Hipoksija potiče širenje matičnih stanica glioma pozitivnih na cd133 aktivacijom hif-1α | onkogena

Hipoksija potiče širenje matičnih stanica glioma pozitivnih na cd133 aktivacijom hif-1α | onkogena

Anonim

Sažetak

Hipoksija doprinosi napredovanju raznih vrsta karcinoma aktiviranjem adaptivnih transkripcijskih programa koji promiču preživljavanje stanica, pokretljivost i angiogenezu tumora. Iako je važnost hipoksije i naknadne aktivacije faktora-1α (HIF-1α) induciranog hipoksijom u angiogenezi tumora dobro poznata, njihova uloga u regulaciji matičnih stanica dobivenih gliomom nije jasna. U ovom istraživanju pokazujemo da hipoksija (1% kisika) potiče sposobnost samo-obnove CD133-pozitivnih matičnih stanica karcinoma dobivenih glioma (CSC). Širenje CSC-a izvedenih iz glioma u hipoksičnom okruženju također je dovelo do širenja stanica koje nose CXCR4 (CD184), CD44 niske i A2B5 površinske markere. Pojačanoj aktivnosti samo-obnove CD133 pozitivnih CSC-a u hipoksiji prethodila je regulacija HIF-1α. Srušenje HIF-1α ukidalo je hipoksiju posredovanu CS133-pozitivnu ekspanziju CSC-a. Inhibicija 3-kinaze fosfatidilinozitola (PI3K) -Akt ili ERK1 / 2 smanjila je hipoksijsku ekspanziju CD133, sugerirajući da ove signalne kaskade mogu modulirati hipoksični odgovor. Konačno, CSC-i koji se razmnožavaju hipoksijom snažno su zadržali nediferencirani fenotip, dok CSC-i uzgajali normoksiju nisu. Ovi rezultati sugeriraju da odgovor na hipoksiju od strane CSC uključuje aktiviranje HIF-la za pojačavanje aktivnosti samo-obnove CD133 pozitivnih stanica i inhibiciju indukcije diferencijacije CSC-a. Ova studija ilustrira važnost mikrookolje tumora u određivanju staničnog ponašanja.

Uvod

Smatra se da su gliomi, najčešći primarni tumor mozga, pokrenuli i održavali matične stanice karcinoma (CSC), populacija stanica sposobnih ekstenzivnog samoobnavljanja, diferencijacije u više rodova i rekapitulacije izvornog tumora kod imunodeficiranih miševa (Galli i sur., 2004; Singh i sur., 2004). Čini se da CSC-ovi imaju središnju ulogu u pokretanju i ponovnom nastanku tumora, sugerira se da definitivno liječenje raka treba ciljati na ovu populaciju stanica (Reya i sur., 2001; Pardal i sur., 2003; Bao i sur., 2006a; Vescovi i sur., 2006; Park i sur., 2007). Slično kao kod ostalih karcinoma, vjeruje se da su interakcije mikrookolista kritične u patogenezi i progresiji glioma (Calabrese i sur., 2007). Kako gliomageneza i naknadni rast tumora mogu dijelom biti posljedica aberrantne interakcije između karcinoma i tumorske niše, bolje razumijevanje mikroekoloških okoliša može dovesti do identifikacije novih terapijskih ciljeva (Pouyssegur i sur., 2006 Keith i Simon, 2007; Calabrese i sur., 2007). Pojašnjenje tumorske genske uloge mikrookoline može biti jednako važno koliko i razumijevanje mehanizama koji sudjeluju u staničnoj transformaciji. Slično uobičajenoj niši neuronskih matičnih stanica (NSC) u subventrikularnoj zoni, CSC mikrookruženje glioma može pružiti strogo regulirane signale potrebne za održavanje nediferenciranog stanja CSC-a, čuvajući na taj način njihov proliferativni i multipotencijalni kapacitet (Pouyssegur i sur., 2006 .; Keith i Simon, 2007).

Smatra se da proliferativnom fazom koja dovodi do širenja tumora upravlja mikrookolišna obilježja, uključujući regulaciju i dostupnost kisika i hranjivih sastojaka (Keith i Simon, 2007). Iako hipoksija može biti neizbježan ishod brzo rastućeg tumora koji nadilazi krvožilnu opskrbu, on daje određene prednosti tumorskim stanicama (Pouyssegur i sur., 2006). Na primjer, hipoksija čini tumorske stanice većom otpornošću na antikanceroterapiju poput zračenja. Stoga, faktori koji reguliraju hipoksično stanje predstavljaju potencijalne mete za liječenje protiv raka. Iako se zna da sposobnost samoobnove i nediferencirano stanje NSC-a pojačavaju hipoksijom (Gustafsson i sur., 2005; Chen i sur., 2007), takav je učinak na CSC-e nejasan. Jedan dobro karakteriziran mehanizam staničnog odgovora na smanjenu dostupnost kisika uključuje pojačanu ekspresiju faktora-induciranog hipoksijom (HIF-1α) (Semenza i Wang, 1992; Maxwell i sur., 1997; Carmeliet i sur., 1998 ). Pokazalo se da su HIF-1α potaknuti brojnim podražajima osim hipoksije, uključujući inzulin, inzulinu slične faktore rasta, epidermalni faktor rasta (EGF) i teške metale (Richard i sur., 1999; Zhong i sur., 2000; Fukuda i sur., 2002). Osim toga, sisavca meta rapamicina (mTOR), silaznog efektora PI3K puta, uključena je u hipoksičnu transdukciju signala i uključena je u regulaciju stabilizacije, akumulacije i aktivacije HIF-1α (Hudson i sur., 2002),

