jedan od C / EBP β ciljnih gena potrebnih za MCE tijekom diferencijacije 3T3-L1 adipocita

Metilacija lizina na histonima ima ključnu ulogu u regulaciji transkripcije. 20 Histon demetilaza Kdm4b (za H3K9me3) bila je među 68 potencijalnih C / EBP β ciljnih gena identificiranih gore. Ovo sugerira da C / EBPP može regulirati ekspresiju gena neizravnom regulacijom metilacije histona lizinom.

DNK fragment koji sadrži 5 'bočno područje Kdm4b gena subkloniran je u luciferazni reporterski konstrukt pGL3-basic i transfektiran u 3T3-L1 preadipocite s / iz C / EBP β ekspresioniranog plazmida. Aktivnost luciferaze povećana je 10 puta kad se kofeficira s C / EBP β ekspresijskim plazmidom (slika 2a). Dosljedno, brisanje mjesta vezanja C / EBP (−577 do –564 bp) utvrđenog u našoj ChIP-on-chip analizi gotovo je u potpunosti ukinulo ovu aktivaciju. ChIP-qPCR potvrdio je da je fragment promotora Kdm4b koji sadrži područje −577 bp ∼ -564 bp značajno obogaćen C / EBP p antitijelom u 16 h i 20 h nakon adipogene indukcije (slika 2b). Specifično vezivanje C / EBP β na ovo područje također je potvrđeno analizom pomaka elektroforetske pokretljivosti (EMSA) (dopunska slika S2). Nakon indukcije diferencijacije, razina KNm4b glasnika RNA (mRNA) je značajno inducirana i ta je regulacija spriječena kada je C / EBP β oborio RNAi (Slika 2c). Dosljedno tome, razina proteina Kdm4b također se povećala nakon indukcije i oslabila je u stanicama tretiranim C / EBP β RNAi (Slika 2d). Potvrđena je i učinkovitost obustave C / EBP β RNAi (slike 2c i d), a njezin utjecaj na diferencijaciju MCE i terminalnih adipocita u skladu je s našim prethodnim izvješćem. 10 Iako je ekspresija Kdm4b značajno inducirana i regulirana C / EBP β , to nije slučaj za ostale gene Kdm4 porodice (Slika 2e).

Image

Transaktivacija Kdm4b pomoću C / EBP β tijekom MCE diferencijacije preadipocita 3T3-L1. ( a ) Preadipociti 3T3-L1 transficirani su kontrolnim vektorom ili C / EBP p- ekspresionirajućim vektorom, zajedno s reporter konstruktima koji sadrže Kdm4b promotor (−1000 do -1 bp) ili mutante. Aktivnosti luciferaze izmjerene su 36 sati kasnije i nacrtane su. ( b ) Stanice 3T3-L1 inducirane su na diferencijaciju i vezanje C / EBP p na Kdm4b promotoru analizirano je sa ChIP-qPCR na vrijeme naznačeno. ( c ) 3T3-Ll stanice su tretirane s kontrolom ili C / EBP P RNAi. Nakon indukcije, razina mRNA C / EBP p i Kdm4b u naznačenim vremenima analizirana je pomoću RT-qPCR. ( d ) Stanični lizati su sakupljeni u vremenima naznačenim i podvrgnuti se zapadnom pjevanju s naznačenim antitijelima. C / EBP β antitijelo detektira dvije vrpce: aktivatorski protein obogaćen jetrom (LAP, 34 kDa) i inhibitorni protein je obogaćen jetrom (LIP, 21 kDa, N-krajnje odrezan izoform C / EBP β ). Hsp90 je služio kao kontrola opterećenja. ( e ) Nakon indukcije, razina mRNA članova Kdm4 porodice u vrijeme naznačenom analizirana je pomoću RT-qPCR. Podaci su normalizirani na 0 h vremenske točke svakog gena. * P <0, 05. ( f - i ) Prekomjerna ekspresija C / EBP β potiče ekspresiju Kdm4b. Preadipociti 3T3-L1 zaraženi su retrovirusom koji izražava zastavicu C / EBP β s oznakom zastave ili s praznim vektorom i inducirani su na diferencijaciju. ( f ) Prekomjerna ekspresija C / EBP β (LAP) potvrđena je zapadnim upijanjem u 20 h. ( g ) 16 sati nakon indukcije stanice su obilježene EdU tijekom 2 sata, a zatim podvrgnute FACS analizi. Određeni su postoci stanica u S fazi. ( h ) U 8 d nakon indukcije, stanice su obojene uljno crvenim O. ( i ) Učinak C / EBP β prekomjerne ekspresije na ekspresiju Kdm4b detektiran je RT-qPCR

