Inhibicija autofagijskih senzibilizira maligne stanice plevralnog mezotelioma na dualne inhibitore pi3k / mtor | stanična smrt i bolest

Inhibicija autofagijskih senzibilizira maligne stanice plevralnog mezotelioma na dualne inhibitore pi3k / mtor | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • autophagy
  • Terapijska otpornost na rak
  • Stanična signalizacija
  • Mesothelioma

Sažetak

Maligni pleuralni mezoteliom (MPM) potječe u većini slučajeva od kronične upale mesotheliuma zbog izloženosti azbestnim vlaknima. S obzirom na ograničeni učinak kemoterapije, ulažu se veliki napori u pronalaženju novih mogućnosti liječenja. Za PI3K / mTOR stazu se navodi da je regulirana u MPM. Ispitivali smo svojstva inhibicije rasta stanica dvaju dualnih inhibitora PI3K / mTOR NVP-BEZ235 i GDC-0980 na 19 MPM staničnim linijama. Mogli bismo prepoznati otporne i osjetljive crte; međutim, nije bilo povezanosti sa smanjenom vrijednosti pokazatelja aktivnosti PI3K / mTOR. Kao rezultat inhibicije mTOR, oba su lijeka učinkovito inducirali dugotrajnu autofagiju, ali ne i staničnu smrt. Autofagična blokada klorokinom u kombinaciji s dualnim PI3K / mTOR inhibitorima značajno je inducirala kapaza neovisnu staničnu smrt koja uključuje RIP1 u osjetljivoj staničnoj liniji SPC212. Stanična smrt u rezistentnoj staničnoj liniji Mero-82 bila je manje izražena i nije inducirana putem mehanizma ovisnog o RIP1, što sugerira uključivanje RIP1 nizvodnih efektora. Indukcija stanične smrti potvrđena je u 3D sustavima. Na temelju ovih rezultata identificiramo autofagiju kao jedan od glavnih mehanizama otpornosti na staničnu smrt protiv dvojnih inhibitora PI3K / mTOR u MPM. Kako su inhibitori PI3K / mTOR pod istragom u kliničkim ispitivanjima, ovi rezultati mogu pomoći u tumačenju njihovog ishoda i predlaganju načina za intervenciju.

Glavni

Maligni pleuralni mezoteliom (MPM) osjetljiv je na fosfatidilinozitol 3-kinazu / sisavce ciljane inhibitore signala rapamicina (PI3K / mTOR) zbog aktiviranja PI3K / mTOR signalizacije. 1, 2 Aktivacija može biti rezultat inaktivacije INP4A fosfataze, koja je snižena u 44% MPM (predstavljena u IMIG2014), ili promjena u signalnim komponentama PI3K, koje su mutirane u 9% MPM, 3 dok mutacije tirozin kinaze receptora / pojačanja nisu identificirana u dvije nedavne studije o velikoj propusnosti. 4, 5

Jedan od gena za supresiju tumora koji su često mutirani u MPM je NF2, a NF2-null stanice pokazale su se osjetljivima na učinke inhibicije rasta rapamicina 6 preko mehanizama koji uključuju mTORC1 neovisnu o signalizaciji PI3K. Međutim, mTOR inhibitor, everolimus, nije pokazao terapijsku korist kod neselektiranih MPM bolesnika. 7 Kako mTORC1 inhibitori često dovode do povratne aktivacije PI3K aktivacije u karcinomu, 8, 9 pretpostavili smo da dvostruki PI3K-mTOR inhibitori mogu donijeti veću terapijsku korist. Nadalje, pokazalo se da NF2 inhibira PI3K aktivnost vezanjem na PI3K pojačivač-L (PIKE-L), što narušava vezanje PIKE-L na PI3K 10 i gubitak NF2 u švanomu, pokazalo se da senzibilizira na PI3K inhibitore. 11

Na ekranu na dualnom inhibitoru PI3K / mTOR NVP-BEZ235, u okviru pregledničkog panela "Genomika osjetljivosti na lijekove" Sanger Institute / MGH, pokazalo se da je brisanje 12 CDKN2A povezano s povećanom osjetljivošću. Budući da su NF2 i CDKN2A geni najčešće mutirani u MPM, blokiranje PI3K / mTOR signalizacije može biti valjan pristup za zaobilaženje poteškoća u primjeni ciljane terapije u nedostatku identificiranog onkogena. Obrazloženje ciljanja PI3K / mTOR puta također je podržano povezivanjem povećane aktivnosti s lošijim kliničkim ishodom. 13, 14

NVP-BEZ235 (ref15) i GDC-0980 (ref16) su inhibitori male molekule klase I PI3K i mTOR (mTORC1 i mTORC2). GDC-0980 je testiran u ispitivanjima faze I gdje je kohorta proširenja faze I pokazala dva objektivna odgovora među 26 bolesnika s mezoteliomom. Unatoč ovim ohrabrujućim rezultatima, ovaj lijek se neće dalje istraživati ​​zbog nuspojava uočenih u drugom kliničkom ispitivanju. 18 To nas, međutim, ne bi trebalo odvratiti od pokušaja pronalaženja načina za poboljšanje antitumorskog učinka ove klase sredstava. Prethodno smo pokazali da inhibicija signalizacije PI3K / mTOR senzibilizira stanice mezotelioma na lijekove koji se izlučuju putem ABCG2 transportera inhibirajući funkciju ABCG2. 19 U ovoj smo studiji pokušali identificirati temeljne mehanizme odgovorne za osjetljivost na otpornost prema inhibiciji PI3K / mTOR u velikom panelu staničnih linija mezotelioma. Primijetili smo da inhibicija PI3K / mTOR povećava autofagičnu stopu, što predstavlja učinkovit mehanizam otpornosti inducirajući zaustavljanje rasta i preživljavanje. Međutim, blokiranje autofagije, koja sama po sebi utječe na stanični rast, sintetički je smrtonosna kada se kombinira s PI3K / mTOR inhibitorima mehanizmom koji uključuje staničnu smrt ovisnu o recepturi koja utječe na receptor 1 (RIP1).