Ranije smo pokazali da EGF signalizacija potiče formiranje sfere i povećava sposobnost samoobnove CSC-a, uključujući CD133 pozitivnu pot-populaciju, pretpostavljeni marker gliomskih CSC-a (Soeda i sur., 2008). U ovom istraživanju ispitali smo ulogu hipoksije i naknadne aktivacije HIF-1α u samoobnavljanju CSC-a izvedenih iz glioma. Učinak hipoksije na CSC karakterizirala je površinska ekspresija stabljike / porijekla i ostale markere, uključujući CD133, CD44, A2B5, CD24 i CXCR4 (CD184). Također smo istražili regulaciju HIF-1α po PI3K-Akt-mTOR i ERK / MAPK putovima u CSC-ima izvedenim od glioma. Nadalje, karakterizirali smo stanje diferencijacije i multipotencijalne kapacitete CSC-a u normoksičnim i hipoksičnim uvjetima. Naši podaci sugeriraju da hipoksija potiče samo-obnavljanje i proliferaciju CSC-a izvedenih iz glioma čovjeka, dijelom aktivacijom HIF-1α, a da normoksija potiče diferencijaciju i ograničava samo-obnovu CSC-a.

Rezultati

Hipoksija povećava CD133 + CSC samoobnovu i proliferaciju

Svi su pokusi izvedeni s prethodno utvrđenim CSC linijama koje su dobivene od malignog glioma, iz svježe resetiranih uzoraka kirurga, prema protokolu koji je odobrilo lokalno institucionalno tijelo za reviziju (Oka i sur., 2007; Soeda i sur., 2008). Ove CSC linije izražavaju markere nediferenciranog fenotipa, pokazuju samoobnovu i multipotentne su. Ove stanice eksprimiraju markere neuronskog stabljike / potomstva poput nestina, musashi-1 i CD133 u prisutnosti EGF-a u mediju bez seruma. Transplantacija 100-1000 CD133 pozitivnih stanica u mozak imunodeficiranih miševa rekapitulira izvorni tumor (Oka i sur., 2007). Te stanice također izražavaju markere neuronskih, astrocitnih i oligodendroglialnih loza u serumu koji sadrži diferencijacijski medij (dopunska slika 1). Kapaciteti ovih stanica za samoobnavljanje određene su korištenjem modificiranog testa za oblikovanje sfere (Soeda i sur., 2008). U hipoksičnom stanju (1% kisika) sposobnosti spuštanja disociranih pojedinih stanica u sferi su izrazito porasle u usporedbi s normoksijom (Slika 1a). Analiza omjera CD133 + / CD133 pokazala je da hipoksija preferirano proširuje CD133 + CSC na vremenski ovisan način (Slike 1b-d).

Image

Hipoksija potiče samoobnovu matičnih stanica karcinoma glioma (CSC). ( a ) Analiza formiranja sfere pokazuje da se sposobnost samo-obnove CSC-a povećava kada se inkubira na 1% kisika (hipoksija) u usporedbi s 20% kisika. CSC kultivirani u mediju bez seruma koji je dodan epidermalnom faktoru rasta (20 ng / ml) inkubirali su se 5 dana. S lijeve strane, slika stanica u reprezentativnom bunaru snimljena je faznom kontrastnom mikroskopijom. S desne strane, X osi grafikona označava različite CSC linije, a osi Y označava broj prisutnih sfera. Upotrebom formata ploče od 24 jažice, na ploču je posijano tisuću stanica u mediju od 2 ml, a broj sfera brojao se nakon 5 dana. Rezultati prikazani na grafu su prosječni ± sd iz tri pokusa. * P <0, 05, bar = 100 µm. ( b ) Relativni broj CD133 pozitivnih stanica povećava se kao odgovor na hipoksiju. Grafikon prikazuje relativno širenje CD133 pozitivnih stanica određeno kao omjer CD133 pozitivnih stanica i CD133 negativnih stanica u hipoksiji u odnosu na normoksiju u različitim vremenskim točkama. Povećavajući omjer podrazumijeva specifično širenje CD133 pozitivnih stanica, a ne nespecifično širenje zbog ukupnog povećanja ukupnog broja stanica. ( c ) Reprezentativni imunoblot za liniju X01 CSC pokazuje povećanje ekspresije ukupne razine proteina CD133 na vrijeme ovisan o hipoksiji. ( d ) Reprezentativni fluorescentno aktivirani stanični sortiranje histograma za liniju X01CSC pokazuje širenje CD133 pozitivnih stanica u hipoksiji.

Slika pune veličine

Hipoksija potiče ekspresiju HIF-1 α i vaskularnog endotelnog faktora rasta

Budući da je HIF-1a važna molekula u odgovoru stanica na hipoksiju, pretpostavili smo da hipoksija može pospješiti samo obnavljanje CD133 pozitivnih CSC stabiliziranjem ekspresije HIF-1α. Da bismo testirali ovu hipotezu, kultivirali smo tumorske sfere u hipoksiji i odredili ekspresiju HIF-lα Western blot-om (slika 2a). U stanju 1% kisika opažen je HIF-lα u roku od 2 sata. Zanimljivo je da nije bilo razlike u izražavanju HIF-2α. Kako je vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) važan parakrinski faktor rasta koji je uključen u angiogeni odgovor na HIF-1α, odredili smo razinu VEGF-a pri normoksiji i hipoksiji. Nakon izloženosti hipoksiji tijekom 72 sata, razine VEGF-a bile su gotovo trostruko veće kod hipoksije. Zanimljivo je da CSC-ovi dobiveni iz glioma stupnja III (X03) stvaraju manje VEGF-a u usporedbi s CSC-ovima stupnja IV (X01 i X02).