Slika pune veličine

Da bi se potvrdila uloga C / EBP β u indukciji Kdm4b, C / EBP β je prekomjerno ekspresioniran u stanicama 3T3-L1 (Slika 2f). Kao što se očekivalo, ektopična ekspresija C / EBP β promovirala je MCE, što je prikazano povećanom ugrađivanjem EdU (pokazatelj sinteze DNK, poput inkorporacije BrdU) (slika 2 g), kao i diferencijacijom adipocita, što je naznačeno povećanom akumulacijom citoplazmatskog triglicerida (Slika 2h) i pojačali su ekspresiju Kdm4b i za 0 i 20 sati nakon adipogene indukcije (Slika 2i). Ovi rezultati pokazuju da je Kdm4b dobronamjerna meta C / EBP β tijekom MCE.

Pokazano je da kdm4b regulira staničnu proliferaciju, uključujući rast karcinoma dojke izazvan estrogenom i proliferaciju MEC-a. 16, 17 Stoga smo pretpostavili da bi Kdm4b također mogao biti uključen u regulaciju MCE tijekom diferencijacije preadipocita 3T3-L1. RNAi oligonukleotid Kdm4b je transfektiran u preadipocite 3T3-L1. Učinkovitost i specifičnost Kdm4b obustave potvrđena je Western blottingom (slika 3a) i RT-qPCR (dopunska slika S3). Učinak RNAi na sintezu DNK ocijenjen je korištenjem EdU označavanja. Kao što je prikazano na slici 3b, Kdm4b knockdown uzrokovao je manje ugradnje EdU-a. Nadalje, analiza protočne citometrije otkrila je da je oborenje Kdm4b rezultiralo značajnim smanjenjem stanične populacije u S fazi (s 34 na 19%) uz istodobno povećanje stanične populacije u fazi G1 (s 40 na 71%) (Slika 3c ). Ovi podaci sugeriraju da Kdm4b može promovirati MCE olakšavajući tranziciju G1 / S. Dosljedno, stanična proliferacija je značajno inhibirana 1 do 4 dana nakon indukcije (Slika 3d). Pored toga, kada je MCE bio inhibiran nakon što je srušen Kdm4b, terminalna diferencijacija 3T3-L1 stanica također je potisnuta kako je naznačeno obojenjem Oil Red O (slika 3e), kao i ekspresijom gena markera adipocita (slika 3f). Zbirno, ovi rezultati ukazuju na to da je Kdm4b potreban za MCE.

Image

Kdm4b je potreban za MCE tijekom diferencijacije preadipocita 3T3-L1. Preadipociti 3T3-L1 zaraženi su praznim vektorom ili inficirani retrovirusom koji eksprimira humani Kdm4b (hKdm4b). Tada su stanice transficirane kontrolnom RNAi ili Kdm4b RNAi. Nakon post-konfluencije, stanice su inducirane na diferencijaciju. ( a ) Stanični lizati su sakupljeni u 20 h i ekspresijom navedenih gena detektirano je Western blottingom. ( b ) 18 sati nakon indukcije, stanice su obilježene EdU tijekom 2 sata, a zatim obojene s Hoechstom. Fluorescencija EdU (crvena) i Hoechst (plava) otkrivena je fluorescentnim mikroskopom. ( c ) Sadržaj DNA je analiziran pomoću PI bojanja i protočne citometrije u vremenskim tačkama od 0 h i 20 h i analiziran. ( d ) Broj stanica određen je u vrijeme naznačeno nakon indukcije. Podaci su normalizirani na vremensku točku od 0 h. * P <0, 05. ( e ) 8 dana nakon indukcije, stanice su obojene uljno crvenim O. ( f ) 8 dana nakon indukcije depresija gena markera adipocita otkrivena je Western blottingom