Rezultati

Pregled osjetljivosti na lijekove mezotelioma staničnih linija

U ovoj smo studiji nastojali identificirati mehanizme koji obrađuju osjetljivost naspram otpornosti prema dualnim PI3K / mTOR inhibitorima u velikom panelu staničnih linija mezotelioma. Kako bismo riješili ovo pitanje, izveli smo test citotoksičnosti u 19 komercijalno dostupnih staničnih linija mezotelioma. Stanice su tretirane povećanim dozama ili NVP-BEZ235 ili GDC-0980, a inhibicija i inhibicija rasta ispitivana je mjerenjem mitohondrijske aktivnosti u roku od 72 sata pomoću MTT testa. Raspodjela IC50 određena za NVP-BEZ235 pokazala je razliku od oko 26 puta između najosjetljivijih i najotpornijih staničnih linija, dok je distribucija GDC-0980 IC50 bila homogenija i pokazala je maksimalnu razliku od 8 puta (Slika 1).

Image

Identifikacija staničnih linija mezotelioma osjetljivih naspram rezistentnih na inhibiciju PI3K / mTOR. IC50 od 19 MPM staničnih linija: ACC-Meso-1, SPC212, MSTO-211H, ZL34, ZL55, NCI-H2452, ZL5, NCI-H226, SPC111, NCI-H2052, Mero-25, Mero-95, SDM103T2, ACC -Meso-4, Mero-82, ONE58, Mero-14, Mero-84 i Mero-83 i QQ Praktični test normalnosti pri 250 nM nakon 72 sata tretiran s ( a ) NVP-BEZ235 i ( b ) GDC-0980

Slika pune veličine

Da bismo utvrdili da li su dobiveni rezultati prikladni za odabir otpornih i osjetljivih staničnih linija, testirali smo da li su postoci rasta i održivosti za određenu koncentraciju bilo GDC-0980 ili NVP-BEZ235 normalno raspodijeljeni koristeći Quantile-Quantile Plot ( QQ Plot) test normalnosti (Slika 1, Dopunska slika S1). Inhibicija i inhibicija rasta stanica i NVP-BEZ235 i GDC-0980 normalno su raspodijeljeni. Rezultati održivosti za NVP-BEZ235 i GDC-0980 koncentrirani su na 45, 7 odnosno 43, 65%, neobrađene kontrole, što daje maksimalnu osjetljivost za otkrivanje otpornih i osjetljivih linija. Pragovi osjetljivih i otpornih staničnih linija postavljeni su korištenjem ± 1 SD od srednje vrijednosti. Raspodjela staničnih linija na temelju IC50 bila je konzistentna onoj opaženoj u QQ planu.

Objavljeni IC50 NVP-BEZ235 promatran u staničnim linijama kreće se od 10 do 100 nM 20, 21, a za GDC-0980 varira između 200 i 500 nM. 22 IC50 od 26% MPM staničnih linija liječenih NVP-BEZ235 bilo je <100 nM, a IC50 od 68% stanica MPM staničnih linija tretiranih s GDC-0980 <<nn. Na temelju ovog opažanja, koncentracija lijeka koja se koristi u funkcionalnom ispitivanju za NVP-BEZ235 postavljena je na 200 nM, što uključuje IC50 od 58% staničnih linija. Za GDC-0980 je odabrano 500 nM.

Nema razlike između osjetljivih i otpornih staničnih linija u PI3K / mTORC1 / 2 signalizaciji

Za obavljanje funkcionalnih ispitivanja odabrano je šest reprezentativnih staničnih linija koje se preklapaju u osjetljivosti i otpornosti na oba lijeka, uključujući osjetljive SPC212, ZL34 i Mero-25 i rezistentne stanične linije Mero-83, Mero-82 i ONE58. Nadalje smo ispitali je li fosforilacija markera aktivnosti PI3K / mTORC1 / 2 različito inhibirana u osjetljivim nasuprot rezistentnim staničnim linijama i nije li utvrđena značajna razlika na razini signalizacije mTORC1 (Slika 2a). Oba su inhibitora na sličan način smanjila fosforilaciju markera aktivnosti mTORC1 4E-BP1 i S6 već nakon 4 sata liječenja, a ovo se održavalo nakon 72 sata na način ovisan o dozi. Fosforilacija S6 nije bila u korelaciji s fosforilacijom 4E-BP1, a ovo može biti reprezentativno za ovisnost stanica karcinoma u aberantnom prijevodu posredovanom heterotrimerom eIF4F, 23 čiji je skup inhibiran defosforiliranim 4E-BP1.

Image

Smanjenje PI3K / mTOR signalizacije prati zaustavljanje G1, koje je izraženije kod osjetljivih staničnih linija. ( a ) Proteinski lizati osjetljivih staničnih linija SPC212, ZL34 i Mero-25 i rezistentne stanične linije Mero-83, Mero-82 i ONE58 analizirani su Western blottingom protiv markera aktivnosti PI3K / mTOR: fosfo-AKT (Thr308), fosfo- AKT (Ser473), AKT, fosfo-S6, S6, fosfo-4E-BP1, 4E-BP1 i Actin. Svaka stanična linija bila je 16 sati serumirana i tretirana kao što je naznačeno 4 sata s 1000 µg / ml IGF-1, 0, 5 µM NVP-BEZ235, 0, 5 µM GDC-0980 ili je tretirana 72 h s povećanim koncentracijama NVP-a -BEZ235 ili GDC-0980 kako je naznačeno. ( b ) Profil staničnog ciklusa osjetljive stanične linije SPC212 i otporne linije Mero-82 tretirane s 0, 2 µM NVP-BEZ235 ili 0, 5 µM GDC-0980 u trajanju od 72 h. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz ≥3 neovisnih pokusa. Značajnost je određena Studentovim t- testom (*** P <0, 005, ** P <0, 01 i * P <0, 05; NS, nije značajno)

Slika pune veličine

Inhibicija fosforilacije fosforilacije GDC-0980 mTORC2 supstrata AKT (Ser473) bila je vrlo učinkovita tijekom 4 sata i održavana je nakon 72 sata u većini analiziranih linija, dok se inhibitorni NVP-BEZ235 učinak smanjio nakon 72 sata. Slično tome, inhibicija fosforilacije AKT markera PI3K p100 (Thr308) bila je učinkovita kod oba lijeka u 4 sata, ali samo je inhibitorni učinak GDC-0980 održan nakon 72 sata za većinu analiziranih linija. Slični rezultati s NVP-BEZ235 primijetili su Serra i sur. 21 inhibicija PI3K / mTORC2 u stanicama karcinoma dojke gdje su samo visoke koncentracije od 500 nM postigle efikasnu inhibiciju PI3K p100. Uzeto zajedno, iako nije postojala povezanost između markera aktivnosti PI3K / mTORC1 / 2 i rasta stanica u osjetljivim i rezistentnim staničnim linijama za oba dvostruka inhibitora PI3K / mTORC1 / 2, GDC-0980 bio je učinkovitiji u blokiranju PI3K / mTORC2 u usporedbi s NVP-BEZ235.