Image

Izražavajući faktor-1α (HIF-1α) hipoksiju i faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF) u hipoksičnom stanju. ( a ) Razina ekspresije HIF-1α vidi se kod hipoksije na način ovisan o vremenu. Izraz HIF-2α izgleda stabilan i nije pod utjecajem napetosti kisika u liniji matičnih stanica X01 raka (CSC). ( b ) Hipoksija potiče proizvodnju VEGF-a pomoću CSC-a. Rezultati prikazani na grafu su prosječni ± sd iz tri pokusa. * P <0, 05. ( c ) Tretiranje CSC-a s malom interferirajućom RNA (siRNA) HIF-1α ukida indukciju HIF-lα proteina kao odgovor na hipoksiju i smanjuje CD133 ekspresiju. Susjedni graf s desne strane pokazuje da iscrpljivanje HIF-1α dovodi do snažnog smanjenja kapaciteta za formiranje sfere. Podaci su iz reprezentativnih pokusa ponovljenih tri puta. ( d ) Iscrpljivanje proteina 2-PH (PHD2) koji sadrži domenu prolil hidroksilaze inducira ekspresiju HIF-la na normoksiji, ali ne pokazuje pojačano stvaranje sfere. Inhibicija PHD2 sa siPHD2 pri sobnoj napetosti kisika rezultira niskom ekspresijom HIF-la. Međutim, nema značajne razlike u formiranju sfera. ( e i f ) Iscrpljivanje niti HIF-2α, niti Notch1 ne utječe na sposobnost formiranja sfere.

Slika pune veličine

Koristili smo prolazni "knockdown" pristup kako bismo dodatno istražili ulogu HIF-1α, HIF-2α, proteina-2 (PHD2) koji sadrži domen prolil hidroksilaze i Notch1 u promicanju sposobnosti formiranja sfere glioma CSC-a. Transfekcija CSC-a koja se razmnožava u hipoksiji s HIF-1α malom interferirajućom RNA (siRNA) ukinula je ekspresiju HIF-la i smanjila CD133-pozitivnu pod-populaciju (Slika 2c). To je također rezultiralo inhibicijom formiranja sfera (slika 2c). Eksperiment s iscrpljivanjem HIF-1α izveden na normoksiji nije imao utjecaja na sposobnost formiranja CSC sfere (podaci nisu prikazani). Osiromašenje PHD2 kod normoksije rezultiralo je slabom ekspresijom HIF-lα (slika 2d). Međutim, to nije dovelo do značajne razlike u formiranju sfera. Iscrpljivanje HIF-2α i Notch1 također nije pokazalo razliku u sposobnosti formiranja sfere (slike 2e i f). Ovi podaci sugeriraju da je za X01, X02 i X03 CSC linije hipoksija snažan induktor ekspresije HIF-1α i da HIF-1α ima kritičnu ulogu u samoobnavljanju posredovanom hipoksijom.

Ekspresija HIF-1α uzrokovana hipoksijom pojačana je signalnim putem EGFR

Signalizacija receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR) važna je za preživljavanje i rast stanica glioma. Ranije smo pokazali da topljivi EGF povećava sposobnost samo-obnove CD133-pozitivnih CSC-ova na način ovisan o dozi. Da bi se odredio kombinirani učinak signalizacije hipoksije i EGFR-a, rekombinantni EGF dodan je CSC-ima razmnoženim normoksijom i hipoksijom. Dodavanje EGF-a CSC-u normoksije nije imalo utjecaja na HIF-1α. Međutim, EGF je bio u mogućnosti daljnjeg pojačavanja hipoksije izazvane ekspresije HIF-1a, sugerirajući da EGFR signalizacija može imati potencijal povećati hipoksiju posredovanu sposobnost CSC samo-obnove (slika 3a). Ipak, u nedostatku egzogenog EGF-a, samo je hipoksija bila u stanju proširiti CD133-pozitivne CSC-e (Slika 3b). Ova zapažanja sugeriraju prisutnost unakrsnog razgovora između hipoksičnog odgovora i EGFR signalizacije, ali potonje nije potrebno za hipoksiju izazvanu ekspanziju CD133 pozitivnih CSC-a.

Image

Indukcija hipoksije-induciranog faktora-α (HIF-1α) hipoksijom pojačana je signalizacijom receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), ali nije potrebna. ( a ) HIF-lα proteini analizirani su pokusima zapadnog blotiranja s različitim koncentracijama EGF-a (0, 20, 100 ng / ml) kod normoksije i hipoksije. ( b ) Analiza razvrstavanja stanica aktiviranim fluorescencijom pokazuje da je hipoksija sposobna proširiti matičnu stanicu karcinoma pozitivne na CD133 (linija X01) u odsustvu egzogenog EGF liganda. Podaci su iz reprezentativnih pokusa ponovljenih tri puta.

