Nokaut atg5 odgađa sazrijevanje i smanjuje preživljavanje neurona generiranih od odraslih u hipokampusu | stanična smrt i bolest

Nokaut atg5 odgađa sazrijevanje i smanjuje preživljavanje neurona generiranih od odraslih u hipokampusu | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Neurogeneza odraslih
  • autophagy
  • morski konj
  • Neuronski potomci

Sažetak

Autofagija je evolucijski očuvan put razgradnje lizosoma koji ima važnu ulogu u održavanju, proširenju i diferencijaciji stanica. Uklanjanje gena neophodnih za autofagiju iz embrionalnih stanica neuronskog matičnjaka i prekursora smanjuje preživljavanje i inhibira diferencijaciju neurona kod neurona generiranih od odraslih. Nijedno istraživanje nije izmijenilo autofagiju unutar stanica odraslih prekursora, ne ostavljajući nepoznatu stanično autonomnu ulogu autofagije u neurogenezi odraslih. Ovdje pokazujemo da autofagični tok postoji u odrasloj stanici koja dijeli potomstvo i potomstvu u zubnom zubu. Da bismo istražili ulogu autofagije u neurogenezi hipokampa kod odraslih, genetski smo izbrisali gen 5 ( Atg5 ) koji je povezan sa autofagijom, a koji je smanjio autofagični tok i preživljavanje potomstva dijeljenja stanica praroditelja. Ovo značajno smanjenje preživljavanja neurona generiranih od strane odraslih popraćeno je kašnjenjem sazrijevanja neurona, uključujući prolazno smanjenje gustoće kralježnice u nedostatku promjene u diferencijaciji. Kašnjenje u staničnom sazrijevanju i gubitak potomstva Atg5-nultih stanica nije bilo prisutno kod miševa kojima je nedostajao esencijalni pro-apoptotički protein Bax (X-protein povezan s Bcl-2), što sugerira da stanice s nedostatkom Atg5 umiru kroz Bax- ovisni mehanizam. Uz to, došlo je do gubitka Atg5-null ćelija nakon izlaganja trčanju, što sugerira da je Atg5 potreban za povećanje neurogeneze izazvano trčanjem. Ovi nalazi naglašavaju stanično-autonomnu potrebu Atg5 za preživljavanje neurona generiranih od strane odraslih.

Glavni

U mozgu odraslih osoba neurogeneza omogućava kontinuirani razvoj neurona generiranih od strane odraslih kao odgovor na fiziološke i patološke podražaje. Stanice neuronskih pretpostavki (NPC) unutar neurogene niše subventrikularne zone (SVZ) i subgranularne zone (SGZ) stvaraju odrasle generirane neurone unutar olfaktorne žarulje i dentata. 1, 2, 3 Sposobnost NPC-a da se šire, diferenciraju i integriraju u strujni krug radi modificiranja ponašanja čini razumijevanje ovih stanica i faktora koji reguliraju te procese kritičnim za razvoj novih terapija. To je posebno važno za brojne bolesti poput neurodegenerativnih bolesti, uključujući Parkinsonove i Huntingtonove bolesti koje su povezane sa smanjenom neurogenezom odraslih, kao i strategije regenerativne medicine za oporavak nakon moždanog udara. 4, 5, 6

Dvije skupine su otkrile da in vivo makroautofagija (u daljnjem tekstu autofagija) može regulirati neurogenezu odraslih ispitivanjem učinka brisanja gena povezanih s autofagijom ( Atgs ). Yazdankhah i sur. 7 su pronašli da heterorozni embrionalni miševi s embrionalnim embrionizmom Ambra1 i Beclin1 imaju manje razmnožavajuće NPC u SVZ i s njima povezano smanjenje neurogeneze u olfaktornoj žarulji. Wang i sur. 8 su otkrili da uvjetno uklanjanje FIP200 ( proteina fokalne adhezijske kinaze (FAK), interakcije proteina M r 200 K, također poznat kao ULK1, Atg1 protein koji djeluje homologom) iz embrionalnih NPC-a postupno smanjuje broj postnatalnih NPC-a, kao i smanjuje neurogeneza i povećava astrogenezu. Za razliku od embrija, Lv i sur. 9 je pokazalo da specifično rušenje gena 5 povezanog s autofagijom ( Atg5 ) povećava proliferaciju i inhibira diferencijaciju neurona embrionalnih NPC-a tijekom razvoja kortiksa . Ovi podaci sugeriraju da se embrionalni i odrasli NPC mijenjaju kada se geni povezani s autofagijom izbrišu u embriju. Međutim, ostaje nepoznanica je li autofagija, neovisna o učincima u embriju, potrebna izravno za NPC i njihovo potomstvo u odraslih.

Ovdje smo testirali funkcionalnu ulogu autofagije posebno u mozgu odraslih uklanjajući Atg5 od dijeljenja NPC-a. Otkrili smo da se autofagični tok pojavljuje kod NPC-a odraslih i da je uklanjanje Atg5 povezano sa smanjenjem autfagijskog fluksa. Uz to, nalazimo da Atg5-null stanice imaju značajno smanjenje preživljavanja, kao i kašnjenje sazrijevanja neurona. Smanjenje neurogeneze dogodilo se u nedostatku promjene proliferacije ili staničnog roda. Nadalje, uklanjanjem Bax-a (protein B-povezan s Bcl-2) obnovljena je neurogeneza u odsutnosti Atg5 , što implicira Baxove funkcije nizvodno od Atg5 da regulira preživljavanje neurona generiranih od odraslih. Konačno, pokazali smo da je signalizacija ovisna o Atg5 potrebna za povećanje povećanja preživljavanja NPC-ova kod odraslih.