Nadalje smo istražili osjetljivu liniju SPC212 i otpornu staničnu liniju Mero-82 na temelju njihove sposobnosti da rastu u 3D kulturama. Inhibicija staničnog rasta potvrđena je analizom profila staničnog ciklusa za svaku staničnu liniju nakon 72 sata liječenja. Akumulacija G1 s 200 nM NVP-BEZ235 i 500 nM GDC-0980 bila je značajno izraženija u osjetljivim linijama od otpornih staničnih linija; međutim, nije zabilježena smrt stanica (Slika 2b, Dopunska slika S2).

PTEN, negativni regulator staze PI3K, različito je izražen u svim ispitivanim staničnim linijama MPM (dopunska slika S3). Osjetljive stanične linije Mero-25 i ACC-Meso-1 nisu pokazale ekspresiju PTEN-a, što ukazuje da prekomjerna aktivacija PI3K putanje predisponira za osjetljivost na inhibitore.

Pokazalo se da je gubitak NF2 osjetljiv na inhibitore PI3K i mTOR. 6, 11 Samo četiri MPM linije izrazile su protein NF2 (NCI-H2452, ACC-Meso-4, MSTO-211H i Mero-25), u skladu s prethodnim studijama. 6, 24, 25 Od četiri retka, tri (NCI-H2452, ACC-Meso-4, MSTO-211H) dokumentirale su divlji tip NF2 prema bazi CCLE i objavio podatke. 24, 26 Budući da samo nekoliko linija izražava dokazani divlji tip NF2, teško je izvući bilo kakav zaključak o bilo kakvoj povezanosti između statusa NF2 i osjetljivosti i otpornosti na dual PI3K / mTOR inhibitore u našim eksperimentalnim okruženjima.

MPM stanične linije imaju visoku razinu bazalne autofagije

Autofagija je mehanizam preživljavanja pomoću kojeg se citosolni materijal odvaja u dvoslojnoj membrani, autofagosomu, dostavlja u lizosom na razgradnju i reciklira kako bi se potaknuo stanični rast u razdobljima gladovanja ili nevolje. 27 Rak može iskoristiti ovaj mehanizam za održavanje vitalnosti stanica, što dovodi do dormancije tumora, progresije i terapijske otpornosti. 28 U skladu s opažanjima drugih da NVP-BEZ235 inducira autofagiju u stanicama glioma 29, 30, 31 i GDC-0980 kod karcinoma gušterače, 32 također smo primijetili trajnu indukciju autofagije u stanicama SPC212 i Mero-82 nakon 72 sata liječenja, dokazano preradom LC3-I u autofagosom lokalizirani oblik LC3-II i razgradnjom P62 (slika 3a). Stoga smo hipotetizirali da autofagija može djelovati kao mehanizam otpornosti u našem modelu mezotelioma. Otkrili smo da gotovo sve analizirane stanice mezotelioma imaju visoku razinu bazalne autofagije, što je naznačeno LC3-II oblikom (slika 3b) u usporedbi s ne-transformiranom mezotelnom staničnom linijom SDM104. Prekomjerno gladovanje iz seruma nije značajno povećalo razinu bazalne autofagije u većini analiziranih staničnih linija, za razliku od drugih prilagodbi metabolizma uočenih nakon uskraćivanja vanjskog faktora rasta. 33 Nisu primijećene korelacije između razine LC3-II i promjena PI3K / mTOR signalnih regulatora poput PTEN, NF2 kao i mTORC1 aktivnosti (dokumentirano fosforilacijom S6) između otpornih i osjetljivih linija u uvjetima oduzimanja seruma (dodatna slika S3),

Image

Stanice mezotelioma pokazuju visoku razinu autofagije, koja se povećava inhibicijom PI3K / mTOR signalizacije. ( a ) Anti-P62 i -LC3BI / II i -Aktin zapadne mrlje od proteina lizata osjetljive stanične linije SPC212 i rezistentne stanične linije Mero-82 tretirane su 72 h s povećanom koncentracijom NVP-BEZ235 ili GDC-0980 kako je naznačeno. ( b ) Anti-LC3BI / II i -Aktinski zapadni mrlje mezotelne stanične linije SDM104 i MPM stanične linije SPC111, SPC212, NCI-H226, NCI-H2052, NCI-H2452, Mero-14, Mero-25, Mero-82, Mero-83, Mero-84, Mero-95, ACC-Meso-1, ACC-Meso-4, MSTO-211H i ONE58 ostali su 16 sati sa serumom ili izgladnjeli serumom. U donjem dijelu prikazana je kvantifikacija razine proteina LC3BII normalizirana u odnosu na Actin za stanične linije opisane gore sa standardnim uvjetima kulture

Slika pune veličine

Stanice SPC212 i Mero-82 imaju visok autophagični tok i blokada autofagije senzibilizira ih na PI3K / mTOR inhibitore koji induciraju staničnu smrt na način ovisan o RIP1

Pokazalo se da GDC-0980 i NVP-BEZ235 sami ili u kombinaciji s drugim kemoterapeuticima ili radioterapijom induciraju unutarnju apoptozu kod različitih čvrstih i tekućih tumora. 20, 22, 29, 34, 35, 36 Štoviše, kod karcinoma, kao što su karcinom bubrežnih stanica ili karcinom gušterače, kombinacija inhibitora autofagije klorokin (CQ) s jednim mTOR-om ili dualnim inhibitorima PI3K / mTOR senzibilizira stanice i inducira kaspaza- ovisna i ovisna stanična smrt. 32, 37, 38, 39 CQ je lizosomotropni lijek koji podiže intralysosomalni pH 40 i smanjuje autofagičnu razgradnju proteina.