Slika pune veličine

PI3K / Akt / mTOR i ERK putevi međusobno djeluju signalom hipoksije

Hipoksija je sposobna stimulirati ključne signalne putove aktivirane u matičnim stanicama i raku (Keith i Simon, 2007). U nedostatku egzogenog EGF-a, samo je hipoksija bila dovoljna za aktiviranje PI3K i MAPK staza u CSC-ima povećavanjem fosforilacije Akt, ERK i p70S6-kinaze (Slika 4a). Za daljnje karakteriziranje unakrsnog razgovora između faktora rasta i signalnih putova hipoksije u CSC-ima izvedenim od glioma, stanice uzgajane kod hipoksije bile su izložene različitim inhibitorima: inhibitoru PI3K (LY294002), inhibitoru ERK (PD98059) i mTOR inhibitoru (rapamicin). Stanice su prethodno tretirane s inhibitorima 2 sata prije stavljanja u okruženje s 1% kisika. Hipoksičnu indukciju HIF-1a ovi su inhibitori ublažili (Slika 4b). Konačno, istražili smo učinak takvih inhibitora na širenje CSC-pozitivnog CS133-pozitivnog hipoksije. Inhibicija PI3K i ERK staza neovisno je ukinula HIF-lα-posredovanu ekspanziju CD133-pozitivnih CSC-a (Slika 4c). Ovi podaci sugeriraju da inhibicija signalnog puta faktora rasta može umanjiti hipoksiju uzrokovanu ekspanziju CD133 pozitivnih CSC-a.

Image

Hipoksični stanični odgovor djeluje na signalni put faktora rasta. ( a ) U nedostatku egzogenog EGF liganda, hipoksija povećava fosforilaciju p70S6K, Akt i ERK. ( b ) Hipoksičnu indukciju faktora-hipo-induciranog hipoksijom (HIF-1α) smanjuju inhibitori signalnog puta faktora rasta. Matične stanice karcinoma (CSC) prethodno su tretirane s LY294002-10 μM (LY), PD98059-20 μM (PD) i rapamicinom-5 μM (Rap) 2 sata prije 2 sata inkubacije u hipoksičnom okruženju. Inhibitori signalizacije faktora rasta potiskuju ekspresiju HIF-1α pod hipoksijom. Podaci su iz X01 CSC linijskog eksperimenta, ponovljenog najmanje tri puta. ( c ) Inhibicija PI3K i ERK staza neovisno suzbija hipoksiju posredovanu ekspanziju CD133 pozitivnih CSC-a. Ukupni broj CD133 pozitivnih CSC-a na 20% kisika, 1% kisika i izloženosti LY294002 (LY; 1 μM), PD98059 (PD; 1 μM) i Rapamicinu (Rap; 0, 5 μM) određen je analiza točaka točke sortiranja fluorescencije koja se aktivira. Podaci su iz X03 CSC eksperimentalnog eksperimenta, ponovljenog najmanje tri puta.

Slika pune veličine

Širenje hipoksije proširuje CD133 / CXCR4 / CD44 niske / A2B5 / CD24 pozitivne stanice

Da bismo dalje karakterizirali fenotip CS podpopulacije koji pokazuje ekspanziju pri smanjenom kisiku, izveli smo analizu stanica sortiranja CSC-a fluorescencijom s nizom površinskih markera povezanih sa stabljikom / progenitorima i stanicama raka. Ispitan je utjecaj hipoksije na različite izraze CD133, CXCR4 (CD184), CD44, A2B5 i CD24. Razmnožavanje kod hipoksije dovelo je do povećanja broja stanica koje nose CXCR4, CD44 nisko, A2B5 i CD24, uz smanjenje CD44 visoko- ekspresivnih stanica (Slike 5a-c). Analiza točkastih parcela staničnih sortiranja aktivirana fluorescencijom pokazuje ukupno smanjenje udjela CD44-pozitivnih stanica i povećanje CD133- i CXCR4-pozitivnih stanica s izloženošću hipoksiji (Slika 5d). Ovi rezultati pokazuju da hipoksija preferirano proširuje CD133 / CXCR4 / CD44 nisku / A2B5 / CD24-pozitivnu pod-populaciju CSC-a.

Image

Hypoxia proširuje CD133-pozitivne stanice obogaćene za CXCR4, CD44 low, A2B5 i CD24 površinske markere. ( a ) Linije matičnih stanica karcinoma (CSC) pokazuju statistički značajno širenje CXCR4 pod hipoksijom. Liniji X01 pokazali su značajno širenje CD44 nisko, a X02GB statistički značajno širenje CD24. ( b ) Reprezentativni histogram za sortiranje stanica koji aktivira fluorescenciju (FACS) za X02GB CSC pokazuje ekspanziju CXCR4-pozitivnih stanica u hipoksiji. ( c ) Reprezentativni FACS histogram za X01GB CSC pokazuje ekspanziju CD44 s niskom hipoksijom. ( d ) Reprezentativna analiza točaka FACS-a za X03AOA CSC pokazuje da hipoksija rezultira porastom broja CXCR4 i CD133. Stanice izložene hipoksičnom okruženju tokom 48 sati fiksirane su i analizirane FACS. Podaci su iz reprezentativnih pokusa ponovljenih najmanje tri puta.