Rezultati

Autofhagični tok u hipokampnim NPC-ima i njihovo potomstvo

Autofagija je izrazito dinamičan proces koji uključuje indukciju, inicijaciju i produženje izolacijske membrane, tvoreći autofagosom koji se čisti nakon fuzije s lizosomom. Ekspresija autofagosomskog marker mikro proteina 1 lakog lanca 3 (LC3) i fosfatidil-etanolamina (PE) -Modificirani LC3 (LC3-II) prikazana je u SVZ NPC-ima i njihovom potomstvu u rostralnom migracijskom toku i olfaktornoj sijalici. 7, 8

Unutar dentinog gyrus-a stanična raspodjela autofagosoma unutar NPC-a i njihovo potomstvo ostaju nepoznati. Stoga smo, kako bismo ispitali da li se javlja autophagička aktivnost u NPC-u i njihovo potomstvo dok sazrijevaju unutar SGZ-a, koristili monomerni protein mCherry-EGFP-LC3 koji se u posljednje vrijeme koristi za mjerenje autofagičnog toka u mozgu u zrelim neuronima. 10 Na temelju osjetljivosti GFP fluorescentnog signala, ali ne mCherry fluorescentnog signala, na kisela stanja lizosomskog lumena, ovaj pristup omogućuje otkrivanje autofagosoma (GFP i mCherry koji izražavaju puncta (GFP + mCherry +)) i autolysosoma (samo puncta izraziti mCherry (GFP-mCherry +).

Stvorili smo mCherry-EGFP-LC3 retrovirus da inficiramo i rodnim žigom podijelimo NPC i ispitali smo ekspresiju mCherry-EGFP-LC3 proteina 3, 7, 14 i 30 dana nakon infekcije (DPI). Zaražene stanice identificirane su izrazitim izrazom citoplazmatskog nuklearnog bojenja GFP-a i mCryry-ekspresionirajućim punktama koji ukazuju na autolysomome i sugeriraju na brzi autofagični tok (slika 1a). Autolysosomi su bili jasno vidljivi u soma i procesima zaraženih stanica. U 3–14 DPI, kvantifikacija broja autolysosoma prisutnih u obilježenim stanicama nije pokazala značajnu razliku u ukupnom broju autolysosoma u soma po zaraženoj stanici (Slika 1b). Do 30 DPI došlo je do značajnog smanjenja broja autolysosoma u procesima, ali ne unutar soma (Slike 1b i c). Nadalje smo potvrdili da su inficirane stanice NPC-i i njihovo potomstvo utvrđivanjem da je nezreli marker neurocita Doublecortin (DCX) izražen u 94 ± 7% i 93 ± 7% inficiranih stanica u 3 odnosno 7 DPI (Slika 1d). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da je autofagija aktivna u NPC-u tijekom svog razvoja i čini se aktivnijom u procesu razvoja u stanicama mlađim od jednog mjeseca.

Image

Retrovirusno označavanje mCherry-EGFP-LC3 pokazuje autofagičnu aktivnost unutar NPC-a prisutnih u SGZ-u DG-a. ( a ) Reprezentativne slike tandem mCherry-EGFP-LC3 retrovirusno inficiranih stanica koje pokazuju mCherry + autolysosoms prisutne tijekom sazrijevanja NPC-a tijekom 3, 7, 14 i 30 dana nakon injekcije (DPI). Autolizomomi su kvantificirani unutar ( b ) soma, kao i ( c ) procesa koji se protežu iz staničnog tijela ( n = 2–3 životinje u grupi, 7–15 stanica / životinja, jednosmjerna ANOVA, ** P < 0, 005 u usporedbi sa 7DPI). ( d ) Reprezentativna slika na 7 DPI prikazuje DCX + stanice koje eksprimiraju autolysosoms (strelica usmjerena na autolysosoms prisutne na dendritu neurona koji eksprimira DCX). Šipke skale = 10 μ m

Slika pune veličine

Atg5 je potreban za preživljavanje potomstva NPC-a

Da bismo utvrdili je li autofagija bitna za preživljavanje NPC-a i njihovo potomstvo, koristili smo pristup prijenosom gena posredovan retrovirusom kako bismo izbacili Atg5 iz razdjelnih NPC-a u mozgu odraslih. Da bi se utvrdilo da li bi gubitak Atg5 iz NPC-a utjecao na autofagični tok, broj autolysosoma računao se u Atg5 + / + i Atg5 flox / flox miševima koji su ubrizgani ubrizgavanjem GFP-Cre i mCherry-EGFP-LC3 retrovirusima. Stanice zaražene mCherry-EGFP-LC3 same su izrazile GFP u citoplazmi (slika 2a strelica, veće uvećanje na slici 2b), dok stanice zaražene s oba virusa izražavaju GFP kroz jezgro i citoplazmu, jer ekspresija GFP u stanicama zaraženim GFP-Cre je nuklearno zbog signala nuklearne lokalizacije (slika 2a strelica, veće uvećanje na slici 2c). Kvantificiranje Atg5 nultih i Atg5 + / + -inficiranih stanica pokazalo je značajno manje autolysosoma u Atg5-null stanicama i u staničnom tijelu (slika 2d) i u procesu (slika 2e).