Kako bi se ispitalo da li NVP-BEZ235 i GDC-0980 potiču preživljavanje putem autofagije, osjetljive i rezistentne linije tretirane su inhibitorima samostalno ili u kombinaciji s CQ. CQ sam i u kombinaciji s GDC-0980 učinkovito je blokirao autofagiju nakon 24 sata liječenja, a taj se učinak zadržao i nakon 72 h. Sama GDC-0980 povećala je autophagični tok u stanicama SPC212 i Mero-82 u 72 h (slika 4a). Snažna vakuolizacija citoplazme inducirana je samim CQ tretmanom ili u kombinaciji s inhibitorima u obje stanične linije, podupirući rezultate imunoblotingom (Slika 4b). Iako je jaki morfološki utjecaj CQ u kombinaciji s dualnim inhibitorima PI3K / mTOR zabilježen u ranijim vremenskim točkama, stanična smrt je otkrivena tek nakon 96 h u ispitivanim staničnim linijama (Slika 4c, Dopunska slika S4). Primijetili smo značajan pad ATP-a u obje stanične linije liječene samo CQ-om, a to je bilo manje istaknuto kod rezistentne linije Mero-82 nakon 96 sati tretmana. Kombinacija je pokazala značajan aditivni učinak na smanjenje razine ATP-a u stanicama SPC212 i manji učinak u Mero-82 (slika 4c), što je potvrđeno ispitivanjem formiranja kolonije u stanicama Mero-82 (dopunska slika S5).

Image

Inhibicija autofagije CQ senzibilizira mezoteliomne stanične linije na PI3K / mTOR inhibitore. ( a ) Western-blots proteina lizata osjetljive stanične linije SPC212 i rezistentne stanične linije Mero-82, anti-P62, L-C3BI / II i Actin, tretiranih s 20 µM CQ, 0, 5 µM GDC-0980 ili u kombinaciji za 24, 48 i 72 h. ( b ) Lagane mikrografije SPC212 i Mero-82, tretirane s 0, 2 µM NVP-BEZ235, 0, 5 µM GDC-0980 samostalno ili u kombinaciji s 20 µM CQ, 96 h. Linija skale predstavlja 25 µm. ( c ) Kvantifikacija postotka ATP sadržaja SPC212 stanica i Mero-82 stanice tretirane s 0, 2 μM NVP-BEZ235, 0, 5 μM GDC-0980 samostalno ili u kombinaciji s 20 µM CQ tijekom 96 h. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz ≥3 neovisnih pokusa. Značajnost je određena analizom testa varijance (*** P <0, 005, ** P <0, 01 i * P <0, 05; NS, nije značajno)

Slika pune veličine

Kako bismo potvrdili ulogu autofagije u preosjetljivosti na inhibiciju PI3K / mTOR, ušutkali smo Atg5 gen (slika 5a), što je važno za produženje autofagosome. Šutiranje Atg5 rezultiralo je ukidanjem nakupljanja P62 nakon tretmana CQ (slika 5b), pokazujući tako efikasnu blokadu autofagije. Slični rezultati opaženi su i kod drugog sustava kratkih ukosnica (podaci nisu prikazani). Iznenađujuće, prigušivanje Atg5 gena povezano je sa značajno poremećenim rastom stanica u SPC212 osjetljivoj liniji i Mero-82 rezistentnoj liniji (slika 5c), što ukazuje na ovisnost MPM o autofagiji. Zbog ovog fenotipa, nismo mogli testirati učinak inhibicije PI3K / mTOR.

Image

Autofagija je potrebna za rast stanica mezotelioma. SPC212 i Mero-82 stanične linije bile su stabilno transducirane virusnim česticama koje nose Mir30-Sh-Atg5 ili Mir30-Sh-Ctrl. ( a ) Šutnja gena Atg5 potvrđena je anti-ATG5 Western blottingom. ( b ) Anti-P62, -LC3BI / II i -Aktin SPC212 i Mero-82 Sh-Atg5 i Sh-Ctrl neobrađeni ili tretirani s 20 μM CQ 4 h. ( c ) Rast staničnog rasta SPC212 i Mero-82 Sh-Atg5 i Sh-Ctrl tijekom 3 dana. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz tri neovisna pokusa. Značaj je određen Mann-Whitney U -test (* P <0, 05)

Slika pune veličine

Da bi se odredila vrsta stanične smrti koja je inducirana kombinacijom CQ i dualnih inhibitora PI3K / mTOR, stanice su ispitivane na apoptozu procjenom Test održivosti iz Dodatka V / PI (Slika 6, Dopunska slika S6), preradom i cijepanjem efektorske kaspaze 3 supstrata kaspaza 3 PARP. Promatrali smo indukciju stanične smrti i u SPC212 i u Mero-82 stanicama s oba inhibitora u Aneksin V / PI testu; međutim, značajna veća indukcija smrtnosti stanica postignuta je tek kad je dodan CQ. Ovaj aditivni učinak bio je veći u osjetljivoj liniji SPC212 nego u rezistentnoj liniji Mero-82. Dodavanje inhibitora pan-kaspaze širokog spektra Z-VAD-FMK nije uspjelo spasiti staničnu smrt (Slika 6a). Nakon kombiniranog liječenja nije otkriveno aktivno cijepanje kaspaze-3, PARP ili otpuštanje citokroma c (Slika 6b, Dodatna slika S7), a također nismo primijetili porast BIM samo B3 proteina (podaci nisu prikazani). Sve u svemu, ta zapažanja govore o tome da unutarnja apoptoza nije bila uključena. Potom smo provjerili može li se primijećena smrt dogoditi putem mehanizma ovisnog o RIP1. 41 Stanice SPC212 i Mero-82 tretirane su s CQ i NVP-BEZ235 ili GDC-0980 u odsutnosti i prisutnosti specifičnog RIP1 inhibitora Nekrostatin-1 (Nec-1). 42 Samo Nec-1 uspio je značajno blokirati staničnu smrt izazvanu CQ i dualnim PI3K / mTOR inhibitorima u SPC212. U Mero-82 stanicama, Nec-1 nije blokirao staničnu smrt. Nadalje, dualni inhibitori PI3K / mTOR inducirali su degradaciju RIP1 (slika 6c), što je zatim spašeno dodatkom CQ u obje stanične linije. Taj je učinak bio očitiji nakon 96 sati, kada su stanice počele umrijeti. Zanimljivo, inhibitor proskurzivnog proteina X vezan za protein apoptoze (XIAP) bio je učinkovito smanjen kao rezultat inhibicije AKT samo u osjetljivoj liniji SPC212, ali ne i u rezistentnoj liniji Mero-82.

