Knockdown of sirt7 pojačava osteogensku diferencijaciju mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži dijelom aktivacijom wnt / β-katenin signalnog puta | stanična smrt i bolest

Knockdown of sirt7 pojačava osteogensku diferencijaciju mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži dijelom aktivacijom wnt / β-katenin signalnog puta | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Razvoj kostiju
  • Stanična signalizacija
  • hidrolaze
  • Mezenhimske matične stanice

Sažetak

Sirtuin 7 (SIRT7) je NAD + ovisna deacetilaza u obitelji sirtuin. U prethodnom istraživanju razvijene su mezenhimske matične stanice ljudske koštane srži (hBMSC) sa smanjenom aktivnošću SIRT7 kako bi se procijenio učinak SIRT7 na osteogenezu. Srušenje SIRT7 značajno je poboljšalo ekspresiju gena specifičnih za osteoblast, aktivnost alkalne fosfataze i taloženje minerala in vitro . Uz to, SIRT7 srušeni regulirani β- katenin. Pojačana osteogeneza uslijed rušenja SIRT7 djelomično je spašena inhibitorom Wnt / P- katenina. Nadalje, SIRT7 srušeni hBMSC-ovi u kombinaciji s hitozanskim skelom značajno su potaknuli formiranje kostiju u modelu oštećenja tibije žlijezda štakora, što je određeno slikanjem i histološkim pregledima. Ovi nalazi sugeriraju da SIRT7 ima bitnu ulogu u osteogenoj diferencijaciji hBMSC, dijelom aktiviranjem Wnt / β- kateninskog signalnog puta.

Glavni

Matične stanice koštane srži (BMSC) posjeduju sposobnost samoobnove i mogu se razlikovati u različite vrste stanica, uključujući osteoblaste, hondrocite i adipocite. 1 BMSC smatraju se perspektivnim sjemenskim stanicama za popravak koštanih oštećenja. Bolje razumijevanje osteogeneze MSC-a potrebno je za kliničku primjenu u regeneraciji kostiju. 2 Dakle, uočavanje genetskih čimbenika koji su uključeni u MSC osteogenezu važno je područje istraživanja.

SIRT7 je član porodice sirtuin histon deacetilaza, čiji članovi imaju raznoliku ulogu u starenju, obnovi DNK, staničnom ciklusu, metabolizmu i biologiji bolesti. 3, 4, 5 SIRT7 se vezuje za ribosomalni RNA gen i povezan je s reaktivacijom transkripcije ribosomalne DNA nakon mitoze. 6 Barber i sur. Slika 7 otkrila je da je SIRT7 ovisna o NAD + H3K18Ac (acetilirani lizin 18 histona H3) deacetilaza koja stabilizira transformirano stanje stanica karcinoma. Štoviše, nekoliko studija izvijestilo je da je SIRT7 prekomjerno izražen u tkivima karcinoma dojke i tumorima štitnjače i debelog crijeva u usporedbi s normalnim tkivom, 7, 8, 9 i pokazao je blisku vezu s upalnom kardiomiopatijom i apoptozom. 10 Pored toga, geni u obitelji sirtuin i osteogena diferencijacija usko su povezani. SIRT1 je regulator koštane mase i supresor sklerostina. 11 SIRT3 je potreban za osteogenezu modulacijom mitohondrijske funkcije i biogenezu putem signalizacije PGC-1 α / SOD2. 12 Sun i sur. Slika 13 pokazala je bitnu ulogu SIRT6 u osteogenezi MSC-a štakora dijelom potiskivanjem NF- κ B signalizacije. Međutim, malo se zna o ulozi SIRT7 u osteogenezi MSC-a.

Signalizacija Wnt / β- katenina ključni je regulator MSC-a koji ima važnu ulogu u diferencijaciji osteogena. 14, 15 Kanonski Wnt signalni put aktivira se nakon vezanja Wnt na zamrznute receptore 16 i LRP ko-receptora na staničnoj membrani, 17, 18, izazivajući inhibiciju glikogen sintaze kinaze-3 β (GSK3 β ) i stabilizirajući citoplazmatski β- katenin. 15 Aktivacijom Wnt, β- katenin se akumulira u citosolu i translocira u jezgru gdje on promovira T-stanični faktor / limfoidni pojačavajući transkripciju posredovanu faktor-1, 19, 20 i time utječe na transkripciju ciljnih gena. Nadalje, nekoliko izlučenih molekula su antagonisti Wnt signalizacije, uključujući izlučene glikoproteine ​​dickkopfs (Dkks) i izlučene proteine ​​povezane sa frizulom. 17, 21 Od ovih je pokazalo da Dkk1 inhibira kanonski Wnt signalni put u nekoliko različitih tipova stanica. 22, 23, 24, 25 Prethodna ispitivanja pokazala su da je Wnt signalizacija presudna za stvaranje i održavanje kostiju i da kanonička signalizacija potiče stromalnu progeneraciju progenera i osteogenezu. 26, 27, 28 Osim toga, obitelj sirtuin i signalizacija Wnt usko su povezani. SIRT1 potiče stvaranje kostiju sprječavajući sekvestraciju β- katenina FoxO transkripcijskim faktorima. 29 Kao supresor tumora, SIRT2 inhibira Wnt signalni put vezanjem na β- katenin proizveden kao odgovor na stres izazvan zračenjem. 30 Wang i sur. 31 utvrđeno je da SIRT6 regulira homeostazu matičnih stanica hematopoetskih stanica i sposobnost samoobnavljanja putem Wnt signalizacije.

