Oslobađanje intracelularnog Ca2 + kroz rijanodinske receptore doprinosi disfunkciji mitohondrija posredovanih ampa receptorima i stresu u oligodendrocitima | stanična smrt i bolest

Oslobađanje intracelularnog Ca2 + kroz rijanodinske receptore doprinosi disfunkciji mitohondrija posredovanih ampa receptorima i stresu u oligodendrocitima | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Metaboličke bolesti
  • oligodendrocita
  • lučenje

Sažetak

Prekomjerna aktivacija ionotropnih receptora glutamata u oligodendrocitima izaziva citosolno preopterećenje Ca 2+ i ekscitotoksičnu smrt, proces koji pridonosi demijelinizaciji i multiple sklerozi. Eksitotoksične uvrede uzrokuju dobro karakterizirane promjene mitohondrija i poremećaj endoplazmatskog retikuluma (ER), što nije u potpunosti razumljivo. U ovom istraživanju analizirali smo doprinos oslobađanja ER-Ca 2+ putem rijanodinskih receptora (RyRs) i inozitol trifosfatnih receptora (IP 3 Rs) ekscitotoksičnosti u oligodendrocitima in vitro . Prvo, primijetili smo da oligodendrociti izražavaju sve prethodno okarakterizirane RyR i IP 3 Rs. Blokada Ca 2+ -induciranog oslobađanja Ca2 + od strane TMB-8 nakon α -amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol-propionat (AMPA) receptora posredovanih receptorima oslabila je i smrt oligodendrocita i citosolno Ca2 + preopterećenje, Zauzvrat, inhibicija RyR-a rijanodinom smanjila je i preopterećenje Ca2 +, dok inhibicija IP3R nije bila učinkovita. Nadalje, depolarizacijom mitohondrijalne membrane izazvane AMPA, oksidativnim stresom i aktivacijom kaspaze-3, što je u svim slučajevima smanjeno inhibicijom RyR. Pored toga, primijetili smo da AMPA inducira reakciju na stres na ER kao što je otkriveno α podjedinicom faktora eukariotske inicijacije 2 α fosforilacijom, prekomjernom ekspresijom GRP-kapenera i cijepanjem kaspaze-12, ovisno o RyR. Konačno, slabljenje ER stresa sa salubrinalno zaštićenim oligodendrocitima od ekscitotoksičnosti AMPA. Ovi rezultati zajedno pokazuju da oslobađanje Ca 2+ kroz RyR doprinosi citosolnom preopterećenju Ca 2+, disfunkciji mitohondrija, ER stresu i staničnoj smrti nakon ekscitotoksičnosti posredovane AMPA receptorima u oligodendrocitima.

Glavni

Oligodendrociti, mijelinizirajuće stanice CNS-a, izražavaju funkcionalne ionotropne receptore glutamata, 1 koji mogu potaknuti staničnu smrt i in vivo i in vitro. 2, 3 Stoga se važnost ekscitotoksičnosti glutamata za neurone u akutnoj ozljedi CNS-a i kroničnih neurodegenerativnih poremećaja 4 proširila na oligodendrocite i demijelinizacijske bolesti poput multipla skleroze (MS). 5

Mitohondrije su ključne za intracelularnu homeostazu Ca2 + i nakupljanje Ca2 + uzrokovano ekscitotoksičnim inzultama dovodi do depolarizacije mitohondrijske membrane, povećane proizvodnje ostataka bez kisika i smrti oligodendrocita ovisnih o kaspazi. 6 Zauzvrat, endoplazmatski retikulum (ER) je također kritičan za homeostazu Ca 2+ i njegov stres doprinosi demijelinizacijskim poremećajima. 7 ER služi kao spremnik Ca2 + koji se brzo mijenja i doprinosi kaskadi citosolne Ca2 + za signalizaciju oslobađajući Ca 2+ uglavnom putem rjanodinskih (RyR) i inozitol trifosfatnih (IP 3 R) receptora. 8 Obitelj RyR ima tri izoforme, sve se eksprimiraju u mozgu i ima više alosteričnih mjesta vezanja Ca2 + koja su odgovorna za pokretanje Ca2 + -induciranog oslobađanja Ca2 + (CICR) na citosol. 9 IP 3 R (izoformi I, II i III) također se eksprimiraju u mozgu i aktiviraju Ins (1, 4, 5) P3, metabolički produkt aktivnosti fosfolipaze C (PLC), a također su regulirani IP 3 -nevisni putovi. 10 Ti RyR / IP 3 R imaju središnju ulogu u preživljavanju stanica kao i u apoptotskoj staničnoj smrti. 11

CICR od ER može aktivirati apoptozu ovisnu o mitohondriji preopterećenjem ove organele. Doista, ER i mitohondriji su fizički i funkcionalno spojeni mikrodomenima, koji uključuju RyR i IP 3 R. 12, 13 Stoga, signalizacija Ca2 + između ovih organela može inicirati apoptozu putem mitohondrija specifičnih toksičnih događaja. 14 Pored toga, ER može izazvati apoptozu intrinzičkim putevima aktiviranim oštećenjem funkcije ER. Konkretno, akumulacija nerazvijenih proteina ili iscrpljivanje Ca2 + iz ER pokreće nerazvijeni protein proteina (UPR) 15 aktiviranjem PERK / α podjedinice eukariotske faze inicijacije 2 (eIF2) α . 16 UPR dovodi do zaustavljanja prevođenja i prekomjerne ekspresije GRP-ovih chaperona kako bi se vratio kapacitet savijanja proteina ER. Međutim, pod jakim stresom, sama ER može izazvati apoptozu aktiviranjem kaspaze-12, koja se aktivira u poremećaju homeostaze Ca 2+ i nakupljanja viška proteina unutar ER. 17