Image

Inhibicija autofagije s CQ u kombinaciji s inhibicijom PI3K / mTOR signalizacije inducira staničnu smrt neovisnu o kaspazi. ( a ) SPC212 i Mero-82 stanične linije tretirane su kako je naznačeno s 0, 2 μM NVP-BEZ235, 0, 5 μM GDC-0980, 20 μM CQ, 20 μM ZVAD-FMK ili 50 μM Nec-1 u trajanju od 96 h, Stanična smrt procijenjena je obojenjem GFP-Aneksinom V / PI i protočnom citometrijom. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz tri neovisna pokusa. Značajnost je određena analizom testa varijance (*** P <0, 005, ** P <0, 01 i * P <0, 05; NS, nije značajno). ( b ) Anti-PARP, -Kaspaza 3 i -Aktin zapadnja mrlja od SPC212 i Mero-82 tretirana kao što je naznačeno sa 0, 2 µM NVP-BEZ235, 0, 5 µM GDC-0980 i 20 µM CQ. SV40 immortalizirani wt MEF-ovi tretirani 15 h s 3 μg / ml etoposida korišteni su kao kontrola apoptoze. ( c ) Anti-XIAP (zvjezdica (*) predstavlja nespecifični pojas), -RIP1 i -Aktin zapadne mrlje proteinskih lizata SPC212 i Mero-82 tretirani kako je naznačeno s 0, 2 μM NVP-BEZ235, 0, 5 μM GDC-0980 i 20 µM CQ tijekom 72 i 96 h

Slika pune veličine

Brojne petlje za preslušavanje, povratne informacije i usmjeravanje prema naprijed povezuju signalne putove PI3K / AKT / mTOR i Ras / MEK / ERK, koji pružaju uvid u kompenzacijske odgovore promatrane samo kod ciljanja bilo kojeg puta. 43 Primijetili smo da GDC-0980 inducira aktiviranje ERK-a u rezistentnim stanicama Mero-82, ali ne i u osjetljivim SPC212 stanicama (dopunska slika S8a). ERK aktivaciju je također snažno izazvala CQ u rezistentnim stanicama Mero-82. Da bismo testirali hoće li inhibiranje MEK / ERK putanje pojačati učinak GDC-0980 i CQ, testirali smo U0126, inhibitor MEK1 / 2. U0126 efikasno inhibira indukciju ERK-a pomoću CQ i GDC-0980 (dopunska slika S8b). Međutim, kombinacija U0126, GDC-0980 i CQ nije inducirala staničnu smrt (Dopunska slika S8c).

Dupli inhibitori PI3K / mTOR u kombinaciji sa CQ induciraju staničnu smrt u 3D MPM

Primjećeni su sferoidi u pleuralnoj tekućini humanog MPM-a i povezani s povećanom malignom bolešću. 44 MPM sroroidi korišteni su za ispitivanje novih terapijskih mogućnosti 45 i pokazali su da ovaj model bolje predstavlja biološku složenost koja postoji u pacijentovom tumoru. 46, 47 Stoga smo htjeli u ovom modelu provjeriti učinkovitost blokiranja PI3K / mTOR u kombinaciji s inhibicijom autofagije.

U ovom istraživanju koristili smo spužve s gusto nabijenim sferoidima promjera 300 µm formirane u 4 dana prema standardiziranom protokolu. 48 U tim je uvjetima oko jedne trećine stanica u stanju mirovanja, 44 što bolje odgovara statusu proliferacije tumorskih stanica 49 u usporedbi s 2D staničnom kulturom.

Mero-82 i SPC212 sferoidi su tretirani ili sa CQ samostalno ili u kombinaciji s NVP-BEZ235 ili GDC-0980. Iako liječenje samo CQ-om nije imalo utjecaja na rast sferoideje, došlo je do značajnog pada sadržaja ATP-a od oko 20% za obje stanične linije (slike 7a-c). Uz to, sferoidi su bili lomljivi i izgledali su tamno na svjetlosnoj mikroskopiji. Tretiranje sferoida samo PI3K / mTOR inhibitorima induciralo je značajnu inhibiciju rasta stanice i pad ATP-a u obje stanične linije (slike 7b i c). Kombinacija CQ s PI3K / mTOR inhibitorima nije imala dodatni utjecaj na rast stanica sam po sebi ; međutim, primijećena je snažna vakuolizacija citoplazme i oticanje pojedinih stanica (slika 7a). Štoviše, postojao je značajan aditivni učinak na smanjenje ATP-a za obje stanične linije. Zanimljivo je da je u SPC212 sferoidima sadržaj ATP-a gotovo potrošen i izgledali su dezintegrirano, a pojedine stanice su bile prepoznatljive dok je Mero-82 oblik sferoida u trenutku analize još uvijek bio netaknut.

Image

Inhibicija autofagije s CQ u kombinaciji s inhibicijom PI3K / mTOR signalizacije inducira smrt sferoidnih stanica. ( a ) Reprezentativne svjetlosne mikrografije SPC212 i Mero-82 sferoida liječenih kako je naznačeno s 1 μM NVP-BEZ235, 1 μM GDC-0980 i 20 μM CQ tijekom 6 dana. ( b ) Preokretni volumen (rast) sferoida prikazan na ploči ( a ). ( c ) održivost je prikazana kao postotak sadržaja ATP-a u SPC212 i Mero-82 sheroidima tretiranim kao što je opisano u panelu ( a ). Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz ≥3 neovisnih pokusa. Značajnost je određena analizom testa varijance (*** P <0, 005 i * P <0, 05; NS, nije značajno)

Slika pune veličine

Inhibicija autofagije nije senzibilizirala normalne stanice SDM104 na inhibiciju PI3K / mTOR (dopunske slike S9a-c).