U ovom istraživanju istražili smo ekspresiju SIRT7 u ljudskim BMSC (hBMSC) i njezin utjecaj na osteogenu diferencijaciju hBMSC. Otkrili smo da se endogena ekspresija SIRT7 smanjila tijekom osteogene diferencijacije. Hipotetizirali smo da snižavanje regulacije SIRT7 potiče osteogenezu hBMSCs putem Wnt / β- kateninske signalizacije. Procjenjujući razine ekspresije specifičnih osteogenih markera i taloženja kalcija otkrili smo da spuštanje SIRT7 pojačava osteogenu diferencijaciju hBMSC dijelom in vitro putem signalnog puta Wnt / β- katenina. Koristili smo i model oštećenja tibijalnog oštećenja štakora koji je transplantiran s NBMSCs srušenim SIRT7, u kombinaciji s kitozanskim skelom i otkrili smo da knockdown SIRT7 potiče zarastanje koštanih oštećenja in vivo .

Rezultati

Endogena ekspresija SIRT7

Da bismo odredili razinu ekspresije SIRT7 povezane s osteogenom diferencijacijom MSC-a, ispitivali smo SIRT7 endogenu ekspresiju u hBMSCs u dane 0, 3 i 7 tijekom osteogene diferencijacije. U usporedbi s nediferenciranim hBMSC-om, mRNA (slika 1a) i ekspresija proteina (slike 1b i c) SIRT7 značajno su smanjeni u 3. i 7. danu.

Image

Endogena ekspresija SIRT7 i konstrukcija SIRT7-konckdown hBMSC i lenti kontrole hBMSC. ( a - c ) Endogena ekspresija SIRT7 mRNA i proteina određena je, qPCR-om, i Western blot-analizom u dane 0, 3 i 7 dana osteogenske diferencijacije. ( d ) opaženi su hBMSC nakon lentivirusne transfekcije i probira puromicina pod normalnim mikroskopom i fluorescentnim mikroskopom. ( e - g ) Razine mRNA i proteina SIRT7 određene su qPCR-om i analizom Western blotting-a među lenti-SIRT7, lenti-kontrolnom skupinom i mock-tretiranom skupinom. ( h ) Propadanje hBMSC-a nije značajno utjecalo na obustavu SIRT7. Razine mRNA i ekspresije proteina su normalizirane na gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH). Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Podaci su izraženi u obliku ± SD, * P <0, 05 nasuprot lenti-kontrolnoj skupini

Slika pune veličine

SIRT7 knockdown u hBMSCs

Da bi se razjasnila uloga SIRT7 u osteogenoj diferencijaciji, korišten je lentivirusni vektorski sustav da učinkovito sruši SIRT7 treće generacije hBMSC. Srušenje SIRT7 kvantificirano je procjenom omjera pozitivnih stanica zelenog fluorescentnog proteina (GFP) i ukupnog broja stanica (Slika 1d). Ekspresija SIRT7 kvantificirana je PCR u realnom vremenu i analizom Western blottinga 3 dana nakon infekcije i probira. U usporedbi s grupama lenti-kontrole i ismijanim lijekovima (bez virusa), SIRT7 je smanjen u skupini lenti-SIRT7 (Slike 1e i f). Izrazitost mRNA i proteina SIRT7 hBMSC-a s rušenjem u prolazu 9 zadržala je stabilnu učinkovitost pri spuštanju (vidi Dodatnu sliku 1).

Srušenje SIRT7 nije utjecalo na proliferaciju hBMSC-a

Da bismo utvrdili utječe li SIRT7 utjecaj na širenje hBMSC-a, izmjerili smo razinu CCK8 u hBMSC-ima. Učinci srušavanja SIRT7 na proliferaciju hBMSC u danima 1, 3 i 5 nakon infekcije prikazani su na slici 1h. Nije utvrđena značajna razlika u brzini proliferacije stanica između obustave SIRT7 i hBMSC lenti kontrole.

Srušenje SIRT7 povećalo je razinu osteo-specifičnih gena i proteina

Za procjenu uloge pada SIRT7 u diferencijaciji osteogena, razine osteo-specifičnih gena i proteina, uključujući transkripcijski faktor 2 (RUNX2), osterix (OSX), osteopontin (OPN), i kolagen tipa I alfa 1 lanca ( COL1A1), određene su kvantitativnim PCR (qPCR) analizama u realnom vremenu i blotting analizom. qPCR analiza otkrila je da su razine mRNA RUNX2, OSX, OPN i COL1A1 bile značajno veće u hBMSC srušenim u SIRT7 nego u kontrolnoj skupini u danima 3 i 7 ( P <0, 05, slike 2a-d). Western blotting analiza otkrila je veću ekspresiju proteina RUNX2 i COL1A1 u hBMSC srušenim SIRT7 nego u kontrolnim stanicama (Slika 2e).

