Intracelularne reaktivne vrste kisika su ključne za vitalnost ovisne o il-7 posredovanoj s pi3k / akt / mtor t-staničnim akutnim stanicama limfoblastične leukemije | leukemija

Intracelularne reaktivne vrste kisika su ključne za vitalnost ovisne o il-7 posredovanoj s pi3k / akt / mtor t-staničnim akutnim stanicama limfoblastične leukemije | leukemija

Anonim

teme

  • Akutna limfocitna leukemija
  • Stanična signalizacija
  • interleukina

Sažetak

Interleukin-7 (IL-7) aktivira cilj fosfoinozid 3-kinaza / Akt / sisavca put rapamicina (PI3K / Akt / mTOR) i tako posreduje vitalnost, proliferaciju i rast ćelija akutne limfoblastične leukemije T-stanica. Reaktivne vrste kisika (ROS) mogu se regulirati faktorima rasta i poznato je da reguliraju proliferaciju i održivost. Ovdje pokazujemo da IL-7 pojačava ROS u T-ALL stanicama na način koji je ovisan o aktivnosti PI3K / Akt / mTOR puta i koji se oslanja i na NADPH oksidazu i na mitohondrijski respiratorni lanac. Suprotno tome, IL-7-inducirana aktivacija PI3K signalnog puta zahtijeva mitohondrijsko disanje i ROS. Prethodno smo pokazali da IL-7 posredovana aktivacija PI3K putanje pokreće reguliranje transportera glukoze Glut1, promičući unos glukoze u T-ALL stanice. Koristeći floretin za inhibiranje funkcije Glut, pokazujemo da je unos glukoze obvezan za povećanje ROS-a u T-ALL stanicama tretiranim IL-7, sugerirajući da IL-7 stimulacija dovodi do povećanja ROS-a putem aktivacije PI3K puta i posljedičnog uguliranja Glut1 i unosa glukoze, Općenito, naši podaci otkrivaju postojanje kritične preslice između PI3K / Akt signalnog puta i ROS-a koji je ključan za preživljavanje T-ALL-posredovanih IL-7 i koji može predstavljati novi cilj terapijske intervencije.

Uvod

Unatoč sve većoj svjesnosti potencijalnog značaja mikroekoloških okoliša za pokretanje i napredovanje hematoloških malignih oboljenja, stvarna važnost i regulacija tumorageneze od strane određenih znakova i dalje je u velikoj mjeri nedefinirana. Bez obzira na to, nekoliko dokaza dokazuje da interleukin-7 (IL-7) ima značajnu ulogu u leukemiji T-stanica. 1 Na primjer, in vitro studije pokazale su da IL-7 potiče preživljavanje i proliferaciju T-staničnih akutnih limfoblastičnih leukemija (T-ALL) stanica 2, 3, 4, 5 i transgenih IL-7 transgenih miševa razvijaju limfoidne malignitete. 6, 7

Signalni put fosfoinozid 3-kinaze (PI3K), koji regulira preživljavanje, proliferaciju, rast i pokretljivost, deregulira se u brojnim karcinomima ljudi, uključujući mijeloidne leukemije 8, 9 i T-ALL. 10 Prije smo pokazali da se IL-7 oslanja na PI3K i njegov nizvodni cilj, cilj sisavaca rapamicin (mTOR), ne samo da promiče proliferaciju i održivost T-ALL stanica, već i da povećavaju Glut1, povećaju unos glukoze i potaknu leukemiju rast stanica. 3, 5

T-SVE stanice pokazuju povišene razine reaktivnih kisikovih vrsta (ROS). 10 ROS-a očito su uključeni u zloćudnu transformaciju 8, 11 i mogu funkcionirati kao drugi glasnici. 12 Nakon vezivanja liganda, širok raspon receptora inducira stvaranje unutarćelijskog ROS-a, kao što je vodikov peroksid (H202) i superoksid (O2 • - ), 13, 14 koji mogu reverzibilno inaktivirati fosfatazu i tenzinski homolog i aktivirati fosfoinozitid 3-kinaza (PI3K) / Akt put. 15, 16, 17

U ovom istraživanju istražili smo potencijalnu ulogu ROS u transdukciji signala posredovanih IL-7 u T-ALL stanicama. Primijetili smo da su razine ROS-a u T-ALL stanicama regulirane IL-7 stimulacijom, te da je signalizacija IL-7 održavala životnu sposobnost leukemije na ROS-ovisan način. Nadalje, ROS je bio kritičan za aktiviranje IL-7 aktiviranja PI3K / Akt / mTOR signalnog puta, na način koji je ovisio o respiratornom lancu mitohondrija. Reciprocally, PI3K / Akt / Glut os bila je obvezna za IL-7 posredovanu uporgulaciju ROS u T-ALL stanicama, koja se oslanjala i na disanje mitohondrija i na NADPH oksidazu.