Kako bismo provjerili je li ERK staza uključena u Mero-82 otpor u 3D-u, dodali smo U0126 (dopunska slika S10). Kombinacija U0126 i GDC-0980 imala je blagi aditivni učinak na vitalnost, a nije bilo dodatnih značajnih učinaka kada je dodan CQ. Dezintegracija sferoida nije zabilježena nakon 6 dana liječenja. Ovi rezultati pokazuju da ERK nije glavni put koji sudjeluje u otpornosti na staničnu smrt.

Rasprava

U ovom istraživanju pokazujemo da je bijeg iz prečice u autofagiju jedan od načina za poboljšanje terapijske učinkovitosti inhibicije PI3K / mTOR u MPM.

Opisano je nekoliko mehanizama koji podupiru otpornost na inhibiciju PI3K / mTOR. Na primjer, stanične stanice karcinoma dojke otporne na NVP-BEZ235 pojačale su aktivaciju JAK2 / STAT5 što je posljedica lučenja IL-8. 50 U skladu s tim, kombinirano liječenje GDC-0980 zajedno s inhibitorom c-Met učinkovito inhibira rast tumora mezotelioma in vivo . Opisana su 51 dvostruka inhibitora PI3K / mTOR 52 da induciraju ERK aktivaciju inhibiranjem mTORC2 u karcinomu gušterače. Kombinacija PI3K / mTOR i MEK / ERK inhibitora pojačala je odgovor na lijek. Sličan učinak primijetili smo i u otpornoj staničnoj liniji Mero-82; međutim, kombinacija inhibitora PI3K / mTOR i MEK / ERK, u prisutnosti ili odsutnosti inhibicije autofagije, nije rezultirala staničnom smrću, što ukazuje da bi mogao biti uključen dodatni mehanizam. Drugi poznati mehanizmi otpornosti na inhibiciju PI3K / mTOR uključuju prevođenje neovisno o kapi i mehanizam posredovan FOXO. 53 Pokazano je da NVP-BEZ235 inducira ugulaciju i / ili aktivaciju nekoliko proskurzivnih proteina poput RTK-a, citosolnih kinaza, antiapoptotskih proteina i faktora transkripcije, uglavnom prijevodom neovisnim o kapici. 54 mRNA prevedena pod tim uvjetima imaju visoko strukturiranu 50 netransuliranu regiju koja često sadrži unutarnji slijed unutarnjeg ribosome ulaza i nekoliko uzvodnih AUG. Jedan od proteina koji se na ovaj način prevodi u uvjetima smanjene globalne sinteze proteina je XIAP. 55 XIAP je ključni unutarnji regulator apoptoze, prvenstveno zahvaljujući njegovoj sposobnosti da se veže i inhibira i inicijatoru i efektor kaspazama. 56 Iako stanične razine XIAP-a reguliraju nekoliko neovisnih mehanizama, čini se da je prevladavajuća regulacija kontrola transformacije XIAP mRNA. Razine XIAP-a regulirane su GDC-0980 u Mero-82 rezistentnim, ali ne i u SPC212 osjetljivim stanicama. Zanimljivo je da su razine XIAP-a također regulirane CQ-om, ali to bi moglo biti povezano s drugim mehanizmima, uključujući povećanje inhibicije proteazoma supstrata uslijed inhibicije uzrokovane autofhagijom. 57

Mehanizmi ovisni o FOXO mogu biti podložni različitom odgovoru na dva PI3K / mTOR inhibitora korištena u ovom istraživanju. U stvari, mTORC2 je efikasnije inhibirao GDC-0980 u usporedbi s NVP-BEZ235, što je rezultiralo inhibicijom AKT aktivacije. Atg geni pozitivno kontroliraju FoxO3a, 58, a potonji negativno regulira aktivni AKT. Stoga GDC-0980 potaknuvši bolju blokadu aktivacije AKT može rezultirati dugoročnom, FOXO3a ovisnom autophagijom, i zaista smo primijetili smanjenu fosforilaciju FOXO3a nakon liječenja GDC-0980 (podaci nisu prikazani). Naša su opažanja u skladu s povećanom učinkovitošću opaženom inhibicijom autofagije zajedno s dualnim inhibitorima PI3K / mTOR kod karcinoma gušterače 59 i tumora perifernog živca. 60

Stanična smrt promatrana u našim eksperimentalnim okruženjima najvjerojatnije je nekroptoza, što je jedan od nekoliko oblika regulirane stanične smrti koji uključuje RIP1, RIP3 i MLKL. 41 Mehanizam koji aktivira nekroptozu uključuje pad razine ATP-a, koji u nekom trenutku ukida aktivnost svih enzima ovisnih o ATP-u (uključujući razne transportere koji održavaju ionsku ravnotežu na plazma membrani) i kompromitiranu redoks ravnotežu (koja inaktivira različite enzime i uzrokuje oksidacijske molekularne molekule oštećenja organela i membrana) kao središnjih igrača u izvršenju regulirane stanične smrti. 41 Dokumentirali smo drastično smanjenje razine ATP-a što potvrđuje teoriju da su stanice umrle uslijed nekroptoze. Smanjenje razine ATP-a bilo je teže u osjetljivim stanicama SPC212 u usporedbi s rezistentnim stanicama Mero-82. Zanimljivo je da je stanična smrt izazvana kombiniranim liječenjem efikasno blokirana inhibitorom RIP1 Nec-1 samo u osjetljivoj staničnoj liniji SPC212. To ukazuje da se stvarna indukcija stanične smrti u rezistentnoj liniji Mero-82 događa u RIP1 neovisnom kontekstu, a najvjerojatnije uključuje samo RIP3 i MLKL. 41 Vjerojatnost ovog scenarija sugeriraju nedavni podaci koji pokazuju da XIAP inhibira staničnu smrt ovisnu o TNF i RIP3 61 i naše opažanje da XIAP nije bio učinkovito reguliran kombiniranim liječenjem lijekova u Mero-82 u usporedbi sa stanicama SPC212

Rezultati promatranja bili su konzistentni u 2D i 3D modelima. Ovo je važno jer je opisano da je osnovna fosforilacija članova PI3K / AKT / mTOR puta smanjena u 3D sferoidima u usporedbi s 2D. 47 Budući da 3D / sferoidi predstavljaju model približavanja biološkoj složenosti tumora, ovi rezultati sugeriraju da ovu kombiniranu terapijsku mogućnost treba istražiti u kliničkim uvjetima.