Slika pune veličine

Za daljnju potvrdu gornjeg promatranja izvedeni su spasilački eksperimenti. Kako su preadipociti 3T3-L1 mišjeg podrijetla, ljudski Kdm4b se ektopično eksprimira u 3T3-L1 stanicama tretiranim Kdm4b RNAi retroduralnom transdukcijom. Western blot-analiza pokazala je da je humani Kdm4b gen rezistentan na mišji propadanje Kdm4b RNAi i bio je eksprimiran na sličnoj razini ukupnog Kdm4b kao i roditeljske kontrolne stanice (Slika 3a). Prisilna ekspresija humanog Kdm4b dovela je do značajnog spašavanja MCE (slike 3b-d) i terminalne diferencijacije adipocita (slike 3e-f). Ovi podaci pojačavaju ideju da Kdm4b ima važnu ulogu u MCE.

Transkripcijska aktivacija gena staničnog ciklusa Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c pomoću C / EBP β tijekom MCE

Analiza genske ontologije (GO) otkrila je da su četiri gena staničnog ciklusa ( Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c ) bila među 68 potencijalnih C / EBP β ciljnih gena (Dopunska tablica S5). Ekspresija Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c određena je RT-qPCR-om i Western blottingom. Nakon hormonske indukcije, razina mRNA (slika 4a) i proteina (slika 4b) povećala se u 8 h. Do regulacije ovih gena staničnog ciklusa došlo je nakon gena C / EBP β , koji je dostigao maksimum 4 sata nakon indukcije (Slike 4a i b). Kada je srušena ekspresija C / EBP β , indukcija ovih gena staničnog ciklusa značajno je smanjena, što je naznačeno smanjenjem njihove razine mRNA i proteina (slike 4c i d). Ovi rezultati potvrđuju da je C / EBP β potreban za indukciju gena četiri staničnog ciklusa tijekom MCE u programu diferencijacije 3T3-L1 preadipocita.

Image

Četiri gena staničnog ciklusa Cdc45l , Mcm3 , Gins1 i Cdc25c identificirani su kao C / EBP β ciljni geni. ( a, b ) Stanice 3T3-L1 inducirane su do diferencijacije. Profili ekspresije C / EBP p i četiri gena staničnog ciklusa Cdc45l , Mcm3 , Gins1 i Cdc25c analizirani su pomoću RT-qPCR ( a ) i Western blotting ( b ). ( c, d ) preadipociti 3T3-L1 transfektirani su kontrolnom RNAi ili C / EBP β RNAi. Nakon post-konfluencije, stanice su inducirane na diferencijaciju. Učinak obaranja C / EBP β na ekspresiju četiriju gena staničnog ciklusa detektiran je RT-qPCR ( c ) i Western blot ( d )

Slika pune veličine

Zatim je ispitano vezivanje C / EBP p na promotore četiriju gena staničnog ciklusa. Promocijske regije četiriju gena identificirane u C / EBP β ChIP-na čip podacima i C / EBPP konsenzusnim sekvencama prikazane su na Dodatnoj slici S4. ChIP-qPCR ispitivanja provedena su korištenjem prajmera koji pokrivaju ove C / EBPP konsenzusne sekvence četiriju gena.

Kao što prikazuje slika 5a, C / EBP β asocira na promotore četiriju gena u 16 h i 20 h nakon indukcije. Suprotno tome, popunjenost C / EBP β u mirovanju stanica teško je bilo detektirati prije indukcije (tj. Pri 0 h). EMSA je također izvedena pomoću sondi koje sadrže C / EBP β konsenzusne sekvence i nuklearne ekstrakte iz 3T3-L1 stanica 20 sati nakon indukcije. Kao što je prikazano na slici 5b, s tim sondama formirali su se DNA-proteinski kompleksi (trase 1, 6, 11, 16). C / EBP β sadržani DNA-proteinski kompleksi bili su verificirani potpunim pomakom kompleksa pomoću C / EBP β antitijela (trake 3, 8, 13 i 18) u usporedbi s kontrolnim IgG (trake 2, 7, 12, i 17). Nadalje, inhibicija stvaranja kompleksa neoznačenim konkurentnim oligonukleotidom, ali ne i samo sondama mutiranim u C / EBP konsenzusnom slijedu (dopunska slika S4), potvrdila je specifično vezivanje (usporedite trake 4, 9, 14, 19 s trakama 5, 10, 15, 20). Nadalje, izvjestiteljska analiza promotor-luciferaza pokazuje da C / EBP β transaktivira promotore gena četiri staničnog ciklusa i da mutacija mjesta vezanja C / EBP β značajno smanjuje ekspresiju (Slika 5c).