Materijali i metode

Stanice

T-ALL stanice dobivene su iz periferne krvi i / ili koštane srži dijagnostičkih pedijatrijskih bolesnika s visokim stupnjem leukemije (> 85%) i obogaćene centrifugiranjem gustoće preko Ficoll-Paquea (GE Healthcare, Carnaksid, Portugal). Normalne mononuklearne stanice periferne krvi izolirane su iz periferne krvi zdravih davatelja. Za sve zbirke uzoraka dobiveni su pisani informirani pristanak i odobrenje institucionalnog odbora za reviziju. Stanice TAIL7 imaju značajne sličnosti s primarnim T-ALL uzorcima. 18

In vitro kultura

IL-7-lišene TAIL7 stanice ili primarne T-ALL stanice uzgajane su kao 2 × 106 stanica / ml na 37 ° C uz 5% C02 u mediju RPMI-1640 uz dodatak 1% fetalnog goveđeg seruma i inkubirane sa ili bez 10 ng / ml IL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, SAD). Gdje je naznačeno, kulturi su dodani sljedeći: kloni protutijela α -IL7 M25 (7, 5 μg, ljubazno osigurao dr. Cindy Willis, AMGEN, Cambridge, Velika Britanija); LY294002 (10 μM, Calbiochem, San Diego, Kalifornija, SAD); rapamicin (100 n M, Sigma, Sintra, Portugal); p-merkaptoetanol (βME, 500 μM, Sigma-Aldrich, Sintra, Portugal); pirolidin ditiokarbamata (PDTC, 500 n M, Sigma, Sintra, Portugal); floretin (50 μM, Calbiochem); H202 (različite doze kako je naznačeno, Merck, Nottingham, Velika Britanija); SP600125 (10 μM, Calbiochem); desferrioksamin (1 mM; Sigma-Aldrich); rotenon (50 n M, Sigma-Aldrich); i apocinin (10 μM, Calbiochem). U određenim eksperimentima, stanice TAIL7 tretirane su 30 minuta s H20 i glukoznom oksidazom da bi se postigla razina H2O2 u stabilnom stanju, kako je opisano. 19 stanica je isprano fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom i uzgajano u normalnim uvjetima tijekom 48 sati. Mononuklearne stanice periferne krvi kultivirane su dva dana s forbolom 12-miristat 13-acetatom (10 ng / ml, Sigma-Aldrich) i ionomicinom (1 μg / ml, Sigma-Aldrich), zatim isprane i uzgajane najmanje 24 h u mediju sa 10 U / ml rhIL-2 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Njemačka).

Određivanje nivoa unutarćelijskih ROS

Stanice se inkubiraju 15 min M diklorfluorescejn diacetatom (Sigma-Aldrich) 15 min na 37 ° C, isperu i analiziraju protočnom citometrijom. Uzorci su nabavljeni u protočnom citometru FACSCalibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, SAD) i analizirani s FlowJo softverom (Tree Star, Ashland, OR, USA).

Analiza potencijala mitohondrijske membrane

Stanice se inkubiraju sa 100 nM tetrametil-rodamin etil-ester perhloratom (Sigma-Aldrich) 15 min na 37 ° C i analiziraju protočnom citometrijom.

Procjena održivosti stanica

Određivanje vitalnosti stanica izvršeno je primjenom priloga za otkrivanje apoptoze temeljenog na prilogu V prema uputama proizvođača (R&D sustavi, Minneapolis, MN, USA), ili procijenjeno veličinom ćelije (FSC) prema analizama protočne citometrije složenosti / granulositeta (SSC).,