Image

Retrovirusom posredovano uklanjanje Atg5 iz dijeljenja NPC smanjuje broj autolizosoma i smanjuje opstanak stanica. ( a ) Reprezentativna slika zubnog gustera koja prikazuje dvije stanice zaražene retrovirusom. Stanica zaražena virusom mCherry-EGFP-LC3 prepoznaje se citoplazmatskom GFP ekspresijom, koja se također može prepoznati u ( b ) pri većem povećanju. Suprotno tome, stanica zaražena i mCherry-EGFP-LC3 i GFP-Cre identificirana je citoplazmatskom EGFP i nuklearnom GFP ekspresijom, koja se također može prepoznati u ( c ) pri većem povećanju. Linija mjerila = 20 µ m ( a ) i 5 µ m ( b i c ). Broj autolysosoma u tijelu ( d ) stanice i ( e ) procesi Atg5-null ćelije u Atg5 flox / flox miševima značajno je smanjen u usporedbi sa WT stanicama u Atg5 + / + miševima na 7 DPI ( n = 3 Atg5 + / + miševi, n = 2 Atg5 flox / flox miševi; n = 7–13 stanica / životinja; stanica t (50) = 5, 7, **** P <0, 0001; za procese t (50) = 5, 0, **** P <0, 0001). ( f ) Reprezentativne konfokalne slike GFP-Cre + (zelena), RFP + (crvena) i dvostruko označenih (žuta; GFP + RFP +) stanica na 3, 7, 30 i 60 DPI retrovirusa ( CAG-GFP-Cre i CAG- RFP ) u dentate gyrus WT ( Atg5 + / + ) i flox Atg5 ( Atg5 flox / flox ) miševe. Linija mjerila = 20 μ m. ( g ) Omjer preživljavanja izražen kao GFP + RFP + (žuto) u svim RFP + (crvenim + žutim) stanicama na 3–60 DPI, što pokazuje manje preživljavanje Atg5-nultih stanica kod 30 i 60 DPI ( n = 2–5 životinja u skupini, dvosmjerna ANOVA, Bonferroni post hoc . ** P <0, 01, *** P ≤0, 005)

Slika pune veličine

Kako bi se karta sudbine procijenila i procijenila preživljavanje Atg5-null NPC-a, za infekciju razdvajajućim NPC-ima u SGZ-u korištena je mješavina retrovirusnog GFP-Cre ( CAG-GFP-Cre ) i kontrolnog RFP-a ( CAG-RFP ) 11. miševi Atx5 flox / flox i divlji tip ( Atg5 + / + ). Ovaj pristup je korišten jer omogućava usporedbu omjera Atg5-null zaraženih dvostruko označenih stanica GFP-Cre- i RFP-ekspresije (GFP + RFP +) u svim kontrolnim stanicama koje izražavaju RFP (RFP +), kao što je slično objavljeno od strane naše grupe i drugih. 11, 12, 13, 14, 15 Kao što se očekivalo kod Atg5 + / + miševa, nije bilo značajne razlike u omjeru preživljavanja između 3 i 60 DPI. Suprotno tome, kod Atg5 flox / flox miševa došlo je do smanjenja preživljavanja tijekom vremena, a post-hoc analiza otkrila je značajno smanjenje preživljavanja između 3 i 7 DPI. Značajno smanjenje preživljavanja Atg5-nultih stanica pri 3 do 7 DPI povezano je sa značajnim smanjenjem omjera preživljavanja između Atx5 flox / flox miševa i kontrolnih Atg5 + / + miševa na 30 i 60 DPI (Slike 2f i g), Rezultat smanjenog omjera preživljavanja potkrijepljen je i brojem stanica za prosječan broj ćelija inficiranih Cre-GFP- i RFP-om koji su pokazali značajno smanjenje broja stanica inficiranih Cre-GFP-om na 7 DPI u Atg5 flox / flox miševima u usporedbi s kontrolnim miševima Atg5 + / + . Smanjenje broja Atg5-null (GFP +) stanica dogodilo se bez bilo kakve razlike u broju kontrolnih RFP-inficiranih stanica u bilo kojem trenutku (Dopunska slika 1). Prema tome, sveukupni rezultati sugeriraju da je Atg5 potreban za preživljavanje potomstva NPC-a tijekom kritičnog razdoblja od 3 do 7 dana. Ovi rezultati sugeriraju da značajno smanjenje preživljavanja Atg5-null NPC-a posreduje autofagija.

Potomstvo Atg5-null NPC-a ima zastoj u sazrijevanju neurona u nedostatku promjene sudbine