Image

C / EBP β se veže i transaktivira promotore gena četiri stanična ciklusa. ( a ) Rast zaustavljeni 3T3-L1 preadipociti potaknuti su na diferencijaciju. Ponekad je naznačeno da je ChIP izveden radi prikazivanja vezanja C / EBP p na promotore gena sa četiri stanična ciklusa. Podaci se u svakom trenutku normaliziraju na IgG kontrole. Jedna regija gena inzulina služi kao negativna kontrola. ( b ) EMSA je provedena s nuklearnim ekstraktima iz 3T3-L1 stanica 20 sati nakon indukcije. Supershift pokusi su izvedeni s kontrolnim IgG ili C / EBP p protutijelom. Za analizu konkurencije korištena je neoznačena natjecateljska sonda C / EBP elementa u C / EBP α promotoru gena (Consensus) ili neoznačena samonikla mutirana u C / EBP elementu (Mut, prikazano na Dodatnoj slici S4). Navedeni su položaji C / EBP β koji sadrži DNA – proteinski kompleks i pojasa super-pomicanja (SS). ( c ) preadipociti 3T3-L1 transficirani su s reporter konstruktima sa / van mutiranih C / EBP mjesta vezivanja i s / iz vektora ekspresije C / EBP P. Nakon 48 h, aktivnost luciferaze je analizirana i prikazana. * P <0, 05

Slika pune veličine

Uloga četverogenih gena u staničnom ciklusu bila je dodatno ispitana. Rušenje četiriju gena inhibira MCE (dopunska slika S5). Pored toga, ektopična ekspresija četiriju gena zajedno značajno spašava inhibitorni učinak C / EBP β RNAi na MCE (dopunska slika S6). Uzeti zajedno, eksperimenti RNAi i prekomjerne ekspresije pokazuju da Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c, koji su aktivirani C / EBP β , imaju važnu ulogu u MCE.

Histon demetilaza Kdm4b služi kao ko-faktor C / EBP β tijekom MCE

Nedavna istraživanja otkrila su da je Kdm4b direktan ciljni gen ER α , formira kompleks s ER α i olakšava ER α- reguliranu transkripciju. 16, 17 Kao što je gore navedeno, pokazalo se da je Kdm4b ciljni gen C / EBP β (slika 2), a poput C / EBP β , Kdm4b je također potreban za MCE (slika 3). Dakle, pretpostavili smo da Kdm4 može djelovati kao ko-faktor C / EBP β za promicanje MCE.

Provedeni su ChIP testovi kako bi se utvrdilo interakciju Kdm4b s lokusima gena staničnog ciklusa pod utjecajem C / EBP P. Rezultati su pokazali da se Kdm4b, slično C / EBP β , regrutuje u promotorskim regijama četiri gena staničnog ciklusa 20 sati nakon indukcije, ali ne prije (slika 6a). Nadalje, ponovna ChIP analiza pokazala je da promotore četiri gena, koji su imunoprecipitirani C / EBP p protutijelom, imunoprecipitiraju Kdm4b antitijelom (Slika 6b). Interakcija između C / EBP β i Kdm4b potvrđena je i u eksperimentima sa zajedničkom imunoprecipitacijom. Imunoprecipitacija nuklearnih ekstrakata u 20 h nakon indukcije s C / EBP β antitijelom povlači Kdm4b (slika 6c), a antitijelo na Kdm4b također imunoprecipitira C / EBP β (slika 6d). Skupno, ovi rezultati potvrđuju da C / EBP β i Kdm4b tvore kompleks koji cilja promotore gena četiri staničnog ciklusa. Nadalje, testovi luciferaze pokazuju da Kdm4b povećava sposobnost C / EBP β da aktivira promotore četiri gena staničnog ciklusa (Slika 6e), što ukazuje da Kdm4b djeluje kao pozitivni transkripcijski ko-faktor za C / EBP β za reguliranje četiri gena staničnog ciklusa.