Kratkoročni eksperimenti sa signalizacijom

ILIL-lišene TAIL7 stanice dvaput su isprane fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom i inkubirane su naznačena razdoblja na 37 ° C, prethodno zagrijanom fiziološkom otopinom, fosfatom (nestimuliranom), 50 ng / ml IL-7 ili 1 m MH 2 O 2 . U definiranim eksperimentima, stanice su prethodno inkubirane u RPMI sa 500 µMPME 2 h 30 min, 50 n M rotenona tokom 1 sata ili 10 µM apocinina tijekom 1 sata. Reakcije su zaustavljene stavljanjem uzoraka na led. Stanice su isprane dvaput fiziološkom otopinom hladne fosfate i lizirane za mononuklearne stanice periferne krvi su stimulirane kao što je prethodno opisano. 20

imunoblatin

Stanični lizati su pripravljeni kako je opisano. 21 Proteini su analizirani pomoću 10% natrijeve dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeze, izbrisani na nitroceluloznu membranu (Bio-Rad, Amadora, Portugal) i ispitivani odgovarajućim antitijelima uzgojenim protiv: ZAP-70 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA) ), aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD) i p-Akt (S473), p-GSK3β (S9), p-FOXO3a (T32) i p-S6 (S235 / 236) (Stanična signalizacija, Danvers, MA, SAD). Otkriveni su imuni kompleksi s odgovarajućim sekundarnim antitijelima konjugiranim peroksidazom iz hrena.

Statistička analiza

Razlike između populacija izračunate su dvostrukim Wilcoxonovim testom s potpisom. P- vrijednost manja od 0, 05 smatrala se značajnom.

Rezultati

IL-7 poništava unutarćelijski ROS u T-ALL stanicama

Zabilježeno je da su povećane razine ROS-a i smanjivanje ROS-a koji uklanjaju antioksidans i antioksidantne enzime povezane s karcinomom. 22 Otkrili smo da primarne T-ALL stanice imaju visoku razinu unutarćelijskog ROS-a koja je važna za održavanje leukemije. 10 Kao što smo prethodno pokazali da je IL-7 kritičan za širenje i održivost T-ALL stanica in vitro , 5 upitali smo može li razina ROS-a regulirati IL-7 u stanicama leukemije. Kultivirali smo IL-7 ovisnu T-ALL staničnu liniju, TAIL7 i primarne T-ALL stanice, s 10 ng / ml IL-7 tijekom 72 sata i primijetili da signalizacija posredovana IL-7 može povisiti razine unutarstaničnog ROS-a. (Slika 1a). Da potvrdimo da je regulacija ROS-a u T-ALL stanicama rezultat specifičnog vezanja IL-7 na IL-7R, koristili smo anti-IL-7 neutralizacijsko antitijelo, koje je preokrenulo IL-7-posredovanu ROS uregulaciju (Slika 1c). Nadalje, otkrili smo da su svi analizirani uzorci pozitivni na IL-7Rα ( n = 7) povećali razinu endogene ROS u prisutnosti IL-7 (slike 1b, c i e), dok je jedini uzorak leukemije u našem istraživanju kojem nedostaje IL- 7Rα nije mijenjao nivo unutarstaničnog ROS-a na kulturi IL-7 (slika 1d).

Image

IL-7 povisuje razinu ROS-a u T-ALL stanicama. Stanice TAIL7 ( a ) i primarni IL-7R-pozitivni ( b, c ) ili IL-7R-negativni ( d ) T-ALL uzorci uzgajani su 72 h sa ili bez IL-7 (10 ng / ml) i obojeni sa redoks osjetljivu boju diklorfluoresceinski diacetat. Intracelularne razine ROS-a izražene su kao srednji intenzitet fluorescencije (MIF) unutar populacije živih stanica. ( c ) U jednom IL-7R-pozitivnom T-ALL uzorku, IL-7 kulturi dodano je antitijelo koje blokira α-IL7 (M25, 7, 5 μg). ( e ) Svi analizirani slučajevi pozitivni na IL-7R ( n = 7) pokazali su porast razine ROS nakon stimulacije IL-7 ( P = 0, 0156; test s rangom s Wilcoxonom s potpisom). Intracelularne razine ROS-a normalizirane su na srednju kontrolu i prikazane su kao prosjek ± sem

Slika pune veličine

Za preživljavanje T-ALL stanica posredovanih IL-7, potrebna je regulacija ROS-a putem NADPH oksidaznog kompleksa i respiratornog lanca