Slika pune veličine

Hipoksija inhibira diferencijaciju CSC-a

Da bismo odredili ulogu hipoksije u održavanju nediferenciranog stanja, uspoređivali smo fenotip CSC-a koji se propagiraju uz različite napetosti kisika. Stanice posađene u gustoći od 1000 / cm2 pod različitim uvjetima analizirane su indirektnom imunofluorescentnom mikroskopijom koristeći dva markera ograničena na liniju: glialni fibrilarni kiseli protein (astrocit) i Tuj-1 (neuronal). Veći broj stanica bio je prisutan (gotovo dvostruko) kod hipoksije nego kod normoksije. Pored toga, broj stanica koje eksprimiraju diferencijacijske markere značajno je smanjen u stanicama koje razmnožavaju u hipoksiji u odnosu na CSC koji su kultivirani u normoksiji (Slike 6a-b). Ovi podaci pokazuju da hipoksija potiče proliferaciju CSC-a i održava njihov nediferencirani fenotip.

Image

Hipoksija održava nediferencirane matične stanice karcinoma (CSC). ( a ) Normoksija potiče diferencijaciju CSC-a glioma. Reprezentativne kolonije obojene su glialnim fibrilarnim kiselinskim proteinima (GFAP) (astrocitski marker) i Tuj1 (neuronski marker) pod napetostima od 20 i 1% kisika sa medijem dopunjenim 10% serumom. Bar = 50 μm. ( b ) Broj stanica koje izražavaju markere ograničene na rodove izrazito je smanjen u stanicama koje razmnožavaju u hipoksiji u usporedbi s normoksijom. Rezultati prikazani na grafu su prosječni ± sd iz tri pokusa. * P <0, 05.

Slika pune veličine

Rasprava

Određivanje mehanizama za mikroko okruženje koje potiču rast će poboljšati naše razumijevanje biologije raka i možda identificirati nove terapijske pristupe. U ovom istraživanju istraživali smo ulogu hipoksije u održavanju i rastu CSC-a glioma i pokušali identificirati potencijalni mehanizam. Otkrili smo da hipoksija daje prednost rasta CSC-ovima promičući samoobnovu CD133 pozitivnih stanica putem mehanizma ovisnog o HIF-1α i dodatno pridonosi tumorskoj patogenezi održavanjem CSC-a u nediferenciranom stanju.

Rast CSC-a u hipoksiji

Neuralne matične stanice reguliraju se izvanstaničnim mikrookološkim znakovima za održavanje sposobnosti samoobnove i nediferenciranog stanja (Wurmser i sur., 2004). Nedavna istraživanja impliciraju napetost kisika kao ključni regulator metaboličkog stanja NSC-a, preživljavanja i sudbine (Gustafsson i sur., 2005; Chen i sur., 2007). Da su tumori hipoksični, dobro je poznato, ali razlozi su manje jasni. Većina solidnih tumora, uključujući gliome, dobro je vaskularizirana i njihov rast ovisi o vaskularnoj formaciji (Louis i sur., 2007). To je temeljni princip koji stoji iza strategije antiangiogeneze u terapiji raka (Folkman, 1971). Razvoj tumora karakterizira početna faza brzog širenja, nakon čega slijedi razdoblje usporenog rasta, jer proliferirajuće tumorske stanice nadmašuju lokalnu opskrbu kisikom i hranjivim tvarima (Louis i sur., 2007). Iako mnoge tumorske stanice reagiraju na ovaj metabolički stres indukcijom apoptotičkog mehanizma, neke će se stanice moći nositi s tim stresom kroz promjene u staničnom metabolizmu (Li et al., 2004). Te stanice mogu naknadno potaknuti neovaskularizaciju i pridonijeti daljnjem rastu tumora (Zagzag i sur., 2000; Bao i sur., 2006b; Oka i sur., 2009). Hipoksija također pridonosi rastu tumora promjenom metaboličkog stanja stanica, što rezultira proizvodnjom makromolekula potrebnih za staničnu proliferaciju (DeBerardinis i sur., 2008). U hipoksičnom okruženju, tumorske stanice se više oslanjaju na glikolizu za proizvodnju energije bez potpune oksidacije intermedijara. Drugo tumorigensko svojstvo hipoksije je aktiviranje specifičnih putova i faktora transkripcije koji kontroliraju matične stanice, poput Notch i Oct4 (Gustafsson i sur., 2005; Covello i sur., 2006). Hipoksično okruženje može biti pogodnije za odabir CSC-a koji održavaju tumor aktiviranjem specifičnih ranih razvojnih programa. Kao takva, hipoksija je korištena kao uzročni mehanizam slabog odgovora glioma na zračenje.

Da bismo istražili daje li hipoksija rastnu prednost CSC-ima koji iniciraju gliom, uspoređivali smo rast stanica koje se razmnožavaju pod hipoksijom i normoksijom. Kapaciteti samoobnove bili su nevjerojatno viši pod hipoksijom u usporedbi s normoksijom, a hipoksično okruženje povezano je sa smanjenjem ekspresije markera koji ukazuju na diferencijaciju. Niska kisikova napetost preferirano je proširila CD133 pozitivnu pod-populaciju. Da bismo dalje karakterizirali ove stanice odgovora na hipoksiju, istražili smo ekspresiju različitih površinskih markera analizom razvrstavanja stanica aktiviranim fluorescencijom. CD133-pozitivne stanice pokazuju pojačanu ekspresiju CXCR4, A2B5 i CD24. CXCR4 je hemokinski receptor uključen u migraciju NSC-a, a uključen je u invaziju glioma i metastaze CSC-a gušterače (Ehtesham i sur., 2004; Hermann i sur., 2007). Intrigantno je da hipoksija može proširiti stanice s pojačanim infiltrativnim svojstvom. A2B5, marker stanične površinske gangliozidnog glijalnog potomstva, navodni je marker CSC-a također povezan s rekapitulacijom tumora na ksenografima (Ogden i sur., 2008). Konačno, visoke razine ekspresije CD24 korištene su za identificiranje stanica koje pojačavaju tranzit, kao i diferencirane neurone, a CD24 je potreban za terminalnu diferencijaciju neuronskih progenista (Nieoullon i sur., 2005; Panchision i sur., 2007). Hipoksija daje prednost porastu gliomskih CSC pojačavanjem izrazite pod-populacije nediferenciranih CD133 pozitivnih stanica obogaćenih za površinske markere CXCR4, A2B5 i CD24.