Image

Kdm4b je djelovao kao ko-faktor C / EBP β za aktiviranje promotora četiriju gena staničnog ciklusa. ( a ) ChIP analiza pokazala je da je Kdm4b također povezan s promotorima gena četiri staničnog ciklusa. ( b ) U 20 h nakon indukcije pripremljen je topljivi kromatin za ChIPs i Re-ChIPs sa naznačenim antitijelima. Oporavak četiri promotora staničnog ciklusa analiziran je PCR-om. ( c, d ) Interakcija između C / EBP β i Kdm4b. U 20 h nakon indukcije, stanični lizati su sakupljeni i imunoprecipitirani s antitijelom protiv C / EBP β ( c ) ili Kdm4b ( d ). Imunoprecipitatni kompleksi detektirani su Western blottingom naznačenim antitijelima. Traka koju detektira C / EBP p antitijelo je aktivatorski protein obogaćen jetrom (LAP) (34 kDa). ( e ) 3T3-L1 preadipociti su transfektirani sa reporterski konstrukcijom sa / van navedenih ekspresijskih vektora. Nakon 48 h, aktivnost luciferaze je analizirana i prikazana. * P <0, 05

Slika pune veličine

Kdm4b je histonska demetilaza koja revertira tri-metilaciju u H3K9. H3K9me3 općenito je povezan s prigušivanjem gena i obogaćen je heterokromatinom neaktivnih gena. Utvrđeno je da je modifikacija H3K9me3 promotivnih područja Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c visoka u 0 h i značajno se smanjuje za 20 h nakon indukcije (Slike 7a-d). Dosljedno, smanjenje H3K9me3 povezano s tim promotorima nakon adipogene indukcije primijećeno je samo u kontroli, ali ne i u stanicama koje su istrošene Kdm4b (Slika 7e). Kao što se očekivalo, oborenje ekspresije Kdm4b oslabilo je indukciju četiriju gena staničnog ciklusa (Slika 7f).

Image

Kdm4b regulira ekspresiju gena staničnog ciklusa pod utjecajem C / EBP β kroz demetilaciju H3K9me3. ( a - d ) Smanjenje nivoa modifikacije H3K9me3 na promotorima četiriju gena staničnog ciklusa tijekom MCE. Gornja ploča: Shematski prikaz genomskog lokusa. Područja od 'a' do 'd' analizirana su ChIP-qPCR-om. TSS je označen strelicom. Donja ploča: ChIP-qPCR analiza popunjenosti H3K9me3 na mjestima u genskim lokusima navedenim na gornjoj ploči izvršena je 0 h i 20 h nakon indukcije. Primeri za ChIP-qPCR dostupni su na zahtjev. ( e ) 3T3-L1 preadipociti su tretirani s kontrolnom RNAi ili Kdm4b RNAi, a zatim su inducirani na diferencijaciju. Stanice su sakupljene na vrijeme naznačeno i podvrgnute ChIP-qPCR analiziranju modifikacije H3K9me3 na položaju 'c' svakog gena lokusa promotora. Podaci su normalizirani na 0 h vremenske točke kontrolnih RNAi stanica tretiranih stanica. ( f ) Preadipociti 3T3-L1 tretirani su kao u ( e ). RT-qPCR analiziran je relativnom razinom mRNA C / EBP β- nabijenih gena staničnog ciklusa

Slika pune veličine

C / EBP β i Kdm4b posebno reguliraju MCE, ali nisu normalni proliferacija preadipocita 3T3-L1