ER stres i ekscitotoksičnost povezani su s demijelinizirajućim poremećajima, ali dok je veza između ova dva fenomena opisana u neuronima, 18, 19, ostala je nepoznata u oligodendrocitima. U ovom istraživanju istražili smo doprinos oslobađanja ER-Ca 2+ oligodendroglialnoj ekscitotoksičnosti in vitro . U ovom istraživanju pokazujemo da aktiviranje receptora α -amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol-propionata (AMPA) inducira ER stres i naknadnu aktivaciju kaspaze-12, kao i citosolno Ca2 + preopterećenje i mitohondrijska disfunkcija, a sve ovisi o oslobađanju ER-Ca 2+ putem RyR-a.

Rezultati

RyRs i IP3R su izraženi u kultiviranim oligodendrocitima

I RyRs i IP3 Rs široko su opisani u CNS 20, 21 iako specifična raspodjela tih receptora po mozgu ostaje nejasna. Da bismo potvrdili ekspresiju različitih RyR i IP 3 R izoformi u našem in vitro oligodendroglialnom modelu, izveli smo imunofluorescentno označavanje za svaki izoform i osnovni protein mijelina (MBP) kao specifični oligodendroglialni marker. Oligodendrociti su pokazali koekspresiju tri izoforme IP 3 R (I, II i III) i MBP (slika 1). Imunofluorescencija i koekspresija su također bili pozitivni za tri izoforme RyR (slika 1). Dvostruko imunofluorescentno bojenje upotrebom MBP antitijela pokazalo je da se IP3 R / RyR izoforma i MBP koepresija javljaju uglavnom duž tijela i proksimalnih procesa zrelih oligodendrocita koji stvaraju mijelin. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da su tri izoforme IP 3 R i RyR prisutne u našim in vitro oligodendrocitima dobivenim iz optičkog živca štakora.

Image

IP 3 Rs i RyRs izraženi su u kultiviranim oligodendrocitima. Oligodendrociti (osnovni protein mijelinskog osnovnog proteina (MBP) oligodendrocita) obojeni su antitijelima na IP 3 RI, II, III i na RyR-I, II, III (oba zeleno). Koekspresija receptora i MBP imunofluorescencija su prikazani u spojenim slikama (žuto). Svih šest izoforma izraženo je u MBP + stanicama. Linija mjerila: 50 μ m

Slika pune veličine

Blokiranje oslobađanja ER Ca 2+ putem RyRs smanjuje citosolno Ca 2+ preopterećenje i ekscitotoksičnost u oligodendrocitima

Aktivacija AMPA receptora inducira porast razine citosolne Ca2 + koja je dovoljna da pokrene ekscitotoksičnost u kultiviranim oligodendrocitima, bez zahtjeva unosa Ca 2+ kroz naponski aktivirane kanale niti Na + -Ca 2+ izmjenjivač. 22 Da bi proučile doprinos oslobađanja ER-Ca 2+ oligodendroglialnoj ekscitotoksičnosti, stanice su bile izložene povećanim koncentracijama AMPA u prisutnosti ili odsutnosti CICR inhibitora TMB-8. 23 AMPA (25–100 µM ) izazvao je staničnu smrt 34, 1 ± 3, 6 do 52, 3 ± 3, 7% kontrole (neobrađene stanice, n = 4), što je značajno smanjeno u prisustvu TMB-8 (slika 2a). Međutim, selektivni inhibitor RyR ryanodin 9 nije bio zaštitni (Slika 2b).

Image

Inhibicija otpuštanja ER Ca 2+ smanjuje ekscitotoksičnost uzrokovanu AMPA i citosolno Ca2 + preopterećenje oligodendrocitima. ( a, b ) Toksičnost koju inducira AMPA značajno je smanjena TMB-8, ali ne i rjanodinom. Oligodendrociti (DIV 1) prethodno su tretirani s TMB-8 (50 µM , 30 min) ili ryanodinom (50 µM , 45 min) i izloženi povećanim koncentracijama AMPA u prisutnosti CTZ (100 µM ). 24 sata kasnije, održivost je kvantificirana kalcein-AM metodom. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM normaliziranih vrijednosti fluorescencije kalceina i AM za najmanje n = 4 kulture. Statistička značajnost procijenjena je t -testom ( * P <0, 05) i dvosmjernom analizom varijancije (ANOVA) ( P = 0, 034). ( c ) AMPA (25 µM ) zajedno s CTZ-om (100 µM ) inducira brzo povećanje citosolnog Ca2 +, što se značajno smanjuje u prisutnosti ryanodina (50 µM ) i TMB-8 (50 µM ) ali ne 2-APB (10 µM ). Neuroni su bili napunjeni s Fura-2 AM 30 minuta prije primjene lijeka. Tragovi predstavljaju vremenski tijek [Ca 2+ ] i (znači ± SEM) tijekom izlaganja agonistu tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Da bismo analizirali doprinos CICR-a, posebno RyR-a i IP 3 R-a, citosolnom Ca2 + uzrokovanom AMPA-om, mikroskopom smo izmjerili unutarstaničnu koncentraciju Ca2 + ([Ca 2+ ] i ) nakon primjene AMPA ( 25 μM ) do oligodendrocita u prisutnosti TMB-8 (50 μM ), ryanodina (50 μM) i inhibitora IP3R 2APB (10 μM). 24 U oligodendrocitima stimuliranim AMPA [Ca 2+ ] povećao sam se na 841 ± 65 nM ( n = 78 stanica), učinak koji je u velikoj mjeri smanjen u prisustvu TMB-8 (492, 3 ± 67, 4, n = 33 stanica) i ryanodina (264 ± 23 nM, n = 96 stanica; Slika 2c). Međutim, inhibicija IP3R od 2APB (10 µM) nije značajno oslabila [Ca2 + ] (Slika 2c). Ovi rezultati pokazuju da otpuštanje Ca 2+ kroz RyRs, ali ne i preko IP 3 R, doprinosi citosolnom preopterećenju Ca2 + izazvanom AMPA i ekscitotoksičnosti u oligodendrocitima.