Uz to, uočili smo da inhibicija autofagije po sebi ima utjecaja na rast stanica mezotelioma. Autofagija potiče preživljavanje stanica otpornih na apoptozu kada su lišene vanćelijskih hranjivih tvari ili faktora rasta. Liječenje takvih stanica za ovisnost o autofagiji za preživljavanje s CQ rezultira smrtnom stanicom ovisnom o ATP-u. 62 Inhibicija unutarnje autofagije stanica raka smirivanjem Atg5 smanjuje rast B16-F10 tumora. 63 Autofagija ima ulogu ovisnu o karcinomu. 64 To je regulirano i potrebno za preživljavanje tumorskih stanica u hipoksičnim tumorskim regijama. 64 Izbacivanje esencijalnih gena autofagije u genetski modificiranim modelima miša za rak pokazalo je pro-tumorigensku ulogu za autofagiju. 65 Mehanizmi koji stoje iza „autofagične ovisnosti“ koji se opažaju u stanicama MPM-a su izvan okvira ove studije, ali će se dalje istražiti.

Zaključno, pokazali smo da inhibitori PI3K / mTOR povećavaju razinu autofagije u MPM-u i kombinaciju zajedno s CQ treba dodatno istražiti kao inhibiciju autofagije koja blokira ovaj mehanizam otpornosti.

Materijali i metode

Reagensi

Dulbeccova modifikovana orao-srednja / hranjiva smjesa F-12 Ham (DMEM-F12), propidijum jodid i otopina penicilina / streptomicina 100 × kupljena je od tvrtke Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Buchs, Švicarska). Otopina tripsina 0, 25% kupljena je od tvrtke GIBCO (Life Technologies Europe, Zug, Švicarska). Fetalni teleći serum (FCS, CVFSVF00-01) kupljen je od tvrtke Eurobio (Ulis (Les), Francuska). Puromicin je kupljen od tvrtke AppliChem (Darmstadt, Njemačka). Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-FMK) was purchased from BACHEM (Bubendorf, CH, Switzerland). Nec-1 was purchased Enzo LifeSciences AG (Lausen, Switzerland). NVP-BEZ235 was obtained from Novartis (Basel, Switzerland) and GDC-0980 was obtained from Genentech (Roche, Basel, Switzerland). U0126 was purchased from Cell Signaling Technology (Allschwil, Switzerland). Nivaquine (chloroquine sulfate) was purchased from Sanofi Aventis (Paris, France). Recombinant His 6 -GFP-Annexin V was kindly provided by T Kaufmann (Bern, CH, Switzerland).

Stanična kultura

The following mesothelioma cell lines have been used: ZL55, ZL5, ZL34, SDM103T2, SPC111 and SPC212 from our laboratory; NCI-H226, NCI-H2052, NCI-H2452, MSTO-211H 66 were obtained from ATCC (Wesel, Germany); ACC-Meso-1 and ACC-Meso-4 24 were obtained from Riken BRC (Ibaraki, Japan); and Mero-25, Mero-82, Mero-83, Mero-84, Mero-95 (ref 67) and ONE58 (ref 68) was obtained from the European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). The non-transformed mesothelial cell line SDM104 (ref 69) was established in our laboratory. Cells established in our laboratory were maintained as described by Thurneysen et al. 70 The rest of the cell lines were cultured in DMEM–F12 supplemented with 15% FCS and 1% Penicillin/Streptomycin solution. SV40 immortalized wild-type MEF cells and Hek 293T cells were cultured in DMEM high glucose medium supplemented with 10% FCS and 1% Penicillin/Streptomycin. All cells were cultured at 37 °C in a humidified 5% CO 2 atmosphere.

Gel electrophoresis and immunoblotting

Total protein extracts were prepared by lysing the cells with hot H8 buffer containing 10 mM Tris-Cl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA and 1% SDS and boiled for 5 min. Protein concentration was determined using a DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), and proteins were prepared by adding 6 × reducing Lämmli buffer (600 mM DTT) and boiling the samples for 5 min. A total of 10 μ g protein per extract was separated on denaturing 4–20% gradient SDS-PAGE gels. Proteins were transferred onto PVDF transfer membranes (0.45 μ m, Perkin Elmer, Schwerzenbach, Switzerland). For western blotting, membranes were probed with the following primary antibodies: rabbit anti-AKT (no. 9272), rabbit anti-Phospho-AKT (Thr308) (no. 9275), rabbit anti-Phospho-AKT (Ser473) (193H12, no. 9275), mouse anti-S6 (54D2, no. 2317), rabbit anti-Phospho-S6 (Ser235/236) (D57.2.2E, no. 4858), rabbit anti-4E-BP1 (no. 9452), rabbit-Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4, no. 2855), rabbit anti-p44/42 MAP Kinase (no. 9102), rabbit anti-Phospho-p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr 204) (no. 9101), rabbit anti-PTEN (138G6, no. 9559), rabbit anti-LC3B (no. 2775), rabbit anti-PARP (no. 9542), rabbit anti-caspase-3 (no. 9662) from Cell Signaling Technology; rabbit anti-NF2 (C18, no. sc-332) from Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, TX, USA); guinea pig anti-p62 (GP62-C) from Progen (Heidelberg, Germany); mouse anti-RIP (no. 610458) and mouse anti-XIAP (no. 610763) from Transduction Laboratories (Allschwil, Switzerland); mouse anti-ATG5 (7C6) from Nanotools (München, Switzerland); rabbit anti-Phospho-NF2 (Ser518) (PAI-14252) from Pierce (Rockford, IL, USA) and mouse anti-Actin (no. 69100) from MP Biomedicals (Santa Ana, CA, USA). Membranes were then incubated with the secondary antibody goat anti-mouse IgG-HRP (A-5420) from Ancell (Bayport, MN, USA), goat anti-guinea pig IgG-HRP (sc-2438) from Santa Cruz and goat anti-rabbit IgG-HRP (no. 7074) from Cell Signaling. The signals were detected by enhanced chemiluminescence (ECL Western Blotting Reagents, GE Healthcare, Glattbrugg, Switzerland) and detected on photosensitive film (Super RX Fuji x-Ray Film, Fujifilm, Düsseldorf, Germany).