Image

Srušenje SIRT7 potaknulo je osteogenu diferencijaciju hBMSC-a. ( a ) Ekspresija RUNX2 mRNA određena je qPCR-om u 3. i 7. danu osteogene diferencijacije. ( b ) Ekspresija OSX mRNA. ( c ) Ekspresija OPN mRNA. ( d ) Ekspresija COL1A1 mRNA. ( e - g ) Ekspresija proteina RUNX2 i COL1A1 određena je analizom Western blottinga nakon diferencijacije osteogena tijekom 3 i 7 dana. ( h ) ALP u hMSC obojen je nakon diferencijacije osteogena tijekom 3 i 7 dana. ( i ) ALP aktivnost hMSC-a. ( j ) ARS nakon diferencijacije osteogena tijekom 9 i 12 dana. ( k ) Mineralizacija je kvantificirana ekstrakcijom stanica obojenih s ARS-om. Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Podaci su bili prosječni ± SD * P <0, 05 u odnosu na lenti-kontrolnu skupinu. Linija mjerila = 200 μ m

Slika pune veličine

Također smo obavili analizu imunofluorescencije kako bismo procijenili ekspresiju proteina RUNX2, a rezultati su pokazali da su razine ekspresije RUNX2 povećane 3. dana u srušenim stanicama SIRT7 (slika 3a). Ekspresija proteina SIRT7 bila je vrlo niska 3. dana u stanicama srušenja SIRT7, što ukazuje na efikasno oborenje tijekom osteogeneze (Slika 3b).

Image

Imunofluorescentno bojenje pokazalo je razinu proteina RUNX2, SIRT7 i β- katenina. ( a ) Razina proteina RUNX2 (crvena) u 3. dan osteogene diferencijacije. ( b ) Razina proteina SIRT7 (crvena) u 3. dan osteogene diferencijacije. ( c ) Razina proteina β- katenina (crvena) u 3. dan osteogene diferencijacije. Jezgra su kontraponirana DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; plava). Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Linija mjerila = 100 μ m

Slika pune veličine

SIRT7 povećana aktivnost alkalne fosfataze (ALP) i stvaranje naslaga kalcija

ALP aktivnost označava osteogenezu u ranom stadiju. Aktivnost ALP-a procijenili smo u 3. i 7. danu tijekom osteogene diferencijacije. U usporedbi s kontrolnom skupinom, viša ALP aktivnost primijećena je u knockdown grupi SIRT7 ( P <0, 05, slika 2i). Slični rezultati opaženi su ALP bojenjem (Slika 2h). Naslage kalcija ispitivane su i Alizarin crvenim bojenjem (ARS), a obojena područja kvantificirana su mjerenjem apsorbancije na 560 nm. Više depozita kalcija otkriveno je u rušenju SIRT7 nego u kontrolnoj skupini u danima 9 i 12 (Slika 2j). Analiza kvantifikacije dala je slične rezultate (slika 2k).

SIRT7 knockdown aktivirao je Wnt /-katenin signalni put

Da bi se potvrdili gornji nalazi koji sugeriraju ulogu za Wnt / β- katenin signalizaciju, ekspresija β- katenina određena je qPCR-om, zapadnom blot analizom i imunofluorescentnom analizom tijekom osteogeneze u danima 3 i 7. Ekspresija GSK3 β i Axina bila je također određuje qPCR. Rezultati analiza qPCR-a i zapadnog blotiranja pokazali su veću ekspresiju β- katenina u srušenim hBMSCs SIRT7 (slike 4a i d). U usporedbi s kontrolnom skupinom, razina Axina je povišena u SIRT7 srušenim hBMSC-ima; međutim, razina GSK3 β se nije promijenila (slike 4b i c). Nadalje, imunofluorescentna analiza pokazala je veću razinu nakupljanja β- katenina u citoplazmi u knockdown grupi SIRT7 u 3. dan (slika 3c).

Image

Srušenje SIRT7 ureguliralo je signalni put Wnt / β- katenina tijekom osteogeneze. ( a ) Ekspresija p- kateninske mRNA određena je qPCR-om u 3. i 7. danu osteogene diferencijacije. ( b ) Ekspresija GSK3 β mRNA. ( c ) Ekspresija Axin mRNA. ( d - f ) Ekspresija aktivnih β- katenina i ukupnih β- kateninskih proteina određena je Western blot-analizom u danima 3 i 7 osteogene diferencijacije. Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Podaci su bili prosječni ± SD * P <0, 05 u odnosu na lenti-kontrolnu skupinu

Slika pune veličine

Povećana osteogena diferencijacija SBR-a srušena hBMSC djelomično je spašena inhibitorom Wnt / β-katenina

Da potvrdimo uključenost signalnog puta Wnt / β- katenina, ispitali smo učinak inhibicije Wnt / p- katenina na osteogenezu u knockdown ćelijama SIRT7. Nakon dodavanja DKK1 tijekom 3 dana, razina ne-fosforiliranog (aktivnog) β- katenina značajno se smanjila u usporedbi s razinom hBMSC-a srušenim u SIRT7 bez inhibitora (Slike 5a i c). Nadalje, inhibicija Wnt / P- katenina djelomično je preokrenula porast osteogeneze hBMSC, što je naznačeno i ekspresijom osteo-specifičnih gena i proteina (Slike 5b i c). Pored toga, ALP aktivnost i bojenje pokazali su višu ALP aktivnost u SIRT7 obrušenim hBMSCs nego u grupi lenti-SIRT7 + DKK1 (Slike 5d i e). Bojenje ARS-a za određivanje količine naslaga kalcija pokazalo je slične rezultate (slika 5f i g).