Da bismo ispitali je li gubitak Atg5 promijenio sazrijevanje ili sudbinu NPC-a, kvantificirali smo ekspresiju različitih markera staničnih loza u Atg5-null ćelijama u Atg5 flox / flox miševima nasuprot Atg5-eksprimirajućim stanicama u kontrolnoj Atg5 + / + miševi. U 3 DPI, nije bilo razlike u omjeru stanica koje eksprimiraju Atg5 i Atg5 koje se dijele, mjereno GFP + stanicama koje izražavaju marker staničnog ciklusa, Ki67 (dopunska slika 2). Ispitivanje i kvantifikacija Atg5-null i Atg5-eksprimirajućih stanica koje su eksprimirale nezreli neuronski marker DCX značajno su varirale između 3 i 30 DPI (Slike 3a i b). U 3 DPI postojao je sličan omjer Atg5-null i Atg5-eksprimirajućih stanica koji su eksprimirali DCX. Na 7 DPI došlo je do značajnog smanjenja udjela preživjelih Atg5-nultih stanica koje su eksprimirale DCX. Suprotno tome, pri 30 DPI došlo je do značajnog povećanja udjela preživjelih Atg5-nultih stanica koje su eksprimirale DCX. Ovaj nalaz podigao je hipotezu da Atg5-null stanice koje generiraju odrasli mogu imati kašnjenje u sazrijevanju neurona. U prilog ovoj hipotezi došlo je do značajnog smanjenja udjela Atg5-nultih stanica na 7 DPI koje su izrazile marker zrelog neurona NeuN (Slike 3c i d). Taj je učinak bio prolazan i gotovo svi NPC-i izrazili su NeuN pri 30 i 60 DPI. Daljnjom potporom Atg5-null stanice koje imaju prolazno kašnjenje sazrijevanja, udio 30 DPI Atg5-null ćelija koji su eksprimirali i DCX i NeuN bio je značajno povećan (Slike 3e i f). Kombinacijom naše analize broja preživjelih Atg5-null i Atg5-eksprimirajućih stanica između 3 i 60 DPI (Slika 2) i prosječnog postotka koji postaju neuroni na 60 DPI (NeuN +) (Slika 3c), možemo dalje procijeniti uklanjanje Atg5 je smanjio broj novih neurona za približno dvostruko (stopa preživljavanja neurona između 3 i 60 dana: 53% divljeg tipa (WT) i 27% Atg5 fl / fl ). Ovi rezultati stoga potvrđuju da Atg5 ima ulogu preživljavanja i potreban je za vremenski razvoj mladog nezrelog neurona dok se razvija u neuron koji generira odrasla osoba.

Image

Potomstvo preživjelih Atg5-null NPC-a ima zastoj u sazrijevanju neurona u nedostatku promjene sudbine. ( a ) Reprezentativna slika GFP-Cre + stanica na 7 DPI koalirana s DCX (strelice GFP + DCX + kolabirane stanice). ( b ) Kvantifikacija GFP-Cre + ekspresije DCX pokazuje proporcionalno manje Atg5-nultih stanica izražava DCX na 7 i više pri 30 DPI ( n = 3–5 životinja po skupini, n = 17–23 stanica / životinja, dvosmjerna ANOVA, Bonferroni post hoc , ** P <0, 01, **** P <0, 0001). ( c ) Reprezentativna slika koja prikazuje dvije GFP-Cre + stanice koje izražavaju NeuN pri 30 DPI. ( d ) Kvantifikacija GFP-Cre + ekspresije NeuN koja pokazuje manje Atg5-nultih stanica izražava NeuN + stanice na 7 DPI ( n = 3–5 životinja po skupini, n = 17–23 stanica / životinja, dvosmjerna ANOVA, Bonferroni post hoc , * P <0, 05). ( e ) Reprezentativna slika GFP-Cre + (zelene) ćelije koje izražavaju DCX (crvena) i / ili NeuN (plava) (strelica = GFP-Cre + NeuN + DCX - i strelica = GFP-Cre + NeuN + DCX +). ( f ) Kvantifikacija koja pokazuje više Atg5-nultih stanica koeksprimiranih DCX i NeuN kod 30 DPI ( n = 4 Atg5 + / + , n = 5 Atg5 flox / flox miševa, n = 17–23 stanica / životinja, a t (7) = 7, 0, P = 0, 0002). Stup skale = 20 μ m

Slika pune veličine

Potomstvo Atg5-null NPC-a ima prolazno smanjenje gustoće kralježnice

Značajno smanjenje preživljavanja Atg5-nultih stanica bilo je povezano s kašnjenjem sazrijevanja neurona. S obzirom na to da je nedavno pokazano da autofagija regulira embrionalno obrezivanje kralježnice 16 i naše promatranje autolysosoma prisutnih u dendritima hipokampnih stanica koje generiraju odrasli (Slika 1), ispitali smo je li uklanjanje Atg5 promijenjenog dendritičkog rasta i gustoće kralježnice u stanicama koje generiraju odrasli ( Slika 4). Procjena analize i ispitivanja ukupne dužine dendritika nisu otkrili razlike u Atg5-null stanicama u usporedbi s Atg5-ekspresirajućim stanicama (Slike 4a-c). Suprotno tome, došlo je do značajnog smanjenja gustoće kralježnice u Atg5-null nasuprot Atg5-eksprimirajućim stanicama pri 30 DPI (Slike 4d i e). Smanjenje gustoće kralježnice bilo je prolazno i ​​nije se značajno razlikovalo za 60 DPI (slika 4e). Ovi nalazi su u korelaciji sa kašnjenjem sazrijevanja neurona koje je uočeno analizom loze (Slika 3) i daljnjim potporama da je Atg5 potreban tijekom razvoja nezrelih neurona.

Image

Preživele Atg5-null stanice pokazuju normalan dendritički razvoj, ali kašnjenje u razvoju bodlji. ( a ) Reprezentativne konfokalne slike koje prikazuju WT i Atg5-null neurone (GFP + RFP +) pri 30 DPI. Linija mjerila = 20 μ m. ( b ) Detaljna analiza dendritskih lukova u WT i Atg5-nulnim neuronima ne pokazuje razliku u složenosti dendrita ( n = 2 životinje u grupi, 13–20 dendrita / životinja). ( c ) Kumulativna raspodjela frekvencije WT i Atg5-nultih stanica ne pokazuje razliku u ukupnoj dendritičkoj duljini ( n = 2 životinje po genotipu, 6–13 stanica / životinji). ( d ) Reprezentativna slika bodlja duž dendritičkog segmenta iz WT i Atg5-null neurona pri 30 DPI. Linija mjerila = 2 μ m. ( e ) Kvantifikacija broja bodlji na 10 µm otkriva smanjenje gustoće kralježnice u Atg5-nulnim neuronima na 30 DPI ( n = 2 Atg5 + / + , n = 4 Atg5 flox / flox miševa; n = 3–7 dendriti / životinji). ** P <0, 01