Da bi se utvrdilo je li funkcija C / EBP β i Kdm4b specifična za MCE, ispitivani su učinci rušenja C / EBP β i Kdm4b na proliferaciju normalnih 3T3-L1 preadipocita. Propadanje C / EBP β ili Kdm4b nije značajno promijenilo brzinu rasta pre-spajajuće 3T3-L1 stanice, kako je procijenjeno analizom broja stanica, niti faze staničnog ciklusa (Slike 8a i b, respektivno). Nadalje, otkriveno je samo slabo vezanje C / EBP p ili Kdm4b na promotore gena četiri stanična ciklusa u pre konfluentnim stanicama 3T3-L1 (Slike 8c i d, respektivno). Dosljedno, na ekspresiju gena četiri staničnog ciklusa nije utjecao kada je srušen C / EBP β ili Kdm4b (Slika 8e). Ova zapažanja pokazuju da C / EBP β i Kdm4b imaju specifičnu ulogu u MCE, ali ne i u normalnoj proliferaciji 3T3-L1 preadipocita.

Image

Srušenje ekspresije C / EBP β i Kdm4b nema učinka na pre-konfluentnu proliferaciju 3T3-L1 stanica. ( a ) Preadipociti 3T3-L1 postavljeni su na 20% -tnom ušću, sljedećeg dana stanice su transficirane sa C / EBP p ili Kdm4b RNAi. Četrdeset osam sati kasnije stanična proliferacija određena je brojenjem broja stanica u naznačenim vremenima. ( b ) Stanice su tretirane kao u ( a ). 48 sati nakon transfekcije RNAi analizirani su profili faze staničnog ciklusa PI obojenjem, nakon čega je slijedila protočna citometrija. ( c, d ) Analiza ChIP-qPCR vezanja C / EBP β ( c ) i Kdm4b ( d ) na promotore mišjih Cdc45l, Mcm3, Gins1 i Cdc25c izvedena je u stanicama prije spajanja 3T3-L1. ( e ) Četrdeset osam sati nakon transfekcije C / EBP β ili Kdm4b RNAi prikupljeni su lizati stanica i ekspresija navedenih gena procjenjena je Western blottingom

Slika pune veličine

Rasprava

C / EBP β je osnovni faktor transkripcije leucinog zatvarača izražen u različitim tipovima stanica i okarakteriziran je kao regulator diferencijacije, poput diferencijacije adipocita, ženskog reproduktivnog sustava, mliječne žlijezde i kosti. 21, 22, 23 Iako su ove studije osvijetlile njegovu ulogu u diferencijaciji, neke druge studije također pokazuju da C / EBP β djeluje u staničnoj proliferaciji nekih eksperimentalnih i neoplastičnih modela. Mehanički uvid u djelovanje C / EBP β u tim tipovima stanične proliferacije je, međutim, ograničen.

Kdm4b je izvorno pokazao da antagonizira H3K9me3 pri pericentričnom heterokromatinu u stanicama sisavaca. 24 Nedavna izvješća otkrivaju da Kdm4b također djeluje u regulaciji ekspresije gena. U ER signalizaciji, Kdm4b demetilira H3K9me3 u regulatornim regijama gena koji reagiraju na ER, oslobađajući tako transkripcijski blok i potičući proliferaciju stanica karcinoma dojke i razvoj mliječnih žlijezda. 16, 17, 18 Naši nalazi identificirali su specifičnu ulogu Kdm4b u MCE tijekom proliferativne faze diferencijacije adipocita. Otkriveno je da je Kdm4b dobronamjerni ciljni gen C / EBP β tijekom MCE. C / EBP β regulira ekspresiju Kdm4b (slika 2), što zauzvrat demetira H3K9me3 povezane s genima staničnog ciklusa C / EBP β- regulirajući tako aktivirajući ekspresiju tih gena (Slika 7). Konkretno, C / EBP β pokreće ekspresiju gena četiri staničnog ciklusa dvama putima, jedan aktivacijom transkripcije i drugi epigenetskim putem (dopunska slika S7). C / EBP β zahtijeva Kdm4b da preokrene modifikaciju H3K9me3 i na taj način poveća svoju transkripcijsku aktivnost. Nadalje, Kdm4b zahtijeva da C / EBP β bude transkripcijski induciran. Ovo otkriće pruža novi uvid u potencijalne uloge C / EBP β u epigenetskoj i transkripcijskoj regulaciji tijekom MCE diferencijacije preadipocita. Od interesa, C / EBP β potreban je i za razvoj mliječnih žlijezda. Brisanje C / EBP β rezultira retardiranom proliferacijom MEC-a i ozbiljnom inhibicijom lobuloalveolarnog razvoja25, što je slično fenotipu uvjetne delecije Kdm4b u epitelu mliječne žlijezde. 17 Naši nalazi sugeriraju suradnju C / EBP β i Kdm4b tijekom razvoja mliječnih žlijezda.