Mehanizam rasta posredovan HIF-1α

I normalne i tumorske stanice reagiraju na smanjenje napetosti u okolišnom kisiku povećanjem ekspresije HIF molekula. HIF-ovi, članovi faktora transkripcije bazični-helix-loop-helix, su heterodimeri α- i β-podjedinice (Wang i Semenza, 1993; Wang i sur., 1995). Iako je β-podjedinica konstitutivno izražena, α-podjedinica se stabilizira samo pri niskoj napetosti kisika. Kod normoksije, α-podjedinica se podvrgava prolil hidroksilaciji i ciljano je razgraditi proteinom koji supresionira von Hippel-Lindau (Iliopoulos i sur., 1996; Semenza, 2003). Hipoksična mikrookolina tumora rezultira promjenama u metabolizmu, angiogenezi i preživljavanju stanica koje orkestriraju HIF-1α, a ovisno o specifičnosti tkiva i HIF-2α (Keith i Simon, 2007). I HIF-la i HIF-2α potiču ekspresiju gena koji su uključeni u angiogenezu, dok prvi također aktivira transkripciju gena glikolitičkog enzima za sintezu adenosin trifosfata na neovisan kisik način (Keith i Simon, 2007). Druga razlika između dva HIF-a je u tome što je HIF-2α sposoban aktivirati gene koji kodiraju transformirajući faktor rasta-α i ciklin D1 i poboljšavajući funkciju c-Myc u karcinomima bubrežnih stanica (Raval i sur., 2005; Gordan i sur., 2007). Iako je funkcionalna dinamika između dva HIF-a vjerojatno specifična za tkivo, tumorske stanice ovise o rastu i napredovanju programa ekspresije gena koji upravljaju tim faktorima adaptivne transkripcije. Kako je tumorsko tkivo heterogeno sa hipoksičnim tumorskim stanicama u neposrednoj blizini tumorskih stanica izloženih većoj napetosti kisikom, povećana sekrecija faktora rasta pomoću hipoksičnih stanica može inducirati proliferativnu aktivnost susjednih stanica. Prisutnost HIF-a povezana je s lošim ishodom u nizu različitih neoplazmi (Birner i sur., 2000; Aebersold i sur., 2001; Semenza, 2003; Shimogai i sur., 2008; Li i sur., 2009).

U slučaju da je stabilizacija HIF-a glavni učinak hipoksičnog odgovora, pretpostavili smo HIF-posrednički mehanizam za širenje CD133 pozitivnih stanica obogaćenih za površinske markere CXCR4, A2B5 i CD24 kod hipoksije. Otkriven je HIF-1α u stanicama razmnožanih pri niskoj napetosti kisika, a iscrpljivanje HIF-1α dovelo je do značajnog smanjenja kapaciteta formiranja sfere svih triju gliomskih CSC linija. Da bismo dalje utvrdili vezu između HIF-1α ekspresije i poboljšanog samo-obnavljanja gliomskih CSC-a, izveli smo PHD2 knockdown eksperimente u normoksičnim uvjetima. Iako je iscrpljivanje PHD2 dovelo do ekspresije HIF-1α na niskoj razini kod normoksije, nije bilo učinka na samo-obnavljanje CSC-a, kako je procijenjeno formiranjem sfere. Kako je razina ekspresije HIF-1α na 1% kisika značajno veća od one koja se vidi kod ispadanja PHD2, nagađamo da s CSC linijama koje smo proučavali, sam PHD2 pristupni obračun može biti nedovoljan u poticanju odgovarajućeg HIF-1α za promicanje samo- aktivnost obnove. Kombinirano iscrpljivanje i PHD2 i HIF-1 koji inhibira faktor može biti potrebno kako bi se zadržao dovoljan HIF-lα kod normoksije.

Zanimljivo je da je oborenje HIF-1α upotrebom siRNA pokazalo nepotpuno smanjenje CD133 pozitivnih stanica. Čak i uz potpunu inaktivaciju HIF-1α kako je vidio imunoblot, vidljivo je suptilno širenje CD133 pozitivnih stanica. Ovo sugerira prisutnost drugog mehanizma za proširivanje CS133 pozitivnog CSC-a uzrokovanog hipoksijom, različitog od HIF-1α. Kako je raniji rad s karcinomom bubrežnih stanica pokazao da HIF-2α regulira transformirajući faktor rasta-α, ciklin D1 i c-Myc, razmotrili smo mogućnost da oba faktora mogu pridonijeti hipoksiji uzrokovanoj ekspanziji CD133 pozitivnih CSC-a (Raval et al., 2005; Gordan i sur., 2007). Međutim, nismo otkrili promjene u razini HIF-2α, u CSC-ima koji su kultivirani s različitim napetostima kisika. Nadalje, studije o iscrpljivanju HIF-2α nisu uspjele pokazati promjene u sposobnosti samoobnove CSC-a. Iako to ne isključuje definitivno odgovor HIF-2α u gliomskim CSC linijama koje smo proučavali, to ipak pokazuje važnost određivanja regionalnih tkivnih mehanizama specifičnih za tumor. Također, ranije je objavljeno da će Notch signalizacija biti potrebna za održavanje matičnih stanica posredovanih hipoksijom (Gustafsson i sur., 2005). Osiromašenje specifično za1 nije smanjilo kapacitet formiranja sfere triju CSC linija koje su ovdje proučavane.