Image

Pojačana osteogeneza uzrokovana konckdownom SIRT7 mogla bi se djelomično spasiti dodavanjem Wnt / β- katenin signalizatora (DKK1). ( a ) Ekspresija p- katenina, GSK3 p i Axin mRNA u lenti-kontroli, lenti-kontroli + DKK1, lenti-HSPA1A i lenti-HSPA1A + DKK1 skupina određena je qPCR-om u 3. dan osteogeneze. ( b ) Ekspresija RUNX2, OSX, OPN i COL1A1 mRNA u 3. danu osteogeneze. ( c ) Ekspresija RUNX2, COL1A1, aktivnih p- katenina i ukupnih β- kateninskih proteina određena je analizom Western blottinga na 3. dan osteogeneze. ( d i e ) ALP bojenje i aktivnost 7. dana osteogeneze. ( f i g ) ARS i kvantitacija 9. dana osteogeneze. Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Podaci su bili prosječni ± SD * P <0, 05 u odnosu na lenti-kontrolnu skupinu. # P <0, 05 nasuprot grupi lenti-SIRT7. Linija mjerila = 200 μ m

Slika pune veličine

Hitozanska skela u kombinaciji s hBMSCs srušenim sIRT7 ubrzala je zarastanje lomova kostiju u modelu oštećenja tibije

Radiografski snimci snimljeni u šest tjedana pokazali su da je kortikalni defekt jasno prisutan u praznoj skupini. U skupinama samo za kitozanske skele i lenti, taj je jaz bio prikriven, a veća količina stvaranja kalusa uočljiva je u području defekta u usporedbi s onom u praznoj skupini. U grupi s hBMSC srušenom u SIRT7, jaz je gotovo nestao (slika 6a). Mikro-računalna tomografija (mikro-CT) otkrila je značajno više nove tvorbe kostiju u srušenoj hBMSC grupi SIRT7 nego u skupinama samo za kitozanske skele i lenti; među četiri skupine najveći nedostatak pojavio se u praznoj skupini (slike 6b i c). Kvantitativno, prijelomi u grupi s padovima SIRT7 pokazali su značajno povećanje frakcije koštanog volumena (BV / TV), trabekularnog broja (Tb.N) i gustoće povezivanja (Conn.D) u usporedbi s praznom skupinom (Slike 6d-f ).

Image

Radiografskom i mikro-CT analizom područja oštećenja 6 tjedana nakon operacije u svakoj skupini. ( a ) Radiografska analiza. ( b i c ) Micro-CT slike. ( d - f ) Micro-CT analize BV / TV, Tb.N i Conn.D. Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Podaci su bili prosječni ± SD * P <0, 05 u odnosu na praznu skupinu. Linija mjerila = 1 mm

Slika pune veličine

Histološka analiza regeneracije kostiju

Histološke analize prikazane su za svaku staničnu skupinu na slici 7. Odjeljci su obojeni hematoksilinom i eozinom, Safraninom O i Fast greenom, te Masson mrlje. U praznoj skupini nije zabilježeno premoštavanje kostiju u području defekta (slike 7a, e, i i). U skupinama koje sadrže samo hitosanske skele i lenti, u području defekta pronađen je gusti kalus koji se sastoji od novoformiranog tkanog koštanog tkiva (slike 7b, c, f, g, j i k). U grupi hBMSC s rušenjem SIRT7 područje defekta je gotovo zapečaćeno, a pregradnja kalusa gotovo je dovršena, što ukazuje na koštano zarastanje oštećenja (slike 7d, h i l).

Image

Histološka procjena područja defekta 6 tjedana nakon operacije u svakoj skupini. ( a - d ) bojenje na HE. Linija mjerila = 500 μ m. ( e - h ) Safranin O i brzo zelena mrlja. ( i - l ) Masson obojenje. Svi su podaci potvrđeni s tri ponovljena ispitivanja. Linija mjerila = 500 μ m

Slika pune veličine

Rasprava

Koliko znamo, ovo je prva studija koja je istraživala učinke SIRT7 na MSC osteogenu diferencijaciju. Otkrili smo da je endogena ekspresija SIRT7 smanjena u hBMSCs tijekom osteogeneze. Zbog toga smo koristili strategiju srušavanja SIRT7 za promicanje osteogene diferencijacije MSC-a. Otkrili smo da je SIRT7 knockdown ubrzao osteogenezu hBMSC-a dijelom in vitro putem signala Wnt / β- katenina. Nadalje, SIRT7 srušeni hBMSC-ovi u kombinaciji s kitozanskim skelom ubrzali su zarastanje lomova kostiju u modelu oštećenja kostiju štakora. Ovi nalazi pokazuju da srušavanje SIRT7 pojačava osteogenezu hBMSC-a, barem djelomično aktiviranjem signala Wnt / β- katenina.