Zatim smo istražili utjecaj ROS na preživljavanje T-ALL-a posredovanih IL-7 pomoću ROS-a za uklanjanje βME i PDTC. Prvo smo potvrdili da je porast razine ROS u T-ALL stanicama uzgojenim IL-7 poništen dodatkom βME i PDTC (Slike 2a i b i Dodatna slika S1A). Potom smo ispitali da li vitalnost staničnih T-ALL posredovanih IL-7 ovisi o stvaranju ROS-a. βME je potpuno ukinuo održavanje mitohondrijskog membranskog potencijala od IL-7 (slika 2c) i inhibirao vitalnost T-ALL stanica koje su uzgajane IL-7, što je određeno FSC × SSC diskriminacijom (slika 2d) i aneksinom V-FITC / PI bojenje (slika 2e). Slično tome, PDTC liječenje je u potpunosti spriječilo preživljavanje T-ALL-a posredovanih IL-7 (dopunska slika S1B). Ovi rezultati pokazuju da je regulacija unutarstaničnog ROS kritična za preživljavanje T-ALL stanica posredovanih IL-7.

Image

Opipavanje ROS-a o mitohondrijalnom disanju i NADPH oksidazi obvezno je za održivost stanica T-ALL posredovanih s IL-7. Stanice TAIL7 ( b - d, f, g ) i primarni T-ALL uzorci ( a, e ) uzgajani su 72 h sa ili bez IL-7 (10 ng / ml), sami ili plus 500 µM βME ( a - e ), 10 μM apocinina ( f, g ) ili 50 n M rotenona ( f, g ). ( a, b ) Učinak βME na reguliranje ROS-a posredovanog IL-7. Stanice su obojene redovno osjetljivim bojama na diklorofluoresceinski diacetat, a razine unutarćelijskog ROS-a izražene su kao MIF u živoj populaciji. ( b ) Razina unutarćelijskog ROS-a u svakom naznačenom stanju normalizirana je na sredinu sama i prikazana je kao prosjek ± sem od sedam neovisnih pokusa. ( c - e ) Učinak βME na preživljavanje T-ALL stanica posredovanih s IL-7. ( c ) Potencijal mitohondrijske membrane procijenjen je korištenjem lipofilnog bojila tetrametil-rodamin etil estera perklorata i izražen kao MIF ukupne populacije. Vijabilnost je određena FSC × SSC diskriminacijom ( d ) ili dodavanjem V-FITC-a i bojenjem propidijum-jodidom ( e ). Ukazan je postotak održivih stanica u dva analiziranog bolesnika. ( f, g ) Učinak respiratornog lanca mitohondrije i aktivnosti NADPH oksidaze na IL-7 posredovanu regulaciju ROS i T-ALL preživljavanja stanica. ( f ) Stanice su obojene diklorofluorescentnim diacetatom, a razine unutarćelijskog ROS-a izražene su kao MIF u živoj populaciji. ( g ) Stabilnost stanica određena je FSC × SSC i izražena kao postotak održivih stanica. Rezultati su reprezentativni za najmanje tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Zatim smo pokušali utvrditi stanični izvor ROS-a nakon stimulacije IL-7. Kompleks NADPH oksidaze povezan s membranom (NADPH / NADP + ) i respiratorni lanac mitohondrija elektrona dva su glavna unutarćelijska izvora ROS u stanici. Stoga smo procijenili njihovu ulogu u modulaciji razine unutarćelijskog ROS-a u T-ALL stanicama stimuliranim IL-7. Zanimljivo je da obje inhibicije kompleksa I dišnog lanca s rotenonom i demontaža NADPH podjedinica s apocininom ukidaju IL-7-posredovano povišenje unutarstaničnih razina ROS (Slika 2f). Zatim smo procijenili njihov utjecaj na preživljavanje leukemijskih stanica nakon stimulacije IL-7 i otkrili smo da su oba inhibitora poništila IL-7 posredovanu vitalnost T-ALL stanica (Slika 2g). Ovi rezultati sugeriraju da su NADPH oksidazni kompleks i respiratorni lanac uključeni u nastanak unutar-staničnog ROS-a posredovanog IL-7 koji su ključni za održivost leukemijskih stanica.

Dodavanje egzogenih H2O2 nije dovoljno za promicanje održivosti T-ALL stanica

Da bismo procijenili može li egzogeni ROS oponašati stimulaciju IL-7 u T-ALL stanicama, tretirali smo stanice TAIL7 povećanim dozama H202, koristeći davanje u stabilnom stanju 19 i procijenili održivost na 48 h kulture. Naši podaci otkrili su da egzogeno dodavanje H202 nije dovoljno za promicanje održivosti T-ALL stanica i izazvalo je apoptozu u višim dozama (dopunska slika S2A).