Inhibicija RyRs atenuira mitohondrijsko oštećenje uzrokovano AMPA i aktiviranje kaspaze-3 u oligodendrocitima

Unos mitohondrija Ca 2+ tijekom ekscitotoksičnih uvreda uzrokuje membransku depolarizaciju kao i stvaranje reaktivnih vrsta kisika (ROS) u uzgojenim oligodendrocitima štakora. Kako mitohondriji i ER mogu međusobno komunicirati putem RyR-a, 25, analizirali smo može li inhibitor RyR-a oslabiti mitohondrijsku disfunkciju kao posljedicu ekscitotoksičnosti izazvane AMPA-om.

Prvo smo koristili DCFDA za mjerenje generacije ROS-a u oligodendrocitima stimuliranim AMPA (25 µM, 5 min) nakon 30 minuta vrijeđanja. U tim eksperimentalnim uvjetima, izloženost AMPA povećala je razinu ROS-a do 46, 9 ± 11, 2%, n = 7 u usporedbi s kontrolom (neobrađene stanice, 100%). Te su razine znatno oslabljene rijanodinom (10 µM ) na 11, 8 ± 6, 9%, n = 7 (slika 3a).

Image

Blokada RyR smanjuje oksidativni stres, mitohondrijsku depolarizaciju i apoptozu uzrokovanu AMPA. ( a ) Ryanodin smanjuje nastajanje RPA uzrokovanih AMPA u uzgojenim oligodendrocitima. Stanice su stimulirane s AMPA (25 µM , 5 min) plus CTZ (100 µM ) u prisutnosti ryanodina (10 µM ). Razine ROS-a kvantificirane su na 30 min nakon uvrede pomoću CM-H2DCFDA sonde (30 μM). Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM% CM-DCFDA / kalcein-AM n = 7 kultura. ( b ) Inhibicija otpuštanja ER Ca2 + putem RyRs smanjuje depolarizaciju mitohondrijske membrane izazvane AMPA. Stanice su stimulirane AMPA (25 µM , 5 min) i CTZ (100 µM ) u prisutnosti ryanodina (10 µM ), a potencijal mitohondrijske membrane mjeren je fluorescentnim bojama JC-1 1 sat nakon AMPA aplikacije. Podaci predstavljaju normalizirane vrijednosti ± SEM omjera JC-1 crvena / zelena fluorescencija n = 6 kultura. ( c ) Rascjep kaspaze-3 smanjuje se u prisutnosti rijanodina u oligodendrocitima stimuliranim AMPA. Stanice su bile izložene AMPA (25 µM , 5 min) plus CTZ (100 µM ) nakon preinkubacije s ryanodinom (10 µM ) i sakupljene 4 sata kasnije za detekciju propaspaze-3 Western blot-om. Podaci predstavljaju optičku gustoću nivoa propaspaze-3 normalizirane na vrijednosti β- aktina n = 4 kulture. ( d ) AMPA-inducirana aktivnost kaspaze-3 smanjena je u prisutnosti ryanodina. Stanice su bile izložene AMPA (25 µM , 5 min) i CTZ (100 µM ) i Caspase-Glo 3/7 reagens je dodan 1 sat kasnije. Nakon 2 sata izmjeren je luminescentni signal, a podaci predstavljaju prosječne vrijednosti ± SEM vrijednosti luminescencije normalizirane na vrijednosti životne sposobnosti (kalcein-AM, 1 μM ) za svako stanje n = 5 kultura. # P <0, 05, ## P <0, 01 u usporedbi s kontrolom (neobrađene stanice); * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom (samo AMPA), upareni Studentov t- test

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali je li mitohondrijska depolarizacija utjecala na ryanodin nakon ekscitotoksične uvrede. Oligodendrociti su stimulirani AMPA (25 µM , 5 min) i mjeren je potencijal mitohondrijske membrane 1 sat kasnije upotrebom fluorescentne boje JC-1. AMPA je inducirao u oligodendrocitima gubitak depolarizacije mitohondrijske membrane do 79, 01 ± 4% kontrole (neobrađene stanice, n = 6), što je značajno smanjeno ryanodinom (91, 6 ± 3, 8% kontrole, n = 6) (slika 3b).