Faktor rasta i hipoksična signalizacija

Konvergencija signalnih puteva potaknuta faktorima rasta i hipoksije dobro je opisana (Pouyssegur i sur., 2006). Aktivacija receptora faktora rasta dovodi do povećanja HIF ekspresije, što naknadno pojačava ekspresiju VEGF. Još čvršće spajanje opaženo je u matičnim stanicama hematopoeze; ove stanice nisu u stanju eksprimirati HIF-1α mRNA u nedostatku aktivacije receptora faktora rasta, a HIF-lα ovisan o faktoru rasta uključen je u određivanje sudbine unutarćelijske glukoze (Lum i sur., 2007). Takva zapažanja sugeriraju da HIF-ovi surađuju s signalizacijom faktora rasta u upravljanju staničnim metabolizmom.

Primijetili smo mitogeni učinak reduciranog kisika na CSC-ove glioma koji se automatski obnavlja. Da bismo istražili prisutnost i značaj unakrsnog razgovora između hipoksične signalizacije i signalizacije faktora rasta u gliomskim CSC-ima, ispitivali smo mehanizme signalizacije PI3K i MAPK. Kao što su ranije izvijestile druge skupine, otkrili smo da je hipoksija sposobna pojačati aktivaciju signalnih putova faktora rasta (Alvarez-Tejado i sur., 2001; Xu i sur., 2004). Nadalje, blokiranje ovih putova rezultiralo je prigušivanjem hipoksične indukcije HIF-1α pomoću gliomskih CSC-a. Ranije je pokazano da aktiviranje PI3K puta nije potrebno ni dovoljno za samu transkripciju gena ovisnih o HIF-1α (Arsham et al., 2002). Naše iskustvo s CSC-ima izvedenim od glioma sugerira da doista nije potrebna aktivacija PI3K putanje za indukciju HIF-1α, ali signalizacija faktora rasta može pojačati takvu indukciju u hipoksičnim uvjetima. Takva opažanja sugeriraju da je specifični stanični odgovor na hipoksiju specifičan za tkivni ili stanični tip. Čvrsta ovisnost stanica glioma o signalnim putovima faktora rasta može povezati hipoksiju i ove staze u gliomima još prisnije.

Naša otkrića ukazuju da hipoksija doprinosi rastu tumora glioma pojačanom samoobnavljanjem i održavanjem nediferenciranog stanja podskupina populacija CSC. Nadalje predlaže regulaciju ovisnosti o fenotipu CSC koji ovisi o kontekstu. Zanimljivo je da se signalni putovi faktora rasta samo djelomično preklapaju s signalnim odgovorom posredovanim hipoksijom. To sugerira važnost potpunog karakteriziranja mehanizama signalizacije hipoksije u CSC-ima izvedenim od glioma, jer ciljanje putanje faktora rasta hipoksije i signalne kaskade specifične za hipoksiju može pružiti poboljšane terapijske mogućnosti za liječenje zloćudnih glioma.

Materijali i metode

Uzorak tkiva

Ustanovljene su tri CSC linije iz akutno reseciranih tkiva ljudskog tumora. Linija X01 izvedena je od žene s multiformnim glioblastomom. X02 linija potječe od čovjeka s multiformnim glioblastomom. X03 je izveden od žene s anaplastičnim oligoastrocitomom.

Stanična kultura

Kulture tumorske sfere izvedene su kao što je opisano ranije, s nekim modifikacijama, u mediju koji sadrži Dulbeccovo modificirano Eagljevo sredstvo-F12 (Gibco-Invitrogen, La Jolla, Kalifornija, SAD), penicilin G, streptomicin sulfat, B-27 (Gibco-Invitrogen) i rekombinantni humani EGF (20 ng / ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) (Singh i sur., 2004; Oka i sur., 2007; Soeda i sur., 2008). Stanice su kultivirane u HERAcell inkubatorima (Thermo Electronic Corporation, Asheville, NC, SAD) na 37 ° C, 95% relativne vlage i 5% CO2 u uvjetima 20% kisika ili 1% kisika.

Analiza razvrstavanja stanica aktiviranim fluorescencijom

Da bi se karakterizirali učinci hipoksije na CD133-pozitivnu potpopulaciju CSC koja se razmnožava kao sfere, 1x106 stanice smještene su u proliferacijski medij koji sadrži EGF. Nakon 12–72 h, stanice su procijenjene na Coulter EPICS citometru (Beckman Coulter, Fullerton, CA, SAD). Da bi se dalje karakterizirao učinak hipoksije na CSC-ove, svaki je uzorak označen fikoeritrinom konjugiranim anti-humanim CXCR4, CD44, CD24 (BD bioznanosti, San Jose, CA, SAD), CD133 / 1 konjugiranim s fikoetrininom (AC133) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, SAD) ili A2B5 (Miltenyi Biotec) s fikoeritrin-sekundarnim antitijelom (BD Biosciences) prema preporukama proizvođača. Korištene su odgovarajuće kontrole nadoknade i izotipa. Svi su pokusi izvedeni u trojkama.