Slika pune veličine

Inaktivacija Bax-a vraća Atg5-inducirani deficit neurogeneze

Značajno smanjenje broja Atg5-nultih stanica dovelo nas je do hipoteze da Atg5-null stanice umiru vjerojatno od apoptoze. Doista je poznato da je broj neurona generiranih od strane odraslih samo mali dio broja NPC-a koji se dijele zbog apoptotske smrti stanica koja se događa tijekom neurogeneze. 11, 17, 18, 19 Stoga smo testirali hoće li blokiranje apoptoze spriječiti gubitak sazrijevanja Atg5-nultih stanica. Konkretno, utvrdili smo da li bi virusno zaražene Atg5-null stanice poboljšale preživljavanje kod miševa kojima nedostaje osnovni apoptotski protein, Bax. 20 U skladu s procesom koji ovisi o Bax-u koji posreduje apoptozu odraslih NPC-ova u razvoju, ranije smo izvijestili da embrionalni Bax-ovi knockout ( Bax - / - ) miševi imaju značajan porast prosječnog broja virusno obilježenih stanica u usporedbi s WT kontrolnim miševima i mogu spašavanje sazrijevanja NPC-a koji umiru zbog nedostatka Bcl-2. 15 Dakle, mi smo uzgajali embrionalne Bax knockout ( Bax - / - ) miševe s Atg5 flox / flox miševima da bismo stvorili Atg5 + / + Bax - / - i Atg5 flox / flox Bax - / - legla miševe, a obilježene stanice ispitivane su 30 DPI strategijom dvostrukog retrovirusnog označavanja. U nedostatku Baxa , nije postojala razlika u preživljavanju retrovirusnih stanica koje eksprimiraju Atg5 ili null ili Atg5 (Slike 5a i b). Slično tome, nije bilo razlike u postotku Atg5-null ili Atg5-eksprimirajućeg koji je izrazio DCX pri 30 DPI (Slika 5c). To je u oštroj suprotnosti s kašnjenjem sazrijevanja i značajnim povećanjem udjela preživjelih Atg5-nultih stanica koje su izrazile DCX pri 30 DPI u prisutnosti Baxa (Slika 3a). Zajedno, ovi nalazi podržavaju da uklanjanje Baxa može spasiti i gubitak Atg5-null ćelija i njihovo kašnjenje u sazrijevanju, podupirući da Atg5 funkcionira u sazrijevanju NPC-a uzvodno od Bax-ovog apoptotskog puta.

Image

Smanjenje preživljavanja i sazrijevanje Atg5-null NPC-a ovisi o Baxu. ( a ) Reprezentativne slike i ( b ) kvantifikacija 30-dnevnih staničnih stanica retrovirusom u Atg5 + / + ; eBaxKO i Atg5 flox / flox ; eBaxKO miševi koji ne pokazuju razliku u omjerima preživljavanja kod 30DPI ( n = 3 životinje / skupina). ( c ) Kvantifikacija GFP-Cre + stanica ne pokazuje razliku u proporciji tog ekspresnog DCX pri 30 DPI u Atg5 + / + ; eBaxKO i Atg5 flox / flox ; eBaxKO miševi ( n = 2 životinje / grupa, 20–21 stanica / životinja). Linija mjerila = 20 μ m

Slika pune veličine

Atg5 je potreban za povećanje preživljavanja NPC-a izazvanog vježbanjem

Pokazano je da trčanje povećava autofagiju u mozgu, 21 pa smo testirali je li Atg5 potreban za povećanje neurogeneze izazvane vježbanjem. Kao što se i očekivalo, Atg5 flox / flox i WT ( Atg5 + / + ) miševi koji su imali slobodan pristup trkačem kolu imali su porast broja kontrolnih stanica koje nisu bile zaražene Cre-om (RFP + ) u usporedbi s miševima koji su imali pristup zaključani kotač (slika 6a). Ispitivanje WT miševa pokazalo je da je došlo do značajnog porasta stanica inficiranih Cre-om (GFP +) kod miševa kojima je omogućen pristup voznom kolu (Slika 6b). Analiza omjera preživljavanja nadalje je pokazala kod WT miševa značajan porast omjera preživljavanja (Slika 6c). Suprotno tome, Atg5 flox / flox miševi koji su bili izloženi ili zaključanom ili upravljačkom kolu imali su značajno manje Atg5-null (GFP +) stanica u usporedbi sa WT miševima (Slika 6b). Pored toga, Atg5 flox / flox miševi u usporedbi sa WT miševima imali su značajno smanjenje omjera preživljavanja u zaključanim ili slobodnim voznim kotačima (slika 6c). Do tih promjena došlo je u kontekstu sličnih udaljenosti između WT i Atg5 flox / flox miševa (WT 210 836 ± 32 164 m naspram Atg 5 fl / fl 159 909 ± 27 434 m). Stoga, sveukupno, ovi rezultati sugeriraju da trčanje ne može spasiti Atg5-null fenotip preživljavanja, s obzirom da je Atg5 potreban za povećanje NPC-a izazvano trčanjem.