Kvator tihi informacijski regulator 2 (Sir2), član obitelji sirtuin, izvorno je identificiran u pregledu na čimbenike prigušivanja. 32 Imai i sur. 33 su otkrili da Sir2 djeluje kao histon deacetilaza ovisna o NAD koja je uključena u metabolizam, starenje i prigušivanje genoma u kvascima. Iznenađujuće, studije drugih modelnih organizama (uključujući Caenorhabditis elegans i Drosophila ) također su navele Sir2 homologe kao odlučujuće faktore životnog vijeka. 34 Prokariotski i eukariotski sirtuini homologni su s kvascem Sir2, a do sada je identificirano sedam homologa sisavaca. 35 Među njima su tri sisavca sirtuini (SIRT1, SIRT6 i SIRT7) smješteni u jezgri, a SIRT1 se nalazi i u citoplazmi. SIRT7 se nalazi u nukleolusu u ljudskim stanicama i povezuje se s ribosomalnom DNK i u interakciji je s RNA polimerazom. 35 Ford i sur. 36 su otkrili da aktivnost SIRT7 zahtijeva aminokiselinske ostatke koji se vežu na NAD unutar očuvane jezgre sirtuin, što ukazuje na ulogu za regulaciju ovisnu o NAD. Miševi sa nedostatkom SIRT7 doživljavaju smanjenje životnog vijeka i progresivnu hipertrofiju srca i upalnu kardiomiopatiju. 10 Prekomjerna ekspresija SIRT7 pokazuje onkogena svojstva, poput promicanja stvaranja kolonija, invazivnijeg fenotipa i rasta stanica, in vitro i in vivo . 37 Nedavno izvješće pokazalo je da SIRT7 djeluje kao onkogen u karcinomu želuca i hepatocelularnom karcinomu. 38, 39 U posljednje vrijeme, SIRT7, najmanje ispitan član obitelji sirtuin, bio je u središtu istraživanja bolesti, kao što su hipertrofična upalna kardiomiopatija, masne bolesti jetre, onkogena transformacija, rast tumora i gubitak sluha vezan za dob.

Imunofluorescentna analiza pokazala je da se SIRT7 nalazi u jezgri, što je u skladu s opažanjem Forda i sur. 36 Učinak SIRT7 na hBMSCs tijekom osteogeneze ocijenjen je qPCR analizama i Western blottingom, koji su pokazali da se endogena ekspresija SIRT7 značajno smanjila u 3. i 7. dan nakon osteogene diferencijacije. Konstruirali smo SIRT7 knockdown hBMSC za dodatne eksperimente. Bojenje ALP-a i naslage kalcija smatraju se ranim i kasnim markerima diferencijacije osteoblasta. 40 Otkrili smo da SIRT7 knockdown poboljšava ALP aktivnost i ubrzava mineralizaciju. RUNX2, glavni faktor transkripcije u osteogenoj diferencijaciji, 41 je značajno porastao u ekspresiji nakon pada SIRT7, što je određeno qPCR-om, Western blot-om i imunofluorescentnom analizom. Ostali osteogeni biljezi, poput OSX, Col1 i OPN, pokazali su slične obrasce. U međuvremenu, pad sustava SIRT7 nije utjecao na širenje hBMSC-a. Ovi rezultati sugeriraju da sušenje SIRT7 potiče osteogenezu hBMSC-a in vitro .

Wnt / β- katenin signalizacija je bitan signalni put potreban za formiranje kostiju. 42 Pod utjecajem Wnt liganda, frizzirani i LRP-5/6 ko-receptori regrutuju Disheveled u plazma membrani zajedno s Axin-GSK3 β , što inhibira stvaranje kompleksa β- katenina i povećava razinu β- katenina u citoplazmi. 15, 43, 44 Ovo dovodi do nuklearne translokacije β- katenina i aktiviranja ciljnih gena. 45 U našoj sadašnjoj studiji, primijetili smo da srušenje SIRT7 povećava ekspresiju β- katenina tijekom osteogeneze, a imunofluorescentna analiza potvrdila je ta opažanja. Nadalje, povećanu osteogenezu hBMSC-a padom SIRT7 djelomično je spasio inhibitor Wnt / p- katenina (DKK1). Srušenje P- katenina interfejsom RNA koristeći male interferirajuće RNA dalo je slične rezultate. Ovi nalazi pokazuju da obustava SIRT7 regulira osteogenu diferencijaciju hBMSCs aktivacijom Wnt / β- kateninskog signalnog puta.

Prethodno izvješće pokazalo je da su porozne hitosan-alginatne skele osteokonduktivne, a eksperimentalni tretmani pokazali su poboljšano zatvaranje oštećenja na modelu defekta kalvarija. 46, 47 Poliamfolitička hitozanska vlakna su potaknula proliferaciju i osteogenu diferencijaciju MSC-a, kao i regeneraciju kostnih tkiva. 48 U našem istraživanju, uporaba poroznog hitozanskog skela s hBMSC-om potaknula je zacjeljivanje kostiju u modelu oštećenja tibije u pacovima. Bolje formiranje kosti uočeno je kada su u skeli bili SIRT7 srušeni hBMSC-i.