Da bismo razumjeli razliku između tretmana H2O2 i IL-7 u održivosti T-ALL stanica, uspoređivali smo signalne putove aktivirane od svakog podražaja. Fosforilacija Akt na S473, neophodna za Akt punu aktivaciju, dogodila se u roku od 15 min, i sa H2O2 i IL-7 stimulacijom (dopunska slika S2B). Također, GSK3 i FOXO, koji su izravni Akt ciljevi, fosforilirani su oba podražaja (dopunska slika S2B), što ukazuje da H2O2 može učinkovito dovesti do aktiviranja PI3K / Akt puta. Suprotno tome, H20 nije uspio oponašati IL-7 u aktiviranju STAT5 u stanicama TAIL7 (dopunska slika S2B).

H20 je opisan kao aktivator proteinskih kinaza koje se aktiviraju stresom. 23 U skladu s tim, otkrili smo da je H20, ali ne i IL-7, rezultirao aktiviranjem pro-apoptotske signalne molekule c-Jun N-terminalne kinaze (dopunska slika S2B). Iznenađujuće je da inhibicija c-Jun N-terminalne kinaze potencira smrt H20-inducirane stanice umjesto da je spriječi (dopunske slike S3A, B) na sličan način kao efekt blokade PI3K (dopunska slika S2B). Međutim, otkrili smo da je inhibicija lizosomalnog poremećaja upotrebom desferrioksamina značajno preokrenula H2O2-induciranu TAIL7 staničnu smrt (dopunska slika S3C). Ovi su rezultati u skladu s prethodnim istraživanjima 24 i ukazuju na to da je lizosomski poremećaj, umjesto da je c-jun-N-terminalna kinaza u stanicama aktivirana stresom, uključen u promicanje T-ALL stanične smrti nakon bolusne H2O2 stimulacije. Što je još važnije, naši podaci sugeriraju da iako je ROS neophodan za preživljavanje T-ALL stanica posredovanih IL-7, dodavanje egzogenih H2O2 po sebi nije dovoljno da oponaša učinke IL-7 na preživljavanje.

IL-7 aktivira PI3K / Akt signalni put na ROS-ovisan način

Aktiviranje PI3K / Akt signalnog puta obvezno je za IL-7 posredovanu održivost T-ALL stanica. 5 Kako je H2O2 uspio potaknuti Akt fosforilaciju, sljedeće smo pitali je li ROS pridonijeo održivosti T-ALL stanica ovisnih o IL-7 reguliranjem PI3K / Akt signalizacije. Prethodna obrada stanica TAIL7 s βME ili PDTC (slika 3a i dodatna slika S1C) ukinula je fosforilaciju ovisnu o IL-7 ovisnu o Akt. Suprotno tome, STAT5 fosforilacija nije utjecala (slika 3a). Stoga se čini da IL-7-ovisna Akt fosforilacija selektivno zahtijeva sudjelovanje ROS-a u T-ALL stanicama. Međutim, kratkotrajnom stimulacijom IL-7 nije uspjelo povisiti endogene razine ROS-a (slika 3b). To može nagovijestiti da postoji manja, lokalizirana, regulacija ROS-a na staničnoj membrani 25, 26 nakon stimulacije IL-7, što je dovoljno za promicanje Akt fosforilacije, ali nedovoljno za prepoznavanje diklorofluoresceinskog diacetata. Alternativno, iako manje vjerovatno, može doći do regrutovanja ROS-a prema citoplazmatskoj membrani bez ukupnog povećanja razine ROS-a.