U trenutnoj studiji, četiri gena staničnog ciklusa identificirana su kao izravne mete C / EBP β tijekom MCE. Mcm3 je komponenta kompleksa MCM2-7 (proteini mini-kromosoma koji održavaju 2–7), dok je Gins1 podjedinica kompleksa GINS (go-ichi-ni-san). 26, 27 Cdc45l, MCM2-7 i GINS tvore veliki kompleks nazvan CMG, koji se nalazi na mjestima odmotavanja DNA tijekom replikacije i sadrži intrinzičnu helikaznu aktivnost. 28 Komplet CMG uključen je u regulaciju replikacije eukariotske kromosomske DNK i potreban je za korake pokretanja i produženja, kao i koordinaciju replikacije DNK. 29 Cdc25c je fosfo-tirozin fosfataza koja pripada porodici Cdc25 fosfataza. Usmjerava defosforilaciju Cdc2 vezanog ciklinom B i pokreće ulazak u mitozu. 30 Studija pokazuje da Cdc25c ne samo da ima ulogu u mitozi, već također doprinosi ulasku u S-fazu. 31 Naši rezultati potvrđuju da su geni četiri staničnog ciklusa nizvodno ciljani geni C / EBP β za vrijeme MCE (slike 4, 5; dopunska slika S5-S6). Propadanje četiriju gena smanjuje MCE, nakon čega slijedi inhibicija terminalne diferencijacije adipocita (dopunska slika S5). Ovo promatranje daje dodatnu vjerodostojnost ideji da je MCE rani esencijalni korak u programu diferencijacije adipocita stanica 3T3-L1.

Bojenje propidijevim jodidom (PI) i eksperimenti s EdU označavanjem pokazuju da inhibiciju MCE padom Kdm4b i četiri gena staničnog ciklusa slijedi blokada prijelaza G1 / S (Slike 3b i c; Dopunska slika S5b-S5c), Ti su nalazi također u skladu s ulogom C / EBP β u MCE, kao funkcionalnom poremećaju C / EBP β blokade prijelaza G1 / S nakon čega slijedi inhibicija MCE. 5, 11 Poznato je da vezanje histon acetiltransferaze na ORCl (HBO1) pozitivno regulira započinjanje replikacije DNK. 32 Obustava HBO1 smanjuje sposobnost 3T3-L1 preadipocita da se diferenciraju u zrele adipocite inhibiranjem replikacije DNK i MCE. 33 Pored toga, ahidicolin i roskovitin, koji su inhibitori S-faze, blokiraju sintezu DNA, MCE i adipogenezu u procesu diferencijacije 3T3-L1 adipocita. 5, 6 Stoga, naši sadašnji rezultati zajedno s prethodnim izvješćima sugeriraju da je regulacija prijelaza G1 / S ključni korak u MCE. Ova hipoteza podržava ideju da replikacija DNA tijekom MCE povećava dostupnost promotora ili elemenata pojačivača faktorima potrebnim za transkripciju gena uključenih u pokretanje diferencijacije. 34