Western blotting

Analize Western blotta izvedene su kako je ranije opisano (Soeda i sur., 2008). Korištena su sljedeća antitijela: CD133 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, SAD), HIF-1α (BD Biosciences), HIF2-α (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD), fosfo-EGFR (P-Tyr1068, tehnologija stanične signalizacije), Akt (tehnologija stanične signalizacije), ERK1 / 2 (tehnologija stanične signalizacije), fosfo-ERK1 / 2 (P-Thr202 / Tyr204, tehnologija ćelijskog signalizacije), fosfo-p70S6 kinaza (Thr-389, tehnologija stanične signalizacije), PHD2 (tehnologija staničnog signalizacije) i Notch1 (tehnologija staničnog signalizacije). Ukratko, tumorske sfere lizirane su u puferu koji se sastojao od 20 m M Tris-HCl (pH 7, 4, 150 m M NaCl, 1 m M EGTA, 1% triton X-100, 2, 5 m M natrijevog pirofosfata, 1 m M β-glicerola fosfat, 1 m M Na3 VO 4, 1 μg / ml leupeptina i 1 m M fenilmetilsulfonil fluorida). Nakon kratkog soniranja, lizati su pročišćeni centrifugiranjem na 12 000 × g 10 min na 4 ° C, a sadržaj proteina u supernatantu je izmjeren prema Bradford metodi. Alikvoti (30–50 µg proteina po stazi) ukupnog proteina razdvojeni su 7, 5–15% SDS – poliakrilamid gel elektroforezom i izbrisani na membrane za prijenos nitroceluloze (0, 2 µm; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Velika Britanija). Svaka membrana je bila blokirana 5% nemasnim suhim mlijekom u TBS-T (20 m M Tris-HCl, pH 7, 6, 137 m M NaCl i 0, 01% Tween-20) 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi inkubacija sa odgovarajuća primarna antitijela preko noći na 4 ° C. Nakon opsežnog ispiranja s TBS-T, svaka membrana se dalje inkubira 1 h u sobi sa sekundarnim antitijelom konjugiranim peroksidazom iz hrena, miševima ili kozjim kozama (1: 1000) temperatura u TBS-T koja sadrži 5% nemasnog suhog mlijeka. Detekcija je izvedena korištenjem pojačanog hemiluminiscencijskog reagensa (Amersham Biosciences), prema protokolu proizvođača.

Enzimski imunosorbentni test

Razine proteina vaskularnog endotelnog faktora rasta određene su imunološkim testom vezanim za enzim, provedenim s Quantikin imunotestarom za ljudski VEGF (R&D sustavi), prema uputama proizvođača. CSC-i (10 6 ) su disocirani u pojedinačne stanice i prebačeni su u tikvice kulture T75 Falcon s suspenzijskim medijem koji sadrži EGF pri različitim napetostima kisika. Nakon 72 h inkubacije, supernatanti su odmah upotrijebljeni ili zamrznuti na -20 ° C dok nisu obrađeni. Svi su pokusi izvedeni u trojkama.

Indirektna imunofluorescentna mikroskopija

Imunocitokemija CSC-a izvedena je kako je opisano (Oka i sur., 2007; Park i sur., 2007). Primarna protutijela koja su korištena su sljedeća: anti-β-III-tubulin (Tuj1; mišji mAb, 1: 200; Chemicon, Temecula, CA, SAD) i anti-glialni fibrilarni kiselinski protein (GFAP; zečji pAb, 1: 500; DAKO, Glostrup, Danska). Upotrijebljena su sekundarna antitijela Alexa Fluor 488 i 555 (1: 1000; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Stanice su suprotstavljene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolu. Upotrijebljen je sljedeći hardver: mikroskop Zeiss Axiovert 200 (Carl Zeiss, Gottingen, Njemačka), Plan-Neofluar × 20 i × 40 ciljeva, AxioCam MrM CCD kamera. Za snimanje slika korišten je softver Axiovision (Carl Zeiss).

Smetnje RNA

Faktor-1α, HIF-2α, PHD2 i Notchl siRNA oligonukleotidi inducirani hipoksijom komercijalno su dobiveni (Santa Cruz Biotechnology). Prethodno dizajnirana siRNA usmjerena protiv zelenog fluorescentnog proteina korištena je kao kontrola. Dan prije transfekcije, 5x106 CSC disocira se u pojedinačne stanice i prebaci u T25 Falcon tikvice za kulturu sa suspenzijskim medijem koji sadrži EGF. Stanice su zatim transficirane siRNA uporabom nukleofektirajućeg elektropotora prema protokolu proizvođača (Amaxa Inc., Gaithersburg, MD, USA). Nakon 24 sata, medij je zamijenjen i stanice su sakupljene za dodatne eksperimente.

Statistička analiza

Razlike u različitim izrazima tvornika površine između normoksije i hipoksije ocijenjene su Studentovim t- testom. P- vrijednost manja od 0, 05 smatrala se statistički značajnom.

Sukob interesa

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska slikovna legenda

    Dodatne informacije prate rad na web stranici Oncogene (//www.nature.com/onc)