Mnoga su istraživanja pokazala odnos između ekspresije sirtuina i osteogeneze matičnih stanica. Međutim, ovo je prvo istraživanje koje je pokazalo utjecaj SIRT7 na osteogenu diferencijaciju MSC-a. Nažalost, utvrdili smo učinak samo obaranja SIRT7, a ne prekomjerne ekspresije SIRT7, na osteogenezu. Nadalje, mehanizmi aktiviranja Wnt / β- kateninskog signalnog puta rušenjem SIRT7 nisu u potpunosti razjašnjeni, posebno što se tiče nuklearne translokacije p- katenina. Ostale signalne putove potrebno je ispitati na moguće sudjelovanje u osteogenezi hMSC-a padom SIRT7 u budućim studijama.

Zaključak

Prema našim rezultatima, knockdown SIRT7 povećao je osteogenu diferencijaciju hBMSC-a, djelomično aktiviranjem Wnt / β- katenin signalnog puta. Srušenje SIRT7 u hBMSCs u kombinaciji s kitozanskim skelom poboljšava popravke oštećenja kostiju i može pružiti novu strategiju za regeneraciju kostiju koja se temelji na matičnim stanicama.

Materijali i metode

Stanična kultura i reagensi

hBMSC, kupljeni od Cyagen Biosciences (Guangzhou, Kina), mogu se razlikovati u osteoblaste, adipocite i hondrocite pod specifičnim induktivnim uvjetima. Prikladni hBMSC-i uzgajani su u tikvicama za kulturu u mediju za rast hMSC-a (Cyagen Biosciences, Inc., Guangzhou, Kina) u inkubatoru na 37 ° C s 5% CO2 i pasirani nakon postizanja 80% -tnog ušća. Stanice iz odlomaka 3–9 korištene su u sljedećim eksperimentima. Rekombinantni DKK1 kupljen je od PeproTech-a (Rocky Hill, NJ, USA). Na temelju prethodne studije koristili smo DKK1 od 0, 5 µg / ml. 49

Lentivirusno pakiranje i infekcija stanica

Lentivirusne čestice SIRT7 (lenti-SIRT7) i lentivirusne čestice GFP-a, korištene kao kontrolna grupa (lenti-kontrola), pripremile su u kompaniji GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kina). Za infekcije, 40–60% konfluentnih hBMSC inkubirano je lentivirusnim česticama i 2, 5 μg / ml polibrena u mediju za rast kod mnoštva infekcija od 50. Nakon 12 sati, > 95% stanica je još uvijek bilo održivo, a kulturni medij tada je promijenjen. Tri dana kasnije, sve transficirane stanice pasirane su za upotrebu u sljedećim eksperimentima. Ekspresija SIRT7 određena je qPCR i western blotting analizama.

Analiza vitalnosti stanica

Da bi se procijenio učinak obrušavanja SIRT7 na proliferaciju hBMSC-a, stanice su posijane u pločicu s 96 jažica (5000 / jažica) i ostavljene su da se priliježu 24 h. Nakon 24 sata, medij je uklonjen, a stanice su tretirane sa 10% Kit za brojanje stanica-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan) u 100 μl Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (L-DMEM) bez fetalni goveđi serum (FBS) tijekom 3 sata na 37 ° C. Apsorbancija na 450 nm, koja je izravno proporcionalna staničnoj proliferaciji, izmjerena je korištenjem čitača mikroploča (ELX808; BioTek, Winooski, VT, USA).

Protokol diferencijacije osteogena

hMSC-i uzgajani su u mediju za rast (L-DMEM; 10% FBS (1495527; Gibco, Waltham, MA, SAD) i 100 IU / ml penicilina / streptomicina) u pločicama s kulturama sa 6 ili 12 jažica, s gustoćom od 3 × 10 4 / cm2 i inkubira se 48 sati na 37 ° C pod 5% C02. Stanice su zatim kultivirane u osteogenom indukcijskom mediju (L-DMEM s 10% FBS-a, 100 IU / ml penicilina / streptomicina, 100 nM deksametazona, 0, 2 mM askorbinske kiseline i 10 mM p -glicerofosfata). Stanice su održavane dodavanjem svježeg osteogenog indukcijskog medija svaka 2-3 dana.

ALP bojenje i test aktivnosti ALP

Stanice su kultivirane u osteogenom indukcijskom mediju u pločicama s 12 jažica tijekom 3 ili 7 dana. Za ALP bojenje, stanice su fiksirane 4% paraformaldehidom tijekom 15 minuta. Stanice su potom isprane dva puta s PBS-om i obojene pomoću BCIP / NBT kompleta za razvoj alkalne fosfataze u boji (Beyotime, Šangaj, Kina). Za mjerenje ALP aktivnosti, stanice su lizirane puferom za lizu koji se sastojao od 20 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 150 mM NaCl i 1% Triton X-100. ALP aktivnost određena je pomoću ispitivanja ALP aktivnosti (beyotime) prema uputama proizvođača. Ukratko, izmjerena je konverzija bezbojnog p-nitrofenil fosfata u obojeni p-nitrofenol nakon 3 i 7 dana kulture u osteogenom mediju pri 405/650 nm.