Prethodna ispitivanja pokazala su da submaksimalna aktivacija AMPA receptora dovodi do apoptoze u oligodendrocitima. 6 Kako ovom procesu uglavnom prethodi disfunkcija mitohondrija i aktiviranje kaspaza, dalje smo analizirali da li oslobađanje ER-Ca 2+ kroz RyR doprinosi ovoj apoptotičkoj kaskadi. U oligodendrocitima stimuliranim AMPA (25 μM , 5 min), razina proteina pro-kaspaza-3 (neaktivno), 4 sata nakon podražaja, smanjena je na 57, 3% u usporedbi sa stanicama koje nisu tretirane (kontrola, 100%), svojstvo koje je inhibirano u prisutnosti ryanodina (107, 1% kontrole) (slika 3c). Kako bi se potvrdila aktivacija kaspaze-3, aktivnost odcijepljene kaspaze-3 kvantificirana je luminescentnim metodama. U oligodendocitima tretiranim AMPA (25 μM , 5 min) aktivnost rascijepanog kaspaze-3 povećala se na 120, 7 ± 2, 6% u usporedbi s kontrolom (neobrađene stanice, 100%), dok je liječenje ryanodinom značajno smanjilo aktivnost na 104, 3 ± 9, 8%, n = 5 (slika 3d) Ovi rezultati zajedno pokazuju da oslobađanje Ca Ca 2+ putem RyR doprinosi mitohondrijskoj disfunkciji i slijedi apoptozi.

AMPA posredovana ekscitotoksičnost izaziva reakciju ER na stres u oligodendrocitima

Neuroni su podvrgnuti stresnom stresu tijekom ekscitotoksičnosti izazvane Ca2 + dishomeostaze, 18, 19 efekt koji može biti posredovan RyRs. 26 Da bismo istražili da li AMPA inducira ER stres u kultiviranim oligodendrocitima, analizirali smo fosforilaciju eI2F α , nizvodnog cilja ER senzora stresa PERK, kao i regulaciju chaperona, poput proteina 78 reguliranog glukozom (GRP78) i GRP94, Podsticaj AMPA (25 µM , 5 min) stvorio je snažnu fosforilaciju eIF2 α , kao i thapsigargin (5 µM, 30 min), koji inducira iscrpljivanje skladišta blokirajući unošenje ER Ca 2+ i služi kao pozitivna kontrola (slika 4a), AMPA je pokrenuo porast peIF2 α na 474, 2 ± 107, 6%, n = 4, u usporedbi sa stanicama koje nisu tretirane (kontrola, 100%) (Slika 4b). Dalje smo analizirali razine proteina GRP78 i GRP94 tijekom iste ekscitotoksične inzulta i otkrili da su obje regulirane, do 169, 3 ± 38, 9 i 144, 5 ± 21, 8% kontrole (neliječene stanice, 100%), (Slika 4c). Ovi rezultati pokazuju da ekscitotoksične uvrede posredovane AMPA receptorima induciraju ER stres i naknadni UPR u uzgojenim oligodendrocitima.

Image

AMPA inducira reakciju na stres na oligodendrocite in vitro . ( a ) Excitotoksični uvredi izazivaju porast razine peIF2 α u oligodendrocitima. Stanice su stimulirane s AMPA (25 µM , 5 min) zajedno s CTZ (100 µM) i thapsigarginom (5 µM, 30 min), fiksiranim 30 min kasnije i obilježenim antitijelom protiv peIF2 α . Linija mjerila: 50 μ m. ( b ) Ukupni proteinski uzorci su ekstrahirani nakon inkubacije AMPA (25 μM , 5 min, A25) i razina eIF2 α i peIF2 α kvantificirana je Western blotom. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM optičke gustoće razine peIF2 α , normalizirane na vrijednosti β- aktina n = 4 kulture. ( c ) Eksitotoksičnost inducira povećanje regulacije GRP-aperone u oligodendrocitima. Ukupni proteinski uzorci su ekstrahirani 30 min nakon AMPA (25 µM , 5 min, A25) plus CTZ (100 µM) podražaja i GRP78 i GRP94 identificirani su Western blotom koristeći antitijelo protiv KDEL sekvence. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM vrijednosti optičke gustoće normalizirane na odgovarajući β- aktinski signal n = 8 kultura. * P <0, 01 u usporedbi s neliječenim stanicama; upareni Student's t -test

Slika pune veličine

AMPA proizvodi apoptozu ER-a izazvanu stresom u oligodendrocitima

Snažan ili produljen ER stres ugrožava održivost ćelijske smrti, mehanizam koji može biti uključen u patofiziologiju moždanih bolesti. 27 Da bismo analizirali da li izazvana ER apoptoza doprinosi ekscitotoksičnosti u oligodendrocitima, analizirali smo aktivaciju kaspaze-12, koja boravi na vanjskoj strani ER membrane i cijepa se i aktivira tijekom ER stresa. 17 Stanice stimulirane AMPA (25 i 100 µM , 5 min) podvrgnule su se cijepanju kaspaze-12 kako je naznačeno razinama pro-kaspaze-12, koje su smanjene na 80, 7 ± 4%, n = 8 i 65, 4 ± 15, 9%, n = 5, u usporedbi s netretiranim stanicama (100%), respektivno (Slika 5a). U prisutnosti ryanodina, cijepanje kaspaza-12 izazvano AMPA značajno je smanjeno na 101 ± 8, 3% kontrole, n = 7 (slika 5b).