Image

Atg5 je potreban za povećanje povećanja NPC-a izazvanog vježbanjem. ( a ) Miševi sa slobodnim pristupom upravljačkom kolu u usporedbi sa zaključanim kotačem pokazali su porast broja ne-Cre-zaraženih (RFP + ) stanica u Atg 5 flox / flox i WT miševima. ( b ) Broj GFP-Cre + stanica je povećan u Atg5 + / + pokretu u odnosu na Atg5 + / + zaključane miševe i usporediv u Atg5 flox / flox pokretu u odnosu na Atg5 flox / flox lock. ( c ) Omjer preživljavanja veći je u Atg5 + / + trčanju u odnosu na Atg5 + / + zaključane miševe i usporediv u Atg5 flox / flox pokretu u odnosu na Atg5 flox / flox zaključavanje (za a - c, n = 4 Atg5 + / + brava, n = 3 Atg5 flox / flox zaključavanje, n = 4 Atg5 + / + trčanje, n = 6 Atg5 flox / flox trčanje). Bonferroni post hoc , *** P≤ 0.0002, **** P <0.0001, značajna razlika u usporedbi s zaključnom skupinom istog genotipa

Slika pune veličine

Rasprava

Ovdje pokazujemo da je autofagija aktivna u potomstvu NPC-a i da je Atg5 potreban za preživljavanje potomstva odraslih NPC-a. Autofhagični tok prisutan je u potomstvu hipokampalnih NPC-a, pri čemu se autolysosomi otkrivaju unutar soma i dendrita. Funkcionalno, retrovirusna infekcija Cre kod miševa flox / flox Atg 5 smanjuje autolysosoms u Atg5-null stanicama i povezana je sa značajnim gubitkom preživljavanja potomstva NPC-a tijekom prvih 7 dana njihovog sazrijevanja. Smanjenje preživljavanja popraćeno je kašnjenjem sazrijevanja neurona generiranog u odrasloj dobi, uključujući prolazno smanjenje gustoće kralježnice u nedostatku promjene proliferacije ili sudbine neurona. Eksperimenti komplementacije in vivo s Bax-ovim nokautom miševima pokazuju da se smanjenje Atg5-null nezrelih neurona događa uslijed smrti posredovane Bax-om. Štoviše, trčanje, koje je poznati induktor autofagije, nije bilo dovoljno za poništavanje značajnog fenotipa preživljavanja Atg5 nultih NPC-a.

Ovi nalazi sugeriraju da je Atg5 jedan od vratara koji kontrolira koji NPC-i u mozgu odraslih preživljavaju tijekom razvoja u nove funkcionalne neurone.

Ova otkrića nadopunjuju nedavni rad drugih koji su in vivo 7, 8, 9 ispitivali autofagiju i neurogenezu odraslih i prvi put pokazali da autofagija ima ulogu preživljavanja tijekom razvoja odraslih generiranih neurona hipokampala. Naši zaključci nadalje pružaju dokaze da ćelije stare 3–7 dana proći kritično razdoblje za preživljavanje koje zahtijeva Atg5. Također pokazujemo da učinak preživljavanja Atg5 u NPC-ima može nastupiti neovisno o učincima u embrionalnom ili ranom postnatalnom mozgu, neovisno o promjeni stanične proliferacije, kao i neovisan o učincima u populaciji matičnih stanica odrasle dobi jer ovaj retrovirus cilja podjelu NPC-a., Da bi se utvrdilo da li je Atg5 potreban u matičnim stanicama, buduće studije zahtijevaju inducibilni sustav za ciljanje polako dijeljenih matičnih stanica.

Uklanjanje Atg5 iz NPC-a također je rezultiralo značajnim kašnjenjem u njihovom sazrijevanju. Vrijeme kašnjenja sazrijevanja uočeno je između 1 tjedna i 1 mjeseca nakon virusne infekcije. Za to vrijeme dobro je poznato da postoji potreba za neuronskom aktivnošću da promiče preživljavanje stanica putem mehanizama ovisnih o aktivnosti, uključujući NPC koji imaju niži prag za dugoročno potenciranje. 3, 22, 23, 24 Stoga kašnjenje sazrijevanja može pridonijeti smanjenju preživljavanja Atg5-nultih stanica. To je uzbudljiva mogućnost jer su razne studije utvrdile da aktivnost neurona može regulirati autofagiju kroz različite mehanizme, poput retrogradnog transporta autofagosoma ovisnog o aktivnosti i degradacije presinaptičkog AMPA receptora. 25, 26, 27, 28 Zajedno, ovi nalazi zajedno dovode do hipoteze da autofagija i aktivnost neurona mogu temeljno regulirati opstanak sazrijevajućih NPC-a.