Kako je predloženo u ovoj studiji, Kdm4b služi kao faktor C / EBP β za regulaciju gena staničnog ciklusa. Da bi se dobio globalni osjećaj potencijalne suradnje C / EBP β i Kdm4b tijekom MCE, provedeno je pretraživačko mjesto za vezanje Kdm4b za cijelu promociju. Ova analiza identificirala je 379 Kdm4b vezanih regija u 20 sati nakon što su preadipociti 3T3-L1 inducirani na diferencijaciju (Dodatna tablica S6). Integrirajući podatke CIP-a na čipu C / EBP β i Kdm4b, za 101 regiju, koja odgovara 119 gena, pronađeno je da su zajednički okupirani C / EBP β i Kdm4b (dopunska slika S8 i tablica S7). Nadalje, 30 gena od 68 potencijalnih C / EBP β ciljnih gena je također bilo ciljano Kdm4b, uključujući četiri gena staničnog ciklusa opisana u ovoj studiji (dopunska tablica S8). Ranije smo izvijestili da histon H4, koji je uključen u skupljanje kromatina i potreban je za normalno napredovanje S faze, transaktivira C / EBP β tijekom MCE. 10 Intrigantno, histon H4 cilja i Kdm4b, kao što je prikazano u podacima ChIP-on-chip (Dopunska tablica S6 i tablica S8). Dosljedno, naša studija potvrđuje da Kdm4b pozitivno regulira ekspresiju histona H4 demetilacijom H3K9me3 na njegovom promotoru (dopunska slika S9). Prema tome, C / EBP β i Kdm4b ko-reguliraju ekspresiju gena staničnog ciklusa, kao i gene skupljanja kromatina, poput histona H4, da učinkovito promiču MCE.

Propadanje C / EBP β ili Kdm4b čini se da ne smanjuje proliferaciju pre-konfluentnih 3T3-L1 preadipocita (Slika 8). Ovo sugerira da C / EBP β i Kdm4b nisu opći regulatori stanične proliferacije, ali imaju specifične funkcije u određenim vrstama stanične proliferacije, uključujući MCE. Za razliku od snažnih promotorskih veza tijekom MCE, C / EBP β i Kdm4b se slabo vežu na promotore četiriju stanica staničnog ciklusa u pre konfluentnim stanicama 3T3-L1 (Slike 8c i d). Moguće je da su potrebni dodatni ko-faktori ili specifične posttralacijske modifikacije C / EBP β , koje bi mogle biti odsutne u prekonfliktnim 3T3-L1 stanicama, za učinkovito vezanje C / EBP β i Kdm4b na ove promotore tijekom MCE,

Zaključno, naši podaci pokazuju da C / EBP β transaktivira Kdm4b, koji regulira epigenetski potpis u C / EBP β vežućim regijama što dovodi do indukcije gena staničnog ciklusa i gena za skupljanje kromatina i tako promovira MCE (dopunska slika S7). Moguće je da uregulacijom Kdm4b, C / EBP β i Kdm4b formiraju regulatornu petlju za naprijed kako bi se olakšao MCE. To sugerira duboku ulogu C / EBP β u epigenetskoj kontroli MCE i nudi novi uvid u kritično djelovanje C / EBP β u proliferaciji određenih specifičnih tipova stanica.

Dodatna informacija

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica S1

  2. 2.

    Dopunska tablica S2

  3. 3.

    Dopunska tablica S3

  4. 4.

    Dopunska tablica S6

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska tablica S4

  2. 2.

    Dopunska tablica S5

  3. 3.

    Dopunska tablica S7

  4. 4.

    Dopunska tablica S8

  5. 5.

    Dopunska tablica S9-S11

  6. 6.

    Legende dopunskih tablica

  7. 7.

    Dopunske slikovne legende

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

  5. 5.

    Dopunska slika S5

  6. 6.

    Dopunska slika S6

  7. 7.

    Dopunska slika S7

  8. 8.

    Dopunska slika S8

  9. 9.

    Dopunska slika S9

Glosar

Cdc25C

ciklus stanične diobe 25 homolog c

Cdc45l

ciklus stanične diobe 45 homolog

C / EBP β

CCAAT / protein koji veže pojačivač β

C / EBP α

CCAAT pojačavač koji vezuje protein α

Čip

kromatinska imunoprecipitacija

EMSA

Analiza elektroforetske pokretljivosti

ER

estrogeni receptor

Gins1

GINS složena podjedinica 1

KRUG

jetra aktivatorski obogaćen jetrom

LIP

inhibitorni protein obogaćen jetrom

MCE

mitotička klonska ekspanzija

Mcm3

komponenta za održavanje mini-kromosoma 3

MEČ

mliječne epitelne stanice

PPAR γ

peroksisomski proliferacijski aktivirani receptor γ

RNAi

Smetnje RNA

TSS

početno mjesto transkripcije

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Death and Diferenciation (//www.nature.com/cdd)