Image

ER-ovisna apoptoza izazvana stresom pridonosi ekscitotoksičnosti. ( a ) AMPA (25 i 100 µM ) plus CTZ (100 µM ) inducira cijepanje kaspaze-12 ovisno o dozi. Stanice su stimulirane tijekom 5 minuta, ukupni proteinski ekstrakti su pripremljeni 1 sat kasnije i pro-kaspaza-12 je otkrivena Western blot koristeći specifično antitijelo. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM vrijednosti optičke gustoće kaspaze-12, normalizirane na vrijednosti β- aktina n = 8, a n = 5 kultura. ( b ) Rascjep pro-kaspaze-12 smanjen je u prisutnosti ryanodina (10 µM , 45 min) u oligodendrocitima stimuliranim AMPA. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM vrijednosti optičke gustoće kaspaze-12, normalizirane na vrijednosti β- aktina n = 8 kultura. ( c ) Smrt sa oligodendroglijom izazvanom AMPA smanjuje se salubrinal (Sal), inhibitorom apoptoze ER-stresa. Kultivirane stanice bile su izložene AMPA (25 μM , 5 min) i CTZ (100 μM ) nakon tretiranja sa Sal 10 i 50 μM tijekom 30 minuta. Da bi se odredilo staničnu smrt, 24 h kasnije koristilo se vitalno bojilo kalcein-AM ( n = 4 kulture). Podaci predstavljaju normalizirane vrijednosti ± SEM # P <0, 05; ## P <0, 01 u usporedbi s neliječenim stanicama. * P <0, 05 u odnosu na sam AMPA; upareni Student's t -test

Slika pune veličine

Konačno, analizirali smo je li ER-ovisna apoptoza uključena u ekscitotoksičnost AMPA. U tu svrhu testirali smo zaštitni potencijal salubrinala, inhibitora p-eIF2 α defosforilacije, za koji je dokazano da olakšava ER apoptozu stresa. 28 AMPA inducirana stanična smrt ublažena je s 13% kontrolne skupine (neliječene stanice, 0%) na 6, 4 ± 1, 3 i 7, 5 ± 2, 6% salubrinalnim tretmanima 10, odnosno 50 µM, respektivno (Slika 5c). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da AMPA inducira reakciju na stres u oligodendrocitima, što doprinosi ekscitotoksičnosti aktivacijom kaspaze-12, a to ovisi o RyRs.

Rasprava

ER Ca 2+ dishomeostaza, ER stres i neurodegeneracija usko su povezani jer iscrpljivanje ER skladišta uzrokuje pojačanje ER markera stresa i smrt neurona. 15 U ovom istraživanju pokazujemo da oslobađanje ER-Ca 2+ doprinosi citosolnom preopterećenju uzrokovanom AMPA i mitohondrijskoj disfunkciji što dovodi do apoptoze u oligodendrocitima. Uz to, pokazujemo da ekscitotoksične uvrede na oligodendrocite induciraju ER stres i aktivaciju kaspaze-12, što se smanjuje blokiranjem RyR-a. Ovi podaci pružaju nove dokaze o povezanosti ekscitotoksičnosti i ER stresa u oligodendrocitima.

Ekspresija RyR i IP 3 R u oligodendrocitima

IP3 Rs i RyRs su ekspresionirani u neuronima i gliji, a mobilizacija Ca2 + putem ovih receptora ima presudnu ulogu u signalizaciji Ca2 + u tim stanicama. 29 Međutim, većina prethodnih studija koja se odnose na ekspresiju ovih receptora u mozgu ne razlikuju različite izoforme ili stanične tipove. Da bismo procijenili ekspresiju RyRs i IP3R u oligodendrocitima in vitro , proveli smo eksperimente imunofluorescencije kako bismo ispitali prisutnost svih prethodno opisanih izoforma tih receptora u tim stanicama. Imuno obilježavanje za RyRs bilo je pozitivno za tri izoforme u kultiviranim oligodendrocitima, nalaz koji potvrđuje i proširuje one izviještene u prethodnoj studiji o ekspresiji RyR u tim stanicama koje nisu razlikovale različite izoforme. 21 Uz to, otkrili smo da su tri IP3 R izoforme prisutni i u oligodendrocitima, što je u velikoj mjeri u skladu s imunohistokemijskim ispitivanjima mozga štakora. 20

Oslobađanje i ekscitotoksičnost ER-Ca 2+

Prije smo pokazali 18 da oslobađanje ER-Ca 2+ doprinosi ekscitotoksičnosti neurona, ali još uvijek nema čvrstih dokaza o povezanosti između oslobađanja ER-Ca 2+ i ekscitotoksičnosti u oligodendrocitima. Nakon procjene prisutnosti RyR i IP3 R u oligodendrocitima in vitro , analizirali smo doprinos oslobađanja ER-Ca 2+ u citosolnom Ca2 + preopterećenju i staničnoj smrti uzrokovanoj ekscitotoksičnom inzultom. Prvo smo primijetili da prototipski intracelularni antagonist Ca2 + TMB-8, za koji se pokazalo da inhibira RyR-posredovani CICR, 23 prigušuje ekscitotoksičnu staničnu smrt u oligodendrocitima. Taj je rezultat u skladu s prethodnim istraživanjima provedenim u uzgojenim stanicama cerebelarne granule, koje su zaštićene od neurotoksičnosti glutamata TMB-8, 30 i sugerirale da bi ER mogao pridonijeti ekscitotoksičnosti izbacivanjem CICR-a u oligodendrocite izložene AMPA. Kod neurona, CICR uglavnom posreduje RyRs i premda ryanodin smanjuje ekscitotoksičnost u tim stanicama, 18 nismo primijenili konzistentni zaštitni učinak ovog antagonista u oligodendrocitima u korištenom eksperimentalnoj paradigmi. Međutim, inhibicija RyR-a značajno je smanjila citosolno preopterećenje citosolnim Ca2 + izazvanim AMPA u oligodendrocite, što je u skladu s prethodnim eksperimentima provedenim na neuronima i oligodendrocitima u kojima je dantrolen-antagonist RyR zaštitio ove stanice od kainske kiseline, amiloida β - i glutamata- inducirana toksičnost. 31, 32, 33 Za razliku od toga, pokazalo se da se IP 3 R mogu također regulirati citosolnim Ca2 + 10 i stoga sudjelovati u CICR-u. Međutim, liječenje stanica s 2APB, često korišteni IP3R inhibitor 24 nije utjecao na preopterećenje Ca2 + uzrokovanim AMPA-om u oligodendrocitima. Stoga, ovi podaci, zajedno s činjenicom da je TMB-8 smanjio i preopterećenje uzrokovano AMPA [Ca 2+ ], sugeriraju da aktivacija AMPA receptora izaziva CICR na RyR-selektivan način u oligodendroglialnim stanicama.