Smanjenje preživljavanja i kašnjenje sazrijevanja Atg5-nultih stanica događaju se neovisno o utjecaju na diferencijaciju dijelećih NPC-a na zrele dentatne neurone. Gotovo svi Atg5-null NPC-ovi koji opstanu razvijaju se u neurone koji eksprimiraju NeuN unutar 2 mjeseca. To je iznenađujuće jer in vivo studije koje ispituju autofagiju i neurogenezu potvrđuju da su za razlikovanje neurona u potomstvu odraslih NPC-a potrebni barem Ambra1, Beclin1 i FIP200. 7, 8 Postoji mnogo mogućih objašnjenja koja bi mogla objasniti ovu razliku. Jedna od hipoteza je da bi dijeljeni NPC-ovi s retrovirusom mogli proći fazu posvećenja neuronske loze. Međutim, ovo objašnjenje izgleda malo vjerovatno jer je nedavno objavljeno smanjenje neuronske loze u retrovirusno transduciranim NPC-ima. 29 Vjerojatnija hipoteza može biti da zahtjev za autofagijom za diferencijacijom može biti različit unutar embrija u odnosu na odrasle NPC i njihovo potomstvo. To bi moglo proizaći iz unutarnjih razlika u populaciji ćelija embriona ili odraslih te u kompenzaciji koja nastaje u embrionalnom nasuprot odraslom neurogenom niši. Tome u prilog govori i varijabilnost fenotipskih ishoda prijavljenih u Atla5 ablaciji in vivo modelima miša. Uvjetno uklanjanje Atg5 na E10.5 unutar stabljike koja eksprimira nestin i NPC uzrokuje neurodegeneraciju i nakupljanje unutarćelijskih proteina, bez nedostatka velikih razlika u diferencijaciji. 30 U novije vrijeme, inducibilno rušenje Atg5-a ili prekomjerna ekspresija Atg5-a u kortikalnim NPC-ima kod E13 sugerirali su da je Atg5 ključan za poticanje opredjeljenja neuronske loze. 9 Koristeći istu metodologiju na E16, ova je skupina također nedavno izvijestila da Atg5 promiče diferencijaciju astrocita unutar korteksa. 31 Suprotno tome, nalazimo da uklanjanje Atg5 ne mijenja sudbinu potomstva koje dijeli NPC.

Naša studija također pokazuje da uklanjanje Baxa može spasiti gubitak Atg5-null ćelija, podupirući da Atg5 funkcionira uzvodno od Bax-ovog apoptotičkog puta u nezrelim neuronima. Iako su autofagija i apoptoza različiti stanični procesi, proteinske mreže koje kontroliraju njihovo reguliranje i provođenje vrlo su povezane. 32 Na primjer, Atg5 može izazvati apoptozu cijepanjem nekonjugiranog oblika Atg5 kalpainima koji tada izravno stupaju u interakciju s članom obitelji Bcl-2, B-staničnim limfomom-dodatnim većim (Bcl-xL). 33 Iako i Atg5 i skraćeni Atg5 ne vežu izravno Baxa, ostaje nepoznanica može li skraćeni Atg5 promovirati apoptozu aktivacijom molekula sličnih Bax-Bak-u inaktivacijom Bcl-xL. Kako skraćeni Atg5 potiče apoptozu, a mi smo pronašli da brisanje Atg5 potiče smrt NPC potomstva, malo je vjerojatno da je skraćeni Atg5 uključen u smrt Atg5-null ćelija. Tome u prilog ide i naše nedavno otkriće da kalpain-1 i kalpain-2, proteaze koje cijepaju Atg5, nemaju nedostatak u neurogenezi odraslih. 34

Zajedno, ovi podaci sugeriraju da Atg5 možda prolazi kanonskim putem autofagije da bi regulirao opstanak NPC-a u razvoju. Ako je to istina, tada bi induciranje autofagije trebalo biti u stanju spasiti fenotip preživljavanja. To se može dogoditi putem konvencionalnog ili Atg5 neovisnog puta koji ovisi o Atg5. 35 Pokazujemo da trčanje zahtijeva Atg5 u NPC-ima da bi povećali preživljavanje NPC-a i na taj način ne mogu spasiti Atg5-null fenotip preživljavanja. Bit će potrebne daljnje studije kako bi se detaljnije utvrdila uloga autofagije u neurogenezi uzrokovanoj vježbanjem u mozgu. Na primjer, ova studija ispitala je dobrovoljno trčanje, ostavljajući nepoznato hoće li naši nalazi generalizirati sve oblike vježbanja. Uz to, za izravno testiranje hipoteze da su Atg5-null nedostaci preživljavanja koji se javljaju kod naivnih i trčećih miševa ovisni o Atg5, potreban je inducibilni NPC model miša kako bi se utvrdilo može li eksperiment dobitaka u funkciji spasiti deficit opstanka Atg5-null stanice.

Zaključno, naši nalazi podržavaju stanično-autonomni zahtjev za Atg5 u odraslih nezrelih neurona. Ovo otkriće pruža nove informacije o regulaciji preživljavanja NPC potomstva koje su važne za oblikovanje terapijskih strategija usmjerenih na promicanje endogenog popravljanja i poboljšanje uspješnosti neuronskih transplantacija. Naši nalazi imaju i dodatne implikacije zbog eksponencijalnog rasta razvoja terapeutika koji inhibiraju i induciraju autofagiju kao intervenciju za razne vrste ljudskih poremećaja. 36 Na primjer, autofagični inhibitori koji se testiraju kao terapeutici protiv raka mogu imati neočekivane štetne nuspojave smanjenja neurogeneze. Međutim, sa druge strane, autofagični induktori koji su dizajnirani za neurodegenerativne bolesti mogli bi pokazati dodatne korisne učinke promocijom neurogeneze odraslih.

Materijali i metode

životinje

Miševi C57BL / 6 kupljeni su u rijeci Charles (Saint-Constant, QC, Kanada, mužjak, 7-12 tjedana). Linije miša koje su genotipizirane u skladu s ranije objavljenim protokolima uključuju: floxed Atg5 miševe iz RIKEN 30 i Bax nokaut miševe iz Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). 37 Raspon od 2 do 9 miševa bio je uključen u svaku eksperimentalnu skupinu. Postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama Kanadskog vijeća za njegu životinja, a odobrio ih je Odbor za brigu o životinjama Sveučilišta u Ottawi.