Quantification of cell death by flow cytometry

Floating cells and attached cells were collected and washed with Annexin V staining buffer (150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 15 mM HEPES pH 7.2, 2% FCS and 10 mM NaN3) and incubated with GFP-Annexin V diluted in staining buffer for at least 30 min on ice in the dark. Cells were then washed in Annexin V staining buffer and resuspended in 500 μ l staining buffer. Propidium iodide was added to a final concentration of 2 μ g/ml, and cells were examined using on an Attune flow cytometer (Applied Biosystems, Zug, Switzerland) and analyzed with the Attune cytometric software v1.2.5 (Applied Biosystems). GFP-Annexin V- and propidium iodide-positive cells were considered as dead cells.

MTT assay and IC50 calculation

Cells were plated in sextuplicates at a density of 3000 cells/well in 96-well plates and allowed to adhere overnight followed by serum starvation for 16 h. The cells were then exposed to 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 and 5 μ M of GDC-0980 or NVP-BEZ235 for 1 h in serum-free condition, and medium containing serum and the inhibitors were added to the cells and incubated for 72 h. Mitochondrial activity as a readout for cellular viability was assessed by MTT assay. In all, 10 μ l of a 10 mg/ml MTT stock solution (3-amino-9-ethyl-carbazole, Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland) was added per well containing cells in 100 μ l DMEM–F12 without Phenol Red. Plates were incubated for 90 min at 37 °C and cells lysed with 100 μ l MTT lysis buffer (10% SDS, 45% dimethyl formamide, adjusted to pH 4.7 by 80% acetic acid/1 M HCl) for 2 h. Absorbance was measured at 570 nm using SpectraMax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). IC50 was calculated using the GraphPad Prism Software (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA). Cell growth inhibition was assessed using the formula 100 × ( t − t 0)/( c − t 0)=50, where ' t ' is the OD of 72-h exposure time to the test drug, ' t 0' the OD at time 0 and ' c ' the control OD in the absence of drugs.

Analiza staničnog ciklusa

For cell cycle analysis, floating cells and attached cells were collected, washed with D-PBS and fixed with ice cold 70% ethanol on ice for 30 min. Then cells were washed twice with D-PBS and incubated with PI/RNAse solution (50 μ g/ml and 100 μ g/ml) at RT for 1 h. Cells were analyzed on an Attune flow cytometer (Applied Biosystems) and data were processed using the ModFit LT cell cycle software (Topsham, ME, USA).

Spheroid formation

To form spheroids, 1000 cells/well for SPC212 and 2000 cells/well for Mero-82 per well were plated on ultra-low attachment 96-well round-bottomed plates (Sigma-Aldrich). Cells were concentrated by gentle centrifugation at 300 × g for 5 min and incubated at 37 °C for 4 days in order to reach 250–300 μ m before starting the treatment. For each treatment, triplicates were performed. After 6 days, volume of the spheroid was calculated by measuring the spheroid diameter on light micrographs. Spheroid growth fold increase was assessed using the formula ( t − t 0)/( c − t 0); ' t '=spheroid volume after 6 days of exposure to test drug, ' t 0'=spheroid volume at time 0 and ' c '=control spheroid volume after 6 days. Viability was performed by determining the ATP content of the spheroids using CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (D160963, Promega, Dübendorf, Switzerland), following the manufacturer's instructions. Luminescence was acquired using GloMax 96 Microplate Luminometer (Promega).

Lentiviral gene transfer and gene silencing

Two types of short hairpins targeting Atg5 and their respective controls were used: Atg5 shRNA was subcloned in pMSCV-Puro-miR30 (ref 71) and pLKO.1 ATG5 shRNA (Sigma-Aldrich), which were kindly provided by Dr. HU Simon (Bern, CH, Switzerland). HEK 293T cells were co-transfected with PMD2.VSV-G (envelope coding sequence): psPAX2 (packaging elements): shRNA Atg5 or control (total of 5 μ g of DNA) at a ratio of 2:5:3 in 10-cm tissue culture dishes using Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Life Technologies). Lentiviral particles were harvested from the medium 24 and 48 h later, pooled and passed through a 0.2- μ m filter and used fresh for infection or stored in aliquots at −80 °C. Target cell lines were transduced in the presence of 8 μ g/ml polybrene. Successfully transduced cells were selected with 0.3 μ g/ml puromycin for a minimum of 3 weeks.

Statistička analiza

IC50 was calculated using the GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Inc.). QQ Plot was used to identify sensitive and resistant cell lines. Drug response viability of the cell lines >1 SD from the mean were considered resistant, and the drug response viability of cell lines <1 SD from the mean were considered sensitive. Statistical analyses were performed using StatView version 5.0.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA). In order to evaluate statistically significant differences between normally distributed variables paired, Student's t -test was used. To assess significance between variables, which were not normally distributed, Mann–Whitney U -test was used. To determine significant additive effects between combination treatments and inhibition of cell death with the inhibitors, ANOVA test was performed. Differences were considered significant when P <0.05.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska slika 6

  7. 7.

    Dopunska slika 7

  8. 8.

    Dopunska slika 8

  9. 9.

    Dopunska slika 9

  10. 10.

    Dopunska slika 10

Glosar

mTOR

mammalian target of rapamycin

PI3K

fosfatidilinozitol 3-kinaza

RIPK1

receptor-interacting protein kinase 1

XIAP

X-linked inhibitor of apoptosis protein

nec-1

necrostatin-1

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)