Alizarin crveno obojenje

Nakon indukcije osteogene diferencijacije taloženje minerala ocijenjeno je ARS-om (Cyagen Biosciences). Stanice su fiksirane u 4% paraformaldehidu 15 minuta na sobnoj temperaturi, te su potom isprane destiliranom vodom. Stanice se inkubiraju sa 0, 5% -tnom otopinom alizarin crvene boje 20-30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi ispiranje destiliranom vodom. Mrlja je desorbirana inkubiranjem sa 10% cetilpiridinijevim kloridom (Sigma, Šangaj, Kina) 1 sat. Otopina je sakupljena i 200 μl je posađeno na pločama s 96 jažica koje su očitane pri 560 nm pomoću čitača mikroploča (ELX808; BioTek). Očitavanja su normalizirana na ukupnu koncentraciju proteina.

Izolacija RNA i qPCR

Ukupna stanična RNA izolirana je korištenjem RNAiso reagensa (Takara, Dalian, Kina) i kvantificirana mjerenjem apsorbancije na 260 nm (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Cdna prvog lanca sintetizirana je primjenom PrimeScript RT Master Mix-a (Takara) prema uputama proizvođača. Ukupna RNA (0001000 ng) je prepisana u cDNA u reakcijskom volumenu od 20 µl pomoću dvostrukog lanca cDNA sinteze (Takara). Jedan mikroliter cDNA upotrijebljen je kao predložak za qPCR. Svi genski transkripti kvantificirani su qPCR-om korištenjem Power SYBR Green PCR Master miksa (Takara) na ABI StepOnePlus sustavu (Applied Biosystems, Warrington, UK). MRNA ciljnih gena i gen za održavanje (GAPDH) kvantificirani su u zasebnim epruvetama. Sve primere sintetizirao je Sangon Biotech (Šangaj, Kina). Korištene sekvence temeljnih premaza prikazane su u tablici 1. Uvjeti ciklusa su sljedeći: 95 ° C tijekom 30 s, nakon čega slijedi 40 ciklusa na 95 ° C tijekom 5 s i 60 ° C u trajanju od 30 s. Relativne ciljne razine ekspresije gena izračunane su primjenom metode 2 -ΔΔCt .

Tablica pune veličine

Western blot analiza

Stanice su lizirane u RIPA puferu dopunjenom inhibitorom proteasoma (Beyotime). Jednake količine proteina razdvojene su 10% natrijevim dodecil-sulfatnim poliakrilamidnim gel elektroforezama, a zatim prenesene u membranu polivinilidena fluorida (Millipore, Šangaj, Kina). Nakon blokiranja u 5% nemasnom mlijeku tijekom 2 sata, membrane se inkubiraju preko noći na 4 ° C s antitijelima specifičnim za GAPDH (1: 1500; Cell Signaling Technology, Shanghai, Kina), SIRT7 (1 µg / ml; Abcam, Šangaj, Kina), RUNX2 (1: 1600; Stanična tehnologija signalizacije), COL1A1 (1: 1000; Abcam), ne-fosforilirani (aktivni) β- katenin (1: 1000; Stanična tehnologija signalizacije) ili ukupni β- katenin (1: 1000; Tehnologija staničnog signalizacije). Nakon ispiranja u TBST četiri puta (svaki po 5 min), membrane se inkubiraju 1 h na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitijelom konjugiranim peroksidazom u hrenu (antic miš ili zec; beyotime). Nakon pet puta ispiranja TBST-om, otkrili smo proteine ​​primjenom pojačanih hemiluminescencijskih blot-reagensa prema uputama proizvođača. Imunoreaktivne trake detektirane su korištenjem pojačanog hemiluminescentnog reagens za otkrivanje (Millipore). Intenzitet signala mjeren je primjenom Bio-Rad XRS hemiluminescence sustava detekcije (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD).

Imunofluorescentna analiza

Stanice su kultivirane u indukcijskom mediju u pločici s 12 jažica i ocijenjene su za RUNX2, SIRT7 i p- katenin pomoću fluorescentnog mikroskopa (EU5888; Leica, Wetzlar, Njemačka) kako slijedi. Stanice su fiksirane u 4% paraformaldehidu 15 minuta na sobnoj temperaturi, permealizirane i blokirane su 30 minuta u 0, 05% Triton X-100 i 2% goveđeg serumskog albumina. Fiksne stanice su isprane i inkubirane preko noći sa anti-RUNX2 (1: 1600; Stanična tehnologija signalizacije), SIRT7 (10 µg / ml; Abcam) ili ne-fosforiliranim (aktivnim) β- kateninom (1: 1600; Stanična tehnologija signalizacije). ). Stanice se inkubiraju sa sekundarnim antitijelom konjugiranim fluorescencijom (Beyotime) 120 min, a jezgre se oboje sa 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolom (KeyGen Biotech, Nanjing, Kina) tijekom 5 minuta. Uzorci su promatrani pod fluorescentnim mikroskopom (Leica).

Sterilizacija skela i hMSC sjetva i kultura

Kitozanske skele, koje su poklon profesora Hu-a, sterilizirane su inkubacijom u 70% -tnom etanolu u trajanju od 30 minuta nakon čega je bilo izloženo UV zračenju u trajanju od 30 minuta sa svake strane. Kitozanske skele (1 × 1 cm 2 ) postavljene su u ploče s 24 jažice. Jednom postavljeni u sterilne pločice za kulturu tkiva, skele su se inkubirale 4 h u mediju za rast kako bi se uklonio preostali alkohol i navlažile skele. Stanice su posijane na gustoći od 50 000 / skele u mediju od 50 μl i inkubirane su 3 sata na 37 ° C da se osigura vezivanje; medij je tada doveden do 600 μl / jamici. Medij je izmjenjen nakon 24 sata i mijenja se svaki dan.