ER-mitohondrija presreće u ekscitotoksičnosti

Pokazano je da su ER i mitohondriji fizički i funkcionalno spojeni u smislu signalizacije Ca 2+ . 13 Konkretno, prethodni podaci sugeriraju da interakcije između poddomena koje uključuju RyRs u ER-u i mitohondrije omogućuju prijenos Ca2 + signala između ta dva organela. 25, 34 Štoviše, spajanje Ca 2+ između RyRs i mitohondrije uključeno je u aktivaciju putova mitohondrijske apoptoze. Kao i kod neurona, masivni priliv Ca 2+ nastao prekomjernom aktivacijom AMPA receptora u oligodendrocitima dovodi do depolarizacije mitohondrija, oksidativnog stresa i cijepanja kaspaze-3. 6 Ovi karakteristični događaji oštećenja mitohondrija oslabljeni su inhibicijom otpuštanja RyR-Ca 2+ u oligodendrocitima stimuliranim AMPA, što je u skladu s prethodnim rezultatima, koji su pokazali da otpuštanje Ca 2+ posredovano s RyR i IP 3 aktivira mitohondrijski apoptotski put u neurona izloženih β-amiloidu 35 ili NMDA. 18 Ovi rezultati pokazuju da iako zaštitni učinak ryanodina nije izravno primijećen, on ometa molekularne mehanizme koji dovode do smrti oligodendrocita i stoga sugeriraju da RyC-posredovani CICR doprinosi oštećenju mitohondrija i apoptozi tijekom eksitotoksičnosti oligodendroglija.

Eksitotoksičnost i ER stres u oligodendrocitima

Jaki ER stres i neurodegeneracija usko su povezani jer aktiviranje UPR i poremećaj homeostaze ER Ca 2+ može dovesti do apoptoze neurona. 15 Konkretno, ekscitotoksične uvrede izazivaju ER stres i naknadni UPR u neuronima. 18, 19 Nadalje, oslobađanje Ca Ca 2+ putem RyR-a regulira ovaj stresni odgovor u neuronima. 18

Oligodendrociti sintetiziraju veliku količinu proteina tijekom mijelinacije i kao posljedica toga su vrlo osjetljivi na poremećaj sekretornog puta i ER homeostazu. Nedavno su pronađeni putovi aktiviranog ER stresa kod nekih naslijeđenih poremećaja mijelina i MS 7, ali malo se zna o tome kako se ER stres aktivira u tim stanicama u patološkim uvjetima. Naši rezultati pokazuju da ekscitotoksične uvrede posredovane AMPA receptorima induciraju aktivaciju UPR u oligodendrocitima, vjerojatno zbog poremećaja homeostaze Ca 2+ . Kao što je prethodno opisano kod neurona izloženih kainatu 19 i NMDA, 18, primijetili smo brzu aktivaciju eIF2 α puta, što je također pokazalo da štiti od eksperimentalnog autoimunog encefalomielitisa (EAE) izazvanog oligodendrocitnom smrću i demijelinizacijom. 36 Uočena je i regulacija GRP78 i GRP94, što je karakterističan događaj UPR-a povezanog s neuronskim ozljedama, 27 koji se također nalazio u MS demijeliniziranim lezijama 37 i u skladu s rezultatima dobivenim od neurona koji su bili izloženi ekscitotoksičnim uvredama. 18, 19

Pored UPR-a, ovdje prikazani rezultati sugeriraju da stimulacija AMPA receptora u kultiviranim oligodendrocitima inducira ER apostatsku smrt uzrokovanu stresom. Umanjena stanična smrt uzrokovana AMPA smanjena je u prisutnosti salubrinala, inhibitora p-eIF2 α deposforilacije i ER apoptoze izazvane stresom. 28 Liječenje salubrinalom prethodno je pokazalo da ublažava gubitak i okomodendrocite uzrokovane IFN- y i hipomijelinizaciju. 36 U skladu s ER-uzrokovanom apoptozom stresa, AMPA je uzrokovala cijepanje kaspaze-12 u oligodendrocitima, događaj koji je primijećen u modelima neurodegeneracije izazvanih ER-om 17, 38 i posebno u neuronima tijekom ekscitotoksičnosti. 19 Nadalje, inhibicija kaspaze-12 tijekom ekscitotoksičnosti je inhibirana kada je RyRs bio blokiran rijanodinom, što ukazuje da oslobađanje ERPA-Ca 2+ uzrokovano AMPA može izazvati apoptozu kroz neovisne mitohondrije.