Image

IL-7 inducira PI3K / AKT put aktiviranja na ROS-ovisan način koji se oslanja na disanje mitohondrija. ( a ) TAIL7 stanice lišene IL-7, bile su nestimulirane (Unst) ili prethodno obrađene u trajanju od 2 h 30 min sa 500 µM ROS-a za uklanjanje βME ili nosačem i stimulirane su 15 minuta sa 50 ng / ml IL- 7. Stanični lizati su otopljeni u 10% -tnoj elektroforezi natrijevog dodecil-sulfata-poliakrilamidnog gela i imunoblokirani s naznačenim antitijelima. Razine fosforilacije analizirane su s antitijelima koja specifično prepoznaju S473-fosforilirani Akt (p-Akt) i Y694 / Y699-dual-fosforilirani STAT5a i STAT5b (p-STAT5). Mrlje su reprogramirane sa ZAP-70 kako bi se potvrdilo ravnomjerno punjenje proteina. Rezultati su reprezentativni za tri neovisna pokusa. ( b ) mononuklearne stanice periferne krvi ili stanice TAIL7 stimulirane su u trajanju od 30 min s 10 µg / ml α-CD3 (OKT3), odnosno 50 ng / ml IL-7, respektivno. Stanice su obojene redovno osjetljivim bojama na diklorofluoresceinski diacetat, a razine unutarstanične ROS izražene su kao srednji intenzitet fluorescencije (MIF) unutar žive populacije. ( c ) Stanice TAIL7 prethodno su tretirane 1 sat rotenonom ili apocyninom, te potom stimulirane 15 min s 50 ng / ml IL-7 i ocijenjene za p-Akt. Rezultati su reprezentativni za najmanje dva neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Da bismo identificirali izvor ROS-a potreban za aktiviranje PI3K / Akt staze ovisnog o IL-7, prethodno smo tretirali T-SVE stanice s rotenonom ili apocyninom. Inhibicija mitohondrijskog disanja, ali ne i NADPH složena blokada, u potpunosti je ukinula IL-7 posredovanu Akt fosforilaciju (Slika 3c). Ovo sugerira da, iako su oba mehanizma međusobno povezana u povećanju ROS-a posredovane IL-7 ROS regulacije u T-stanicama leukemije (slika 2), čini se da je potreban samo ROS nastao mitohondrijskim disanjem za rano aktiviranje PI3K / Akt signalnog puta nakon IL-7 stimulacija.

IL-7 posredovana regulacija ROS-a ovisi o PI3K / Akt / mTOR- i Glut-u

Prethodna ispitivanja pokazala su da konstitutivna aktivacija PI3K-posredovane signalizacije u stanicama leukemije dovodi do povećanja endogenog ROS-a. 8 Značajno je da je PI3K / Akt put nizvodno ciljanog mTOR, koji je aktivirao IL-7 u T-ALL stanicama (dopunska slika S4), također uključen u stvaranje ROS-a. 8 Stoga smo pitali može li IL-7 posredovana aktivacija osi PI3K / Akt / mTOR doprinijeti ROS-ovoj održanoj regulaciji u T-ALL stanicama. Stanice TAIL7 kultivirane su 72 sata u prisutnosti ili odsutnosti IL-7, sa ili bez PI3K specifičnog inhibitora LY294002 i mTOR specifičnog inhibitora rapamicina. Inhibicija PI3K / Akt / mTOR signalnog puta, korištenjem LY294002 ili rapamicina, potpuno je ukinula IL-7-posredovano povišenje razine unutarstaničnog ROS-a u TAIL7 (slika 4a i dodatna slika S5A) i primarne T-ALL (slika 4b i dodatna slika S5B) Stanice. Ovi rezultati sugeriraju postojanje pozitivne međusobne veze između puta ROS i PI3K / Akt / mTOR u kontekstu signalizacije posredovane IL-7 u T-ALL, u kojoj je ROS potreban za potpunu aktivaciju signalizacije ovisne o PI3K i, nakon toga, Aktivnost PI3K / Akt / mTOR putanja je kritična za održivu regulaciju ROS-a.