In vivo procjena kod životinja

Sve štakorice Sprague Dawley (SD) nabavila je Akademija medicinskih znanosti provincije Zhejiang. Svi pokusi na životinjama izvedeni su u skladu sa smjernicama Odbora za njegu i upotrebu životinja provincije Zhejiang. Sve eksperimentalne postupke odobrio je Institucionalni odbor za njegu i upotrebu životinja na Sveučilištu Zhejiang.

Sve kirurške zahvate obavila su dva iskusna traumatična ortopedska kirurga (ZJP i DTX). Tibialni defekti nastali su u mužjaka SD-štakora u dobi od 8 tjedana (težine otprilike 200 g). Štakori su anestezirani intraperitonealno s 0, 3% pentobarbital natrija (Sigma) pri 30 mg / kg tjelesne težine. Nakon anestezije napravljen je rez na koljenu ispod koljena. Intramedularna igla (igla šprice nehrđajućeg čelika promjera 1, 2 mm) umetnuta je u medularni kanal tibije radi fiksacije. Model tibijalnog oštećenja uspostavljen je kao što je ranije objavljeno. 50, 51 Tibialni defekt promjera 1, 5 mm načinjen je šupljom bušilicom na svim štakorima SD približno 5 mm od proksimalne tibijalne ploče za rast. Za svaku je skupinu korišten isti krak. 24 oštećenja kod 24 štakora nasumično su podijeljena u četiri skupine. U praznoj skupini ( n = 6) ništa nije cijepljeno na mjesto prijeloma; u skupini s negativnom kontrolom ( n = 6) područja oštećenja bila su ispunjena samo hitozanskim skelom; u skupini s lenti-kontrolom ( n = 6) skele zasađene lenti-kontrolnim hBMSCs su ugrađene u oštećenja tibije; i u skupini lenti-SIRT7 ( n = 6) skele su ugrađene u defekte.

Radiografska analiza i mikro-CT ocjena

Životinje su ubijene 6 tjedana nakon operacije, a uzorci su prikupljeni. Radiografske snimke snimljene su pomoću dvostranog molibdena / rodijuma + Mo mamografskog stroja (22 KV, 250 mAS; GE, Fairfield, CT, SAD) za procjenu stvaranja kalusa na mjestu oštećenja. Svi su uzorci skenirani na stvaranje kosti pomoću mikro-CT 100 sustava za obradu slika (Scanco Medical, Brüttisellen, Švicarska) sa sljedećim parametrima skeniranja: 70 kVp energija rendgenskih zraka, 1024 matrica za rekonstrukciju, debljina reza 0, 0148 mm i vrijeme integracije 300 ms., BV / TV, Tb.N i Conn.D izračunati su trodimenzionalnom standardnom mikrostrukturnom analizom. 52

Histološka procjena

Uzorci su fiksirani u 4% paraformaldehidu 72 sata na sobnoj temperaturi, a zatim dekalcificirani pomoću 10% EDTA (Sigma), mijenjajući otopinu jednom tjedno> 8 tjedana, prije nego što su ugrađeni u parafin. Serijski presjeci debljine 3- µm izrezani su i montirani na dijapozitive presvučeni polilizinom. Hematoksilin i eozin, Safranin O i Fast green, te Masson obojenje izvedeni su odvojeno na uzastopnim presjecima tkiva. Za obojenje hematoksilinom i eozinom, dijelovi tkiva nakon deparafinizacije su rehidrirani i obojeni 30 hematoksilinom, isprani 1 min vodom, eozinom 10-30 s i dehidrirani alkoholom. Za bojenje Safranin O i brzo zeleno oboje, presjeci tkiva nakon deparafinizacije su rehidrirani i obojeni 30 hematoksilinom, brzo zeleni 15 minuta, isprani u PBS-u tokom 15 minuta, safranin O 5 minuta i dehidrirani alkoholom. Za Masson obojenje, odsječki tkiva nakon deparafinizacije su rehidrirani i obojeni 30 hematoksilinom, Biebrich grimizno-kiselinski fuksin 5 min, isprani u PBS-u 15 min, fosfomolibdinska kiselina 5 min, isprani u PBS-u 15 min, anilin plavi za 5 min, i dehidrirana alkoholom. Slike su dobivene mikroskopom.

Statistička analiza

Statistička analiza izvršena je korištenjem softvera SPSS 17.0 (IBM, Armonk, NY, USA). Svi su pokusi izvedeni u najmanje tri primjerka, a podaci su prikazani kao sredstvo ± SD

Statistička značajnost utvrđena je korištenjem dvorednog t- testa učenika pri uspoređivanju dviju skupina i jednosmjerne ANOVA praćen Bonferronijevim post-hoc testom za usporedbu više od dvije skupine. Smatralo se da je P-vrijednost 0, 05 statistički značajna razlika.

Bilješka izdavača

Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska slika 1 Legenda

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)