Miševi su bili smješteni u 12-satnom ciklusu svijetlo / tamno, sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Za eksperiment s vježbanjem (Slika 6), miševi su pojedinačno smješteni sa slobodnim pristupom niskoprofiliranom bežičnom kotaču ili zaključanom kolu (Med Associates, St. Albans, VT, USA) 1 tjedan prije i 2 tjedna nakon retrovirusne infekcije.

Retrovirus i stereotaksična injekcija

Retroviralne vektore CAG-GFP-Cre i CAG-RFP i odgovarajuće konstrukcije za pakiranje i omotnice velikodušno je pružio dr. Fred Gage (Institut Salk, La Jolla, Kalifornija, SAD). The retroviruses were generated as previously described. 11 The titers of GFP-Cre and RFP viruses were determined by live tittering using 293T cells and ranged between 2 and 4 × 10 8 infectious units (IU) per ml. The GFP-Cre and RFP virus was injected in a 1 : 1 ratio (volume 1.5 μ l), except for mice used for phenotyping that were injected with only GFP- Cre (volume 1 μ l). The mCherry-EGFP-LC3B plasmid (Addgene, Cambridge, MA, USA, 22418) was used to produce retroviruses as described above and 1.5 μ l was injected into the dentate. In order to target the SGZ, all retroviruses were bilaterally injected into the dentate gyrus (−1.7 mm anterior/posterior, ±1.2 mediolateral, −2.4 mm dorsoventral from Bregma) of mice (7–9 weeks old) during stereotaxic surgery. mCherry-EGFP-LC3B retrovirus was also coinjected with the GFP-Cre retrovirus in both Atg5 +/+ and Atg5 flox/flox mice to determine the effect of Atg5KO on autophagic puncta. Infected cells were distinguished based on either nuclear GFP expression (GFP-Cre infected), cytoplasmic GFP expression (mCherry-EGFP-LC3B infected) or both nuclear and cytoplasmic GFP (GFP-Cre and mCherry-EGFP-LC3B dual-infected) cells.

Tissue processing and immunohistochemistry

Mice were anesthetized and transcardially perfused with cold phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) followed by 4% paraformaldehyde in PBS. Brains were removed and postfixed for 1 h in 4% paraformaldehyde and then transferred into 30% sucrose with 0.1% sodium azide in PBS. Brains were sectioned coronally into 30 μ m slices on a freezing microtome and stored in PBS with 0.1% sodium azide. Histology was performed using free-floating methodology with sections being washed in PBS and incubated in 0.1% Tween-20 and 0.1% Triton X-100 in PBS with corresponding primary antibodies at 4 °C overnight. The following primary antibodies were used: chicken anti-GFP (GFP-1020, Aves, Labs, Inc., Tigard, OR, USA, 1 : 5000), rabbit anti-dsRed (632496, Clontech, Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA, 1 : 5000), rabbit anti-Ki67 (275R-14, Cell Marque, Rocklin, CA, USA, 1 : 100), goat anti-DCX (sc-8066, Santa Cruz, Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA, 1 : 500) and mouse anti-NeuN (MAB377, Millipore, Etobicoke, ON, Canada, 1 : 500). On day 2, sections were washed in PBS, incubated with corresponding Cy2-, Cy3- and Cy5-conjugated IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch, Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA, 1 : 500) for 1 h at room temperature, stained using 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 10236276001, Roche, Laval, QC, Canada, 1 : 10 000, 3 min) and washed in PBS.

Cells in the SGZ were counted using an Olympus BX51 fluorescent microscope (Olympus Canada Inc., Richmond Hill, ON, Canada) using unbiased histological approaches in every ninth serial section throughout the dentate, as previously described. 38 The quantification of colabeled cells was performed using a Zeiss LSM510-META confocal microscope (Carl Zeiss, North York, ON, Canada), as previously described. 38 For mCherry-EGFP-LC3 puncta counts, the images were acquired at the confocal microscope using 63 × objective and all puncta were counted irrespective of their size within the infected cells. For spine analysis, dual-labeled cells were imaged at × 63 (oil immersion) with a Quorum Spinning-disk confocal microscope (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON, Canada) at emission wavelengths of 406, 490 and 561. MetaMorph automation and image acquisition software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) was used to create a high-resolution three-dimensional representation of spines throughout the visible dendritic arbor using 0.5 μ m Z -plane optical sectioning in combination with a tile-scan module. Images were subsequently stitched and flattened in MetaMorph and exported to NeuronStudio (CNIC, Ichan School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA) to measure neurite length. Spines were manually quantified from a single neurite that spanned the hippocampal molecular layer (top of the granule cell layer to the hippocampal fissure) per cell in Fiji image processing software (ImageJ, National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Spine density (spines/10 μ m) was calculated as the quotient of the number of spines over neurite length multiplied by 10. Although not specifically quantified, spine density was observed to be similar for any individual cell throughout the molecular layer.

statistika

All data are reported as mean±SEM and statistical analysis performed using GraphPad Prism (v6.0) software (GraphPad Sofware, Inc., La Jolla, CA, USA). Experiments with two groups were analyzed by the two-tailed Student's t- test. Analyses of three or more groups were performed using an ANOVA test followed by Bonferroni post hoc . Statistička značajnost definirana je kao P <0, 05.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

Atg5

autophagy related gene 5

Bax

Bcl-2-associated X protein

NPC

neural progenitor cell

SVZ

subventricular zone

SGZ

subgranular zone

LC3

microtubule-associated protein 1 light chain 3

DCX

doublecortin

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)