Image

IL-7 posredovana regulacija ROS-a ovisi o PI3K putu i funkciji Glut. Stanice TAIL7 kultivirane su 72 h ( a, c, d), a primarne T-ALL stanice uzgajane su 48 sati ( b ) u medijumu same ili s 10 ng / ml IL-7, samostalno, sa 10 μM od Inhibitor PI3K LY294002 (IL-7 + LY) ili sa 50 μM floretina inhibitora Glut (IL-7 + Pht). ( a – c ) Stanice su obojene redovno osjetljivim bojama na diklorofluoresceinski diacetat, a razine unutarstanične ROS izražene su kao srednji intenzitet fluorescencije (MIF) unutar žive populacije. ( c ) Intracelularne razine ROS-a u svakom naznačenom stanju normalizirane su na sredinu same i prikazane su kao prosjek ± pet od pet neovisnih pokusa. ( d ) Stabilnost stanica je određena FSC × SSC i izražena je kao postotak održivih stanica. Rezultati su reprezentativni za najmanje tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Sljedeće smo pokušali razabrati kako povećana aktivacija PI3K / Akt / mTOR puta posredovane IL-7 može dovesti do uguliranja ROS-a u T-ALL stanicama. Intracelularni ROS posljedica su pojačanog staničnog metabolizma, 8 uključujući metabolizam glukoze. IL-7 povećava ekspresiju transportera glukoze Glut1 na način ovisan o PI3K, pružajući strojeve za hranjive tvari i normalnim i malignim T-stanicama. 5, 8, 27 Stoga smo pitali hoće li aktivnost transportera glukoze regulirati porast unutar-staničnog ROS-a posredovanog IL-7. Stanice TAIL7 analizirane su na razinu ROS i održivost protočnom citometrijom nakon 72 h kulture s IL-7 i 50 μM specifičnog inhibitora transportera glukoze, floretina. Prekomjerna funkcija Glutha spriječila je IL-7 posredovani porast unutarćelijskog ROS-a (slika 4c) i u postotku održivih stanica (slika 4d). Ovi rezultati sugeriraju da je aktivnost transportera glukoze kritična za uregulaciju unutar-staničnog ROS-a posredovanu IL-7 u T-ALL stanicama.

Rasprava

Unatoč sve većoj svjesnosti o važnosti proučavanja interakcije između stanice raka i čitavog spektra elemenata koji čine zloćudni milje, trenutna saznanja o doprinosu mikroekoloških okoliša u stvaranju i napredovanju tumora još uvijek nisu do kraja. IL-7 ima kritičnu ulogu u napredovanju T-ALL staničnog ciklusa i preživljavanju in vitro inducirajući aktiviranje PI3K / Akt / mTOR signalnog puta i regulirajući ekspresiju p27 kip1 i Bcl-2. 3, 5 Ovdje smo dodatno istražili kako IL-7 doprinosi preživljavanju T-ALL stanica in vitro disekcijom međusobne interakcije između osi PI3K / Akt / mTOR i unutarćelijskog ROS-a.

Razine ROS-a mogu se regulirati u malignim stanicama kao posljedica stanično-autonomnih promjena. 8, 28 ROS se također može formirati u normalnim i zloćudnim stanicama nakon različitih vanćelijskih podražaja. 13, 14 Zanimljivo je da visoko oksidativno stanje u stanicama hematopoeze može promovirati apoptozu 29 ili održivost. 14 Primarnih T-ALL stanica prikazuju konstitutivno visoke razine ROS-a. 10 Sada pokazujemo da IL-7 dodatno regulira razinu ROS-a bez negativnog utjecaja na preživljavanje stanica. Suprotno tome, ROS su obavezni za IL-7 posredovanu vitalnost T-ALL stanica.

Suprotno tome, egzogena stimulacija H202 nije spriječila in vitro spontanu apoptozu T-ALL stanica u malim dozama, pa čak i induciranu staničnu smrt u velikim dozama. Kako je H20 mala difuzijska molekula, moguće je da će egzogena primjena aktivirati više signalnih putova 30 na načine koji ne reproduciraju uključenost ROS-a u signalizaciju posredovanu IL-7. Bez obzira na to, naši podaci pokazuju da učinci IL-7 na preživljavanje nisu oponašani liječenjem H202, i sugeriraju da je ROS neophodan, ali možda nedovoljan za promicanje preživljavanja T-SVIH stanica.

Iako smo otkrili da je za rano Akt fosforilaciju potrebno disanje mitohondrija, naši rezultati argumentiraju postojanje brzog vala ROS-a odmah nakon stimulacije IL-7. Čini se da je glavni porast razine ROS-a primijećen nakon liječenja T-ALL stanica IL-7 posljedicom posljedice IL-7 signalizacije posredovane signalom. Međutim, ne može se isključiti mogućnost da diklorofluoresceinski diacetat možda nije dovoljno osjetljiv da otkrije ukontroliranje ROS-a u mikroslomi lokaliziranih membrana. 25, 26 Nadalje, zamisli se da bi se pokretanje ROS-a na definirane mikrodomene, umjesto povećanja ROS-a, moglo brzo pojaviti pri pokretanju IL-7R. ROS generiran / regrutisan aktivacijom receptora vjerojatno će lokalno izmijeniti redoks stanje unutar specifičnih staničnih područja, 25, 26, prema tome, djelujući kao drugi glasnik utjecajem na redox stanje i aktivaciju signalnih proteina. 11, 31 U stvari, faktori rasta povećavaju razinu PIP3, ne samo povećanjem PI3K aktivacije, već i inaktiviranjem frakcije fosfataze i tenzina homologa endogenom produkcijom staničnih oksidansa. 16, 32, 33