Ukratko, ovdje navedeni rezultati pokazuju da oslobađanje ER-Ca 2+ putem RyRs doprinosi oligodendroglialnoj ekscitotoksičnosti in vitro . U oligodendrocitima stimuliranim AMPA inhibicijom otpuštanja ER-Ca 2+ dolazi do slabljenja preopterećenja citosolnim Ca2 +, oštećenja mitohondrija i apoptoze. Pored toga, naši podaci pružaju dokaz da ekscitotoksične inzultacije posredovane AMPA receptorima induciraju reakciju reakcije na stres u tim stanicama, koje doprinose ekscitotoksičnosti aktiviranjem kaspaze-12, ovisnim o RyR, a time i putom apoptoze specifične za ER.

Eksitotoksičnost glutamata relevantna je za demijelinizacijske poremećaje središnjeg živčanog sustava, uključujući MS. Ovu ideju podržavaju podaci koji pokazuju da antagonisti AMPA i kainatskih receptora ublažavaju neurološke simptome u nekoliko oblika EAE 39 koji se koriste za modeliranje različitih stadija MS. Međutim, još nije procijenjen doprinos oslobađanja ER-Ca 2+ oligodendroglialnoj ekscitotoksičnosti. Dakle, naša otkrića pokazuju da oslobađanje ER-Ca 2+ putem RyR-a i kasnije ER stres nakon uvreda glutamata doprinose ekscitotoksičnosti oligodendrocita. Uz to, molekularni posrednici ER stresa otkriveni u ovom istraživanju mogu predstavljati kandidatne mete za neurodegenerativne i demijelinizirajuće bolesti koje su podvrgnute oligodendroglijskoj ekscitotoksičnoj smrti.

Materijali i metode

životinje

Svi su pokusi provedeni pod nadzorom i uz odobrenje našeg internog odbora za etiku životinja (Sveučilište Baskije, UPV / EHU). Sa životinjama se postupalo u skladu s Direktivom Vijeća Europskih zajednica. Učinjeni su svi mogući napori da se patnja životinja i broj korištenih životinja svedu na najmanju moguću mjeru.

Reagensi

AMPA, ciklotiazid (CTZ) i ryanodin dobiveni su iz Ascent Scientific (Bristol, Velika Britanija). Calcein-AM (kalcein acetoksimetil ester), CM-H2 DCFDA i JC-1 kupljeni su od tvrtke Invitrogen (Barcelona, ​​Španjolska). HBSS, poli-D-lizin i TMB-8 dobiveni su od Sigme (St Louis, MO, USA), a salubrinal i 2-APB iz Calbiochem (Merck Chemicals, Nottingham, UK).

Kulture optičkih živaca

Primarne kulture oligodendrocita dobivene iz vidnih živaca 12-dnevnih štakora Sprague-Dawley (obično 8-10 životinja po kulturi) dobivene su kao što je prethodno opisano, 40 s modifikacijama. 22 Stanice su ugrađene u gustoći navedenoj ispod za svaki eksperimentalni postupak, u ploče s 24 jažica koje nose poli-D-lizin (10 µg / ml) obložene poklopce promjera 12 ili 14 mm i održavane na 37 ° C i 5% CO 2 u kemijski određenom mediju. 40

Analiza toksičnosti

Ispitivanja toksičnosti za stanicu izvedena su kao što je prethodno opisano 41 uz modifikacije. Stanice (1 × 10 4 po jažici u jednom danu in vitro (DIV1) bile su izložene AMPA plus CTZ (100 μM ) u prethodno opisanom mediju 40 tokom 5 minuta na 37 ° C. Antagonisti su bili prisutni prije i za vrijeme ekscitotoksične inzulta a vitalnost stanica procijenjena je 24 sata kasnije pomoću fluorimetrijskog ispitivanja kalcein-AM.Svi pokusi su izvedeni u triplikatu / četverostrukom, a dobivene vrijednosti su normalizirane srednje ± SEM od najmanje tri neovisna eksperimenta.

Mjerenja potencijala unutarćelijske ROS i mitohondrije

Oligodendrociti (DIV 1; 1 × 10 4 po jažici su stimulirani s AMPA 25 µM plus CTZ 100 µM u trajanju od 5 minuta u odsustvu ili prisutnosti ryanodina (10 µM , 45 min) i napunjeni sa 5- (i-6 ) -hlorometil-2'7'-diklordihidrofluorescein diacetat acetil ester (CM-H2 DCFDA) u trajanju od 30 minuta za mjerenje generiranog ROS-a. Kalcein-AM (1 µM ) korišten je za kvantificiranje broja stanica u polju za čitanje i fluorescencija je izmjerena kao što je prethodno opisano. 42 Za kvantificiranje potencijala mitohondrijske membrane, stanice su bile napunjene 30 min nakon ekscitotoksičnog podražaja pomoću JC-1 boje za 15 min i izmjeren je omjer crvene / zelene fluorescencije. Navedene vrijednosti su normalizirana srednja vrijednost ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa.