Naši podaci sugeriraju da su PI3K i NADPH kompleks i respiratorni lanac mitohondrija elektrona povezani s trajnim porastom razine ROS nakon IL-7 stimulacije T-ALL stanica. Kompleks NADPH oksidaze (NADPH / NADP + ) može se aktivirati signalima ovisnim o PIP3, pokazano je da 34 i PI3K reguliraju fosforilaciju komponente NADPH oksidaze p47 fox i naknadnu aktivaciju kompleksa NADPH oksidaze. 35 Nadalje, aktiviranje PI3K uzrokovano receptorskom tirozin kinazom rezultira regrutovanjem p47 foksa u plazma membranu i posljedičnom stvaranjem reaktivnih kisikovih vrsta. 36 Mitohondrijsko disanje je glavni stanični izvor ROS-a. U normalnim uvjetima, procjenjuje se da otprilike 1–2% elektrona iscuri iz transportnog lanca mitohondrija elektrona, tvoreći ROS, 37 i povećane razine ROS povezane s transformacijom BCR-ABL povezane su s disanjem mitohondrija. 8 U skladu s tim, otkrili smo da je respiratorni lanac mitohondrija neophodan za uregulaciju razine ROS uzrokovane IL-7 u kasnim vremenskim točkama. Zanimljivo je da činjenica da su i apocynin i rotenon bili dovoljni da u potpunosti spriječe IL-7 posredovanu ROS regulaciju i T-ALL staničnu održivost sugerira da NADPH kompleks i mitohondrijsko disanje mogu biti isprepleteni u kontekstu IL-7 signalizacije, a mogućnost da nije bez presedana. 38, 39, 40

Metabolizam glukoze reguliran je unosom glukoze, a u stanicama hematopoeze Glut1 je glavni izvor unutarstanične glukoze. 41 Prethodno smo izvijestili da IL-7 inducira regulaciju Glut1 i unos glukoze na način ovisan o PI3K u T-ALL stanicama. 5 U ovom istraživanju otkrili smo da phloretin inhibitora transportera glukoze dovodi do smanjenja ROS nastalog od IL-7, slično onome opaženog u stanicama koje su tretirane inhibitorima PI3K i mTOR. To sugerira da se IL-7 generacija ROS-a uglavnom oslanja na opskrbu energijom u obliku glukoze ili piruvata, posredovane osi PI3K / Akt / mTOR / Glut. To ne isključuje mogućnost da IL-7 može povećati razinu ROS u T-ALL stanicama putem Akt-posredovane fosforilacije i inhibicije FOXO faktora transkripcije, koji su kritični negativni regulatori oksidativnog stresa. 42, 43, 44

Uzimajući zajedno naše trenutne i prethodno objavljene podatke, 5 predlažemo model (dopunska slika S6), pri čemu IL-7 brzo inducira manju regulaciju i / ili regrutovanje ROS-a koji je potreban za ranu aktivaciju PI3K / Akt / mTOR signalnog puta u NADPH disanje oksidaze neovisno o mitohondrijskom disanju. Zauzvrat, signalizacija posredovana PI3K / Akt / mTOR dovodi do povećanja regulacije Glut1 i unosa glukoze koji su obavezni za kasnu regulaciju ROS-a posredovanu s IL-7. Zanimljivo je da se održivo povišenje razine ROS oslanja i na NADPH oksidazu i na mitohondrijsko disanje. Ukrštanje između PI3K putanje i ROS presudno je za održivost T-ALL stanica posredovanih IL-7. Uključenost ROS-a u stanični opstanak 10 i IL-7 posredovanih T-ALL sugerira da antioksidanti mogu predstavljati obećavajuće alate za terapijsku intervenciju u ovom zlostavljanju u djetinjstvu.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

  5. 5.

    Dopunska slika S5

  6. 6.

    Dopunska slika S6

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slike S1 – S6 legende

    Dodatne informacije prate rad na web stranici Leukemia (//www.nature.com/leu)