Kvantifikacija aktivnosti kaspaze-3

Oligodendrociti (1 × 10 4 po jažici) su stavljeni na pločice s 96 jažica obloženih poli-D-lizinom i nakon jednog dana in vitro stanice su izložene AMPA 25 μM plus CTZ 100 μM 5 minuta u prisutnosti ili odsutnost ryanodina. Nakon 1 sata dodan je supstrat Caspase-Glo -3/7 (Promega, Madison, WI, USA), a nakon 2 sata aktivnost kaspaze-3 izmjerena je prema uputama proizvođača. Svi su pokusi izvedeni u tri primjerka, a podaci su prosječni ± SEM vrijednosti luminiscencije normalizirane na vrijednosti životne sposobnosti (kalcein-AM, 1 μM ) za svako stanje.

fosforilacija

Za IP3 Rs i RyRs analizu ekspresije 1 DIV oligodendrociti su fiksirani s 4% paraformaldehida 20 minuta i permealizirani u 1% BSA, 1% normalnom serumu, 0, 05% Triton X-100 u PBS u trajanju od 30 minuta. Zatim su stanice blokirane u 10% BSA, 1% normalnog seruma u PBS-u tokom 1 h i inkubirane prvo s anti-MBP antitijelom (1: 500, Stenberger Monoclonals Inc., Baltimore, MD, SAD) 1 sat na sobnoj temperaturi u 1% BSA, 1% normalnog seruma u PBS-u. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su obilježene 2 sata pri RT sa Alexa Fluor 594-konjugiranim IgG (1: 200, Molekularne sonde, Invitrogen, Barcelona, ​​Španjolska). Stanice su isprane u PBS-u i inkubirane preko noći na 4 ° C s primarnim antitijelom: anti-IP3RI (1: 1000, Affinity Bioreagents, Rockford, IL, SAD); anti-IP 3 R-II (1: 50, Biotehnologija Santa Cruz, Heidelberg, Njemačka); anti-IP 3 R-III (1: 1000, Chemicon, Millipore Iberica, Madrid, Španjolska); anti-RyR-I (1: 1000, Chemicon); anti-RyR-II (1: 1000, Chemicon); anti-RyR-III (1: 50, Biotehnologija Santa Cruz). Nakon ispiranja s PBS-om, dodano je sekundarno antitijelo konjugirano na Alexa Fluor 488 (1: 200, Molekularne sonde) tijekom 1 sata, a zatim je obojeno Hoechst 33258 (5 μg / ml, 10 min). Konačno, pokrivači su isprani u PBS-u, montirani na sredstvu za ugradnju glicergela (Dako, Glostrup, Danska) i analizirani konfokalnom mikroskopijom laserskog skeniranja (Olympus Fluoview FV500, Barcelona, ​​Španija). Kontrole bez primarnog antitijela nisu pokazale obojenje.

Za kvantifikaciju peI2F α , anti-peI2F a (1: 100, stanična signalizacija, Denvers, MA, SAD) korišteno je kao primarno antitijelo i bojenje je izvedeno kao gore.

Western blotting

Stanice (1 × 105) su isprane fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS, 0, 1 M) i sabrane u 20 μl pufera s uzorkom ledeno hladne elektroforeze. Lizeti su kuhani 10 min i razdvojeni 10–15% SDS-poliakrilamid gel elektroforezom, ovisno o eksperimentu. Uzorci su preko noći preneseni u nitroceluloznu membranu (Hybond ECL, Amersham Biosciences, Barcelona, ​​Španjolska), blokirani u 5% obranom mlijeku, 5% serumu u TTBS i proteinima otkrivenim specifičnim primarnim antitijelima u 5% BSA u TTBS preko noći na 4 ° C: anti-kaspaza-3 (1: 1000, Biotehnologije, Santa Cruz); anti-peIF2 a i anti-eIF2 α (1: 1000, stanična signalizacija); anti-KDEL (Grp78, Grp94) (1: 1000, Stresgenski bioreagensi, Ann Harbor, MI, SAD); anti-kaspaza-12 (1: 1000, Calbiochem); anti- p- aktin (1: 2000, Sigma). Nakon ispiranja membrane su inkubirane s sekundarnim antitijelom konjugirane peroksidazom iz hrena (1: 2000, Sigma) u 5% obranog mlijeka, 1% normalnog seruma u TTBS tijekom 2 sata i razvijane korištenjem poboljšane hemiluminiscencije prema uputama proizvođača (SuperSignal West Dura, Pierce, Rockford, IL, SAD). Signali su kvantificirani pomoću Image-J softvera (NIH, Bethesda, MA, SAD) i vrijednosti su normalizirane na β- aktinski signal i dobivene kao prosjek ± SEM za najmanje tri neovisna eksperimenta.

Mjerenje [Ca 2+ ] i

Koncentracija unutarćelijskog Ca2 + ([Ca2 + ] i ) određena je kao što je prethodno detaljno opisano. 6, 43 oligodendrocita (10 4 po jažici) je prethodno inkubirano s fura-2 AM (Invitrogenom) na 5 µM u mediju za kulturu 30–45 min na 37 ° C. Antagonisti su kontinuirano perfuzirani 5 minuta prije i za vrijeme stimulacije AMPA plus CTZ. ([Ca 2+ ] i ) procijenjena je metodom omjera 340/380, a podaci su analizirani programima Excel (Microsoft; Seattle, WA, SAD) i Prism (Lake Forest, Kalifornija, SAD).

Analiza podataka

Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM ( n ), gdje se n odnosi na broj ispitivanih kultura, a svaka je dobivena iz različite skupine životinja. U [Ca2 + ] i eksperimentima s mjerenjima, n se odnosi na broj stanica dobivenih iz najmanje tri različite kulture dobivene iz različitih skupina životinja. Statistička analiza provedena je dvosmjernom analizom varijancije ili uparenim Studentovim testom, a značaj je određena na P <0, 05.

Glosar

ER

endoplazmatski retikulum

RyR

ryanodin receptor

IP 3 R

receptor inozitol trifosfat

AMPA

a -amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol-propionat

VIKR

Otpuštanje Ca 2+ Ca 2+

ROS

reaktivne vrste kisika

eIF2 α

α podjedinica faktora eukariotske inicijacije 2

Grp78

protein reguliran glukozom 78

MS

Multipla skleroza